CN113384695B

CN113384695B - 具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113384695B
Application number: CN202110486915.8A
Authority: CN
Inventors: 樊江莉; 赵学泽; 姚起超; 龙飒然; 孙文; 彭孝军
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2021-05-03
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-05-03
Also published as: CN113384695A

Abstract

本发明提供一类具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料及其制备方法和应用，所述光敏染料具有通式I的结构。本发明所述具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料化合物可拥有较高的单线态氧量子产率，较长的激发态寿命。在近红外光的激发下能够对常氧及乏氧癌细胞进行光动力杀伤。同时所述具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料在用于活体内实体肿瘤的治疗，并抑制癌细胞肺转移方面有良好的应用前景。

Description

具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及精细化工领域，尤其涉及一类具有长激发态寿命的五甲川菁染料光敏剂、其制备方法及应用。

背景技术

光动力学疗法(Photodynamic Therapy,PDT)是将光化学、光物理学及光生物学的原理应用于诊断和治疗疾病的一种方法，是继手术、化疗、放疗之后的第四种疗法，在治疗癌症等恶性疾病以及多种良性疾病方面表现出巨大的应用潜力。

光动力治疗的三要素分别是：光源、光敏剂和氧气。其中光敏剂是PDT三要素中最为重要的组分。目前，卟啉类衍生物二氢卟吩(ce6)、酞菁、吲哚菁绿等商品化的光敏剂都在光动力治疗中起到了重要的作用。但是其中很少有可能同时满足以下要求来实现肿瘤抑制和抗癌转移的要求：1.在近红外区具有大的消光系数保证活体治疗中有效的光子捕获；2.明确的亚细胞定位，因活性氧(ROS)扩散范围有限，光敏剂靶向重要的细胞器官(例如，线粒体或内质子)，能有效治疗效果；3.阳离子柔性结构，溶解性、生物相容性良好和能够有效的在肿瘤富集。

与典型的光敏剂母体结构不同，天然具有阳离子结构的花菁染料是一类广泛用于生物领域的化学传感器，能够同时满足具有挑战性的要求。当前对花菁染料的光敏剂化改性主要依赖于“重原子效应”。但是，像许多其他荧光团一样，重原子效应能够引起染料自身的三重态(T₁)寿命缩短，不利于其在进一步生物学中的应用，尤其对乏氧肿瘤的治疗。此外，不良的溶解性和增强的细胞毒性也是不可忽略的缺点。为重原子效应带来的弊端，当前对花菁染料的改性使用了一种称为自由基增强系间窜越(REISC)的无重原子策略。然而，自由基与荧光团之间强的自旋-自旋交换相互作用也会导致显著的荧光猝灭和T₁态寿命缩短。

另外，由于复杂的键异构化过程，花菁染料通常具有较低的辐射量子产率和短寿命的激发态寿命，影响抗癌效果。因此，为克服当前挑战而对花菁染料进行合理设计是非常紧迫的。

发明内容

本发明旨在提供一类能够不依赖于重原子具有近红外激发、线粒体定位、长激发态寿命的PDT光敏剂。

本发明首先提供一类具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料，具有如下结构通式I：

通式I中：

R₁和R₂各自独立地选自H、Cl、F、羧基、磺酸基等；

R₃和R₄各自独立地选自甲基、乙基、丙基、长烷基链、苄基等；

R₅选自式i～v所述基团中的一种：

X选自碘、氯或溴。

另一方面，本发明提供上述具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料的制备方法，包括式II的化合物与式III化合物在零价钯存在条件下反应的步骤，

通过上述本发明的合成方法制备的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏剂，具有以下显著的特征：1、摩尔消光系数大(>200000M^-1cm^-1)，最大吸收波长位于近红外区(>650nm)，能够被近红外光激发；2、阳离子结构能够定位于线粒体；3、激发态寿命长(单线态寿命长于1.5ns，三线态寿命长于50μs)，能够在常氧和乏氧条件下产生单线态氧并破坏细胞；4、生物相容性好，能够快速的在肿瘤富集并代谢；5、能够在活体内对实体肿瘤抑制并抑制肿瘤转移。

基于此，本发明进一步提供所述的具有长激发态寿命的五甲川花菁类光敏染料在制备PDT光敏剂中的应用。所制备的PDT光敏剂可以用于光动力治疗，以近红外光激发，并且显然相对于一般的光敏剂有着更强的光动力治疗效果。

对于PDT光敏剂的更为具体的探讨，与本发明的化合物相对于未经修饰的五甲川花菁染料光物理性能提升有关。对于已报道的花菁类光敏剂，本发明的具有长激发态寿命的五甲川花菁类光敏化合物能够在不损失荧光亮度的同时提升染料的单线态氧量子产率和延长染料的激发态寿命。本发明提供的光敏剂有着特异性的亚细胞器定位，有着更强的治疗效果，并且该光敏剂还可以采用近红外光激发，一定程度上增加了潜在的治疗深度。基于此，上述应用中的PDT光敏剂，优选用于癌细胞、实体肿瘤的荧光成像，并在特定波长激发光的存在下诱导癌细胞死亡。

附图说明

本发明附图8幅：

图1是对本发明的光敏剂ANOMe-Cy5进行单线态氧产生能力测试图。图1中：分别是未经修饰的五甲川菁染料Cy5和ANOMe-Cy5与DPBF(3-二苯基异苯并呋喃)的混合溶液在660nm的光照射下DPBF在415nm处的吸收衰减归一量化曲线。

图2是对普通Cy5分子和光敏分子ANOMe-Cy5的荧光寿命以及三线态寿命测试图。图2中：A和B图分别是未经修饰的五甲川菁染料Cy5的荧光寿命和三线态寿命测试图。C和D图分别是光敏分子ANOMe-Cy5的荧光寿命和三线态寿命测试图。

图3是本发明的光敏分子ANOMe-Cy5对4T1细胞的共聚焦成像细胞摄取量图。图3中：A图是对ANOMe-Cy5的共聚焦成像图，B图是对荧光成像的数据量化图。

图4是本发明的光敏分子ANOMe-Cy5在4T1细胞中的亚细胞器定位图。图4中：A,B,C和D图中分别表示商品化细胞核染料染色，ANOMe-Cy5染色，染色叠加，叠加定位系数图；E,F,G和H图分别表示商品化溶酶体染料染色，ANOMe-Cy5染色，染色叠加，叠加定位系数图；I,J,K和L图分别表示商品化线粒体染料染色，ANOMe-Cy5染色，染色叠加，叠加定位系数图。

图5是本发明的光敏分子ANOMe-Cy5对4T1细胞在常氧和乏氧条件下的光暗毒性测试。图5中：A图是ANOMe-Cy5对4T1细胞在常氧条件下暗毒性和光毒性(660nm)测试；B图是ANOMe-Cy5对4T1细胞在乏氧条件下暗毒性和光毒性(660nm)测试

图6是本发明的光敏分子ANOMe-Cy5对4T1细胞在常氧和乏氧条件下的线粒体膜电位破坏实验。图6中：A和B图分别为对照组和ANOMe-Cy5处理组在常氧光照条件下对4T1细胞的线粒体膜电位染色测试；C和D分别为对照组和ANOMe-Cy5处理组在乏氧光照条件下对4T1细胞的线粒体膜电位染色测试；

图7本发明的光敏分子ANOMe-Cy5在活体皮下肿瘤模型中的荧光成像实验。图7中：A图是ANOMe-Cy5在活体皮下肿瘤模型中的荧光成像图；B图是A图的数据量化图。

图8是光敏分子ANOMe-Cy5在活体转移肿瘤模型中的光动力抑瘤和抗转移实验。图8中：A图是经过ANOMe-Cy5光动力治疗26天后解剖的肿瘤与肺组织，箭头表示肺转移结节；B图是经ANOMe-Cy5光动力治疗后活体肿瘤体积的变化；C图是经ANOMe-Cy5光动力治疗后活体体重的变化。

具体实施方式

本发明的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料，具有如下结构通式I：

R₁和R₂各自独立地选自H、Cl、F、羧基、磺酸基等；

R₅选自式i～v所述基团中的一种：

X选自碘、氯或溴。

优选的，所述的R₁、R₂分别为氢。

优选的，所述R₃和R₄分别为乙基。

优选的，所述的X为碘。

优选的，所述的R₅选自式i,ii,iii所述基团中的一种。

上述优选技术特征之组合可以获得本发明的优选的化合物，其中代表性的最优选化合物是ANOMe-Cy5：

另一方面，本发明提供所述的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料的制备方法，包括式II的化合物与式III化合物在零价钯存在条件下反应的步骤，

其中，式II的化合物与式III化合物的摩尔比可为1:1～10，优选为1:2～4，更优选为1:2～3，最佳为1:2.5。

优选的，其中所述的零价钯选自四三苯基膦钯、三二亚苄基丙酮二钯、醋酸钯搭配磷配体中的一种；

优选的，所述的零价钯与式II的化合物的摩尔比为1:0.01～0.10，优选1:0.08。

优选的，所述的反应的溶剂选自1,4-二氧六环或二甲基亚砜，便于反应物的溶解。

实际生产操作中，优选使式III的化合物的加入量稍过量于中间体II，以利于中间体II反应完全。

另一方面，该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高。

反应是否达到终点通过薄层色谱(TLC)判断，通常的反应时间优选4-12小时。

反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。

所得光敏剂可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。

另一方面，本发明提供所述的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料在制备PDT光敏剂中的应用。

优选的，所述的PDT光敏剂具有线粒体定位特性、和具有近红外区拥有大摩尔消光系数特性、和具有较长的激发态寿命、和具有较高的单线态氧量子产率，并在近红外光的存在下抑制肿瘤的生长和转移。

本发明合成方法制备的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏剂，具有以下显著的特征：1、摩尔消光系数大(>200000M^-1cm^-1)，最大吸收波长位于近红外区(>650nm)，能够被近红外光激发(660nm)；2、阳离子结构能够定位于线粒体；3、激发态寿命长(单线态寿命长于1.5ns，三线态寿命长于50μs)，能够在常氧和乏氧条件下产生单线态氧并破坏细胞；4、生物相容性好，能够快速的在肿瘤富集并代谢；5、能够在活体内对实体肿瘤抑制并抑制肿瘤转移。

本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明及其有益效果，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.光敏分子ANOMe-Cy5的合成：

(1)中间体化合物3的合成：

将化合物2(0.34g，1mmol)，季铵盐1(0.63g，2mmol)和无水乙酸钠(0.2g，2.5mmol)的无水乙醇溶液回流搅拌2h。冷却后，将乙醇通过旋转蒸发仪旋干，后将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1，v/v)，得到化合物3，为蓝色粉末(0.53g，71.8％)。¹HNMR(400MHz,MeOD):8.41(d,J＝13.3Hz,2H,CH),7.56(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),7.46(t,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.40(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.33(t,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.49(d,J＝13.3Hz,2H,CH),4.24(q,J＝7.2Hz,4H,CH₂),1.76(s,12H,CH₃),1.45(t,J＝7.2Hz,6H,CH₃).ESI-MS(C₂₉H₃₄BrN₂I)m/z:[M–I]^-calcd.489.19；found,489.28.

(2)光敏分子ANOMe-Cy5的合成：

将3(0.1g，0.16mmol),4(0.084g，0.25mmol)和四三苯基膦钯(0.0092g，0.008mmol)，碳酸钾(0.066g，0.48mmol)溶解在10mL的1,4-二氧六环中，并在90度下搅拌8小时。最终蒸发溶剂，并将混合物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100：0.8，v/v)，得到蓝黑色固体粉末ANOMe-Cy5(10％)。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ(ppm):8.84(d,J＝14.0Hz,2H),8.49(d,J＝8.7Hz,2H),7.91(d,J＝8.7Hz,2H),7.61–7.57(m,2H),7.55–7.51(m,4H),7.34(d,J＝7.6Hz,2H),7.26(t,J＝7.2Hz,2H),7.13(d,J＝7.9Hz,2H),5.18(d,J＝14.0Hz,2H),4.28(s,3H),3.38(q,J＝7.2Hz,4H),1.86(s,12H),0.63(t,J＝7.2Hz,6H).ESI-MS(C₄₄H₄₅IN₂O)m/z:[M–I]^-calcd.617.35,found 617.42.

实施例2.光敏分子ANOMe-Cy5的单线态氧性能测试

将1.5μM的光敏分子ANOMe-Cy5加入到含有3mL二氯甲烷溶液的测试石英皿，通过DPBF溶液调整415nm处的吸光度达到1左右，将皿置于660nm，10mW/cm²的氙灯光源下照射，每隔15秒记录溶液的吸收光谱。测试结果整理在显示于图1中，溶液的吸收随照射时间的增长按一定的值同等衰减，表明溶液在该波长的光源照射下产生了单线态氧。

实施例3.ANOMe-Cy5激发态寿命的测试

将5μM的化合物ANOMe-Cy5置于3mL的二氯甲烷溶液中。通过闪光光解以及时间分辨光谱对两化合物分子进行荧光寿命和三线态寿命的测试。结果分别反映于图2的C图和D图。

实施例4.光敏分子ANOMe-Cy5的细胞摄取实验

4T1细胞在DMEM(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。将0.5μM的化合物ANOMe-Cy5加入到含有4T1细胞的培养液中，37℃下孵育，后采用共聚焦成像的方式判断摄取量。光敏分子激发波长为640nm，探针发射波长675nm，测试结果显示于图3的A和B图中。从图中可以看到，光敏化合物ANOMe-Cy5在4T1细胞中的摄取量在孵育60min后达到饱和。表明光敏化合物ANOMe-Cy5容易被细胞摄取。

实施例5.光敏分子ANOMe-Cy5的亚细胞器定位实验

4T1细胞在DMEM(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在细胞共聚焦培养皿中。图5是光敏分子与不同亚细胞器定位的商业化染料的复染实验。光敏分子ANOMe-Cy5的浓度为0.5μM，商业化染料Hochest 33342(细胞核)、MTG(线粒体)、LTG(溶酶体)的浓度分别为100nM。先将0.5μM的光敏分子ANOMe-Cy5分别加入至3个含有4T1细胞的皿中孵育2小时，后分别将3种100nM的商业化染料加入皿中分别孵育5min、30min和20min，随后进行激光共聚焦成像。光敏分子ANOMe-Cy5的激发波长为640nm发射为670-710nm。Hochest 33342的激发波长为405nm，接受波段为460-490nm。MTG与LTG的激发波长均为488nm，接受波段为515-545nm。从图4中可以看出ANOMe-Cy5能够较好的定位于4T1细胞的线粒体中。

实施例6.光敏分子ANOMe-Cy5对4T1细胞的细胞光暗毒性实验

将要检测的4T1细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔10³～10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μL；将培养板移入孵箱中，37℃，5％CO₂及饱和湿度下培育24小时后，分别加入不同浓度的光敏分子分子，继续分别在常氧和乏氧下培养2小时；随后采用660nm，25mW/cm²的LED光源均匀的照射每个孔，照射完毕后，继续将96孔板放置培养箱中放置24h。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，孵育4小时，终止培养，小心吸掉孔内培养上清液。然后，每孔加入100μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度，计算细胞存活率：试验组光吸光度/对照组吸光度值×100％。

从图5中可以看出，光敏分子ANOMe-Cy5对4T1细胞不管在常氧和乏氧条件下均拥有显著的光诱导杀伤毒性。

实施例7.光敏分子ANOMe-Cy5的细胞线粒体膜电位破坏实验

4T1细胞在DMEM(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在细胞共聚焦培养皿中。将0.5μM化合物ANOMe-Cy5加入至含有4T1细胞的培养皿中分别在常氧和乏氧下孵育2h，将皿至于660nm，25mW/cm²的氙灯光源照射。同时作为对比实验，未加入光敏分子的细胞皿也在相同光参数下照射。随后向细胞皿中加入JC-1染色剂，37℃下孵育20min。随后进行激光共聚焦成像。JC-1的激发波长为488nm，接受波段分别为515-545nm和570-590nm。如图6(A图表示常氧条件下未经处理的细胞，B图表示常氧条件下经ANOMe-Cy5光动力处理的细胞，C图表示乏氧条件下未经过处理的细胞，D图表示乏氧条件下经ANOMe-Cy5光动力处理的细胞)所示，在光照射条件下，光敏分子可以特异性的破坏线粒体，细胞中红色线粒体聚集荧光消失。说明了破坏线粒体的毒性来自于光敏分子的光动力作用。

实施例8：活体皮下肿瘤模型下光敏分子ANOMe-Cy5的荧光成像

将1×10⁶的4T1细胞皮下注射至BALB/c雌鼠的腋下，并隔天检测一次。待肿瘤体积长至150mm³后，将10nM的光敏分子ANOMe-Cy5通过静脉注射注入小鼠体内，并通过小动物荧光成像仪对活体内荧光进行实时检测。染料ANOMe-Cy5为650nm激发，收集670-700nm波段。

图7可以看出，光敏分子ANOMe-Cy5能够快速的在肿瘤部位富集，并能快速的从体内代谢，拥有良好的生物相容性。

实施例9：活体转移瘤模型下光敏分子ANOMe-Cy5的抑瘤实验和抗肺转移实验

将1×10⁵的4T1细胞原位注射至BALB/c雌鼠的乳房垫处，并隔天检测一次。待肿瘤体积长至80mm³后，将10nM的光敏分子ANOMe-Cy5通过静脉注射注入小鼠体内，在注射15min后，对肿瘤处采用650nm光(80mW/cm²)照射15min。在第一次治疗的14天后，再进行一次相同的实验。从治疗第一天开始，隔天记录一次小鼠的体重和肿瘤体积。在第一次治疗26天后，对小鼠进行解剖去除肿瘤与肺组织，进行分析实验。

从图8(A代表对经过光敏分子ANOMe-Cy5治疗26天后的小鼠解剖得到的肿瘤和肺组织，箭头表示肺转移结节；B图代表经ANOMe-Cy5光动力治疗后活体肿瘤体积的变化；C图代表经ANOMe-Cy5光动力治疗后活体体重的变化)中可以看出，光敏剂ANOMe-Cy5的光动力治疗作用显著地抑制了肿瘤的生长，同时抑制了乳腺癌的肺转移。在整个治疗过程中，各组小鼠的体重没有变化，表明ANOMe-Cy5在拥有高效的肿瘤治疗效果的同时没有毒副作用，生物相容性良好。

对比例1.未经修饰的五甲川菁染料分子的单线态氧性能测试

将1.5μM的参比未修饰的五甲川菁染料Cy5加入到含有3mL二氯甲烷溶液的测试石英皿，通过DPBF溶液调整415nm处的吸光度达到1左右，将皿置于660nm，10mW/cm²的氙灯光源下照射，每隔15秒记录溶液的吸收光谱。测试结果显示于图1中。通过分析图1可以说明目标化合物ANOMe-Cy5提高了(500％)传统五甲川菁染料分子的单线态氧产生性能。

对比例2.未经修饰的五甲川菁染料分子的激发态寿命的测试

将5μM的参比未修饰的五甲川菁染料Cy5置于3mL的二氯甲烷溶液中。通过闪光光解以及时间分辨光谱对两化合物分子进行荧光寿命和三线态寿命的测试。结果分别反映于图2的A图和B图。通过将A图B图与C图D图对比可以说明目标化合物ANOMe-Cy5显著的延长了了传统五甲川菁染料分子的单重态与三重态寿命。

通过对比例和本发明技术方案的数据对比可见本发明延长了传统五甲川菁染料分子的激发态寿命(单线态寿命延长1.21倍，三线态寿命延长10.57倍)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一类具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料，具有如下结构通式I：

通式I中：

R₁和R₂各自独立地选自H、Cl、F；

R₃和R₄各自独立地选自甲基、乙基、丙基、苄基；

R₅选自式i～v所述基团中的一种：

X选自碘、氯或溴。

2.根据权利要求1所述的光敏染料，其特征在于，所述的R₁、R₂分别为氢。

3.根据权利要求1所述的光敏染料，其特征在于，所述R₃和R₄分别为乙基。

4.根据权利要求1所述的光敏染料，其特征在于，所述的X为碘。

5.根据权利要求1所述的光敏染料，其特征在于，所述的R₅选自式i,ii,iii所述基团中的一种。

6.权利要求1所述的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料的制备方法，其特征在于，包括式II的化合物与式III化合物在零价钯存在条件下反应的步骤，

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的式II的化合物与式III化合物的摩尔比为1:1～10；

所述的零价钯与式II的化合物的摩尔比为1:0.01～0.10；

所述反应的溶剂选自1,4-二氧六环或二甲基亚砜。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的零价钯选自四三苯基膦钯、三二亚苄基丙酮二钯中的一种。

9.权利要求1所述的具有长激发态寿命的五甲川菁染料类光敏染料在制备PDT光敏剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的PDT光敏剂具有线粒体定位特性、和具有近红外区拥有大摩尔消光系数特性、和具有长的激发态寿命、和具有高的单线态氧量子产率，并在近红外光的存在下抑制肿瘤的生长和转移。