CN115960115A

CN115960115A - 一种荧光素衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115960115A
Application number: CN202211613528.7A
Authority: CN
Inventors: 孙世国; 刘凤玉; 赵志昊; 谢珍珍; 邓喜玲
Original assignee: Dalian University of Technology; Shihezi University
Current assignee: Dalian University of Technology; Shihezi University
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开一种荧光素衍生物及其制备方法和应用。所述荧光素衍生物结构如式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示。本发明提供的荧光素衍生物除对醌氧化还原酶具有优异的检测灵敏度和特异性之外，其与醌氧化还原酶作用后的产物还具有较好的单线态氧生成能力，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用，因此，不仅可作为优良的荧光探针应用于醌还原氧化酶的定性定量检测及生物学研究、肿瘤细胞荧光检测和不同种类肿瘤细胞区分，还可以作为光动力治疗的光敏剂，从而提高光动力治疗效果，应用在多种肿瘤疾病的治疗中可实现诊疗一体化，具有较高的实际应用价值。

Description

一种荧光素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种荧光素衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是威胁人类健康的恶性疾病，是世界上第二大疾病，也是目前导致人类死亡的主要原因之一。目前，癌症最主要的治疗方法是手术根治性切除癌细胞。现在治疗癌症的主要障碍是难以对癌症进行早期诊断，从而导致错过治疗癌症的最佳时机。癌症生物标志物的早期检测和创新疗法的研究，对于有效控制和治疗癌症具有十分重要的意义。醌氧化还原酶(NQO1)在正常细胞与肿瘤细胞中具有差异性表达的特点，在许多癌细胞中的含量过度升高，因此，醌氧化还原酶可以作为选择性癌症治疗和精准癌症检测的生物标志物。

近年来，大量的荧光探针被开发用于肿瘤中醌氧化还原酶的检测和定量分析。但是，由于生物组织内的环境复杂性，荧光信号不可避免地会受到生物组织自身背景荧光的干扰。在长时间的生物成像过程中，荧光探针都受到聚集引起的猝灭(ACQ)效应的影响，从而导致检测的灵敏度较低，且检测过程中存在非特异性检测等问题。因此，研发具有快速响应、高选择性和高灵敏度的检测醌氧化还原酶的荧光探针，对于癌症疾病的早期诊断，以及全面了解癌症的发病机制和相关药物的开发具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有用于醌氧化还原酶检测的荧光探针存在选择性较差、检测灵敏低、响应时间长等问题，本发明提供一种荧光素衍生物及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种荧光素衍生物，其结构如式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示：

其中，X、X₀分别选自H、F、Cl、Br或I；

R、R₁分别选自H、L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆或L₇；

R₂选自(CH₂)_n+1或(CH₂)_n+1O(CH₂)_n+1；R₃选自H或CH₃；

R₄选自(CH₂)_n；n为0-8的整数。

需要说明的是，为了简化起见，以下将上述荧光素衍生物的结构式简化为如下结构：

L代表O、

相对于现有技术，本发明提供了一种新型结构的荧光素衍生物，将三甲基锁醌通过不同连接臂L连接荧光发色团，此连接方式有效促进了三甲基锁醌与荧光发色基团之间的光致电子转移作用，螺环内酯结构能够最大限度降低荧光素衍生物的自发荧光和活性氧的产生能力，从而有效降低背景荧光，大大提高荧光检测的灵敏度，实现高质量荧光成像，具有广泛的生物应用前景。

优选的，所述荧光素衍生物的结构如下所示：

本发明还提供了一种上述荧光素衍生物的制备方法，包括如下步骤：

步骤a，将化合物1和乌洛托品溶于有机溶剂a中，于70℃-160℃反应20h-40h，冷却，调节反应液的pH至2-4，过滤，洗涤，干燥，得化合物2；

步骤b，惰性气氛下，将化合物2溶于有机溶剂b中，加入中间体R和哌啶，于90℃-180℃反应30h-40h，冷却，纯化，得化合物3；

其中，所述中间体R选自如下化合物：

步骤c，惰性气氛下，将化合物4、中间体Q、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺加至有机溶剂c中，于0℃-5℃反应5min-30min，升温至10℃-30℃反应18h-60h，冷却，纯化，得化合物5；

其中，当中间体Q为R₃-NH-R₂-COOH时，化合物5为：

当中间体Q为NH₂(C₆H₄)R₄COOH时，化合物5为：

步骤d，惰性气氛下，将化合物3、化合物4、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺加入有机溶剂d中，于0℃-5℃反应0.1h-2.5h，升温至50℃-150℃反应1h-3.5h，冷却至10℃-30℃，继续反应18h-48h，得式Ⅰ所示荧光素衍生物；

惰性气氛下，将化合物3、化合物5、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺加入有机溶剂d中，于0℃-5℃反应0.1h-2.5h，升温至50℃-150℃反应1h-3.5h，冷却至10℃-30℃，继续反应18h-48h，得式Ⅱ或式Ⅲ所示荧光素衍生物。

本发明提供的荧光素衍生物是在2,7-二氯荧光素基础上，通过Duff反应引入醛基，然后通过Knoevenagel-缩合反应获得染料母体结构，最后通过链接不同的链接臂L获得的一类特异性识别醌氧化还原酶的荧光素衍生物，合成方法的原料易得，合成路线简捷，反应条件温和，产品收率高。

优选的，步骤a中，所述化合物1与乌洛托品的摩尔比为1:(2-6)。

优选的，步骤a中，所述化合物1与有机溶剂的摩尔比为1:(50-300)。

优选的，步骤a中，所述有机溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯或邻二氯苯中至少一种。

进一步地，步骤a中，采用盐酸溶液、乙酸溶液或硫酸溶液调节反应液的pH至2-4，优选的，酸溶液的浓度为1.0M-3.0M。

优选的，步骤b中，所述化合物2与中间体R的摩尔比为1:(1-8)。

优选的，步骤b中，所述化合物2与哌啶的摩尔比为1:(2-8)。

优选的，步骤b中，所述化合物2与有机溶剂b的摩尔比为1:(100-600)。

优选的，步骤b中，所述有机溶剂b为甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲苯、邻二氯苯或N,N-二甲基甲酰胺中至少一种。

进一步地，步骤b中，所述纯化的具体步骤为：将冷却后的反应液减压蒸馏除去溶剂，加入有机溶剂溶解反应产物，然后加入冷乙醚中，抽滤，采用柱层析法进行纯化，得化合物3。

结合上述，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或N,N-二甲基甲酰胺，其与化合物2的摩尔比为1:(40-60)；所述冷乙醚的温度为0℃-6℃，化合物2与冷乙醚的摩尔比为1:(2000-4000)。

结合上述，所述柱层析是采用硅胶(300-400目)为填料的层析柱，以体积比50:1的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液进行洗脱，收集目标组分，浓缩，干燥，得化合物3。

优选的，步骤c中，化合物4、中间体Q、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:(1-2):(1-6):(15-30)。

优选的，步骤c中，所述化合物4与有机溶剂c的摩尔比为1:(300-1500)。

优选的，步骤c中，所述有机溶剂c为二氯甲烷、乙腈、甲苯、二甲苯、邻二氯苯或N,N-二甲基甲酰胺中至少一种。

进一步地，步骤c中，所述纯化的步骤为：将反应结束后的反应液浓缩，干燥，然后进行柱层析纯化，得化合物5。

结合上述，柱层析是以300-400目硅胶作为填料，以体积比5:1的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱液，收集目标组分，浓缩，干燥，得化合物5。

优选的，步骤d中，所述化合物3、化合物4、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(10-25):(1-8):(20-30)。

优选的，步骤d中，所述化合物3、化合物5、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(15-30):(1-12):(20-30)。

优选的，步骤d中，所述化合物3与有机溶剂d的摩尔比为1:(1000-2500)。

优选的，步骤d中，所述有机溶剂d为二氯甲烷、乙腈、甲苯、二甲苯、邻二氯苯或N,N-二甲基甲酰胺中至少一种。

进一步地，步骤d中，反应结束之后还包括纯化步骤，所述纯化步骤具体为：将反应结束后的反应液浓缩，干燥，然后进行柱层析纯化，得荧光素衍生物。

结合上述，柱层析是以300-400目硅胶作为填料，以体积比100:1的二氯甲烷和乙醇作为洗脱液，收集目标组分，浓缩，干燥，得荧光素衍生物。

优选的反应原料的摩尔比、溶剂、反应温度和反应时间，有利于使反应充分进行，提高原料的转化率，进而提高产品的收率。

本发明中所述惰性气氛可由本领域常规的惰性气体提供，如氮气、氩气或二氧化碳气体等。

本发明还提供了一种荧光探针，包括上述的荧光素衍生物。

本发明还提供了上述荧光素衍生物在醌氧化还原酶检测中的应用。

本发明还提供了上述荧光探针在醌氧化还原酶检测中的应用。

将本发明提供的荧光素衍生物制备成荧光探针，可实现醌氧化还原酶的特异性识别，具有较高的灵敏度，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用，可作为优良的荧光探针应用于醌氧化还原酶的定性定量检测及生物学研究、肿瘤细胞荧光检测、不同种类肿瘤细胞区分，具有广泛的生物应用前景。

本发明提供的荧光素衍生物适用于醌氧化还原酶的检测，可在1min内出现可见的荧光变化，5min内出现显著的荧光差异，且具有较高的选择性，对常见的干扰物，如氨基酸、金属离子、活性氧、活性氮、还原性硫醇和一些其他氧化还原酶等均无明显的荧光响应，检出限可达20ng/mL左右，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用，安全性更高，有望应用于真实生物组织的醌氧化还原酶的检测，实现对醌氧化还原酶的实时可视化检测，应用前景广阔。

本发明还提供了上述荧光素衍生物作为光动力治疗光敏剂的应用。

本发明所述的一类特异性识别醌氧化还原酶的荧光素衍生物，是基于荧光素修饰得到的荧光发色团通过不同链接臂L链接醌氧化还原酶的底物三甲基锁醌得到新型结构的荧光素衍生物，其可以特异性识别醌氧化还原酶。其中，三甲基锁醌通过光诱导电子转移(PET)过程阻碍了S₁到S₀的荧光发射过程，这时荧光素衍生物没有荧光信号和单线态氧生成能力；在醌氧化还原酶催化下，还原型辅酶Ⅱ将探针的锁醌部分还原为氢醌，氢醌上的羟基亲核进攻醌丙酸部分的羰基，发生内酯化反应，得到的产物可以产生强烈的荧光信号，并具有优异的单线态氧生成能力，从而既能对醌氧化还原酶进行定性定量检测，又具有肿瘤靶向和较好的单线态氧生成能力，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用，可作为优良的荧光探针应用于醌氧化还原酶的定性定量及生物学研究、肿瘤细胞检测成像、不同种类肿瘤细胞的区分、肿瘤的靶向和光动力学治疗等；除此之外，因其具有微秒级长寿命荧光(620nm处荧光寿命可达到24μs)，与短寿命的传统荧光探针相比，能够消除生物背景荧光干扰，实现高质量荧光成像，具有广泛的生物应用前景。

附图说明

图1为实施例3制备的荧光素衍生物DCF-ZZH与肿瘤A549细胞共孵育不同时间的荧光成像图，其中，(a)5min，(b)10min，(c)20min，(d)40min；

图2为实施例3制备的荧光素衍生物DCF-ZZH对醌氧化还原酶表达水平不同的肿瘤细胞荧光成像图，其中，(a)DCF-ZZH对肿瘤OVCAR-3细胞的荧光成像图，(b)DCF-ZZH对肿瘤A549细胞荧光成像图，(c)抑制试验中DCF-ZZH对不加双香豆素预孵育的肿瘤A549细胞荧光成像图；(d)抑制试验中DCF-ZZH对双香豆素预孵育的肿瘤A549细胞的荧光成像图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

一类特异性识别醌氧化还原酶的荧光素衍生物DCF-ZZH-0的制备：

(1)中间体Ⅲ的制备

在常温状态下，将化合物Ⅱ(1.0g，2.5mmol)和乌洛托品(1.746g，12.5mmol)溶解在装有30mL三氟乙酸的圆底烧瓶中，加热至90℃回流36h，混合物变深褐色粘稠状，待反应产物冷却至室温(25℃)后，加至装有大量冰块的烧杯中，加入2M盐酸水溶液调至pH＝4，继续搅拌4h，直至有固体析出，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥，得到橘红色固体化合物Ⅲ，不经提纯直接进行下一步反应。

(2)中间体DCF-LHF-0的制备

在氮气保护下，将化合物Ⅲ(0.456g，1mmol)溶解于15mL干燥无水乙醇中，加入2-乙酰基噻吩(0.504g，4mmol)中间体，搅拌，混合物搅拌均匀后加入哌啶(0.4mL)，在氮气保护下加热至100℃回流32h，反应完成后待反应物温度降至室温(25℃)后进行减压蒸馏去除溶剂，加甲醇(2mL)溶解反应产物，在0℃的乙醚(300mL)中析出固体，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，二氯甲烷和甲醇体系作为流动相进行洗脱，二氯甲烷和甲醇体积比为50:1，收集深红色部分，浓缩，干燥，得到化合物DCF-LHF-0(0.159g，收率为23.69％，纯度为98％)。

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₃₄H₁₇Cl₂O₇S₂ ^-(M-H)^-670.9798,found 670.9794。

(3)中间体Ⅵ的制备

在氮气保护下，将化合物Ⅴ(0.05g，0.2mmol)、4-氨基苯乙酸(0.03g，0.2mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(0.128g，0.34mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.516g，4mmol)加至10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，于0℃反应10min后，升至室温(25℃)反应24h，干燥，获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯体系作为流动相进行洗脱，收集黄色部分，浓缩，干燥，得化合物Ⅵ(0.045g，收率为58.75％，纯度为98％)。

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₂₂H₂₄NO₅ ^-(M-H)^-382.1659,found 382.1655.

(4)化合物DCF-ZZH-0的制备

在氮气保护下，将化合物DCF-LHF-0(0.1g，0.15mmol)、化合物Ⅵ(1.027g，2.68mmol)溶解在15mL的干燥二氯甲烷中，然后向其加入4-二甲氨基吡啶(0.0195g，0.16mmol)、二环己基碳二亚胺(0.70g，3.4mmol)，在氮气氛围下于0℃搅拌0.2h，结束后升温至60℃持续2h，温度降至室温(25℃)继续反应36h，反应完成后减压蒸馏除去溶剂，获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，以体积比为100:1的二氯甲烷和乙醇体系作为流动相进行洗脱，收集黑褐色部分，浓缩，干燥，得到荧光素衍生物DCF-ZZH-0(0.025g，收率为16.13％，纯度为98％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.20(1H),8.02(2H),7.73(2H),7.71(2H),7.68(1H),7.66(1H),7.63(2H),7.33(1H),7.13(2H),6.93(1H),6.87(2H),6.81(2H),6.48(2H),3.31(2H),2.82(2H),2.06(3H),1.87(6H),1.35(6H).

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₅₆H₄₁Cl₂NO₁₁S₂Na⁺(M+Na)⁺1060.1391,found1060.1388.

实施例2

一类特异性识别醌氧化还原酶的荧光素衍生物DCF-ZZH-1的制备：

(1)中间体Ⅲ的制备

在常温状态下，将化合物Ⅱ(1.0g，2.5mmol)和乌洛托品(1.746g，12.5mmol)溶解在装有30mL三氟乙酸的圆底烧瓶中。加热至90℃回流36h，混合物变深褐色粘稠状，待反应产物冷却至室温(25℃)后，加至装有大量冰块的烧杯中，加入2M盐酸水溶液调至pH＝4，继续搅拌4h，直至有固体析出，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥，得到橘红色固体化合物Ⅲ，不经提纯直接进行下一步反应。

(2)中间体DCF-LHF-1的制备

在氮气保护下，将化合物Ⅲ(0.456g，1mmol)溶解于15mL干燥无水乙醇中，加入1-萘乙酮(0.680g，4mmol)中间体，搅拌，混合物搅拌均匀后加入哌啶(0.4mL)，在氮气保护下加热至100℃回流32h，反应完成后待反应物温度降至室温(25℃)后进行减压蒸馏去除溶剂，加甲醇(2mL)溶解反应产物，在0℃的乙醚(300mL)中析出固体，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，以体积比为50:1二氯甲烷和甲醇体系作为流动相进行洗脱，收集深红色部分，浓缩，干燥，得到化合物DCF-LHF-1(0.137g，收率为18.03％，纯度为98％)。

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₄₆H₂₅Cl₂O₇ ^-(M-H)^-759.0982,found 759.0976.

(3)中间体Ⅵ的制备

在氮气保护下，将化合物Ⅴ(0.05g，0.2mmol)、4-氨基苯乙酸(0.03g，0.2mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(0.128g，0.4mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.516g，4mmol)加至10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，于0℃反应10min后，升至室温(25℃)反应24h，干燥，获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，以体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯体系作为流动相进行洗脱，收集黄色部分，浓缩，干燥，得化合物Ⅵ(0.045g，收率为58.75％，纯度为98％)。

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₂₂H₂₄NO₅ ^-(M-H)^-382.1659,found 382.1655.

(4)化合物DCF-ZZH-1的制备

在氮气保护下，将化合物DCF-LHF-1(0.1g，0.13mmol)、化合物Ⅵ(1.072g，2.8mmol)溶解在15mL干燥二氯甲烷中，然后向其加入4-二甲氨基吡啶(0.0195g，0.16mmol)、二环己基碳二亚胺(0.70g，3.4mmol)，在氮气氛围下于0℃搅拌0.2h，结束后升温至60℃持续2h，温度降至室温(25℃)继续反应36h，反应完成后减压蒸馏除去溶剂，获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，以体积比为100:1二氯甲烷和乙醇体系作为流动相进行洗脱，收集黑褐色部分，浓缩，干燥，得到荧光素衍生物DCF-ZZH-1(0.023g，收率为13.69％，纯度为98％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.58(2H),8.20(1H),8.08(2H),8.03(2H),7.94(2H),7.73(2H),7.68(1H),7.66(1H),7.33(2H),7.30(1H),7.27(2H),7.18(2H),7.13(2H),6.90(1H),6.87(2H),6.82(2H),6.48(2H),3.31(2H),2.82(2H),2.06(3H),1.88(6H),1.36(6H).

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₆₈H₄₉Cl₂NO₁₁Na⁺(M+Na)⁺1148.2575,found 1148.2569.

实施例3

一类特异性识别醌氧化还原酶的荧光素衍生物DCF-ZZH的制备：

(1)中间体Ⅲ的制备

在常温状态下，将化合物Ⅱ(1.0g，2.5mmol)和乌洛托品(1.746g，12.5mmol)溶解在装有30mL三氟乙酸的圆底烧瓶中，加热至90℃回流36h，混合物变深褐色粘稠状，待反应产物冷却至室温(25℃)加至装有大量冰块的烧杯中，加入2M盐酸水溶液调至pH＝4，继续搅拌4h，直至有固体析出，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥，得到橘红色固体化合物Ⅲ，不经提纯直接进行下一步反应。

(2)中间体DCF-LHF的制备

在氮气保护下，将化合物Ⅲ(0.456g，1mmol)溶解于15mL干燥无水乙醇中，加入2-(2,6-二甲基-4H-吡喃-4-亚基)丙二腈(0.688g，4mmol)中间体，搅拌，混合物搅拌均匀后加入哌啶(0.4mL)，在氮气保护下加热至100℃回流32h，反应完成后待反应物温度降至室温(25℃)后进行减压蒸馏去除溶剂，加少量甲醇(2mL)溶解反应产物，在0℃的乙醚(300mL中)析出固体，布氏漏斗中抽滤获得滤饼，蒸馏水洗涤三次后干燥，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇体系作为流动相进行洗脱，收集深红色部分，浓缩，干燥，得到化合物DCF-LHF(0.105g，收率为13.74％，纯度为98％)。

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₄₂H₂₁Cl₂N₄O₇ ^-(M-H)^-763.0792,found 763.0787.

(3)化合物DCF-ZZH的制备

在氮气保护下，将化合物DCF-LHF(0.1g，0.13mmol)、化合物Ⅴ(0.7g，2.8mmol)溶解在15mL干燥二氯甲烷中，然后向其加入4-二甲氨基吡啶(0.02g，0.16mmol)、二环己基碳二亚胺(0.7g，3.4mmol)，在氮气氛围下于0℃搅拌0.2h，结束后升温至60℃持续2h，温度降至室温(25℃)继续反应36h，反应完成后减压蒸馏除去溶剂，获得粗产物，采用硅胶(300-400目)作为柱色谱填料，体积比为100:1的二氯甲烷和乙醇体系作为流动相进行洗脱，收集黑褐色部分，浓缩，干燥，得到荧光素衍生物DCF-ZZH(0.018g，收率为13.90％，纯度98％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.21(1H),8.01(2H),7.73(2H),7.66(1H),7.64(1H),7.33(1H),6.81(2H),6.62(2H),6.46(2H),2.80(2H),2.36(6H),2.06(3H),1.86(6H),1.36(6H).

HRMS(ESI)m/z calcd.for C₅₆H₃₈Cl₂N₄O₁₀Na⁺(M+Na)⁺1019.1857,found1019.1852.

上述实施例1-3中采用本发明限定的其他反应条件，如反应原料的比例、溶剂、反应温度和时间等，只要在本发明说明书限定的范围内，均可达到与实施例1-3基本相当的效果。

实施例4-8

参照上述方法进行荧光素衍生物4-8的合成，具体工艺参数本领域技术人员可按照实施例1-3中进行常规调整得到。

上述制备得到的荧光素衍生物的结构式如下：

性能检测

1.特异性检测

采用本发明实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)对醌氧化还原酶特异性识别研究。

生物体中存在的氨基酸、离子、活性氧、活性氮、还原性硫醇和一些氧化还原酶可能会干扰荧光素衍生物的检测，为了探究荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)是否对醌氧化还原酶具有特异性响应，在相同条件下对不同的生物相关分析物(浓度均为100μM)：缬氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、H₂O₂、NaClO、半胱氨酸(Cys)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)、抗坏血酸(AA)、过氧化氢酶(CAT)进行测试，进一步监测这些分析物和荧光素衍生物(浓度均为10μM)反应后的荧光强度变化。使用荧光分光光度计，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。

采用10mM PBS(pH＝7.4)缓冲液分别配制得到各干扰分析物浓度为100μM，牛血清白蛋白(BSA)质量浓度为0.007％和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)浓度为100μM的各待测溶液，分别检测氨基酸(Leu，Ala，Arg，Glu，Gly，Tyr，His)、金属阳离子(K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Mg²⁺)、活性氧(H₂O₂，NaClO)、还原性物质(Cys，DTT，GSH，Hcy，AA，CAT)与荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)37℃反应12min后检测荧光强度的变化。

同时，采用10mM PBS(pH＝7.4)缓冲液配制得到醌氧化还原酶浓度10μM，牛血清白蛋白(BSA)质量浓度为0.007％和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)浓度为100μM的待测溶液。测试其与荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)37℃反应12min后检测荧光强度的变化。发射波长620nm处的荧光强度的测试结果如表1所示。

表1荧光素衍生物对各生物相关分析物的荧光强度响应(a.u.)

结果表明，加入醌氧化还原酶后荧光强度显著增强，而其他分析物对荧光强度基本没有影响，证明荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)对醌氧化还原酶具有特异性响应，对其他生物分析物基本无响应。

2.线性关系

将本发明实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)对不同浓度的醌氧化还原酶响应研究，建立醌氧化还原酶浓度与荧光强度之间的线性关系。

使用荧光分光光度计，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。采用10mM PBS(pH＝7.4)缓冲液配制得到荧光素衍生物浓度为10μM，牛血清白蛋白(BSA)质量浓度为0.007％和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)浓度为100μM的检测溶液，分别向检测溶液中加入不同浓度的醌氧化还原酶(0.1-1μg/mL)，37℃反应12min后，观察其对各荧光素衍生物发光强度的影响。发射波长620nm处的荧光强度的测试结果如表2所示。

表2荧光素衍生物对不同浓度醌氧化还原酶的荧光响应强度(a.u)

试验结果证明，实施例1-实施例3制备的各荧光素衍生物发射强度与醌氧化还原酶浓度在0.1-1μg/mL之间具有良好的线性关系。其中，实施例1制备的DCF-ZZH-0荧光素衍生物的线性方程为y＝7271x+1113(R²＝0.9858)；实施例2制备的DCF-ZZH-1荧光素衍生物的线性方程为y＝5937x+1641(R²＝0.9969)；实施例3制备的DCF-ZZH荧光素衍生物的线性方程为y＝7637x+986(R²＝0.9911)。结果表明，本发明实施例制备的荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)可以实现对醌氧化还原酶的准确定量检测。

根据上述线性方程计算实施例1-3制备的各荧光素衍生物对醌氧化还原酶的检测限，实施例1制备的DCF-ZZH-0荧光素衍生物的检测限为21.27ng/mL，实施例2制备的DCF-ZZH-1荧光素衍生物的检测限为24.06ng/mL，实施例3制备的DCF-ZZH荧光素衍生物的检测限为18.16ng/mL。

3.细胞毒性试验

将本发明实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)进行细胞毒性实验。

采用MTT实验探究荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)在不同细胞系(A549，HUVEC，OVCAR-3，HeLa，MCF-7，HepG2，HL-60，L-02)中的细胞毒性。将对数生长期的细胞(8×10³cells/well)接种于96孔板中，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，去除培养基，分别将不同浓度的荧光素衍生物(2.5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)与各细胞共孵育24h后加入10μL MTT试剂(5mg/mL)和90μL培养基，继续在培养箱中孵育4h，去除培养基，每孔中加入100μL二甲基亚砜，震荡后通过酶标仪在490nm处测量OD值，计算细胞存活率(％)。测试结果如表3-5所示。

细胞存活率的计算公式为：

其中，A549，HUVEC，OVCAR-3，MCF-7，HepG2，HL-60，L-02细胞用RPMI-1640培养基，HeLa细胞用DMEM培养基。

表3DCF-ZZH-0不同浓度的细胞存活率(％)

表4DCF-ZZH-1不同浓度的细胞存活率(％)

表5DCF-ZZH不同浓度的细胞存活率(％)

试验结果证明，各细胞存活率均在85％以上，MTT实验表明荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)对上述细胞几乎无毒副作用，具有良好的生物相容性。

4.对肿瘤细胞与正常细胞的区分

将本发明实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)对肿瘤细胞与正常细胞的区分进行研究。

相比于正常细胞，醌氧化还原酶在肿瘤细胞中过表达。将各肿瘤细胞(A549，OVCAR-3，MCF-7，HeLa，HepG2)和正常细胞(HUVEC，L02)分别接种于六孔板中(2×10⁵cells/well)，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h后，去除培养基，然后分别向各六孔板中加入荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)(10μM)，共孵育30min后，用PBS缓冲液洗2-3次将剩余的荧光素衍生物洗掉，然后用荧光显微镜进行成像，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。图片分析用Image J软件处理，检测其荧光强度变化，结果如表6所示。

其中，A549，OVCAR-3，MCF-7，HepG2，L-02，HUVEC细胞用RPMI-1640培养基，HeLa细胞用DMEM培养基。

表6荧光素衍生物对各细胞荧光响应(a.u.)

试验结果证明，荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)在肿瘤细胞(A549，OVCAR-3，MCF-7，HeLa，HepG2)中荧光强度显著增强，这是由于肿瘤细胞中醌氧化还原酶高表达的结果；形成鲜明对比的是，在正常细胞(HUVEC，L02)中呈现出微弱荧光。结果表明荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)具有较好的肿瘤细胞靶向性，可以通过醌氧化还原酶的表达水平差异快速进行肿瘤细胞和正常细胞的区分，以及不同种类肿瘤细胞的区分，在肿瘤早期诊断方面具有巨大的潜力。

5.荧光成像

本发明实施例3制备的荧光素衍生物DCF-ZZH在活细胞中荧光成像；

将肿瘤A549细胞接种于六孔板中(2×10⁵cells/well)，培养基为RPMI-1640培养基，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，去除培养基，使用浓度为10μM的荧光素衍生物DCF-ZZH溶液与肿瘤A549细胞分别共孵育5min、10min、20min、40min，用PBS洗2-3次将剩余的荧光素衍生物洗掉，然后用荧光显微镜进行成像，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。荧光成像结果如图1所示。

从图中可以看出，在共孵育5min时无明显荧光(a)，共孵育10min时出现较弱荧光(b)，共孵育20min荧光显著增强(c)，共孵育40min时有较强荧光(d)。结果表明DCF-ZZH在短时间内(20min)即可对肿瘤A549细胞进行染色，具有较好的肿瘤细胞靶向性。

6.荧光素衍生物对醌氧化还原酶表达水平不同的肿瘤细胞荧光成像研究

将本发明实施例3制备的荧光素衍生物DCF-ZZH对醌氧化还原酶表达水平不同的肿瘤细胞荧光成像进行研究。

肿瘤OVCAR-3细胞是醌氧化还原酶高表达的细胞系(NQO1+)，肿瘤A549细胞是醌氧化还原酶极高表达的细胞系(NQO1++)。将肿瘤OVCAR-3细胞和肿瘤A549细胞分别接种于六孔板中(2×10⁵cells/well)，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，去除培养基，向各六孔板中分别加入荧光素衍生物DCF-ZZH(10μM)，共孵育30min后，用PBS洗2-3次将剩余的荧光素衍生物洗掉，然后用荧光显微镜进行成像，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。

将肿瘤A549细胞接种于六孔板中(2×10⁵cells/well)，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，去除培养基，向六孔板中加入双香豆素(50μM)预孵育20min，然后向各六孔板中分别加入荧光素衍生物DCF-ZZH(10μM)，共孵育30min，用PBS洗2-3次将剩余的荧光素衍生物洗掉，然后用荧光显微镜进行成像，激发波长为550nm，发射波长接收范围为580-660nm。并以不加双香豆素的细胞培养液作为正常组(Normal组)，荧光成像结果如图2所示。

其中，A549，OVCAR-3细胞用RPMI-1640培养基。

从图中可以看出，a-b为DCF-ZZH分别对肿瘤OVCAR-3细胞(NQO1+)和肿瘤A549细胞(NQO1++)的荧光成像；c-d为双香豆素(50μM)在肿瘤A549细胞内的抑制试验的荧光成像。可以看到，NQO1+的肿瘤OVCAR-3细胞可以观察到荧光(a)；NQO1++的肿瘤A549细胞与肿瘤OVCAR-3细胞相比，荧光强度明显增强(b)。与不加双香豆素的图c相比，利用双香豆素孵育肿瘤A549细胞，抑制其中的醌氧化还原酶后，几乎观察不到任何荧光(d)。该结果进一步表明荧光素衍生物DCF-ZZH的荧光增强来源于肿瘤细胞内的醌氧化还原酶，其较高的灵敏度可应用于肿瘤细胞荧光检测，区分不同种类的肿瘤细胞。

7.单线态氧(¹O₂)的产生能力

将实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)，以及3种实施例1-3制备的中间产物(DCF-LHF-0、DCF-LHF-1、DCF-LHF)的单线态氧(¹O₂)产生能力进行对比研究。

荧光素衍生物与醌氧化还原酶作用后的产物对应的即是实施例1-实施例3中步骤(2)制备的中间体产物(DCF-LHF-0、DCF-LHF-1和DCF-LHF)。

实验选用商业化光敏剂原卟啉(PpIX)、中间体产物(DCF-LHF-0、DCF-LHF-1和DCF-LHF)与荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)进行¹O₂生成速率对比，选用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为¹O₂良好的指示剂，当存在¹O₂时会使1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)氧化而消耗，从而使1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)在410nm处的吸收带减弱，因此可以通过检测410nm处的吸收强度变化来评价荧光素衍生物产生¹O₂的能力。

首先在无光照条件下将原卟啉(PpIX)、各中间体产物、各荧光素衍生物(10μM)分别与1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，50μM)共同溶解于乙腈(30mL)溶液中，磁力搅拌均匀后，用LED灯(波长590nm，辐照密度16mW/cm²)作为光源对溶液进行光照(1min)，整个光照中持续搅拌，完成后测定样品的紫外-可见吸收光谱，记录410nm处的吸收光度值。并以不加原卟啉(PpIX)、中间体产物、荧光素衍生物的溶液作为空白对照组(CTR组)。测试结果如表7所示。

表7各荧光素衍生物¹O₂生成速率(a.u.)

实验结果证明，单纯的荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH)产生¹O₂的能力较弱，其与醌氧化还原酶作用后的产物(DCF-LHF-0、DCF-LHF-1和DCF-LHF)具有良好的¹O₂产生能力，并且¹O₂产生能力高于商品化的¹O₂光敏剂原卟啉(PpIX)。这些结果表明其可作为优良的光动力学治疗的光敏剂，同时对正常细胞和组织几乎无毒副作用。

8.荧光素衍生物应用于光动力学治疗的研究

将实施例1-实施例3制备的3种荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1、DCF-ZZH)应用于光动力学治疗中研究其光动力学治疗效果。实验选用商品化光敏剂原卟啉(PpIX)与各荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1、DCF-ZZH)进行光动力学治疗效果对比。

将肿瘤A549细胞和正常HUVEC细胞接种于96孔板中(8×10³cells/well)，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，去除培养基，分别向96孔板中加入原卟啉(PpIX)和各荧光素衍生物(10μM)，共孵育24h，更换新鲜培养基，平衡1h后，用590nm LED灯(16mW/cm²)照射20min，每个孔中加入50μL MTT试剂(5mg/mL)，继续培养4h，小心弃去培养基，向每个孔中加入二甲基亚砜(100μL)将细胞溶解，震荡后通过酶标仪在490nm处测量OD值，计算细胞存活率。并以不加原卟啉(PpIX)和各荧光素衍生物的细胞培养液作为空白组(CTR组)。测试结果如表8所示。

其中，A549，HUVEC细胞用RPMI-1640培养基。

细胞存活率的计算公式为：

表8各细胞光动力治疗后的存活率

从表中可以看出，肿瘤A549细胞存活率显著降低，而正常细胞HUVEC存活率没有影响；荧光素衍生物(DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1、DCF-ZZH)和PpIX的细胞毒性水平几乎相同。结果进一步表明，荧光素衍生物DCF-ZZH-0、DCF-ZZH-1和DCF-ZZH具有优良的光动力学治疗效果，同时对正常细胞和组织几乎无毒副作用。

上述实施例4-8制备的荧光素衍生物4-8对醌氧化还原酶均具有较高的灵敏度(最低检测限可达20-50ng/mL)，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用(MTT细胞毒性实验，细胞存活率均达85％以上)，可作为优良的荧光探针应用于醌氧化还原酶的定性定量检测及生物学研究、肿瘤细胞荧光检测、不同种类肿瘤细胞的区分和肿瘤的靶向。但是，荧光素衍生物4-5均不具有作为光动力治疗的光敏剂的效果，荧光素衍生物6-8可作为光动力治疗的敏化剂(肿瘤细胞在光动治疗后，MTT细胞毒性实验，细胞存活率在20％以下)，可作为优良的荧光探针应用于肿瘤的靶向和光动力学治疗等。

综上所述，本发明提供的荧光素衍生物除对醌氧化还原酶具有优异的检测灵敏度和特异性之外，其与醌氧化还原酶作用后的产物还具有较好的单线态氧生成能力，且对正常细胞和组织几乎无毒副作用，因此，不仅可作为优良的荧光探针应用于醌还原氧化酶的定性定量检测及生物学研究、肿瘤细胞荧光检测和不同种类肿瘤细胞区分，还可以作为光动力治疗的光敏剂，从而提高光动力治疗效果，应用在多种肿瘤疾病的治疗中可实现诊疗一体化，具有较高的实际应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。