KR101401827B1

KR101401827B1 - 광역학적 치료 및 종양 영상화용 환원된 ｂ 고리- 산화된 ｄ 고리 테트라피롤 감광제

Info

Publication number: KR101401827B1
Application number: KR1020107020974A
Authority: KR
Inventors: 라빈드라 케이 판데이; 차오 리우; 마하비어 도브할; 윌리암 포터; 자넷 모르간; 알란 오세로프
Original assignee: 헬스 리서치 인코포레이티드
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2014-05-29
Also published as: EP2252153A2; CN101980609A; CN101980609B; WO2009105210A2; CA2715747A1; WO2009105210A3; US20110264027A1; KR20100121520A; US8679459B2; EP2252153A4; CA2715747C; EP2252153B1

Abstract

본 발명은 A, B, C 및 D 고리를 갖고, 환원된 B 고리 및 산화된 D 고리를 갖는 테트라피롤 감광제 및 영상화제 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 바람직하게는 95% 이상의 순도를 갖고, 바람직하게는 D 고리에 가장 가까운 C 고리의 불포화 탄소 원자 및 C와 D 고리 사이의 불포화 탄소 원자에서 연결된 융합 시스템을 갖는다. 또한, 본 발명은 산화된 B 및 D 고리 테트라피롤 화합물로 출발하여, 이를 할로겐화된 탄화수소 용매에 용해시키고, 이를 FeCl₃·6H₂O의 충분한 나이트로알케인 용액으로 처리하여 D 고리를 산화시키고, 생성된 유기 층을 분리하고 건조시킴으로써 95% 이상의 수율로 화합물을 제조하는 방법을 포함한다.

Description

광역학적 치료 및 종양 영상화용 환원된 Ｂ 고리- 산화된 Ｄ 고리 테트라피롤 감광제{B RING REDUCED-D RING OXIDIZED TETRAPYROLLIC PHOTOSENSITIZERS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY AND TUMOR IMAGING}

본 발명은 환원된 고리 B 감광제의 제조를 위한 성공적인 접근법에 관한 것이다.

본 발명은 2008년 2월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제 61/066,374 호를 우선권 주장한다.

본 발명은 전체적으로 또는 부분적으로 국립보건연구소(National Institute of Health)로부터 승인 번호 CA 114053 및 CA 119358하에 개발되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가질 수 있다.

포르피린(테트라피롤 시스템)은 광역학적 치료에 사용되는 감광제로서 대단한 흥미를 일으켰다. 포토프린(Photofrin, 등록상표명), 즉 로스웰 파크 암 연구소(RPCI)에서 개발된 헤마토포르피린 유도체는 다양한 암을 치료하기 위해 전 세계적으로 현재 사용되고 있다. 포토프린의 일부 단점은 (i) 피부 광독성이 연장되고, 환자는 치료 후 적어도 4 내지 6주 동안 직사 광선을 피하도록 권장되며, (ii) 630nm에서의 약한 흡수는 그의 조직의 침투 능력을 제한하고, 따라서 고질적인 종양은 치유되기 어렵다. 감소된 피부 광독성을 가지면서 포토프린보다 더욱 종양 친화성인 화합물을 개발하려는 우리의 노력을 포함한 노력들이 여러 실험실에서 진행되고 있다.

최근에, 핵의학 영상(PET/SPECT) 및 치료에 사용되거나, 또는 "보고 치료하는" 접근법을 위해 비히클로서 종양-친화 감광제가 목적하는 영상화제(예컨대, 형광 영상화, MRI)를 종양으로 전달하는 능력을 결정하기 위한 포르피린-계 화합물 및 "이작용성 시약"의 유용성이 보고되었다. 최근에, 종양-표적화 잔기로서 3-(1-헥실옥시에틸)-3-데비닐-피로페오포르비드-a(HPPH, 현재 임상 제2상 인간 시험 중임)를 사용하는 형광 영상화/PDT에서 상기 접근법의 용도가 보고되었다.

PDT는 일반적으로 형질전환 세포의 과성장을 특징으로 하는 몇몇 비암종 상태 및 암의 치유적 또는 완화적 치료로서 점점 더 허용될 수 있다. 이러한 절차에 대한 관심은 몇몇 국가에서 보건 기관 규제에 의해 자궁경부 형성이상 및 광선 각화증 외에도 폐, 위, 식도, 방광 및 자궁경부 종양의 치료를 위해 포토프린(등록상표명)(헤마토포르피린 유도체의 착체 혼합물)을 사용하는 PDT를 최근에 승인하여 촉진되었다. 세포 및 조직의 광감작 손상에 포함되는 기작의 보다 상세한 이해 및 포르피린 화합물의 여러 부류에 있어서 화학적 구조와 광역학적 활성 간의 관계에 대한 보다 잘 된 정의는 개선된 광치료 특성을 갖는 2세대 감광제의 개발을 유도하였다. 이러한 감광제 중 몇몇은 연령-관련 황반 변성(AMD)¹의 습성 형태와 같은 비종양학 징후에 유용한 것으로 입증되었다.

PDT의 성공적인 결과는 빛, 감광제 및 산소와 같은 3가지 요소들 간의 최적 상호작용에 좌우된다. 일반적으로, 가시광선에 가까운 적외선 영역을 향하는 적색 빛은 인간 조직에서 가장 내생적으로 흡수하는 분자의 흡수 밴드 밖이다. 따라서, 가장 빈번하게 사용되는 PDT 시약은 630 내지 800nm의 범위에서 흡수 밴드를 갖는 포르피린 및 그의 유사체(예컨대, 클로린, 박테리오클로린 및 프탈로사이아닌)이다. 최근에, 광학 섬유와 효율적으로 연결될 수 있는(내부 장기에서의 병변의 방사선 요법을 허용함) 낮은 비용의 소형 적색-발광 다이오드 레이저의 이용가능성은 PDT¹의 용도를 넓혔다.

종양에 의한 포르피린 체류의 기작은 잘 이해되지 않지만, 친유성 및 친수성 간의 균형이 중요한 인자로서 인식된다. 우리 실험실에서, SAR 및 QSAR 연구를 기초로, 피로페오포르비드-a(660nm)², 푸르푸린이미드(700nm)³ 및 박테리오푸르푸린이미드(800nm)⁴와 관련된 감광제에서 중요한 구조 매개변수를 결정할 수 있었다. 이들 화합물은 현재 다양한 임상 및 임상전 시험 단계에 있다. 종양 영상화 및 PDT용 "이중-작용" 시약을 개발하려는 우리의 이전 작업에서, 종양-친화 감광제를 영상화제를 종양으로 전달하기 위한 표적화 비히클로서 사용할 수 있음을 밝혔다. 이러한 접근은 광학 영상화/PDT⁵, PET 영상화/PDT⁶ 및 MR 영상화/PDT 시약⁷의 제조시에 상당히 성공적이었다. 그러나, 이러한 "이작용성 시약"의 종양-선택성을 개선시키려는 노력은 진행중이다.

특정 클로린(환원된 고리 D) 유사체의 일련의 알킬- 또는 아릴 에터 유사체를 사용하는 SAR 연구에서, (i) 분자의 전체 친유성 및 (ii) 분자의 여러 주변 위치에서 치환기의 존재는 종양-섭취 및 PDT 효율에 두드러진 영향을 주는 것으로 관찰되었다.

앞서 피로페오포르비드-a 시리즈(고리 D가 환원된 클로린 시스템)에서, 광감작 효능에 대해 일련의 알킬 에터 유사체(예컨대, 도 7의 반응식 1에서 화합물 3)를 합성하고 평가하였다. log P 값(화합물의 전체 친유성을 결정함)과 PDT 활성 간의 포물선 관계를 관찰하였고, 이들 유사체들 중에서 헥실 에터 유도체(3a, HPPH)가 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. HPPH는 현재 임상 제II상 인간 시험 중에 있다(폐, 바레트(Barrett) 식도, 및 두경부 암).

최근에, 종양 영상화 및 PDT용 "이작용성 시약"이 개발되었다. 일련의 감광제 중에서, 요오도벤질에터 유사체(5)가 뛰어난 종양 영상화(PET 영상화) 및 PDT 효율⁵을 나타내었다. 생체내 예비 스크리닝으로부터 얻은 최초 결과는 또한 종양 전이의 영상화에서 상기 화합물의 유용성을 시사한다. F-18 플루오로데오지글루코스(F-18 FDG)와의 비교 연구로부터 얻은 최초 결과는 화합물 5가 F-18 FDG에 비해 우수함을 보여주었다. 그러나, 보다 고급의 종과의 상세한 연구가 현재 진행중이다.

지금까지, 우리의 실험과 다른 실험에서 클로로필-a 유사체로부터 유도된 대부분의 클로린은 환원된 고리-D 시스템을 함유한다. 우리의 이전 발명에서, 클로린(환원된 고리-D)의 여러 주변 위치에서 특정 치환기의 위치의 존재가 PDT 효율에 상당한 영향을 미친다는 것을 발견하였다.

본 발명은 환원된 고리 B 감광제의 제조를 위한 성공적인 접근법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 환원된 B 고리 및 산화된 D 고리를 갖는 신규한 테트라피롤 감광제 및 영상화제를 포함한다. 예를 들면, 도 2의 6 내지 9를 참고한다. 광물리학적 성질, 종양 섭취 및 PDT 효율을 우리의 실험실에서 이전에 개발된 상응하는 환원된 D 고리 감광제와 비교하였다.

목적하는 바를 위해, 메틸 박테리오페오포르비드-a(10)를 다음과 같은 공지된 방법론, 즉 문헌[Chen, Y et al., Bioconjugate Chemi. 2007, 18, 1460-1473]에 의해 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터 단리하였고, 콜리딘과의 환류시에 우수한 수율로 메틸 박테리오피로페오포르비드-a(11)(도 8, 반응식 2)가 수득된다.

본 발명에 따라, 광감작성 또는 종양 영상화 특성을 갖는, 산화된 D 고리 및 환원된 B 고리를 갖는 정제된 테트라피롤 화합물이 제공되며, 이때 이 화합물은 하기 화학식 1의 구조, 및 그의 폴리뉴클라이드, 방사성동위원소, X 착체를 갖고, 여기서 X는 Zn, In, Ga, Al, Mn, Pd, Cu 및 방사성동위원소 표지된 잔기로 이루어진 군 중에서 선택된 금속이고, 이때 방사성동위원소는 ¹¹C, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ¹²⁴I, ¹²⁴I, ¹³¹I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In 및 GdIII으로 이루어진 군 중에서 선택된다:

상기 식에서,

R₁은 -CH=CH₂, -CH₂CH₃, -CR₁₃O, -COOH 또는

이고, 여기서 R₁₃은 수소, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이고, R₉는 -OR₁₀ 또는 형광 염료 잔기이고, R₁₀은 수소, 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬, 아릴, 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 폴리알킬렌 글라이콜 기, -CH₂R₁₄, -(CH₂-O)_nCH₃, -(CH₂)₂CO₂CH₃, -(CH₂)₂CONH페닐렌CH₂DTPA, -CH₂CH₂CONH(CONH페닐렌CH₂DTPA)₂, -CH₂R₁₁ 또는

이고, R₁₄는 페닐 또는 치환된 페닐이고,

R₂, R_2a, R₃, R_3a, R₄, R₅, R_5a, R₇, R_7a 및 R₁₃은 독립적으로, 수소, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 이웃한 탄소 원자 상의 두 개의 R₅, R_5a, R₇ 및 R_7a 기는 함께 취해져서 공유 결합을 형성할 수 있거나, 동일한 탄소 원자 상의 두 개의 R₂, R_2a, R₃, R_3a, R₅, R_5a, R₇ 및 R_7a 기는 이중 결합을 형성하여 2가 펜던트 기를 형성할 수 있고, R₂ 및 R₃은 함께 산소, 질소 또는 황을 함유하는 5 또는 6원 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있고,

R₆은 -CH₂-, -C(O)O(O)C-, -N(R₁₂)- 또는 공유 결합이고,

R₈은 -(CH₂)₂COR₁₅, -(CH₂)₂CONH페닐렌CH₂DTPA, -CH₂CH₂CONH(CONH페닐렌CH₂DTPA)₂, -CH₂R₁₁ 또는

이고, 여기서 R₁₅는 -OH, 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 -O-저급 알킬, 아릴, -NH₂, 아미노산 잔기 또는 항체 잔기이고, R₁₁은 -CH₂CONH-RGD-Phe-Lys, -CH₂NHCO-RGD-Phe-Lys, 형광 염료 잔기 또는 -CH₂CONHCH₂CH₂SO₂NHCH(CO₂)CH₂NHCO페닐OCH₂CH₂NH사이클로CNH(CH₂)₃N이고, 여기서 R₁₂는 수소, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이다.

X와의 착체는 단순히 화합물을 X의 염, 예컨대 클로라이드와 함께 가열시킴으로써 용이하게 제조된다.

또한, 본 발명은 산화된 B 및 D 고리 테트라피롤 화합물로 출발하고, 이를 할로겐화된 탄화수소 용매에 용해시키고, 이를 FeCl₃·6H₂O의 충분한 나이트로알케인 용액으로 처리하여 D 고리를 산화시키고, 생성된 유기 층을 분리하고, 건조시킴으로써 상기 화합물을 95% 이상의 수율로 제조하는 독특한 방법을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 환원된 B 및 D 고리 클로린을 처리하여 환원된 B 고리 - 산화된 D 고리 클로린을 수득할 수 있다. 예를 들면, D 고리에 가장 가까운 C 고리의 불포화 탄소 원자에서 및 C와 D 고리 사이의 불포화 탄소 원자에서 융합된 무수물 또는 융합된 N-치환된 이미드 고리 시스템을 갖는 환원된 B 및 D 고리 테트라피롤 화합물을 전환시켜 상응하는 환원된 B 고리- 산화된 D 고리 화합물을 수득하는데 사용될 수 있다.

화합물은 존재하는 경우 -DTPA 잔기, 또는 아민 구조의 질소 원자들 사이의 테트라피롤 구조 내에서, 또는 둘 다의 킬레이트로서 형성될 것이다. 상기 구조의 예는 X가 M인 경우 다음과 같은 화합물이다:

상기 식에서,

M은 2H이거나, In, Cu, Ga(방사성동위원소를 갖거나 갖지 않음)이다.

도 1은 포르피린, 클로린 및 박테리오클로린의 기본 구조를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 PDT 및 종양 영상화용 박테리오클로로필-a로부터 유도된 클로린의 기본 골격 구조를 도시한다. R은 다양한 길이의 탄소 쇄를 갖는 알킬, 아릴, PEG이고, R₁은 -COOH, 에스터, 아마이드, 아미노산, 엽산, 단클론 항체 등의 잔기이다.
도 3은 A 내지 F의 그래프에서, 다이클로로메테인 중 5μM의 등몰량의 농도에서 클로로필-a 및 박테리오클로로필-a로부터 유도된 여러 가지 환원된 B-고리 및 D-고리 클로린의 감광제의 비교 전자 흡수 스펙트럼의 곡선을 도시하며, 여기서 범례 화합물 번호는 도 7 내지 12에 도시된 화합물을 참고한다.
도 4는 결장-26 종양 세포에서 여러 가지 유리-염기 및 클로로필-a 및 박테리오클로로필-a로부터 유도된 감광제의 In(III) 착체의 비교 생체외 광감작 효능을 도시한다. A 내지 E의 그래프에서, Y는 생존 분율이고, X는 빛의 양(J/cm²)이다. 범례의 번호는 도 7 내지 12의 화합물 번호를 참고한다. A는 0.125μM의 농도에서 광감작성을 나타낸다. B 내지 D는 0.031μM의 농도에서 광감작성을 나타낸다. E는 0.25μM의 농도에서 광감작성을 나타낸다.
도 5의 A는 주입 후 24시간째에 화합물 3a의 생체내 반사율 스팩트럼을 도시하고(종양: 실선, 피부: 구멍 선), 여기서 Y는 OD(염기 e)이고, X는 파장(nm)이며, B는 종양 대 피부(4:1 비율)에서 감광제의 마이크로몰 농도의 비율을 도시하고, Y 및 X는 주입 후 시간(분)을 나타낸다.
도 6의 A는 주입 후 24시간째에 화합물 14의 생체내 반사율 스팩트럼을 도시하고(종양: 실선, 피부: 구멍 선), 여기서 Y는 OD(염기 e)이고, X는 파장(nm)이며, B에서 X는 주입 후 시간(분)이고, Y는 종양 대 피부(9:1 비율)에서 감광제의 마이크로몰 농도를 도시하고, 이는 HPPH-메틸 에스터에서 관찰된 것보다(도 5) 상당히 더 높다.
도 7은 PET 영상화 능력을 갖는 광역학 치료 및 갖지 않는 광역학 치료용 피로페오포르비드-a로부터 유도된 감광제의 반응식 1을 도시하며, 여기서 A는 유사한 약동학적 및 약력학적 특성을 갖는 PET 및 PDT 시약이다. 스피루리나 패시피카(Spirulina Pacifica)는 주로 클로로필 a를 함유한다.
도 8은 메틸 박테리오피로페오포르비드-a의 제조에 대한 반응식 2를 도시한다. 로도박터 스파에로이데스는 주로 박테리오클로로필-a를 함유한다.
도 9는 다양한 산화제에 의한 박테리오피로페오포르비드 2의 산화에 대한 반응식 3을 도시하며, 여기서 DDQ의 사용은 82%의 수율과 함께 생성물 분해를 초래한다.
도 10은 환원된 B-고리 클로린의 제조를 위한 합성 전략에 대한 반응식 4를 도시한다.
도 11은 융합된 무수물 또는 N-치환된 이미드 고리 시스템을 함유하는 환원된 고리-B 클로린의 제 1 합성의 반응식 5를 도시하며, 여기서 R은 알킬, 아릴 또는 PEG 치환이다.
도 12는 본 발명의 클로린의 In(III) 착체의 합성에 대한 반응식 6을 도시한다.
도 13은 요오도벤질 에터 치환기, 및 PET 영상화 및 PDT를 위한 상응하는 I-124 표지된 유사체를 함유하는 환원된 B-고리 클로린의 합성에 대한 반응식 7을 도시한다.

박테리오클로린(11)의 위치선택적 산화(고리 B에 대한 고리 D)를 위한 여러 가지 산화제의 유용성을 조사하였다. 도 9의 반응식 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 11과의 반응시 대부분의 산화제(DDQ, NIS, H₅IO₆)는 주로 산화된 고리 B 클로린(12)(메틸 3-아세틸-3-데비닐피로페오포르비드-a)을 95% 이상의 수율로 제공하였다. 그러나, 놀랍게도 염화제2철(FeCl₃) 산화는 오직 산화된 고리 D 클로린(6)만을 생성시켰다. 흥미롭게도, 이는 박테리오클로린 시스템에서 고리 D의 위치선택적 산화에서 FeCl₃의 뛰어난 유용성을 보여주는 첫번째 예이다. 본 발명에서, 용이하게 입수할 수 있는 박테리오클로로필-a로부터 신규한 클로린 시스템(환원된 B 고리 및 산화된 D 고리)에 대한 합성에 용이하게 접근할 수 있는 신규한 접근법을 증명하였다(도 9의 반응식 3).

목적하는 신규한 클로린(6)(환원된 고리 B)을 획득한 후에, 우리의 목표는 그의 3-(1'-헥실옥시에틸) 유도체(14)의 제조를 위한 효율적인 합성 방법(도 10의 반응식 4)을 개발하고 및 그의 효능을 HPPH(고리 D가 환원된 구조 이성질체)와 비교하는 것이었다. 화합물(14)의 제조에 사용되는 두 가지 합성 전략을 반응식 4에 나타내었다. 두 접근법은 목적하는 유사체를 제공하였다. 그러나, 화합물(12)의 FeCl₃에 의한 산화는 화합물 13을 생성시키고, 이는 나트륨 보로하이드라이드(NaBH₄) 및 HBr/헥산올과의 후속 반응시에 보다 우수한 전체 수율로 목적하는 헥실 에터 유도체(14)를 제공하므로, 보다 우수한 합성 접근법임이 입증되었다.

추가로, 융합된 6원 무수물(17) 또는 N-치환된 이미드 고리 시스템(19)을 함유하는 다른 박티오클로린 시스템에서 염화제2철 산화의 유용성을 조사하였다. 융합된 5원 아이소사이클릭 고리를 함유하는 박테리오클로린으로부터 수득된 결과와 유사하게, 이들 화합물은 또한 100% 수율로 각각 오직 환원된 B-고리(산화된 D 고리) 클로린(18 및 20)을 생성시켰다(도 11의 반응식 5).

매우 효과적인 금속화된 감광제: 포르피린은 열역학적 안정성 면에서 금속 착체를 제조하는데 있어 가장 우수한 리간드 중 하나이다. 대부분의 천연 포르피린(헴, 클로로필 a 및 b, 비타민 B12)은 금속 결합되고, 살아있는 유기체에 대해 어떠한 독성도 보이지 않는다. 포르피린 고리에 존재하는 금속의 성질은 그의 광화학적 및 광물리학적 특성을 변경시키는 것으로 공지되어 있다. 중심 금속 및 그의 전자 특성은 또한 포르피린의 광세포독성 가능성을 초래한다. 특정한 반자성 금속은 감광제의 삼중항 여기된 상태의 수명을 증가시키며, 이는 그의 삼중항 양자 수율을 증가시킨다. 삼중항 양자 수율이 단일항 산소의 발생 효율에 정비례하기 때문에, 삼중항 상태의 보다 긴 수명을 발생시키는 금속은 보다 효과적인 단일항 산소 생성제이어야 한다. 최근에, 클로린, 박테리오클로린 및 프탈로사이아닌과 관련된 상당수의 금속화된 PS가 임상 시도의 여러 단계에 있다. 금속화된 유사체 중에서, 박테리오페오포르비드 a의 Pd(II) 착체(WST09 또는 투캐드(Tookad))가 특히 흥미롭다. 이는 어떠한 형광 생성 효능도 갖지 않는 높은 단일항 산소 발생제(100%)이다. 불행하게도, 그의 열등한 약력학으로 인하여, 이는 오랫 동안 종양에 체류하지 않고, 매우 짧은 "치료 윈도우"로 인하여, 약물 주입 및 빛 전달은 동시에 수행되어야 하고, 이는 임상 조건하에 매우 실용적이지 못하다. 헤마토포르피린-아스파르트산 유도체의 알킬 에터 유사체의 일련의 갈륨 착체에서, 나카에(Nakae) 및 동료⁹는 갈륨의 존재 및 분자의 전체 친유성이 종양 섭취 및 PDT 효능에 중요한 역할을 담당함을 입증하였다. 시험된 화합물 중에서, 2개의 10-탄소 유닛을 갖는 HP-Asp의 갈륨 착체가 최대 효능을 나타내었다. 그러나, PDT 효능을 개선시키기 위해, 헤마토포르피린 유사체와 갈륨의 착화는 PS-파장 흡수가 630nm에 속하기 때문에 이상적인 접근이 아니다.

비금속화된 유사체와 비교하여, HPPH의 상응하는 인듐 착체(환원된 고리-B 클로린)가 향상된 PDT 효능을 나타냄을 이전에 증명하였다. 또한, 이러한 금속화된 유사체는 가시광선 선량 측정하에 보다 높은 단일항 산소 생성, 보다 높은 안정성 및 상당히 감소된 광표백 속도를 초래한다. 그러므로, 우리의 관심은 고도로 종양-친화성인 신규한 환원된 B-고리 클로린의 특정한 금속 착체(예컨대, In, Pd 및 Ga)의 효과를 조사하는 것이었다. 초기 연구에서, 클로린(13, 14 및 16)을 각각 상응하는 In(III) 착체(22 내지 24)로 전환시켰다(도 12의 반응식 6). 예비 스크리닝에서, 이들 화합물은 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다(본 발명의 생물학적 연구 부분 참고). 유리 염기 및 금속화된 유사체의 생체내 생물학적 조사는 현재 진행중이다.

개선된 PET 영상화 및 PDT용 이작용성 시약: 피로페오포르비드-a 시스템에서, 분자의 위치 3에서 요오도벤질 에터 치환기의 도입 및 차가운 요오드의 I-124로의 대체는 이들을 영상화(PET) 및 광역학적 치료에 적합한 후보자로 만든다는 것을 이전에 증명하였다(도 7의 반응식 1). I-124의 긴 반감기(4.2일)는 최적 종양 섭취(24 내지 48시간) 및 감광제의 약력학을 제공한다. 그러므로, 우리의 관심은 신규한 클로린 시스템(8)(도 2)에서 동일한 치환기를 도입하고, 종양 섭취 및 광감작 효능을 관련된 피로페오포르비드-a 유사체(4) 및 I-124 유사체 5를 갖는 PET 영상화(도 7의 반응식 1)와 비교하는 것이었다. 박테리오클로린(11)으로부터 목적하는 요오드화된 감광제(8) 및 상응하는 I-124 유사체(27)의 제조를 위한 합성 접근은 도 13의 반응식 7에 나타내었다.

광물리학적 특성: 효과적인 감광제에 대한 주요 요건 중 몇몇은 높은 소광 계수 값, 높은 단일항 산소 생성 효능, 높은 종양 친화성, 및 피부 및 주변 근육에서의 약한 섭취와 함께 650nm 초과의 긴 흡수 파장을 갖는 것이다. 따라서, 박테리오클로로필-a로부터 유도된 신규한 감광제(환원된 B 고리 클로린)의 전자 흡수 스팩트럼을 클로로필-a로부터 얻은 환원된 D-고리 클로린과 비교하였다. 도 3에 요약한 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 클로로필-a로부터 유도된 환원된 고리-D 클로린과 비교하여, 박테리오클로로필-a로부터 얻은 환원된 고리-B 클로린은 보다 긴 파장 흡수를 나타내었다. 흥미롭게도, 융합된 무수물(18) 및 이미드 고리(21) 시스템을 함유하는 클로린은 745nm 초과의 긴 파장 흡수를 나타내었다.

생체외 광감작화 효능(MTT 어세이): 결장-26 세포를 10% 우 태아 혈청 및 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 α-DMEM에서 성장시켰다. 세포를 5% CO₂ 및 95% 공기에서 100% 습도로 유지시켰다. 광독성 연구를 위해, 세포를 완전 배지 중 5 ×10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 판에 두었다. 24시간 후에, 다양한 농도로 화합물을 첨가하였다. 37℃에서 암실 중 24시간 배양 후, 세포를 5.6mW/cm²의 선량에서 0 내지 2J/cm²의 노를 사용하는 아르곤 펌프식 염료 레이저로부터 레이저 빛으로 조사하였다. PDT 후에, 세포를 1회 세척하고, 완전 배지에 두고 48시간 동안 배양하였다. 최종적으로 4시간 동안 4mg/ml MTT의 10㎕/웰로 세포를 배양하였다. MTT-함유 배지를 제거하고, 100㎕ DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 웰의 흡광도는 560nm의 파장¹⁰에서 마이크로타이터 판 판독기 상에서 판독하였다. 결과를 생존 분율 대 동일한 농도에서 사용되는 빛의 양으로서 플롯하였다. 알 수 있는 바와 같이, 모든 화합물 중에서 유리-염기 유사체와 비교하여 상응하는 In(III) 착체는 향상된 활성을 생성하였다. 흥미롭게도, 치환기의 주변 위치에서의 효과는 또한 상당한 활성 차이를 보였다. 예를 들면, 지금까지 시험된 모든 화합물 중에서, 위치 3에서 아세틸 기를 함유하는 화합물(22 및 23)이 가장 효과적이었으며, 일반적으로 환원된 D-고리 클로린과 비교하여(4 및 8 제외), 환원된 고리 B-클로린이 보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이들 화합물은 생체내 효능에 대해 현재 평가중이며, 여기에서 분자의 약력학적 및 약동학적 특성은 효능에 상당한 영향을 끼칠 것이다.

생체내 종양 섭취: 감광제(3 및 14)의 종양 대 피부/근육 섭취를 생체내 반사율 분광학에 의해 결정하였다. 생체내 반사 데이터를 해당 조직(종양 및 피부)과 접촉하는 석영 섬유를 통해 단색성 빛을 전달함으로써 모았다. 전달 섬유로부터 측정된 거리(전형적으로, 대략 5mm)에서, 픽업 섬유를 표면과 접촉하게 두었다. 두 섬유는 조직 표면에 수직이었다. 측정 동안 PDT 효과를 방지하기 위해 매우 낮은 광학 전력 수준(1μW)이 이 실험에 필요하다. 픽업 섬유로 들어오는 빛은 규소 광다이오드 검출기로 전도되었다. 검출기 회로는 7 내지 8 이상 정도의 전력 크기에서 선형인 광전류를 측정하였다. 조직의 광학 특성으로 인한, 600 내지 1000nm 사이의 영역에서 가장 좋은 유용성을 갖는 스팩트럼 범위. 이러한 스팩트럼 범위에서, 레이저에 의한 광자의 확산 산란 확률은 흡수 확률보다 더 크다. 빛의 파장은 단색화 장치의 스캐닝에 따라 달라지며, 확산 산란된 광자의 스팩트럼을 기록하였다. 농도를 계산하기 위해, 가장 긴 흡수 파장을 사용한 후 잘 정립된 방법론을 사용하였다.

유사한 친유성(5.0μmol/kg)을 갖는 HPPH 메틸 에스터(3) 및 관련된 환원된 B-고리 클로린(14)의 종양 대 피부 흡수를 생체내 반사율 분광학에 의해 측정하였다. 전형적인 실험에서, 감광제를 결장-26 종양을 갖는 BALB/c 마우스에 개별적으로 주입하고, 생체내 흡수를 다양한 시간에 측정하였다. 종양 및 피부 흡수 스팩트럼, 및 이들 부위에서 주입후 24시간째에 감광제의 농도를 각각 도 5 및 6에 나타내었다. 유사한 실험 조건하에, 환원된 고리 B 클로린의 종양 대 피부 섭취를 또한 측정하였다. 도 5 및 6에서 알 수 있는 바와 같이, 두 감광제는 높은 종양 섭취를 보였다. 그러나, 화합물 14의 경우 종양 대 피부 비율은 9:1이었고, 이는 화합물 3a에 의해 관찰된 것보다 상당히 높은 비율이었으며, 이는 클로린(14)이 화합물(3a)보다 감소된 피부 광독성을 나타냄을 시사한다.

본 발명의 장점은 다음과 같다:

(i) 신규한 환원된 B-고리 클로린의 합성을 위한 출발 물질(로도박터 스파에로이데스)이 용이하게 입수가능하다.

(ii) 목적하는 화합물의 제조는 높은 수율을 갖는 제한된 합성 단계를 요구한다.

(iii) 현재 인간 임상 제I/II상 시험중인 HPPH 3a(환원된 고리 D 클로린)와 비교하여, 유사한 친유성을 갖는 클로린(14)(환원된 고리 B)은 보다 높은 종양 대 근육 비율, 보다 긴 파장의 흡수 및 보다 높은 생체외 PDT 효능을 초래하였다.

(iv) 유리 염기 유사체(6 및 14)와 비교하여, 상응하는 In(III) 유사체(22 및 24)는 각각 향상된 PDT 효능을 초래하였다. 차가운 인듐을 In-111로 대체하여 SPECT 영상화 능력을 갖는 PDT 시약을 제공할 수 있었다(이중-작용성 시약).

(v) 또한, 신규한 환원된 B-고리 요오도벤질 클로린(8)은 높은 종양 친화성을 나타내었다. 관련된 I-124 유사체는 PET 영상화 및 PDT에 유용할 수 있다.

(vi) 박테리오클로로필-a로부터 출발하여, 신규한 클로린 시스템의 제조에 신규하고 효율적인 합성을 개발하였다(5원 아이소사이클릭 고리 또는 6원 융합된 무수물 고리 또는 6원 융합된 N-치환된 이미드 고리 시스템을 함유). 이러한 모든 유사체는 상응하는 환원된 D-고리 클로린보다 더 긴 파장 흡수를 나타내었다.

(vii) 높은 종양 친화성 및 긴 파장의 흡수로 인하여, 이들 화합물은 영상화(형광, PET/SPECT)용 "다작용성 시약" 및 암의 광역학적 치료를 개발하는데 매우 유용하다.

신규한 감광제의 합성 및 특성화:

환원된 B 고리 클로린(6): 박테리오피로페오포르비드-a(11)(50.0mg, 0.0883mmol, 1.0 당량)를 다이클로로메테인(50ml)에 용해시켰다. 이 혼합물에, FeCl₃·6H₂O(95.5mg, 4.0 당량)의 나이트로메테인(4ml) 용액을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하고 H₂O로 3회 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 수득된 고체는 다음 단계에 사용하기에 충분히 순수하였다. 수율: 49.0mg, 99%.

클로린(13): 화합물 6(40.0mg, 0.0108mmol, 1.0 당량)을 다이클로로메테인/메탄올(20ml, 4:1, v/v)에 용해시켰다. 나트륨 보로하이드라이드(10.8mg, 4.0 당량)를 여기에 첨가하였다. 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반하고, NaHCO₃ 포화 용액, 염수 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 5% 아세톤). 수율: 27.3mg, 68%.

박테리오클로린(15): 박테리오피로페오포르비드-a(10)(50.0mg, 0.0883mmol, 1.0 당량)를 다이클로로메테인/메탄올(25ml, 4:1, v/v)에 용해시켰다. 나트륨 보로하이드라이드(36.6g, 10 당량)를 여기에 첨가하였다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하고, NaHCO₃ 포화 용액, 염수 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 수득된 고체는 다음 단계에 사용하기에 충분히 순수하였다. 이 화합물은 타미아키(Tamiaki) 등에 의해 보고되었다(문헌[Tamiaki, H.; Kouraba, M.; Takeda, K.; Kondo, S.-i.; Tanikaga, R. Tetrahedron Asymmetry 1998, 9, 2101-2111]). 수율: 49.7mg, 99%.

박테리오클로린(16): 화합물 14의 합성에 기재된 절차에 따라, 화합물 15(50.0mg, 0.0879mmol, 1.0 당량)를 HBr 기체, C₆H₁₃OH(0.1ml) 및 K₂CO₃(50mg)으로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 헥세인 중 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다. 수율: 43.0mg, 75%.

클로린(14): 방법 A(화합물 13으로부터): 클로린 13(40.0mg, 0.0705mmol, 1.0 당량)을 N₂하에 무수 CH₂Cl₂(4ml)에 용해시켰다. 2분 동안 이 혼합물에 HBr 기체를 버블링하였다. 실온에서 5분 동안 N₂하에 교반한 후, 혼합물을 탈기시키고, C₆H₁₃OH(0.1ml) 및 K₂CO₃(40.0mg)을 즉시 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고 H₂O로 3회 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 3% 아세톤). 수율: 33.0mg, 71%.

방법 B(화합물 16으로부터): 화합물 6의 제조에 기재된 절차에 따라, 화합물 16(40.0mg, 0.0705mmol, 1.0 당량)을 FeCl₃·6H₂O(66.3mg, 4.0 당량)로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 3% 아세톤)에 의해 정제하였다. 수율: 25.2mg, 55%.

In(III) 클로린(24): 무수 톨루엔(10ml) 중 클로린 14(30.0mg, 0.046mmol, 1.0 당량), InCl₃(50.8mg, 5.0 당량), K₂CO₃(31.7mg, 5.0 당량)을 1시간 동안 N₂하에 환류하여 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 CH₂Cl₂(20ml)로 희석하고, 셀라이트(Celite)를 통해 여과하였다. 용매를 물로 3회 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 5% MeOH). 수율: 28.7mg, 78%.

클로린(22): 화합물 24의 합성에 기재된 절차에 따라, 화합물 6(30.0mg, 0.0531mmol, 1.0 당량)을 InCl₃(58.8mg, 5.0 당량) 및 K₂CO₃(36.7mg, 5.0 당량)으로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 5% MeOH)에 의해 정제하였다. 수율: 30.5mg, 81%.

클로린(13): 박테리오피로페오포르비드-a(11)(50.0mg, 0.0883mmol, 1.0 당량)를 다이클로로메테인(50ml)에 용해시켰다. 이 혼합물에, DDQ(20.0mg, 1.0 당량)의 CH₂Cl₂(2ml) 용액을 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하고 H₂O로 3회 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄로부터 건조시키고, 건조물로 증발시켰다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 3% 아세톤). 이 화합물은 타미아키 등에 의해 보고되었다(문헌[Tamiaki, H.; Yagai, S.; Miyatake, T. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 2171-2178]). 수율: 41.0mg, 82%.

클로린(23): 화합물 24의 합성에 기재된 절차에 따라, 화합물 13(30.0mg, 0.0531mmol, 1.0 당량)을 InCl₃(58.8mg, 5.0 당량) 및 K₂CO₃(36.7mg, 5.0 당량)으로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 5% MeOH)에 의해 정제하였다. 수율: 33.0mg, 87%.

융합된 무수물 고리를 갖는 클로린(18): 화합물 6의 제조에 기재된 절차에 따라, 화합물 17(20.0mg, 0.0336mmol, 1.0 당량)을 FeCl₃·6H₂O(36.2mg, 4.0 당량)로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 수율: 19.8mg, 99%.

6원 N-알킬 이미드 고리를 갖는 클로린(20): 화합물 6의 제조에 기재된 절차에 따라, 화합물 19(20.0mg, 0.023mmol, 1.0 당량)를 FeCl₃·6H₂O(32.0mg, 4.0 당량)로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 수율: 19.8mg, 99%.

박테리오클로린(25): 화합물 16의 합성에 기재된 절차에 따라, 화합물 15(50.0mg, 0.0879mmol, 1.0 당량)를 HBr 기체, 3-요오도벤질 알콜(0.1ml) 및 K₂CO₃(50.0mg)으로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 헥세인 중 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다. 수율: 42.8mg, 62%.

클로린(8): 화합물 6의 제조에 기재된 절차에 따라, 화합물 25(40.0mg, 0.051mmol, 1.0 당량)를 FeCl₃·6H₂O(55.1mg, 4.0 당량)로 처리하여 목적하는 생성물을 수득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, CH₂Cl₂ 중 3% 아세톤)에 의해 정제하였다. 수율: 20.0mg, 50%.

Claims

광감작성 또는 종양 영상화 특성을 갖고 산화된 d 고리 및 환원된 b 고리를 갖는, 하기 화학식 1A의 테트라피롤 감광제 또는 영상화제 화합물 또는 그의 X 착체로서, 이때 X가 In 또는 ¹¹¹In 이고, 하기 화학식 1A의 화합물의 하나 이상의 중심 질소 원자에 결합하는 것에 의해 착체를 형성하는, 화합물:
화학식 1A

상기 식에서,
R₁은 -C(=O)R₁₃, 또는
이고, 여기서 R₁₃은 수소 또는 C_1-8 알킬이고, R₉는 -OR₁₀이고, R₁₀은 수소, C_1-8 알킬 또는 -CH₂R₁₄이고, R₁₄는 비치환되거나, 또는 F, Cl, Br, I 또는 ¹²⁴I 로 치환된 페닐이고,
R₂및 R₃은 C_1-8 알킬이고,
R₄ 및 R₁₃은 독립적으로, 수소 또는 C_1-8 알킬이고,
R₅ 및 R_5a는 함께 카보닐기를 형성하고,
R₇ 및 R_7a는 수소, C_1-8 알킬 또는 함께 카보닐기를 형성하고,
R₆은 -N(R₁₂)- 또는 공유 결합이고,
R₈은 -(CH₂)₂COR₁₅이고, 여기서 R₁₅는 -O-C_1-8 알킬이고, R₁₂는 수소 또는 C_1-8 알킬이다.
제 1 항에 있어서,
95% 이상의 순도를 갖는 화합물.
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제 1 항에 있어서,
R₆이 -N(R₁₂)-인 화합물.
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제 1 항에 있어서,
R₆이 공유결합인 화합물.
제 1 항에 있어서,
R₁₄가 ¹²⁴I로 치환된 페닐이고, X가 할로겐화된 인듐이고, PET(양전자 방사 단층 촬영, positron emission tomography), SPECT(단일 광자 방사 단층 촬영, single photon emission computed tomography) 및 PDT(광역학적 치료, photodynamic therapy)에 의해 종양 영상화 능력을 갖는 화합물.
하기 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 테트라피롤 감광제 또는 영상화제 화합물:

상기 식에서,
R은 -COCH₃ 또는 -CH(OR₃)CH₃이고,
R₃은 1 내지 8개의 탄소 유닛을 갖는 포화 알킬 쇄이고,
R₁은 CO₂R₄이고,
R₄는 1 내지 8개의 탄소 쇄 알킬이고,
R₂는 O 또는 NR₅이고,
R₅는 1 내지 8개의 탄소 유닛을 갖는 알킬이고,
M은 2H이다.
제 1 항에 있어서,
660 내지 750nm 범위에서 파장 흡수를 갖는 화합물.
환원된 b 및 d 고리 테트라피롤 화합물로 출발하여, 이를 할로겐화된 탄화수소 용매에 용해시키고, 이를 FeCl₃·6H₂O의 충분한 나이트로알케인 용액으로 처리하여 d 고리를 산화시키고, 생성된 유기 층을 분리하고 건조시킴으로써 95% 이상의 수율로 제 1 항에 따른 화합물을 제조하는 방법.
제 12 항에 있어서,
환원된 b 및 d 고리 클로린을 처리하여 환원된 b 고리 - 산화된 d 고리 클로린을 수득하는 방법.
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제 13 항에 있어서,
출발 테트라피롤 화합물이 메틸 박테리오피로페오포르비드-a인 방법.
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