CN114989068A - 一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与应用 - Google Patents

一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及荧光分子探针制备技术领域，具体公开一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与应用。本发明以2‑[2‑[2‑氯‑3‑[2‑(1,3‑二氢‑1,1,3‑三甲基‑2H‑苯[E]‑吲哚乙基二烯]‑1‑环己烯]‑乙烯]‑1,1,3‑三甲基‑1H‑苯[E]吲哚高氯酸盐为反应原料，经过反应后合成荧光探针Cy735，其化学结构式如式1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式1。本发明通过重新进行荧光探针分子设计，通过电子云密度调节改变荧光探针检测硫化氢后生成的产物，实现原位生成具有光动力治疗效果的光敏剂，实现了基于硫代羰基光敏剂的癌症治疗。

Description

一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与 应用
技术领域
本发明涉及荧光分子探针制备技术领域，尤其涉及一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前结肠癌已成为第三大流行癌症，死亡率排名第五，在世界各国均列为威胁人体健康的主要死因。现代医学已证明，硫化氢的含量与癌细胞有着密切的关系。合理可靠的快速检测细胞内硫化氢含量的方法对于早期癌症的诊断至关重要。
与化学疗法、手术疗法和放射疗法等传统临床疗法相比，光动力疗法(PDT)因无创、光控制选择性、出色的时间可控性、可忽略的耐药性和副作用小而备受关注。但传统的硫化氢荧光探针检测方法多基于光诱导电子转移机理恢复荧光团的荧光，但生成的产物没有治疗癌细胞的效果。
发明内容
针对上述的问题，本发明提供一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针及其制备工艺与应用。本发明通过重新进行荧光探针分子设计，通过电子云密度调节改变荧光探针检测硫化氢后生成的产物，实现原位生成具有光动力治疗效果的光敏剂，实现了基于硫代羰基光敏剂的癌症治疗。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
在本发明的第一方面，公开一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针，其化学结构式如式1所示：
Figure BDA0003728487970000011
进一步地，所述可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针为绿色固体，命名为：2-((E)-2-((E)-2-((4-甲氧基苯基)磺酰基)氧基)-3-((Z)-2-(1,1,3-三甲基-1,3-二氢-2H-苯并[E]吲哚-2-亚基)亚乙基)环己-1-烯-1-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[E]吲哚-3-三碘，简称为Cy735。
在本发明的第二方面，公开所述可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，包括如下步骤：
(1)提供含有Cy565和三乙胺的溶液A，备用；所述Cy565的化学结构式如式2所示：
Figure BDA0003728487970000021
(2)提供含有对甲氧基苯磺酰氯的溶液B，备用。
(3)将所述溶液B逐渐加入至溶液A中，反应完成后去除反应物中溶剂，得粗产物，经过纯化，即得所述硫化氢响应荧光探针。
进一步地，步骤(1)中，所述Cy565和三乙胺的摩尔比为1:5～1:8。
进一步地，步骤(1)中，以二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯等中的任意一种作为溶剂，在隔氧保护气环境下将所述Cy735和三乙胺溶解在其中得到所述溶液A。可选地，所述隔氧保护气包括氮气、惰性气体、二氧化碳等中的任意一种。
进一步地，步骤(2)中，以二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯等中的任意一种作为溶剂，将所述对甲氧基苯磺酰氯溶解在其中得到所述溶液B。
进一步地，步骤(3)中，所述对甲氧基苯磺酰氯和Cy565的摩尔比为3:1～6:1。
进一步地，步骤(3)中，所述反应时间为2～3小时。
在本发明的第三方面，公开一种所述Cy565的制备工艺，包括如下步骤：
(i)提供含有2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(简称为IR-813高氯盐酸)、醋酸根的溶液C，备用；
(ii)将所述溶液C在加热条件和隔氧条件下进行反应，反应完成后对反应物进行萃取，得到粗产品，经过纯化，即得所述Cy565。
进一步地，步骤(i)中，所述IR-813高氯盐酸和醋酸根的摩尔比为1:2～1:3。
进一步地，步骤(i)中，所述醋酸根由醋酸盐提供，可选地，所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾、醋酸钙、醋酸锌、醋酸亚铁等中的至少一种。
进一步地，步骤(i)中，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷等中的任意一种作为溶剂，将所述IR-813高氯盐酸、醋酸盐溶解得到溶液C。
进一步地，步骤(ii)中，所述加热的温度为65～70℃，反应时间为8～10小时。
进一步地，步骤(ii)中，所述反应在氮气、惰性气体、二氧化碳等中的任意一种保护气提供的隔氧条件下进行。
进一步地，步骤(ii)中，当溶液C的颜色由绿色变为红色时，表示反应完成。
进一步地，步骤(ii)中，所述反应完成后，用二氯甲烷和盐水的混合物对反应产物进行萃取，得粗产物，将该粗产物进一步纯化后即得目标产物。
进一步地，所述纯化包括液相色谱分离技术、柱色谱分离技术等中的任意一种。
在本发明的第四方面，公开所述可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针在医药、生物等领域中的应用；优选为用于癌症细胞及肿瘤的光动力治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针以经过改造的花菁染料为荧光基团，该荧光探针的发射波长处于近红外区，该荧光探针具有更小的荧光背景干扰，使本发明的荧光探针具有良好的荧光成像效果。
(2)相比于传统的响应硫化氢策略，本发明通过调控电子密度，重新进行荧光探针分子设计，引入供电子基团代替传统的吸电子基团，实现硫化氢进攻位点的改变，得到的荧光探针响应硫化氢后产物是非重原子光敏剂。这是因为传统的用于硫化氢检测的荧光探针是将吸电子结构的基团设计融入分子结构中，而本发明与传统硫化氢检测分子的不同是使用在分子探针设计时供电子基团，通过调控分子的电子密度，合理的改变硫化氢进攻位点，实现硫化氢的检测。本发明实现调控电子密度的最终目的是实现原位生成具有光动力治疗效果的光敏剂，从而实现基于硫代羰基光敏剂的癌症治疗。
(3)本发明的荧光探针检测硫化氢后原位生成的硫代非重原子光敏剂，能够有效地促进系统间交叉(ISC)，导致该光敏剂产生单线态氧的能力显著提高。试验结果表明，在乙醇溶剂中，商用光敏剂亚甲基蓝单线态氧产生效率仅为0.52，而该光敏剂的单线态氧产生效率为0.94。
(4)本发明的荧光探针检测硫化氢后的产物正好可用于癌症细胞及肿瘤的光动力治疗，有效地改善了传统重原子光敏剂所带来的暗毒性升高和重金属消耗成本高等缺点。试验结果显示，本发明提供的荧光探针Cy735可应用于结肠癌HCT116细胞的光动力治疗，进一步推动了有机小分子在生命体微环境中作用的探究。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是第一实施例合成的荧光探针Cy735的质谱图。
图2是第一实施例合成的荧光探针Cy735的核磁H谱。
图3是第一实施例合成的荧光探针Cy735的核磁C谱。
图4是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的机理图。
图5是第一实施例合成的荧光探针Cy735的电子云密度示意图。
图6是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的紫外吸收图谱。
图7是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的荧光发射图谱。
图8是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的线性图谱。
图9是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的选择性图。
图10是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的响应时间图谱。
图11是第一实施例合成的荧光探针Cy735在HCT116细胞中的细胞毒性检测的检测图。
图12是第一实施例合成的荧光探针Cy735在HCT116细胞中共聚焦荧光成像图。
图13是第一实施例合成的荧光探针Cy735在HCT116细胞中荧光强度的图谱。
图14是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢后原位生成的产物对HCT116细胞进行光动力治疗的图谱。
图15是第一实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢后原位生成的产物对HCT116细胞进行光动力治疗的细胞活性的图谱。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对该方法作进一步说明。
第一实施例
1、Cy565的制备工艺，参考路线1，包括如下步骤：
(1)称取2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)(400毫克，0.530毫摩尔)，无水醋酸钠(130毫克，1.59毫摩尔)，用30毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解于100毫升烧瓶中，得到溶液C。
(2)然后氮气保护条件下，于65～70℃的加热条件下搅拌所述溶液C进行反应，反应10小时后溶液颜色由绿色变为红色，即反应完成。
(3)用二氯甲烷和盐水的混合物对反应溶液进行三次萃取，萃取结束后取有机相进行减压旋蒸得到粗品，然后利用硅胶柱色谱法对所述粗品进行提纯，洗脱剂由石油醚：乙酸乙酯10：1变为2：1，得到红色纯品(165毫克，产率为55％)，记为Cy565。
Figure BDA0003728487970000051
2、一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成，参考路线2，包括以下步骤：
(1)将本实施例制备的Cy565(0.30mmol)在冰浴条件和氮气保护下溶解于25毫升二氯甲烷中，然后加入1.8mmol三乙胺。搅拌均匀，得到溶液A，备用。
(2)将对甲氧基苯磺酰氯(247.80毫克，1.20毫摩尔)溶解于10毫升二氯甲烷中，得到溶液B，备用。
(3)在30分钟内将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，反应3小时，反应完成后减压蒸发去除反应物中的溶剂二氯甲烷，所得残留物通过硅胶柱色谱纯化，用200：1至4：1(v/v)的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到绿色粉末(138.50mg，收率62.80％)，记为荧光探针Cy735。
Figure BDA0003728487970000061
图1是本实施例合成的荧光探针Cy735的质谱图；图2是本实施例合成的荧光探针Cy735的核磁H谱；图3是本实施例合成的荧光探针Cy735的核磁C谱。其中：
所述质谱解析结果为：高分辨质谱(在甲醇中的阳离子模式)得到所述荧光探针Cy735理论分子量为735.3251，实际检测分子量为735.3174。
所述H谱解析结果为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝7.3Hz,2H),8.03(d,J＝13.7Hz,2H),7.95(d,J＝7.6Hz,4H),7.92(d,J＝8.8Hz,4H),7.84(d,J＝8.5Hz,2H),7.62(d,J＝6.4Hz,2H),7.48(d,J＝5.9Hz,2H),6.81(d,J＝6.6Hz,1H),6.11(d,J＝14.1Hz,1H),3.86(s,3H),3.81(s,6H),2.62(s,4H),1.90(s,12H),1.26(s,2H).
所述C谱解析结果：13C NMR(126MHz,CDCl3)δ174.01,164.80,159.92,157.90,140.38,140.23,133.76,131.97,131.09,130.16,127.83,127.70,125.06,123.99,122.13,114.71,112.88,110.85,100.97,56.10,55.24,50.98,40.98,32.35,27.15,25.22.
上述结果得到本实施例合成的荧光探针Cy735结构式为：
Figure BDA0003728487970000062
图4是本实施例合成的荧光探针Cy735检测硫化氢的机理图。传统的用于检测硫化氢的荧光探针多应用吸电子基团作为硫化氢的响应基团，硫化氢进攻位点为吸电子基团中亲电性较强的位置，从而导致光诱导电子转移机理的抑制消失，实现原有荧光分子荧光的恢复。而本发明的荧光探针使用对甲氧基苯磺酰氯(供电子基团)作为硫化氢的响应基团，使得硫化氢进攻位点发生变化，进攻原有荧光团的位置，导致光诱导电子转移机理的抑制作用消失，生成不同于原有荧光分子的新型荧光分子。
图5是本实施例合成的荧光探针Cy735的电子云密度示意图。该图能够说明荧光分子的电子云密度分布，可以明显看出对甲氧基苯磺酰作为供电子基团，周围的电子云密度要略低，使得硫化氢更易进攻花菁染料，从而生成区别于传统硫化氢检测产物的新型产物，实现响应硫化氢后的新型产物。
第二实施例
1、Cy565的制备工艺，包括如下步骤：
(1)称取2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)(400毫克，0.530毫摩尔)，醋酸亚铁(1.325毫摩尔)，用30毫升二氯甲烷溶解于100毫升烧瓶中，得到溶液C。
(2)然后氮气保护条件下，于65～70℃的加热条件下搅拌所述溶液C进行反应，反应8小时后溶液颜色由绿色变为红色，即反应完成。
(3)用二氯甲烷和盐水的混合物对反应溶液进行三次萃取，萃取结束后取有机相进行减压旋蒸得到粗品，然后利用硅胶柱色谱法对所述粗品进行提纯，洗脱剂由石油醚：乙酸乙酯10：1变为2：1，得到红色纯品(165毫克，产率为55％)，记为Cy565。
2、一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成，参考路线2，包括以下步骤：
(1)将本实施例制备的Cy565(0.30mmol)在冰浴条件和氮气保护下溶解于25毫升乙酸乙酯中，然后加入1.5mmol三乙胺。搅拌均匀，得到溶液A，备用。
(2)将对甲氧基苯磺酰氯(0.9毫摩尔)溶解于10毫升乙酸乙酯中，得到溶液B，备用。
(3)在30分钟内将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，反应2小时，反应完成后减压蒸发去除反应物中的溶剂二氯甲烷，所得残留物通过硅胶柱色谱纯化，用200：1至4：1(v/v)的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到绿色粉末(138.50mg，收率62.80％)，记为荧光探针Cy735。
经过采用和上述第一实施例相同的方法测试，本实施例合成的荧光探针Cy735结构式为：
Figure BDA0003728487970000081
第三实施例
1、Cy565的制备工艺，包括如下步骤：
(1)称取2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)(400毫克，0.530毫摩尔)，醋酸锌(130毫克，1.59毫摩尔)，用30毫升二氯甲烷溶解于100毫升烧瓶中，得到溶液C。
(2)然后二氧化碳气体保护条件下，于65～70℃的加热条件下搅拌所述溶液C进行反应，反应10小时后溶液颜色由绿色变为红色，即反应完成。
(3)用二氯甲烷和盐水的混合物对反应溶液进行三次萃取，萃取结束后取有机相进行减压旋蒸得到粗品，然后利用硅胶柱色谱法对所述粗品进行提纯，洗脱剂由石油醚：乙酸乙酯10：1变为2：1，得到红色纯品(165毫克，产率为55％)，记为Cy565。
2、一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成，参考路线2，包括以下步骤：
(1)将本实施例制备的Cy565(169.50mg，0.30mmol)在冰浴条件和氮气保护下溶解于25毫升乙酸乙酯中，然后加入2.4mmol三乙胺。搅拌均匀，得到溶液A，备用。
(2)将对甲氧基苯磺酰氯(1.8毫摩尔)溶解于10毫升二氯甲烷中，得到溶液B，备用。
(3)在30分钟内将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，反应3小时，反应完成后减压蒸发去除反应物中的溶剂二氯甲烷，所得残留物通过硅胶柱色谱纯化，用200：1至4：1(v/v)的二氯甲烷/甲醇洗脱，得到绿色粉末(138.50mg，收率62.80％)，记为荧光探针Cy735。
经过采用和上述第一实施例相同的方法测试，本实施例合成的荧光探针Cy735结构式为：
Figure BDA0003728487970000091
性能测试：对第一实施例制备的荧光探针Cy735的各项性能进行测试。
1、荧光探针Cy735检测硫化氢能力的试验，包括如下步骤：
(1)将所述荧光探针Cy735溶解到二甲基亚砜中，配置成没浓度为10mmol/L的储备液，备用。
(2)在2毫升的pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入所述荧光探针Cy735配置成1μL10mmol/L的溶液，然后分别加入0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44μL的10mmol/L硫化氢溶液。
(3)以紫外吸收波长为横坐标，以吸收度为纵坐标，得到关于荧光探针检测硫化氢的紫外吸收图谱，结果如图6所示。
(4)以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到关于荧光探针检测硫化氢的荧光发射图谱，结果如图7所示。
(5)以硫化氢浓度为横坐标，对应的荧光强度为纵坐标，得到关于荧光探针检测硫化氢的线性图谱，结果如图8所示。
(6)以不同的目标物为横坐标，荧光强度变化为纵坐标，得到关于荧光探针检测硫化氢的选择性图谱。其他的目标物包括阴离子溶液和生物硫醇如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、NO、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、Br-、I-、SO3 2-、S2O3 2-、SO4 2-、H2O2、O2-、ONOO-、S2-、HSO3 -、HCO3 -和CO3 2-，结果如图9所示。
(7)以时间为横坐标，以荧光强度变化为纵坐标，得到关于荧光探针检测硫化氢的响应时间图谱，结果如图10所示。
从图6可以看出Cy735的紫外吸收特征峰为816nm和752nm的肩缝，随着硫化氢的加入，Cy735的两个特征峰的吸收出现明显减弱，同时在390nm处出现一个新的吸收峰，且逐渐增强，说明了Cy735能够与硫化氢发生反应。从图7可以看出Cy735在720nm的荧光发射下，能够在845nm处出现明显的荧光发射峰，随着硫化氢的加入，Cy735的荧光发射峰出现明显减弱最终趋于平稳，说明Cy735能够与硫化氢发生明显的反应。从图8可以看出10μmol/L的荧光探针Cy735与0-44μmol/L的硫化氢的荧光强度呈现线性，且线性相关系数R2为0.997。从图9中可以看出本发明的荧光探针Cy735能够对硫化氢发生特异性的响应，但是对于其他目标物(阴离子溶液和生物硫醇如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、NO、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、Br-、I-、SO3 2-、S2O3 2-、SO4 2-、H2O2、O2-、ONOO-、S2-、HSO3 -、HCO3 -和CO3 2-)均不会发生明显的响应。从图10可以看出Cy735对于硫化氢的响应时间为35分钟，且在反应完全后荧光强度能够在60分钟内保持稳定，说明了Cy735能够在体外快速响应硫化氢且保持稳定的状态。
2、荧光探针Cy735的细胞毒性试验：
(1)将浓度分别为0，2.5，5，10，15，20μL的荧光探针Cy735加入到96孔板中配制成0，2.5，5，10，15，20μM的荧光探针溶液。
(2)将步骤(1)得到的溶液在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，然后将25μL，5mg/mL的4-甲基噻唑基四唑MTT加入到细胞培养液中培养4h。
(3)通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加荧光探针Cy735的细胞组存活率为100％，不同浓度荧光探针Cy735加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图。结果如图11，可以看出Cy735的毒性很低。
3、荧光探针Cy735对结肠癌HCT116细胞的荧光成像实验：
选择HCT116细胞进行激光共聚焦扫描实验，对内源性H2S进行成像，结果如图12所示，可以明显看出荧光探针Cy735对于内源性硫化氢具有明显的响应，随着硫化氢含量的增多而出现明显的红色通道荧光减弱现象。
将细胞分为3组：第一组HCT116细胞以生理盐水作为对照预处理1h后，再加入荧光探针Cy735(20μM)处理1h。第二组用CBS激活剂SAM(3mM，使内源性H2S水平升高)预处理HCT116细胞1h后，再负载荧光探针Cy735(20μM)1h。第三组用AOAA(1mM，CBS抑制剂，通过抑制CBS表达降低内源性H2S水平)预处理HCT116细胞一小时，然后加入Cy735(20μM)一小时。
进行共聚焦发光成像并采集图像，激发波长在720nm，监测在750-880nm。利用ImageJ计算细胞的荧光强度，结果如图13所示，可以看出，当加入硫化氢促进剂时，硫化氢水平升高，红色通道中的荧光强度明显降低；当加入硫化氢抑制剂时，硫化氢水平降低，红色通道中的荧光强度明显升高。
4、荧光探针Cy735检测硫化氢后原位胜场的产物对结肠癌HCT116细胞进行光动力治疗实验：
(1)利用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为单线态氧吸收剂，活性氧指示剂DCFH-DA作为单线态氧指示剂。将实验分为五组，第一组：只加入光敏剂Cy581。第二组：只用808nm激光器照射。第三组：加入光敏剂Cy581并用808nm激光器照射。第四组：加入光敏剂Cy581并用808nm激光器照射，同时加入NAC。第四组：加入光敏剂Cy581并用808nm激光器照射并加入少量冰。所述光敏剂Cy581的结构式如下：
Figure BDA0003728487970000111
(2)对五组细胞分别进行MTT实验，统计细胞成活率，绘制五组实验的细胞成活率图谱。结果如图14、图15所示，可以看出单独的808nm的光照和单独的光敏剂并不能产生单线态氧，而光敏剂Cy581和808nm的光照同时出现时就有单线态氧产生，加入单线态氧抑制剂后明显绿色荧光消失，证明该光敏剂能够产生单线态氧。MTT实验再次说明加入光敏剂并进行808nm激光照射可以有效杀死肿瘤细胞。
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的权利要求为准。

Claims (10)

1.一种可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针，其化学结构式如式1所示：
Figure FDA0003728487960000011
2.根据权利要求1所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针，其特征在于，所述可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针为绿色固体。
3.权利要求1或2所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供含有Cy565和三乙胺的溶液A，备用；所述Cy565的化学结构式如式2所示：
Figure FDA0003728487960000012
(2)提供含有对甲氧基苯磺酰氯的溶液B，备用；
(3)将所述溶液B逐渐加入至溶液A中，反应完成后去除反应物中溶剂，得粗产物，经过纯化，即得所述硫化氢响应荧光探针。
4.权利要求3所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述Cy565和三乙胺的摩尔比为1:5～1:8；
优选地，以二氯甲烷、乙酸乙酯中的任意一种作为溶剂，在隔氧保护气环境下将所述Cy735和三乙胺溶解在其中得到所述溶液A；
更优选地，所述隔氧保护气包括氮气、惰性气体、二氧化碳中的任意一种。
5.权利要求3所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，步骤(2)中，以二氯甲烷、乙酸乙酯中的任一种作为溶剂，将所述对甲氧基苯磺酰氯溶解在其中得到所述溶液B；
或者，步骤(3)中，所述对甲氧基苯磺酰氯和Cy565的摩尔比为3:1～6:1；
或者，步骤(3)中，所述反应时间为2～3小时。
6.权利要求3-5任一项所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，所述Cy565的制备工艺，包括如下步骤：
(i)提供含有2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐、醋酸根的溶液C，备用；
(ii)将所述溶液C在加热条件和隔氧条件下进行反应，反应完成后对反应物进行萃取，得到粗产品，经过纯化，即得所述Cy565。
7.权利要求6所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，步骤(i)中，所述2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐和醋酸根的摩尔比为1:2-1:3；
或者，步骤(i)中，所述醋酸根由醋酸盐提供；优选地，所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾、醋酸钙、醋酸锌、醋酸亚铁中的至少一种；
或者，步骤(i)中，以N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的任意一种作为溶剂，将所述2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐、醋酸盐溶解得到溶液C。
8.权利要求6所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，步骤(ii)中，所述加热的温度为65～70℃，反应时间为8～10小时；
或者，步骤(ii)中，所述反应在氮气、惰性气体、二氧化碳中的任意一种保护气提供的隔氧条件下进行。
9.权利要求6所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针的合成工艺，其特征在于，步骤(ii)中，当溶液C的颜色由绿色变为红色时，表示反应完成；
或者，步骤(ii)中，所述反应完成后，用二氯甲烷和盐水的混合物对反应产物进行三次萃取，取最后一次萃取的下层有机相进行减压旋蒸得粗产物，将该粗产物进一步纯化后即得目标产物；
或者，所述纯化包括液相色谱分离技术、柱色谱分离技术中的任意一种。
10.权利要求1或2所述的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针，或者权利要求3-9任一项所述的合成工艺得到的可调控电子密度的硫化氢响应荧光探针在医药、生物领域中的应用。
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