CN116947835B - 一种产生i型活性氧和近红外荧光的光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种产生i型活性氧和近红外荧光的光敏剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂及其制备方法和应用。本发明提供的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，具有式I所示结构。本发明提供的光敏剂，分子结构中存在D‑A相互作用，有利于光敏剂的吸收和发射波长发生红移，增加对生物组织的穿透深度，降低对生物组织的光损伤；同时，本发明提供的光敏剂具有明亮的近红外荧光，可以进行荧光成像，具有较强的活性氧产生能力。由实施例的结果表明，式I所示结构的光敏剂有望用作荧光介导的PDT抗癌。
Description
技术领域
本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。化疗、手术和放疗这些传统治疗方法的效果差、毒副作用大，给患者的身心带来了极大的痛苦，并且易复发。光动力疗法（PDT）具有无创性、低耐药性、局部治疗的优势，通过光对光敏剂的激发使其产生活性氧（ROS）来杀死癌细胞，选择性好、副作用小，因此在抗癌方面得到了广泛的关注。光动力治疗主要分为I型反应（Type I）和II型反应（Type II）两种机制。II型反应途径高度依赖于O2从而产生1O2，不适用于乏氧的实体肿瘤。基于产生I型ROS的反应途径具有低氧气浓度依赖特点，能够产生I型ROS的光敏剂是更有前途PDT抗癌光敏剂。
在多种癌症诊断技术中，近红外（near-infrared，NIR）荧光成像（fluorescenceimaging，FLI）由于具有微创、高灵敏度、高时空分辨率、高信噪比的特点以及毫米级的深层组织穿透能力而备受关注。其中，NIR有机发光材料因其结构明确、易于修饰和优异的生物相容性，是近红外荧光成像绝佳的候选者。因此，开发具有明亮的NIR荧光亮度和高效的Ⅰ型活性氧产生能力的光敏剂用于癌症治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂及其制备方法和应用，本发明提供的光敏剂能发出明亮的NIR荧光，且具有优异的ROS产生能力和光热产生能力，可对癌细胞进行高效的光动力光热协同杀伤，抗癌活性高，有望用于NIR荧光成像引导的I型光动力治疗。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，具有式I所示结构：
式I；
所述式I中：X为O、S、NH或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1~9的正整数；R1为：或/>，/>中的A为O、S或Se。
优选的，X为O或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1或2。
优选的，R1为：或/>。
优选的，具有式I-1、式I-2、式I-a1、式I-b1或式I-b2所示结构：
式I-1；
式I-2；
式I-a1；
式I-b1；
式I-b2。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、哌啶和有机溶剂混合进行第一脑文格反应，得到具有式I所示结构的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂；
式II，式II中的X为O、S、NH或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1~9的正整数；
R1-CHO 式III；式III中R1为：或/>，中的A为O、S或Se。
优选的，式II所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
（1）将式IV所示结构的化合物、式V所示结构的化合物和乙酸酐混合，进行第二脑文格反应，得到具有式VI所示结构的化合物；
式IV；/>式V；/>式VI，式V和式VI中的X为O、S或NH，得到的式VI所示结构的化合物为X为O、S或NH时的式II所示结构的化合物；
（2）当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-1所示结构的化合物和有机溶剂混合，进行第一取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物；R2-NH2 式VII-1，式VII-1中的R2为-CH2-(CH2)n-CH3，R2中的n为1~9的正整数；
（3）当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺、醋酸铜和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物；R3-NH2 式VII-2，式VII-2中的R3为-CH2-(CF2)n-CF3，R3中的n为1~9的正整数。
优选的，式III所示结构化合物中的R1为时，式III所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
将式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷、叔丁醇钠和有机溶剂混合进行第三取代反应，得到具有式Ⅸ所示结构的化合物；
式VIII；/>Ⅸ；式VIII和式Ⅸ中：A为O、S或Se；
将式Ⅸ所示结构的化合物、三氯氧磷和有机溶剂混合进行第四取代反应，得到R1为的式III所示结构的化合物。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在制备抗癌药物或制备抗肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在非治疗目的的癌细胞成像中的应用。
本发明提供了一种荧光探针水分散纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂、包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂水分散纳米颗粒。
本发明提供了一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，具有式I所示结构。本发明提供的光敏剂的分子结构中存在电子给体-电子受体(D-A)相互作用，其中R1基团为电子给体，有利于光敏剂的吸收和发射波长发生红移，增加对生物组织的穿透深度，降低对生物组织的光损伤；本发明提供的光敏剂因具有较强的D-A相互作用而具有较小的单重态-三重态能隙，有利于提升活性氧产生能力。由实施例的结果表明，式I-1、式I-2、式I-a1、式I-b1或式I-b2所示结构的光敏剂有明亮的NIR荧光、高效的活性氧产生能力，表明本发明提供的光敏剂有望用作荧光介导的PDT治疗。而且，将本发明提供的光敏剂包覆成纳米粒子后，光诊疗剂表现出大斯托克斯位移，能够有效避免自吸收，降低荧光成像中背景的噪声；位于近红外区域的光谱，利于穿透深层次的生物组织，降低对生物组织的光损伤；同时，本发明提供的光诊疗剂还具有自由基型活性氧与光热产生能力，能够在激光照射下产生自由基型活性氧与热，可用于缺氧条件下的光动力/光热协同作用杀伤癌细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂的制备方法，本发明提供的制备方法步骤少，容易操作，适宜工业生产。
附图说明
图1为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy在DMSO溶液中的吸收光谱；
图2为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy在DMSO溶液中的荧光光谱；
图3为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy与总ROS捕获剂DCFH-DA混合溶液在530 nm处的荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
图4为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy与超氧阴离子（O2 •-）捕获剂DHR 123混合溶液在525 nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
图5为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy与单线态氧（1O2）捕获剂ABDA混合溶液在378nm处的实时吸光度与初始吸光度比随光照时间的变化曲线；
图6为本发明实施例1和实施例4中化合物3的合成路线图；
图7为本发明实施例1中化合物4的合成路线图；
图8为本发明实施例1中2TPA-HPy的合成路线图；
图9为本发明实施例2中化合物6的合成路线图；
图10为本发明实施例2中2TPA-FPy的合成路线图；
图11为本发明实施例3和实施例5中化合物10的合成路线图；
图12为本发明实施例3中2DSP-FPy的合成路线图；
图13为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的透射电子显微镜（TEM）图；
图14为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的紫外吸收图；
图15为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的荧光发射图；
图16为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中与活性氧捕获剂DCFH-DA混合溶液在660 nm激光照射下（光功率：0.1 W/cm2）位于528 nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
图17为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中与过氧化氢捕获剂DHR 123混合溶液在660 nm激光照射下（光功率：0.1 W/cm2）位于525 nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
图18为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中与单线态氧捕获剂ABDA混合溶液在660 nm激光照射下（光功率：0.1 W/cm2）位于378 nm处的实时吸光度与初始吸光度比随光照时间的变化曲线；
图19为2TPA-PTCF NPs（摩尔浓度：100 µM）在660 nm激光照射下的光热性能及其光热转换效率计算（光功率：0.4 W/cm2）；
图20为2TPA-PTCF NPs在5次660 nm激光开启/关闭循环中的升温情况（光功率：0.4 W/cm2）；
图21为2DSP-PTCF NPs（摩尔浓度：100 µM）在660 nm激光照射下的光热性能及其光热转换效率计算（光功率：0.4 W/cm2）；
图22为2DSP-PTCF NPs在5次660 nm激光开启/关闭循环中的升温情况；
图23为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs对HeLa细胞的荧光成像和流式细胞仪结果；
图24为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs对4T1细胞的荧光成像和流式细胞仪结果；
图25为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs对MCF-7细胞的荧光成像和流式细胞仪结果；
图26为2DSP-PTCF NPs和2TPA-PTCF NPs对HeLa细胞进行光动力/光热协同杀伤分析测试；
图27为本发明实施例4中2TPA-PTCF的合成路线图；
图28为本发明实施例5中2DSP-PTCF的合成路线图。
具体实施方式
本发明提供了一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，具有式I所示结构：
式I；
所述式I中：X为O、S、NH或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1~9的正整数；R1为：或/>，/>中的A为O、S或Se。
在本发明中，式I中X为NR时，所述产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂具有式I-a或式I-b所示结构：
式I-a；
式I-b。
在本发明中，式I-a或式I-b中的给体为R1。
在本发明中，式I中的X优选为O或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1或2。
在本发明中，n为1~9的正整数，具体优选为1、2、3、4、5、6、7、8或9，最优选为2。
在本发明中，R1优选为：或/>。
在本发明中，所述产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂具体优选为具有式I-1、式I-2、式I-a1、式I-b1或式I-b2所示结构：
式I-1；
式I-2；
式I-a1；
式I-b1；
式I-b2。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、哌啶和有机溶剂（以下称为第一有机溶剂）混合（以下称为第一混合）进行第一脑文格反应，得到具有式I所示结构的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂；
式II，式II中的X为O、S、NH或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1~9的正整数；
R1-CHO 式III；式III中R1为：或/>，中的A为O、S或Se。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明中，式II所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
（1）将式IV所示结构的化合物、式V所示结构的化合物和乙酸酐混合（以下称为第二混合），进行第二脑文格反应，得到具有式VI所示结构的化合物；
式IV；/>式V；/>式VI，式V和式VI中的X为O、S或NH，得到的式VI所示结构的化合物为X为O、S或NH时的式II所示结构的化合物；
（2）当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-1所示结构的化合物和有机溶剂（以下称为第二有机溶剂）混合以下称为第三混合），进行第一取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物；R2-NH2 式VII-1，式VII-1中的R2为-CH2-(CH2)n-CH3，R2中的n为1~9的正整数；
（3）当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺、醋酸铜和有机溶剂（以下称为第三有机溶剂）混合（以下称为第四混合），进行第二取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物；R3-NH2 式VII-2，式VII-2中的R3为-CH2-(CF2)n-CF3，R3中的n为1~9的正整数。
本发明将式IV所示结构的化合物、式V所示结构的化合物和乙酸酐第二混合，进行第二脑文格（Knoevenagel）反应，得到具有式VI所示结构的化合物；
式IV；/>式V；/>式VI，式V和式VI中的X为O、S或NH，得到的式VI所示结构的化合物为X为O、S或NH时的式II所示结构的化合物。在本发明中，式IV所示结构化合物与式V所示结构化合物反应的摩尔比优选为1:5。本发明对所述乙酸酐的用量没有特殊要求，确保所述第二脑文格反应顺利进行即可。所述第二混合优选为：将式IV所示结构的化合物和式V所示结构的化合物溶解于乙酸酐中。所述第二脑文格反应的温度优选为140 ℃；所述第二脑文格反应的时间优选为12 h。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第二脑文格反应进行监控，直至所述式IV所示结构的化合物完全消失，第二脑文格反应结束，得到第二脑文格反应液。本发明优选对所述第二脑文格反应液进行后处理，得到式VI所示结构的化合物。所述后处理优选包括以下步骤：将第二脑文格反应液浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到式VI所示结构的化合物。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为石油醚和二氯甲烷（DCM），所述石油醚和二氯甲烷的体积比优选为1:3。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
得到X为O的的式VI所示结构的化合物后，当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3时，本发明将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-1所示结构的化合物和第二有机溶剂第三混合，进行第一取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物；R2-NH2 式VII-1，式VII-1中的R2为-CH2-(CH2)n-CH3，R2中的n为1~9的正整数。在本发明中，所述式VII-1中：R2中的n优选为2。式VII-1所示结构的化合物具体优选为CH3-CH2-CH2-CH2-NH2。第二有机溶剂具体优选为甲苯。式VI所示结构的化合物和式VII-1所示结构的化合物的摩尔比优为1:1.5。本发明对所述第二有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述第一取代反应顺利进行即可。所述第三混合优选为：将式VI所示结构的化合物和式VII-1所示结构的化合物溶解于第二有机溶剂中。所述第一取代反应的温度优选为110 ℃；所述第一取代反应的时间优选为12 h。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第一取代反应进行监控，直至所述式VI所示结构的化合物完全消失，第一取代反应结束，得到第一取代反应液。本发明优选对所述第一取代反应液进行后处理，得到R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物。所述后处理优选包括以下步骤：将第一取代反应液浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为二氯甲烷（DCM）和甲醇（MeOH），所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为100:1。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
在本发明中，R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物具体优选为：。
得到X为O的式VI所示结构的化合物后，当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3时，本发明将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺、醋酸铜和第三有机溶剂第四混合，进行第二取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物；R3-NH2 式VII-2，式VII-2中的R3为-CH2-(CF2)n-CF3，R3中的n为1~9的正整数。在本发明中，式VII-2中：R3中的n优选为2，式VII-2所示结构的化合物具体优选为CF3-CF2-CF2-CH2-NH2。第三有机溶剂优选为乙腈。所述式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺和醋酸铜的摩尔比优选为1:2:3:1。本发明对所述第三有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述第二取代反应顺利进行即可。所述第四混合优选为：将式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺、醋酸铜溶剂于第三有机溶剂中。所述第二取代反应的温度优选为110 ℃；所述第一取代反应的时间优选为12 h。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第二取代反应进行监控，直至所述式VI所示结构的化合物完全消失，第二取代反应结束，得到第二取代反应液。本发明优选对所述第二取代反应液进行后处理，得到R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物。所述后处理优选包括以下步骤：将第二取代反应液浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为二氯甲烷（DCM）和甲醇（MeOH），所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为300:1。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
在本发明中，R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物具体优选为：。
在本发明中，式III所示结构化合物中的R1为时，式III所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
将式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷、叔丁醇钠和有机溶剂（以下称为第三有机溶剂）混合（以下称为第四混合）进行第三取代反应，得到具有式Ⅸ所示结构的化合物；
式VIII；/>Ⅸ；式VIII和式Ⅸ中：A为O、S或Se；
将式Ⅸ所示结构的化合物、三氯氧磷和有机溶剂（以下称为第四有机溶剂）混合（以下称为第五混合）进行第四取代反应，得到具有式III所示结构的化合物。
本发明将式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷、叔丁醇钠和第三有机溶剂第四混合进行第三取代反应，得到具有式Ⅸ所示结构的化合物。在本发明中，式VIII和式Ⅸ中：X优选为S。所述第三有机溶剂优选为甲苯，具体优选为无水无氧甲苯。所述式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷和叔丁醇钠的摩尔比优选为1.2:1:0.03:1.2:1.2。本发明对所述第三有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述第三取代反应顺利进行即可。所述第四混合优选为：将式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷溶解于部分第三有机溶剂中，得到第一混合液；将所述叔丁醇钠溶解于剩余第三有机溶剂中，得到第二混合液；将所述第一混合液和第二混合液搅拌混合，所述搅拌混合在氮气保护条件下进行，所述搅拌混合的温度优选为室温，时间优选为30min。所述第三取代反应的温度优选为110 ℃；所述第三取代的时间为优选15h。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第三取代反应进行监控，直至所述二苯胺完全消失，第三取代反应结束，得到第三取代反应液。本发明优选对所述第三取代反应液进行后处理，得到式Ⅸ所示结构的化合物。所述后处理优选包括以下步骤：将第三取代反应液浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到式Ⅸ所示结构的化合物。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为石油醚（PE）和乙酸乙酯（EA），所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为10:1。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
在本发明中，式VIII所示结构的化合物具体为。
在本发明中，式Ⅸ所示结构的化合物具体为。
得到式Ⅸ所示结构的化合物后，本发明将式Ⅸ所示结构的化合物、三氯氧磷和第四有机溶剂第五混合进行第四取代反应，得到R1为的具有式III所示结构的化合物。在本发明中，所述第四有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。所述式Ⅸ所示结构的化合物与三氯氧磷的摩尔比优选为1:1.1。本发明对所述第四有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述第四取代反应顺利进行即可。所述第五混合优选为：将式Ⅸ所示结构的化合物和三氯氧磷溶解于第四有机溶剂中。所述第四取代反应的温度优选为室温；所述第四取代的时间优选为10 h。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第四取代反应进行监控，直至所述式Ⅸ所示结构的化合物完全消失，第四取代反应结束，得到第四取代反应液。本发明优选对所述第四取代反应液进行后处理，得到式III所示结构的化合物。所述后处理优选包括以下步骤：将第四取代反应液、二氯甲烷和水混合进行萃取，得到二氯甲烷相；将所述二氯甲烷相浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到式III所示结构的化合物。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为50:1。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
在本发明中，R1为的式III所示结构的化合物具体为/>。
在本发明中，式III所示结构的化合物具体优选为或。
在本发明中，式II所示结构的化合物具体优选为、或/>。
在本发明中，所述第一有机溶剂优选为乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，所述乙醇和二氯甲烷的体积比优选为5:1。式III所示结构的化合物、式II所示结构的化合物和哌啶的摩尔比优选为1:2.1:1。本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述脑文格反应顺利进行即可。所述第一混合优选为：将式III所示结构的化合物、式II所示结构的化合物和哌啶溶解于第一有机溶剂中。在本发明中，所述第一脑文格反应的温度优选为80℃。所述第一脑文格反应的时间优选为15 h。所述第一脑文格反应优选在保护气体氛围下进行，所述保护气体氛围优选为氮气或氩气，更优选为氮气。本发明优选使用TLC板（即薄层色谱点板）对所述第一脑文格反应进行监控，直至式II所示结构的化合物完全消失，所述第一脑文格反应结束，得到第一脑文格反应液。本发明对所述第一脑文格反应液进行后处理，得到具有式I所示结构的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：将所述第一脑文格反应液浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到纯化反应物；将所述纯化反应物、二氯甲烷和正己烷混合进行重结晶，固液分离后，得到具有式I所示结构的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂。本发明对所述浓缩的具体实施方式没有特殊限定，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。所述柱层析使用的洗脱剂优选为石油醚和二氯甲烷，所述石油醚和二氯甲烷的体积比优选为1：（3~5），具体优选为1:5、1:4或1:3。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1:10。所述重结晶的温度优选为室温。所述固液分离优选为过滤。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在制备抗癌药物或制备抗肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在非治疗目的的癌细胞成像中的应用。
本发明提供了一种荧光探针水分散纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂、包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂水分散纳米颗粒。
本发明将上述技术方案所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂、包覆剂和有机溶剂（以下称为第五有机溶剂）混合，得到混合液。在本发明中，产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂具体优选为式I-1所示结构或式I-2所示结构。所述包覆剂优选为甲氧基聚乙二醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-羧酸、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-叠氮、二硬酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和泊洛沙姆F127中的一种或多种。所述第五有机溶剂优选为四氢呋喃（THF）。所述同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂与包覆剂的质量比优选为1:5~10，更优选为1:5~6。本发明第所述第四有机溶剂的用量没有特殊要求，确保所述同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂和包覆剂混合均匀即可。
得到混合液后，本发明将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂水分散纳米颗粒。在本发明中，所述混合优选为将所述混合液滴加至所述水中。所述超声共沉淀的超声功率优选为100~300 W，更优选为150 W，超声时间优选为2~10 min，更优选为5 min。
在本发明中，所述荧光探针水分散纳米颗粒的粒径优选为90~120 nm，更优选为100~120 nm。本发明将产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂制备成水分散纳米颗粒，有利于对癌细胞进行近红外荧光成像。
本发明提供的光敏剂分子中存在强给体（D）-受体（A）相互作用，将其包覆成纳米粒子后，光敏剂表现出大斯托克斯位移，能够有效避免自吸收，降低荧光成像中背景的噪声；位于近红外（NIR）区域的光谱，利于穿透深层次的生物组织，降低对生物组织的光损伤；同时，本发明提供的光敏剂还具有自由基型活性氧与光热产生能力，能够在激光照射下产生自由基型活性氧与热，可用于缺氧条件下的光动力/光热协同作用杀伤癌细胞。
下面结合实施例对本发明提供的同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照图6所述的合成路线制备化合物3：
将化合物1（199.2 mg，1 mmol）、化合物2（620.7 mg，5 mmol）溶于乙酸酐中得到混合液。将混合液在140 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物1完全消失，将反应完全的反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:3（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂进行重结晶，得到绿色固体产物，产率：90%；
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3)：δ 6.67 (s, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.20 (s, 1H),2.41 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.55 (s, 6H)；13C NMR (126 MHz, CDCl3)：δ 178.85,173.99, 163.74, 162.81, 150.95, 150.87, 113.81, 113.24, 113.18, 113.04,111.38, 97.67, 97.61, 97.05, 97.03, 51.38, 51.26, 26.45, 20.50, 19.91；HRMS [M+Na]+ calcd 328.1062, found 328.1061.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备得到化合物3。
按照图7所述的合成路线图制备化合物4：
将化合物3（305.3 mg，1 mmol）、CH3-CH2-CH2-CH2-NH2（109.7 mg，1.5 mmol）溶于甲苯中得到混合液。将混合液在110 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物3完全消失，将反应液浓缩，以二氯甲烷（DCM）:甲醇（MeOH）=100:1（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂进行重结晶，得到橙色固体产物，产率：98%；
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3)：δ 7.37 (s, 2H), 5.55 (s, 1H), 4.31- 4.28 (m,2H), 2.74 (s, 6H), 1.81 (dt, J = 15.8, 8.7 Hz, 2H), 1.54 (s, 6H), 1.41 - 1.30(m, 2H), 1.06 (t, J = 7.3 Hz, 3H)；HRMS [M+Na]+ calcd 383.1848, found383.1851.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备得到化合物4。
按照图8所述的合成路线图制备式I-a1所示结构化合物：
将化合物4（360.5 mg，1 mmol）、化合物5（574.0 mg，2.1 mmol）、哌啶（85.2 mg，1.0 mmol）溶于乙醇/二氯甲烷（5：1=v:v）混合液中。将混合液在80 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物4完全消失，将反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:5（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到蓝紫固体产物，产率：38%；
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.68 (d, J = 15.5 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.6Hz, 4H), 7.32 (dd, J = 18.6, 10.7 Hz, 10H), 7.12 (dd, J = 18.7, 7.7 Hz, 11H),7.04 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.83 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 5.24 (s, 1H), 4.21 -4.11 (m, 2H), 1.91 - 1.88 (m, 2H), 1.51 (s, 6H), 1.05 (t, J = 7.3 Hz, 3H),0.88 (t, J = 6.6 Hz, 1H); HRMS [M+Na]+ calcd 893.3949, found 893.3951.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备的产生I型活性氧和明亮近红外荧光的光敏剂的结构式如式I-a1所示，记为2TPA-HPy。
实施例2
按照图9所述的合成路线图制备化合物6：
将化合物3（305.3 mg，1 mmol）、CF3-CF2-CF2-CH2-NH2（398.1 mg，2.0 mmol）、三乙胺（303.6 mg, 3 mmol）、醋酸铜（181.6 mg, 1 mmol）溶于乙腈中得到混合液。将混合液在110 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物3完全消失，将反应液浓缩，以二氯甲烷（DCM）:甲醇（MeOH）=300:1（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到粉色固体产物，产率：25%；
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3)：δ 7.36 (s, 2H), 5.57 (s, 1H), 5.31 (t, J =15.7 Hz, 2H), 2.70 (s, 6H), 1.56 (s, 6H)；HRMS [M+Na]+ calcd 509.1188, found509.11190.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备得到化合物6。
按照图10所述的合成路线图制备式I-b1所示结构化合物：
将化合物6（486.4 mg，1 mmol）、化合物5（574.0 mg，2.1 mmol）和哌啶（85.2 mg，1.0 mmol）溶于乙醇/二氯甲烷（5：1=v:v）混合液中。将混合液在80 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物6完全消失，将反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:4（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到蓝色固体产物，产率：17%；
对所得固体进行表征，具体数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.71 (d, J = 16.2 Hz, 3H), 7.33 (dt, J =12.7, 8.6 Hz, 13H), 7.13 (dd, J = 13.2, 7.5 Hz, 10H), 7.02 (t, J = 13.8, 4H),6.83 (d, J = 21.7 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 15.5 Hz, 2H), 5.29 (s, 1H), 3.59 (s,2H), 1.54 (s, 6H); HRMS [M+Na]+ calcd 1019.3284, found 1019.3300.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备的产生I型活性氧和明亮近红外荧光的光敏剂的结构式如式I-b1所示，记为2TPA-FPy。
实施例3
按照图11所述的合成路线图制备化合物10：
将化合物7（195.6 mg，1.2 mmol）、二苯胺（化合物8，169.2 mg, 1 mmol）、Pd(dba)3（28 mg, 0.03 mmol）、(t-Bu)3PHBF4（1.18 g, 1.2 mmol）溶于无水无氧的甲苯中得到混合液，加入无水无氧的甲苯溶解的叔丁醇钠（115.3 mg, 1.2 mmol）后，氮气保护下室温搅拌30 min。将混合液在110 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至二苯胺完全消失，将反应液浓缩，以石油醚（PE）:乙酸乙酯（EA）=10:1（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到白色固体产物9，产率：95%；将化合物9（251.3 mg，1 mmol）、三氯氧磷（168.7 mg, 1.1 mmol）溶于无水无氧的DMF中得到混合液。将混合液在室温条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至式化合物9完全消失，将反应液用二氯甲烷和水萃取后，得到二氯甲烷相浓缩，以石油醚（PE）:乙酸乙酯（EA）=50:1（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到黄色固体产物，产率：92%。
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3)：δ 9.61 (s, 1H), 7.46 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.37(t, J = 8.2 Hz, 4H), 7.28 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 6.39(d, J = 4.3 Hz, 1H)。
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备得到化合物10。
按照图12所述的合成路线图制备式I-b2所示结构化合物：
将化合物6（486.4 mg，1 mmol）、化合物10（586.6 mg, 2.1 mmol）和哌啶（85.2mg，1.0 mmol）溶于乙醇/二氯甲烷（5：1=v:v）混合液中。将混合液在80 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物6完全消失，将反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:3（v:v）为洗脱剂进行柱层析，用二氯甲烷:正己烷=1:10（v:v）的混合溶剂重结晶，得到深蓝色固体产物，产率：24%；
对所得固体进行表征，具体数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.77 (d, J = 14.2 Hz, 3H), 7.34 (t, J = 7.3Hz, 9H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 9H), 7.18 (t, J = 7.0 Hz, 5H), 7.08 (s, 3H),6.66 (d, J = 21.4 Hz, 2H), 6.41 (s, 2H), 6.00 (d, J = 14.7 Hz, 2H), 3.68 (s,1H), 1.53 (s, 6H); HRMS [M+Na]+ calcd 1009.2593, found 1009.2603.
根据上述核磁表征数据可知，本实施例制备的产生I型活性氧和明亮近红外荧光的光敏剂的结构式如式I-b2所示，记为2DSP-HPy。
性能测试：
（1）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy紫外吸收光谱测试，具体步骤如下：
将浓度为1 mM的2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的DMSO母液配置成终浓度为10 μM的DMSO溶液，放于紫外可见吸收光谱仪进行吸收光谱的采集。结果如图1所示。
从图1可以看出2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的最大吸收波长分别为515 nm、565nm、579 nm。
（2）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的荧光光谱测试，具体步骤如下：
将浓度为1 mM的2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的DMSO母液配置成终浓度为10 μM的DMSO溶液，放于荧光光谱仪进行荧光发射光谱的采集。结果如图2所示。
从图2可以看出2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的最大发射波长分别为632 nm、671nm、705 nm。
（3）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的绝对荧光量子产率，具体步骤如下：
将2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy配置成终浓度为10 μM的甲苯/DMSO混合溶液（甲苯体积分数（fT）为80%），放于绝对荧光量子产率仪器测试绝对荧光量子产率。结果如表1所示。
表1 2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy在甲苯体积分数为80%时的荧光量子产率。
从表1可以看出2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy在fT=80%的甲苯/DMSO混合溶液中的绝对荧光量子产率分别为3.8%，1.1%，3.1%。
（4）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的ROS产生能力测试，具体步骤如下：
利用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）为ROS捕获剂，检测光敏剂产生ROS的效率。首先需要用无水乙醇配置浓度为1 mM的DCFH-DA母液，吸取500 µL的DCFH-DA的无水乙醇母液于NaOH溶液中（2 mL、10 mM），混合均匀，避光条件下保存30 min以活化DCFH-DA得到二氯荧光素（DCFH）溶液。最后将DCFH溶液加入到10 mL PBS缓冲溶液（pH=7.4、25 mM）中，混合均匀后得到终浓度为40 µM的DCFH溶液。在含有一定浓度光敏剂的2 mL比色皿中加入50 µL的DCFH溶液，用CEL-PE300L-3A太阳能模拟器白光光照，此为实验组。利用荧光光谱仪收集光照时间从0 s开始，一定时间间隔的荧光光谱（激发波长为489 nm，发射波长范围：500-600 nm），将只加DCFH后光照组做为空白对照组，结果如图3所示。
图3为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy与ROS捕获剂DCFH混合溶液在530 nm处的荧光强度比随光照时间的变化情况。从图3可以看出，随着光照时间的延长，空白DCFH组荧光强度比无明显变化，但有实施例1-3的光敏剂存在时，DCFH的荧光强度比上升明显，说明2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy具有ROS产生能力。
（5）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的超氧阴离子（O2 •-）产生能力测试，具体步骤如下：
以二氢罗丹明123（DHR 123）作为指示剂检测溶液中的O2 •-。当系统中产生O2 •-时，DHR 123将被氧化并在525 nm处发出强荧光。将1 μL APF （5 mM）和10 μL光敏剂（1 mM）加入PBS中混合，使最终体积为2 mL。将均匀混合后的溶液暴露于白光（100 mW/cm2）中，在荧光光谱仪（490 nm激发）中每隔10 s测试APF的荧光强度。结果如图4所示。
图4为2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy在水中与超氧阴离子捕获剂DHR 123混合溶液在525 nm处荧光值随光照时间的变化情况。当溶液中存在实施例1-3的光敏剂并暴露于太阳能模拟器白光光照下，DHR 123探针的荧光信号大幅提升，这表明光敏剂具有O2 •-产生能力。
（6）2TPA-HPy、2TPA-FPy、2DSP-FPy的单线态氧（1O2）产生能力测试，具体步骤如下：
以9,10-蒽基-双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）作为指示剂检测溶液中的1O2。一旦溶液中有1O2产生，ABDA会立刻捕获溶液中的1O2，反应生成一种内源性的氧化产物，导致ABDA位于342, 359, 378和400 nm的四个特征吸收峰的吸光度下降。选用孟加拉玫瑰红（RB）为对照，其在水溶液中的1O2量子产率为0.60。将20 μL ABDA（2 mM）和1 μL光敏剂（1 mM）加入PBS中混合，使最终体积为2 mL。对照组为20 μL ABDA加入PBS中测试。将均匀混合后的溶液暴露于白光（100 mW/cm2）中，在紫外可见分光光度计中每隔10 s记录混合溶液吸收值的变化，结果如图5所示。
从图5中可以看出，在本发明实施例1-3光敏剂存在条件下，随着光照时间的延长，ABDA的吸收值下降不明显，与空白组类似。而对照组（RB）的ABDA吸收值下降明显，说明本发明实施例1-3制备的光敏剂不具有1O2产生能力。进一步说明，这些光敏剂产生的活性氧为对氧气依赖程度更低的活性氧自由基，有利于提高乏氧环境下的抗癌效果。
由以上实施例1~3可知，本发明提供的产生I型活性氧和明亮近红外荧光的光敏剂合成步骤简单，分离纯化操作简便，可用于构建近红外荧光介导的PDT抗癌药物。
实施例4
按照图6所述的合成路线图合成化合物3，具体合成方法与实施例1相同。
按照图27所述的合成路线图合成式I-1所示结构的化合物：
将化合物3（305.3 mg，1 mmol）、化合物5（546.7 mg, 2 mmol）和哌啶（85.2 mg，1mmol）溶于乙醇/二氯甲烷（5：1=v/v）混合液中。将混合液在65 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物3完全消失，将反应完全的反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:3（v:v）为洗脱剂进行柱层析得到纯化反应液，然后将纯化反应液与二氯甲烷:正己烷=1:6（v:v）的混合溶剂混合进行重结晶，得到蓝黑色粉末，产率：29%，记为2TPA-PTCF。
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J = 15.4 Hz, -1H), 7.42 (d, J = 8.5Hz, 2H), 7.31 (t, J = 8.0 Hz, 5H), 7.13 (dd, J = 18.0, 7.9 Hz, 10H), 7.03 (d,J = 8.4 Hz, 5H), 6.67 (s, 4H), 5.29 (s, 1H), 1.57 (s, 6H). 13C NMR (151 MHz,CDCl3) δ 178.80, 171.52, 150.33, 150.10, 146.75, 129.60, 127.74, 125.62,124.36, 99.48, 96.44, 50.83, 26.72；HRMS [M+H]+ calcd 816.3339, found816.3339.
根据上述表征数据可知得到的同时具有近红外荧光成像和I型光动力/光热协同杀伤癌细胞能力的光诊疗剂2TPA-PTCF为如式I-1所示结构。
为了使2TPA-PTCF能够被应用于生物环境水体系，本实施例以2TPA-PTCF颗粒为光诊疗剂，以两亲性共聚物DSPE-PEG2000为包覆基质，采用超声的方法制备改性光诊疗纳米颗粒水水分散液。制备步骤如下：
将2TPA-PTCF和DSPE-PEG2000（2TPA-PTCF和DSPE-PEG2000质量比为1:5）分散溶解在THF中，得到混合溶液，混合溶液中，2TPA-PTCF的质量浓度为0.2 mg/mL，DSPE-PEG2000的质量浓度为0.5mg/mL；在超声条件（超声功率为150 W）下向水中迅速滴加所得混合溶液，滴加完毕后继续超声混合5min，得到改性的2TPA-PTCF纳米颗粒（记为2TPA-PTCF NPs）的水分散液。
实施例5
按照图11所述的合成路线图合成化合物10，具体制备方法与实施例3相同。
按照图28所述的合成路线图制备式I-2：
将化合物3 (305.3 mg, 1 mmol)和化合物10（558.7 mg, 2 mmol）和哌啶（85.2mg，1 mmol）溶于乙醇/二氯甲烷（5：1=v/v）混合液中。将混合液在65 ℃条件下反应过夜，用TLC板监控反应进程直至化合物3完全消失，将反应完全的反应液浓缩，以石油醚（PE）:二氯甲烷（DCM）=1:5（v:v）为洗脱剂进行柱层析得到纯化反应液，然后将纯化反应液与二氯甲烷:正己烷=1:6（v:v）的混合溶剂混合进行重结晶，得到黑绿色粉末，产率：21%，记为2DSP-PTCF。
对本实施例所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.62 - 7.42 (m, 3H), 7.35 (m, 9H), 7.26 (d,J = 14.1 Hz, 9H), 7.19 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 7.09 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 6.43(d, J = 3.9 Hz, 2H), 6.13 (d, J = 15.2 Hz, 2H), 5.18 (s, 1H), 1.51 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 178.92, 170.35, 159.37, 157.61, 150.24, 146.55,145.13, 132.96, 131.28, 131.20, 129.70, 127.49, 125.83, 125.37, 124.76,114.60, 114.39, 113.96, 113.40, 112.00, 107.03, 99.17, 96.10, 83.91, 58.48,49.51, 26.80, 26.64, 18.46；HRMS [M+H]+ calcd 828.2467, found 828.2454.
根据上述表征数据可知得到的同时具有近红外荧光成像和I型光动力/光热协同杀伤癌细胞能力的光诊疗剂2DSP-PTCF如式I-2所示结构。
为了使2DSP-PTCF能够被应用于生物环境水体系，本实施例以2DSP-PTCF颗粒为光诊疗剂，以两亲性共聚物DSPE-PEG2000为包覆基质，采用超声的方法制备改性光诊疗纳米颗粒水水分散液。制备步骤如下：
将2DSP-PTCF和DSPE-PEG2000（2DSP-PTCF和DSPE-PEG2000质量比为1:5）分散溶解在THF中，得到混合溶液，混合溶液中，2DSP-PTCF的质量浓度为0.2 mg/mL，DSPE-PEG2000的质量浓度为0.5mg/mL；在超声条件（超声功率为150 W）下向水中迅速滴加所得混合溶液，滴加完毕后继续超声混合5min，得到改性的2DSP-PTCF纳米颗粒（记为2DSP-PTCF NPs）的水分散液。
性能测试：
（1）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的透射电子显微镜测试：将2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的水溶液预先滴到铜网里，待干燥后将铜网放于透射电子显微镜上样杆中并插入仪器样品仓，进行电子显微成像。结果如图13所示。
图13为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的透射电子显微镜（TEM）图。其中，图13中的A为2TPA-PTCF NPs的TEM图，图13中的B为2DSP-PTCF NPs的TEM图。从图1可以看出，2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs具有均匀的球形形态，其平均直径分别为114 nm和105 nm。
（2）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的紫外吸收光谱测试，具体步骤如下：
将2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的水溶液分别配置成10 μM的测试浓度，放于紫外分光光度计进行紫外吸收光谱的采集。归一化的结果如图14所示。
图14为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的紫外吸收图；从图14可以看出，2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的最大吸收波长分别位于639 nm和667 nm。
（3）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的荧光光谱测试，具体步骤如下：
将2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的水溶液分别配置成10 μM的测试浓度，放于荧光光谱仪分别用653、699 nm激发，采集荧光发射光谱。归一化的结果如图15所示。
图15为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的荧光发射图；由图15可以看出，2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水相中的最大发射波长均位于950 nm。
（4）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的总活性氧产生能力测试，具体步骤如下：
利用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）为总ROS捕获剂，检测改性光诊疗剂纳米颗粒2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs产生总ROS的效率。首先需要用无水乙醇配置浓度为1 mM的DCFH-DA母液，吸取500 µL的DCFH-DA的无水乙醇母液于NaOH溶液中（2 mL、10mM），混合均匀，避光条件下保存30 min以活化DCFH-DA得到二氯荧光素（DCFH）溶液。最后将DCFH溶液加入到10 mL PBS缓冲溶液（pH=7.4、25 mM）中，混合均匀后得到终浓度为40 µM的DCFH溶液。在含有一定浓度光敏剂的2 mL比色皿中加入50 µL的DCFH溶液，用660 nm激光器光照，此为实验组。利用荧光光谱仪收集光照时间从0 s开始，每间隔10 s记录荧光光谱变化（激发波长为490 nm，发射波长范围：500-600 nm），将只加DCFH后光照组做为空白对照组。
图16为2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs与总ROS捕获剂DCFH-DA混合溶液在528nm处的荧光值随光照时间的变化情况。由图16可以看出，仅DCFH存在时，溶液的信号强度在660 nm激光照射200 s后显示出可忽略不计的变化。相比之下，溶液的荧光信号强度在2TPA-PTCF NPs或2DSP-PTCF NPs存在时逐渐增加，说明2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs具有优异的ROS生产能力。
（5）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的过氧化氢（H2O2）产生能力测试，具体步骤如下：
以二氢罗丹明123（DHR 123）作为指示剂检测溶液中的H2O2。当系统中产生H2O2时，DHR 123将被氧化并在525 nm处发出强荧光。将10 µM 2TPA-PTCF NPs或2DSP-PTCF NPs溶解在含有5 μL DHR 123（浓度：1 mM）的2 mL PBS 中。然后将混合物置于比色皿中并用660nm激光(0.1 W/cm2)照射。用荧光分光光度计（激发波长：480 nm）记录样品在525 nm处的荧光变化。结果如图17所示。
图17为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水中与过氧化氢捕获剂DHR 123混合溶液在525 nm处荧光值随光照时间的变化情况。当溶液在这两种纳米颗粒存在下暴露于660nm 激光照射时，DHR 123探针的荧光信号大幅提升，这表明纳米颗粒具有过氧化氢产生能力。
（6）2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs的单线态氧（1O2）产生能力测试，具体步骤如下：
以采用9,10-蒽基-双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）作为指示剂检测溶液中的1O2。当系统中产生1O2时，ABDA将被氧化，位于342, 359, 378和400 nm的四个特征吸收峰的吸光度下降。将10 µM 2TPA-PTCF NPs或2DSP-PTCF NPs溶解在含有20 μL ABDA的2 mL PBS 中。然后将混合物置于比色皿中并用660 nm激光(0.1 W/cm2)照射。用紫外分光光度计（记录样品在378 nm处的吸光度变化。结果如图18所示。
图18为2TPA-PTCF NPs与2DSP-PTCF NPs在水中与单线态氧捕获剂ABDA混合溶液在378 nm处吸光度随光照时间的变化情况。当溶液在这两种纳米颗粒存在下暴露于660 nm激光照射时，ABDA探针的吸光度几乎没有变化，这表明纳米颗粒不会产生单线态氧。
（7）2TPA-PTCF NPs的光热性能及其光热转换效率测试，具体步骤如下：
光热性质测试：不同浓度的2TPA-PTCF NPs水溶液(12.5 μM、25 μM、50 μM和100 μM)，用0.4 W/cm2 660 nm激光照射3 min，监测光照期间的温度变化。计算2TPA-PTCF NPs的光热转换效率。当温度达到平台时，将2TPA-PTCF NPs暴露于660 nm 0.4 W/cm2的激光下照射3 min，然后关闭激光器，将溶液冷却至室温。在此过程中，每隔15 s记录溶液温度变化。结果如图19所示。
图19为浓度为100 µM的2TPA-PTCF NPs在660 nm激光照射下（0.4 W/cm2）的光热性能及其光热转换效率计算。其光热转换效率为54%。
（8）2TPA-PTCF NPs的光热稳定性能测试，具体步骤如下：
用0.4 W/cm2 660 nm激光照射100 µM的2TPA-PTCF NPs水溶液3 min，之后降温3min，循环五次，监测这个过程中温度的变化。结果如图20所示。
图20为2TPA-PTCF NPs暴露于660 nm 0.4 W/cm2的激光下的光热稳定性能测试。结果表明2TPA-PTCF NPs表现出优异的光热稳定性能，循环五次，仍然保持稳定的温度增量。
（9）2DSP-PTCF NPs的光热性能及其光热转换效率测试，具体步骤与2TPA-PTCFNPs的测试步骤相同。结果如图21所示。
图21为浓度为100 µM的2DSP-PTCF NPs在660 nm激光照射下（0.4 W/cm2）的光热性能及其光热转换效率计算。其光热转换效率为57%。
（10）2DSP-PTCF NPs的光热稳定性能测试，具体步骤与2TPA-PTCF NPs的测试步骤相同。结果如图22所示。
图22为2DSP-PTCF NPs暴露于660 nm 0.4 W/cm2的激光下的光热稳定性能测试。结果表明2DSP-PTCF NPs表现出优异的光热稳定性能，循环五次，仍然保持稳定的温度增量。
（11）2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs的HeLa细胞荧光成像和流式细胞仪测试，具体步骤如下：
将HeLa细胞铺在共聚焦皿中放置在二氧化碳培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养过夜。在HeLa细胞中分别加入2TPA-PTCF NPs（10 μM）或2DSP-PTCF NPs（10 μM），孵化12 h，PBS冲洗三次后，使用Nikon公司TI2-A倒置荧光显微镜对细胞进行成像。（λex = 605 nm，λem =647 nm），测试结果如图23所示。
将HeLa细胞铺在共聚焦皿中放置在二氧化碳培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养。当细胞达到106每孔时，在HeLa细胞中分别加入2TPA-PTCF NPs（10 μM）或2DSP-PTCF NPs（10 μM），孵化12 h，PBS冲洗三次后使用胰酶消化细胞，放入EP管中离心（1000 rpm，5 min），吸出上清液，用PBS再次轻轻洗3次，后用PBS吹打沉底细胞制成细胞悬液，使用流式细胞仪进行测试，测试结果如图23所示。
图23为2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs对HeLa细胞的实时荧光成像图，从图23中可以看出，2TPA-PTCF NPs处理后的HeLa细胞几乎观察不到荧光信号，而2DSP-PTCF NPs处理的细胞可以明显观察到荧光信号。流式细胞仪结果显示2TPA-PTCF NPs处理后的HeLa细胞与空白HeLa细胞的信号强度几乎没有差别，而2DSP-PTCF NPs处理组的信号强度更强，表明2DSP-PTCF NPs相比于2TPA-PTCF NPs在HeLa细胞中具有更高的摄取水平。
（12）2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs的4T1细胞荧光成像和流式细胞仪测试，具体步骤与对HeLa细胞的测试步骤相同。结果如图24所示。
图24为2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs对4T1细胞的实时荧光成像图，从图24中可以看出，2TPA-PTCF NPs处理后的4T1细胞几乎观察不到荧光信号，而2DSP-PTCF NPs处理的细胞可以明显观察到荧光信号。流式细胞仪结果显示2TPA-PTCF NPs处理后的4T1细胞仅显示出较弱的荧光信号，而2DSP-PTCF NPs处理组的信号强度更强，表明2DSP-PTCF NPs相比于2TPA-PTCF NPs在4T1细胞中具有更高的摄取水平。
（13）2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs的MCF-7细胞荧光成像和流式细胞仪测试，具体步骤与对HeLa细胞的测试步骤相同。结果如图25所示。
图25为2TPA-PTCF NPs和2DSP-PTCF NPs对MCF-7细胞的实时荧光成像图，从图25中可以看出，类似的，2TPA-PTCF NPs处理后的MCF-7细胞几乎观察不到荧光信号，而2DSP-PTCF NPs处理的细胞可以明显观察到荧光信号。流式细胞仪结果显示2TPA-PTCF NPs处理后的MCF-7细胞与空白MCF-7细胞的信号强度几乎没有差别，而2DSP-PTCF NPs处理组的信号强度更强，表明2DSP-PTCF NPs相比于2TPA-PTCF NPs在MCF-7细胞中具有更高的摄取水平。
（14）2DSP-PTCF NPs和2TPA-PTCF NPs对HeLa细胞光动力/光热协同杀伤能力测试，具体步骤如下：
HeLa细胞在含10%（体积含量）热灭活胎牛血清、100 mg∙mL-1青霉素和100 mg∙mL-1链霉素的DMEM（含各种氨基酸和葡萄糖的培养基）中，37 ℃条件下，在含有5% CO2（体积含量）的湿化培养箱中培养。采用MTT法测定细胞活力，MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
将100 µL细胞悬液（5000个细胞/孔）置于96孔板中。37 ℃条件下，在含有5% CO2的加湿培养箱中预孵育24 h。孔中加入不同浓度的2DSP-PTCF NPs水溶液或2TPA-PTCF NPs水溶液，终浓度分别为0 µM、5 µM、10 µM、15 µM、20 µM、25 µM、30 µM。细胞在培养箱中孵育16 h后，用0.5 W/cm2，660 nm激光对HeLa细胞光照10 min，继续在37 ℃条件下孵育4 h后，用含20 µg/mL MTT的新鲜培养基（100 µL）交换细胞培养液。孵育4 h后移去培养基，加入100 µL的DMSO溶解甲臜晶体。用酶标仪测定490 nm处吸光度，作为光毒性组。未处理细胞作为对照。按照上述方法，区别在于不进行光照处理，细胞在培养箱中孵育20 h后，用含20 µg/mL MTT的新鲜培养基（100 µL）交换细胞培养液。孵育4 h后移去培养基，加入100 µL的DMSO溶解甲臜晶体。用酶标仪测定490 nm处吸光度，作为暗毒性组，测试结果如图26所示。
图26中的A为不同浓度的2DSP-PTCF NPs对HeLa细胞的光动力/光热协同杀伤情况；图26中的B为不同浓度的2TPA -PTCF NPs对HeLa细胞的光动力/光热协同杀伤情况。从图26可以看出，随着2DSP-PTCF NPs或2TPA -PTCF NPs浓度的增大，光毒性组HeLa细胞的存活率明显下降，暗毒性组HeLa细胞的存活率均保持在90%左右，说明黑暗条件下，2TPA -PTCF NPs 2DSP-PTCF NPs对HeLa细胞具有较高的安全性，光照条件下，对HeLa细胞的光动力光热杀伤作用明显。
由以上实施例4和5可知，本发明提供的光敏剂合成步骤简单，分离纯化操作简单，具有优异的自由基型活性氧产生能力；高效的光热转换性能，对宫颈癌细胞具有强杀伤能力，可用于构建具有高效光动力/光热协同治疗效果的抗癌药物。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，其特征在于，具有式I所示结构：
所述式I中：X为S、NH或NR时，R1为：
X为O时，R1为：
NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1～9的正整数；中的A为O、S或Se。
2.根据权利要求1所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，其特征在于，X为O或NR，NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1或2。
3.根据权利要求1所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，其特征在于，R1为：
4.根据权利要求1～3任选一项所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂，其特征在于，具有式I-2、式I-a1、式I-b1或式I-b2所示结构：
5.权利要求1～4任一项所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、哌啶和有机溶剂混合进行第一脑文格反应，得到具有式I所示结构的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂；
R1-CHO式III；
式II中的X为S、NH或NR时，式III中的R1为：NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3或-CH2-(CF2)n-CF3，R中的n为1～9的正整数；/>中的A为O、S或Se；
式II中的X为O时，式III中的R1为：中的A为O、S或Se。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，式II所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)将式IV所示结构的化合物、式V所示结构的化合物和乙酸酐混合，进行第二脑文格反应，得到具有式VI所示结构的化合物；
式V和式VI中的X为O、S或NH，得到的式VI所示结构的化合物为X为O、S或NH时的式II所示结构的化合物；
(2)当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-1所示结构的化合物和有机溶剂混合，进行第一取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CH2)n-CH3的式II所示结构的化合物；R2-NH2式VII-1，式VII-1中的R2为-CH2-(CH2)n-CH3，R2中的n为1～9的正整数；
(3)当式II所示结构的化合物中的X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3时，将X为O的式VI所示结构的化合物、式VII-2所示结构的化合物、三乙胺、醋酸铜和有机溶剂混合，进行第二取代反应，得到X为NR，且NR中的R为-CH2-(CF2)n-CF3的式II所示结构的化合物；R3-NH2式VII-2，式VII-2中的R3为-CH2-(CF2)n-CF3，R3中的n为1～9的正整数。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，式III所示结构化合物中的R1为时，式III所示结构的化合物的制备方法包括以下步骤：
将式VIII所示结构的化合物、二苯胺、Pd(dba)3、四氟硼酸三叔丁基磷、叔丁醇钠和有机溶剂混合进行第三取代反应，得到具有式Ⅸ所示结构的化合物；
式VIII和式Ⅸ中：A为O、S或Se；
将式Ⅸ所示结构的化合物、三氯氧磷和有机溶剂混合进行第四取代反应，得到R1为的式III所示结构的化合物。
8.权利要求1～4任一项所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或权利要求5～7任一项所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在制备抗宫颈癌药物或制备抗肿瘤诊断试剂中的应用。
9.权利要求1～4任一项所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或权利要求5～7任一项所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂在非治疗目的且非诊断目的的癌细胞成像中的应用。
10.一种荧光探针水分散纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1～4任一项所述的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂或权利要求5～7任一项所述的制备方法制备得到的产生I型活性氧和近红外荧光的光敏剂、包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到同时具有I型活性氧和光热产生能力的聚集诱导发光型光敏剂水分散纳米颗粒。
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| pH Triggered Switching Dye Sensor Based on Furan and Pyrone Units;Jung-Young Park etc;Fibers and Polymers;第13卷(第2期);159-161 * |
| Sergio Gamez-Valenzuela etc.V-shaped pyranylidene/triphenylamine-based chromophores with enhanced photophysical,electroch -emical and nonlinear optical properties.Materials Advances.2021,(第2期),4255-4263. * |
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