PT863903E - Derivados sintéticos de bacterioclorofila substituídos por metal e a sua utilização - Google Patents

Description

*B»mKDQ8 SINTÉTICOS DE BACTERIOCLOROFILA SUBSTITUÍDOS POR METAL E A SUA UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um novo método da preparação de derivados da bacterioclorofila metalizada para utilização em métodos de terapia forodinâmica in vivo (PPT) e no diagnóstico e na morte forodinâmica in vitro dos vírus e dos microrganismos, e a alguns novos derivados da bacterioclorofila substituídos por metal. BChl = bacterioclorofila a (7,8,17,18-tetra-hidroporfirina que contém Mg da fórmula I a partir daqui em que M é Mg, pi é fitilo ou geranilgeranilo, R2 é COOCH3, R3 é H, R4 na posição 3 é acetilo e na posição 8 é etilo).

Derivado de BChl = um derivado de BChl com modificações no macrociclo, no átomo de metal central e/ou na periferia, incluindo os derivados das fórmulas I, II, III e I', II', III' em seguida. BPhe - bacterioclorofila a (BChl em que c Mg central ê substituído por dois átomos de H).

Chi = clorofila (um derivado de 17,18-dí-hidroporfírina que contém Mg feito de um macrociclo que consiste de 4 pirrolos e um anel isocíclico que são conjugados um ao outro e ligados ao átomo de Mg) . A clorofila a tem a fórmula I em seguida em que E?. é fitilc, R2 e COOCH3, il * H, R4 na posição 3 e vinilo e na posição 8 é etilo. |M] = derivado de BChl em que o átomo de Mg central foi substituído por um metal M como o definido a partir daqui. PDT = Terapia fotodinâmica

Phe = feofitina a (Chi em que o Mg central é substituído por dois átomos de H).

As (bacterio) clorofilas ((B)Chl) que contêm Mg e as suas bases livres, as (bacterio)feofitinas ((B)Phe), são essenciais para a fotossíntese. Elas actuam como pigmentos de antena ou de redox permitindo a separação da carga induzida pela luz dentro do centro da reacção. Os pigmentos são também fotosensibilizadores potenciais úteis, por exemplo na terapia fotodinâmica do tumor.

As porfirinas têm sido mostradas como se acumulando no tecido do tumor e, depois de irradiação do tecido do tumor, para absorver a luz in situ, fornecendo um meio para detectar tumores pela localização da fluorescência. Um derivado bruto da hematoporfirina, conhecido como 0 derivado da hematoporfirina ou o HPD, foi proposto tanto para a detecção como para a terapia fotodinâmica dos tumores. Uma forma do HPD tido como sendo mais eficaz compreende uma parcela de HFC que tem um peso agregado de mais de 10 Kda e é o assunto da Patente norte americana No. 4 649 151. O HPD ou os seus componentes activos foram descritos na Patente norte americana No. 4 753 958 para o tratamento tópico de doenças da pele, e em Matthews et al., 1988, para a esterilização das amostras biológicas que contem organismos infecciosos tais como as bactérias e os vírus. A fim de optimizar o desempenho dos fármacos da porfirina em terapêutica e em diagnóstico, diversos derivados de porfirina foram propostos em que, por exemplo, há um átomo de metal central complexado aos quatro anéis de pirrola, e/ou os substituintes periféricos dos anéis de pirrola são modificados e/ou o macrociclo é di-hidrogenado aos derivados de Chi (clorinas) ou tetra- hidrogenados aos derivados de BChl (bacterioclorinas).

Os complexos de tetra-pirrolas cíclicos com metais a excepção de Mg foram estudados na porfirina e em 17,18-di-hidroporfirina de série para compreender as suas propriedades espectrocóspicas e as de redox (Hynninen, 1991). As bacterioclorofilas são de vantagem potencial comparadas com as clorofilas porque mostram faixas próximo dos infravermelhas intensas, isto é em comprimentos de ondas consideravelmente mais longos do que os derivados das clorofilas. No entanto, pouca informação está presentemente disponível em bacterioclorofilas com metais centrais a excepção do Mq. e o 0 pedido de publicação internacional PCT. No. WO 90/12573 de Dougherty descreve derivados de barteriociorofliã a ou b ou das bacterioclorinas correspondentes com falta de átomo de metal central ou nas quais o átomo de metal central pode ser um metal não paramagnético seleccionado de Mg^T, de Bíf* e de ZnÍT, é esterificado com um resíduo de grupo de hidrocarbilo saturado ou não saturado de 8-25C, para a fabricação de uma composição para utilização num método para efectuar a destruição ou o debilitamento de substratos biológicos alvo indesejados, cujo método compreende a fotosensibização do referido substrato com uma quantidade eficaz do referido derivado, seguida pela irradiação do substrato alvo com a radiação numa faixa de comprimento de onda absorvida pelo referido derivado durante um período eficaz para danificar ou para destruir o substrato. Em adição, os compostos são tidos como sendo úteis na terapia e no diagnóstico fotodinâmicos. Deve ser notado que embora os complexos de Sn/+ e de Ζηέ+ da bacterioclorofila a ou b sejam reivindicados, estes derivados de metal não foram exemplificados nem qualquer método para sua preparação foi descrito na especificação do referido pedido de patente WO 90/12573.

Losev et ai., 1990, descrevem os complexos de [Pd]-BChl e [Cu]-BChl BChl tidos como sendo preparados pelo metalação directa de BPhe com o benzonitrilo de Pd em benzeno numa corrente de azoto ou com uma solução concentrada de ÇfôCla em metanol, respectivamente. No entanto, a esta publicação faltam detalhes do método de preparação e de caracterização dos complexos de metal. Além disso, a preparação do complexo de [Pd]-BChl de acordo com Losev não podia ser repetida por nós.

Sob condições normais de libertação, isto é na presença de oxigénio a temperatura ambiente e sob condições de luz normais, as fracções de BChl são lábeis e têm uns rendimentos quânticos um tanto mais baixos para a formação do estado tripo, quando comparados com, por exemplo, o derivado da hematoporfirina (HPD). No entanto, a sua iniciação possível de reacções de redox biológicas, de características de espectro favoráveis e do seu resultado in vivo da degradação pronta na superioridade potencial das bacterioclorofilas sobre outros compostos, por exemplo as porfirinas e as clorofilas, para a terapia e o diagnóstico de PDT e para a morte das células, dos vírus e das bactérias nas amostras e em tecido vivo. A modificação química das bacterioclorofilas é esperada para melhorar adicionalmente as suas propriedades, mas isto tem sido muito limitado devido a falta de métodos apropriados para a preparação de tais bacterioclorofilas modificadas (Hynninen, 1991). 0 pedido de patente europeia publicada sob o No. 0584552 do mesmo requerente do presente pedido descreve novos conjugados de Chi e de BChl com amino ácidos, péptidos e proteínas para a utilização na terapia e no diagnóstico de PDT. O resíduo do amino ácido, do péptido ou da proteína está ligado directamente ou através de um espaçador ao grupo de carboxilo de C-173 da molécula de Chi ou de BChl. Estes conjugados são preparados pelos métodos que são bastante suaves para reter o átomo de Mg central lábil de ácido. Os complexos de Zn e de Cu do éster de metilo da clorofila a também foram aqui descritos, mas nenhuma bacterioclorofila metalada nem um método para sua preparação foi aqui descrito. O pedido de patente alemã No. DE 4121876 descreve os derivados da bacterioclorofila em que os ésteres modificados nãs posições C-13% C-17' são obtidos sob circunstâncias suaves através de rápida transesterificaçâo alcalina, permitindo umas mudanças adicionais no anel isocíclico enquanto retém o Mg central, pelo qual a absorção do pigmento é deslocada élèm de 800 nanómetros. 0 pedido também menciona os complexos de metal dos referidos derivados de Bchl com Zn ou Ni, mas os referidos complexos não foram exemplificados nem um método para sua preparação foi aqui descrito.

Seria desejável preparar novos complexos metalados de BChl para a utilização em PDT, a fim de manter ou mesmo melhorar as propriedades ópticas e fisiológicas favoráveis de BChls enquanto se optimiza a sua potencial fotosensibilização bem como melhorar a sua estabilidade quimica e optimizar os seus periodos de vida fisiológica. A transmetalação resulta nas mudanças distintas na reactividade e na estabilidade químicas dos BChls, que são importantes para as novas modificações do macrociclo e dos substituintes periféricos, e em particular para optimizar o seu transporte, o seu tempo de vida alvo e biológico e minimizar os efeitos tóxicos colaterais. A transmetalação resulta também em mudanças distintas nas propriedades do estado excitado, incluindo o rendimento e o período de vida do triplo, a acessibilidade de estados excitados mais elevados, e a produção de espécies de oxigénio citotéxicas.

Diversos métodos são conhecidos para a variação do átomo de metal central nas porfirinas (ver Buchler, 1975). As porfirinas são rapidamente acessíveis e quimicamente estáveis, ainda que espectralmente e fisiologicamente desfavoráveis.

Poucos stêtsdoss são conhecidos para a metalação directa ou indirecta das clorofilas. Strell e Urumow, 1977, descrevem os complexos de [Cr]-Chi e de [Mn]-Chi preparados peia transmetalação do complexo de [Cd]-Chi (obtido pela reacção do derivado de Chi desmetalado com acetato do cádmio em metancl ou em metanol sob a a piridina) com o acetato de ou atmosfera de N2. Este método de transmetalação é tido como sendo apropriado também para os complexos de Cu, Zn, Co e Pb dos derivados de clorofila, mas não para Fe3+, Ni e Mg. No entanto, uma vez que os complexos de Cu, Zn, Co e Pb podem ser preparados pela metalação directa em Phe, o método seria vantajoso somente para o Cr e o Mn. Os autores descrevem também a preparação do complexo de [Mg]-Chi pela metalação directa de Phe em acetona com acetato de Mg em dimetilsulf óxido.

Pouca informação está presentemente disponível em bacterioclorofilas com metais centrais a excepção de Mg. A metalação das bacterioclorofilas é conhecida como sendo mais difícil do que a das clorofilas devido a sua reactividade diminuída para a metalação e a reactividade aumentada para as reacções laterais. Um método específico para a inserção de Mg em bacteriofeofitina foi descrito (Wasielewsky, 1977). Os presentes inventores tentaram os procedimentos directos da metalação e da transmetalação para os derivados de clorofila descritos por Strell e por Urumow para a preparação de complexos de metal de derivados de bacterioclorofila, mas todas as tentativas foram mal sucedidas. A metalação directa de derivados de bacteriofeofitina não funcionou com nenhum metal experimentado, a excepção de Cu e de Zn, e resultou de outra maneira numa mistura de bacteriofeofitina não reagida e de produtos de oxidação não metalados de um tipo de 3-acetil- clorofila. presente invenção que os

Foi agora verificado de acordo com a complexos de metal de derivados de bacterioclorofila podem ser obtidos por uma modificação do processo de transmetalação para a metalação dos derivados de clorofila publicados por Strell e por Urumow, usando sais e solventes de metal apropriados. A presente invenção refere-se assim a um novo processo para a preparação de derivados de bacterioclorofila sintéticos metalados da fórmula: [M]-BChl em que o derivado de [M]-BChl e seleccionado a partir de um composto da fórmula geral I, II ou III:

I

II

em que Fj é um resíduo de hidrocarbilo CtKluq R2 é H, OH ou CC>0%., quando o composto e de fórmula ou tóí quando o composto ê de fórmula II, em que R5 (¾ ou cilcoalquilo C::rC:::··.; R;i é H, OH ou alquilo ou alcoxilo quando o composto E de fórmula I, ou R3 ê H ou alquilo ou alcoxilo f quando o composto é de fórmula II; R4 e cada um seleccionado independentemente a partir do grupo que consiste de vinilo, etilo, acetilo, 1-hidrcxietilo e dos seus éteres e ésteres; e M representa um metal com um raio iónico mais pequeno do que aquele de Cd (r-95 pm), sendo o referido metal M seleccionado a partir do grupo que consiste de um metal divalente seleccionado a partir do grupo que consiste de Pd, Co, Ni, e Mn, um metal trivalente seleccionado a partir do grupo que consiste de Fe, Mn e Cr, e um metal tetravalente seleccionado a partir do grupo que compreende Sn e Pt; cujo processo compreende: (i) fazer reagir um derivado de bacteriofeofitina que corresponde ao referido BChl, dissolvido em dimetilformamida com acetato de Cd desidratado em atmosfera de AR e recuperar o complexo de [Cd]-BChl a partir da mistura de reacção por cromatografia sob condições reduzidas; (ii) fazer reagir o complexo de [Cd]-BChl produzido no passo (i) dissolvido em acetona seca com um sal M de metal desidratado apropriado seleccionado a partir de cloreto M de metal, acitato e acetil-acetonato em atmosfera de AR; e (iii) recuperar o derivado de [M]-BChl metalado desejado a partir da mistura de reacção. A partir dos derivados acima de [M]-BChl de fórmulas I, II e podem ser obtidos derivados adicionais por reacção com composto de fórmula RS-OH sob condições de transesterificação posição ΓΙ' tais como compostos das fórmulas I', II' e III': um na

em que κ?;. é seleccionado a partir do grupo que consiste de: (i) um resíduo do hidrocarbilo CuKiu; opcionalmente substituído por halogéneo, oxo (=0), OH, CHO, COOH, ou NH2, ou um tal resíduo interrompido por um ou mais heteroátomos seleccionados a partir de 0, S e NH, ou por um anel de fenilo; (ii) um resíduo de um amino ácido ou de um péptido que contém um grupo de hidroxilo ou um seu derivado seleccionado a partir do grupo que consiste de ésteres e de derivados protegidos de N, e em que o seu referido amino ácido ou derivado hidroxilado é ligado ao resíduo de COO através do grupo de hidroxilo; (iii) um resíduo de um péptido como definido em (ii) ligado ao resíduo de COO através de um resíduo de hidrocarbilo C1-C25 opcionalmente substituído per haiogéneo, oxo, OH, CHO, COOH, ou ou um tal resíduo interrompido por um sus mais heteroátomos seleccionados a partir de 0, Se NH, ou por m anel de fenilo, é adicionalmente substituído por um grupo funcional terminal seleccionadc a partir de OH, COOH, ou NH2; e íivi um resíduo de um ligando específico de célula seleccionado a partir de um péptido e de uma proteína directamente ligados ao resíduo de COO ou através de um resíduo de de hidrocarbilo opcionalmente substituído por halogéneo, oxo, OH, CHO, COOH, ou NH2, ou interrompido por um ou mais heteroátomos seleccionados a partir de 0, Se NH, ou por um anel de fenilo, é adicionalmente substituído por um grupo funcional terminal seleccionado a partir de OH, COOH, ou NH2; R2 é H, OH ou COOR5, quando 0 composto é de fórmula I', ou Rj é H ou R5, quando 0 composto é de fórmula II', em que R5 é alquilo ou cicloalquilo íópllu;) R3 e H, OH ou alquilo ou alcoxilo C1-C12 quando 0 composto é de fórmula I', ou -¾ é H ou alquilo ou alcoxilo C--C12 quando 0 composto é de fórmula II'; R4 é cada um independentemente seleccionado a partir do grupo que consiste de vinilo, etilo, acetilo, 1-hidroxietilo e os seus éteres e ésteres; e M representa um metal com um raio iónico mais pequeno do que aquele do Cd ír=95 pm) , sendo 0 referido metal M seleccionado a partir do grupe que consiste de um metal divalente seleccionado a partir do grupo que consiste de Pd, Co, Ni, e Mn, um metal trivalente seleccionado a partir do grupo que consiste de Fe, Mn e Cr, e um metal tetravalente seleccionadc a partir do grupo que compreende Sn e Pt.

Numa forma de realização preferida, o derivado de [M]-BChl é de fórmula I em que Mi é fitilo ou geranilgeranilo, Iç é COOCH3, te á H ou OH, R4 na posição 3 é acetilo e na posição 8 é etilo e o metal M é Pd, Ni, Co, ou Mn. Numa outra forma de realização preferida, o sal M de metal empregue no passo (ii) é um cloreto de metal.

Numa outra forma de realização adicional, os passos (i) e (ii) podem ser combinados em um único passo, isto é o derivado de bacteriofeofitina é feito reagir com um excesso do sal M de metal desidratado apropriado, por exemplo o cloreto de metal, na presença de quantidades catalíticas do sal de Cd desidratado, por exemplo acetato de Cd, em dimetilformamida ou em acetona.

Os novos derivados de metalobacterioclorofila da invenção das fórmulas I, II e III e os compostos daí derivados por transesterificação na posição H'' como definido acima são para a utilização como fotosensibilizadores como agentes terapêuticos e de diagnóstico, e para matar células, vírus e bactérias nas amostras e em tecidos vivos, como bem conhecido na técnica para o HPD e outros fotosensibilizadores.

A Fig. 1 mostra a fototoxicidade do éster de metilo de [Pd]— o ( [Pd]-BChl-Ser) e do éster de metilo de BChI serilo (BChl-Ser) em suspensões bacterianas de S. aureus. A Fig. 2 mostra a fototoxicidade de [Pd]-BChl-Ser em células de melanoma de M2R em cultura por incorporação de rB] .

Em contraste as porfirinas e as clorofilas, a metalação directa das bacterioclorofilas é difícil. 0 método da presente invenção permite a obtenção de derivados de bacterioclorofilas metaladas que têm propriedades melhoradas para a utilização como fotosensibilizadores pela transmetalação dos derivados de [Cd]— BChl correspondentes.

De acordo com a presente invenção, os complexos de [Cd]-BChl, são rapidamente acessíveis pelo método de acetato/dimetilformamida, podem ser transmetalados em rendimento excelente aos outros complexos do metal sob circunstâncias suaves. A transmetalação fácil usando [Cd]-BChl como o precursor é surpreendente e provavelmente devida em parte ao raio iónico grande (rM) de Cd2+ (95 pm) comparado a Hu"'' (rM=72 pm) . Um segundo factor é o solvente (acetona) em combinação com os contraiões de metal (cloretos) usados para a reacção. Durante a transmetalação, o CdCfe e [M]-BChl são formados em equilíbrio com os eductos, e a solubilidade muito baixa de CdC.la em acetona desloca o equilíbrio para o lado dos produtos.

Numa forma de realização da presente invenção, é qualquer radical de hidrocarbiio, linear ou ramificado, saturado ou não saturado, incluindo aromático, de um modo preferido de 1-25 átomos de carbono, tais como alquilo, o alcenilo, fenilo, de um modo preferido um alquile mais baixo de átomos de um modo mais preferido etilo, ou um radical derivado dos compostos naturais de Bchi, por exemplo geranilgeranilo r;?, i 1 -2, á™ octadienilo) ou fitilo (2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-en-16-il) ; e R'i é como definido para i.* ou é uma tal cadeia de hidrocarboneto substituída por um átomo de halogéneo seleccionado a partir de F, Br, Cl e I, ou por OH, oxo, CHG, CGOH ou NH2, ou uma tal cadeia de hidrocarbilo opcionalmente substituída interrompida por 0, S ou NH, de um modo preferido 0, por exemplo R'i é um resíduo de oligo-oxietilenoglicol de 4 a 10 átomos de carbono, de um modo preferido penta-oxietilenoglicol. Quando serve como um espaçador para um péptido ou uma proteína como definido aqui, terá um grupo funcional terminal seleccionado a partir de OH, COOH e NH2, através de cujo grupo funcional terminal o péptido ou a proteína é ligado por uma ligação de éster ou de amido.

Numa outra forma de realização, R‘χ é o resíduo de um amino ácido ou de um péptido que contém um grupo de hidroxilo, tal como serina, treonina e tirosina, ou os péptidos que os contêm, ou um derivado do referido amino ácido ou péptido seleccionado a partir de ésteres, por exemplo ésteres de alquilo, e derivados protegidos de N em que o grupo de protecção de N é por exemplo terc-butoxilo, carbobenzoxilo ou tritilo, e o referido amino ácido ou péptido ou o seu derivado hidroxilado é ligado ao grupo de COO através do grupo de hidroxilo. Os exemplos de tais derivados do amino ácido são o éster de metilo de serina, o éster de metilo de N-tritil-serina, o éster de metilo de tirosina, e o éster de metilo de N-terc-butoxi-tirosina, e um exemplo de um tal péptido é o éster de metilo de serina de N-carbobenzoxi-serilo, todos eles preparados como descrito no documento EP 0584552. Numa forma de realização mais preferida, o derivado de [M]-BChl é c [Pd]-BChl esterificado com o éster de metilo de L-serina.

Em uma outra forma de realização, G' é c resíduo de um ligando específico de célula seleccionado a partir dos péptidos e das proteínas, que são exemplificados, mas não limitado a, péptidos de hormona, por exemplo hormonas que estimulam o melanocito (melanotropinas), e anticorpos, por exemplo as imunoglobulinas e anticorpos específicos de tumor.

Os derivados de [M]-BChl da fórmula 1' em que M é Zn ou Cu podem ser preparados também por metalação directa do derivado de BChl desmetalado como descrito a seguir nos Exemplos 1 a 4.

Alguns complexos de metal de bacterioclorofilas são muito estáveis e assim podem ser usados para modificações adicionais na periferia do sistema de anel de tetrapirrole que implica condições fortes tais como a utilização de ácido acético ou de um ácido mineral forte tal como o ácido cloridrico ou sulfúrico. Assim, os ésteres, por exemplo os ésteres de alquilo ou de arilo opcionalmente substituídos, podem ser formados pela reacção de grupos de hidroxilo, por exemplo na posição 3 ou 13\ com os correspondentes ácidos alifáticos ou aromáticos, os cloretos ácidos ou os amino ácidos, e os éteres nas mesmas posições são obtidos pela reacção com os correspondentes álcoois alifáticos ou aromáticos. Os compostos que têm um grupo de hidroxilo na posição 3" f por exemplo os derivados de 3- hidroxietil-BChl, ou na posição 13z, por exemplo os derivados de , são disponíveis por procedimentos padrão (ver Struck et al., 1992, e Hinninen, 1991). Além do mais, os ésteres de fitilo e de geranilgeranilo que ocorrem naturalmente na posição 13' podem ser transesterificadcç pela catálise ácida para outros ésteres, por exemplo para o éster de etilo, pela reacção com o álcool correspondente. Outros substituintes podem ser introduzidos no anel de macrocielo pela reacção de Wittig de grupos de CO naturais, tais como 3-acetiio em BChl a, ou os quimicamente introduzidos como os cetoálcoois esterifiçados a ΟΙ?3 bem como pela união oxidativa dos grupos de OH para formarem ligações de eter em 0-13% ou pela esterificação catalisada do ácido de grupos de OH, por exemplo em C-31, C-131, í>13;% com ácidos carboxilicos.

Em uma alternativa, as modificações na periferia do sistema de anel de tetrapirrole são executadas no derivado de BChl que contém o Mg natural antes da desmetalação.

Os derivados de BChl das fórmulas II e III aqui podem ser obtidos a partir dos derivados de BChl que ocorrem naturalmente correspondentemente da fórmula I como descrito anteriormente (Struck, 1990) .

Os compostos da invenção em que é um resíduo de um amino ácido, um péptido ou uma proteína, por exemplo um anticorpo, são preparados depois do procedimento de transmetalação da presente invenção, por transesterificação enzimática com a enzima clorofilase ou pela condensação catalítica da bacterioclorofilida apropriada (o ácido livre de BCh“ll':-€Oõn1 com o amino ácido hidroxilado, o péptido ou a proteína que utiliza diciclo-hexil-carbodiimida DCC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) ou 4-dimetilamínopiridina (DMAP) como descrito no documento EP 0584552, ou por reacções catalisadas de ácido não toleradas por complexos de Mg como o BChl nativo.

Os novos derivados de metalobacterioclorofila da invenção são para a utilização como fotosensibilizadores como agentes terapêuticos e de diagnóstico, e para matar células, vírus e bactérias em amostras e tecidos vivos, também conhecidos na técnica para HPD e outros fotosensibilizadores. Estes compostos são Úteis, por exemplo, na sensibilização de células neoplásticas ou outro tecido anormal à destruição pela irradiação quer in vivo ou ex vivo que usa a luz de comprimento de onda apropriado. Acredita-se que a energia da fotoactivação é transferida para o oxigénio endógeno para convertê-lo em oxigénio atómico, cujo oxigénio atómico é considerado como sendo responsável pelo efeito citotóxico. Além do mais, as formas fotoactivadas das bacterioclorofilas fluoresce, cuja fluorescência pode ajudar na localização de tumores ou outros locais aos quais as bacterioclorofilas metaladas são administradas.

Os exemplos de indicações, conhecidas na técnica, que podem ser tratadas com os novos derivados de metalo-bacterioclorofila da invenção, incluem a destruição do tecido de tumor em tumores sólidos, a dissolução de placas em vasos sanguíneos (ver, por exemplo, a patente norte americana No. 4 512 762), o tratamento de condições tópicas tais como o acne, o pé de atleta, as verrugas, o papiloma, e a psoríase, e o tratamento de produtos biológicos (tal como o sangue para transfusão) para agentes infecciosos.

Os derivados de metalo-bacterioclorofila da presente invenção são formulados em composições farmacêuticas finais para a administração ao paciente ou aplicados a um alvo in vitro que usa técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, como resumido em Remington's Pharmaceutícal Sciences, Mack Publishin Co., Easton, Penna., última edição. As composições podem ser administradas sisternicamente, em particular por injecção, ou usadas topicamente.

Para o diagnóstico, os derivados de metalo-bacterioclorofila podem ser usados sozinhos ou podem ser marcados com um isótopo radioactivo ou outros meios de detecção como conhecido na técnica. A quantidade do derivado de metalo-bacterioclorofila a ser administrado será de acordo com a experiência acumulada com outras porfirinas usadas em PDT, por exemplo e vai variar dependendo da escolha do derivado usado como ingrediente activo, da condição a ser tratada, do modo de administração, da idade e da condição do paciente, e do diagnóstico do médico. 0 comprimento de onda da luz de irradiação é de um modo preferido escolhido para combinar com a absorvência máxima do fotosensibilizador de metalo-bacterioclorofila. 0 comprimento de onda conveniente para qualquer dos compostos pode ser rapidamente determinado a partir do seu espectro de absorção.

Em adição a utilização in vivo, os derivados de metalo-bacterioclorof ila da invenção podem ser usados no tratamento de materiais in vitro para matar virus nocivos ou agentes infecciosos, tais como bactérias nocivas. Por exemplo, o sangue e o plasma do sangue a serem usados para transfusão futura podem ser tratados com um composto da invenção e irradiados para efectuar a esterilização. A invenção assim além disso refere-se a composições farmacêuticas que compreendem os derivados de metalo-bacterioclorof iia metaiados das fórmulas I', II' e III' aqui para a terapia fatodinâmica e o diagnóstico de malignidades e para a morte fotodinâmica de células, bactérias e vírus.

Para estes objectivos, as composições vão ser preparadas e administradas por métodos convencionais, por exemplo, como descrito nas patentes norte americanas Nos. 4 649 151, 4 753 958, 5 256 840 e 5 238 940, o pedido de patente europeia No. 0584552 e o pedido de PCT No. WO 90/12573, todos eles aqui incorporados por referência. A invenção será agora ilustrada pelos exemplos não restritivos seguintes.

Nos Exemplos e na Tabela 1 os compostos de partida e os complexos de metal obtidos serão identificados pelos números seguintes a negrito: la - BPhe lb - BPhe -132-OH 2a - [Pd] - BChl 2b - [Pd] - BChl ·" 3a - [Co] - BChl 3b - [Co] - BCKi-' 4a - [Ni] - BChl 4b - [ní] - Behiy 5a - [Cu] - BChl 5b - [Cu] - BChlo 6a - [Zn] - BChl 6b - [Zn] - BChl- 7a - BChl 7b - BCh i 8a - [Cd] - BChl 8b - [Gd] - BChl- 9a - [Mn] - BChl 9b - [Mn] - BChl-.

Materiais e Métodos (i) Isolamento de BChl. C BChl [composto 7a] foi isolado das bactérias fotosintéticas como a Rhodobãcter (Rb) sphaeroides su; a Rhodospirillum rubrum de acordo com Scherz e Parson, 1984, Struck et al., 1992, ou Svec, 1991. A purificação foi feita em Sefarose de DEAE de acordo com Omata e Murata, 1983. (ii) Preparação de 13z-hidroxibacterioclorofila a m '' [composto 7b], um composto de fórmula I em que rh é fitilo, R2 é COOCH3, R3 é OH, R4 na posição 3 é acetilo e na posição 8 é etilo, foi preparado por hidroxilação de Bchl [7a] na posição C-132 pelo armazenamento de 7a em metanol durante 5-7 dias as escuras a 4 °C (Struck e Scheer, 1990) . Alternativamente, o procedimento de LiBr de acordo com Schaber et al., 1984, foi usado, o qual resultou em menos subprodutos. A purificação foi feita em cada caso em placas de gel de sílica preparativas (20 x 20 cm2) (gel de Sílica 60 H, Merck) ou colunas com tolueno/acetona (9:1, v:v) como eluente. A banda azul esverdeada que contém o produto de título (Rf~0,4) foi mecanicamente separada e 0 Bchl a não reagido foi extraído a partir de S1O2 com acetona. iii) Desmetalação de BChl e O BPhe [composto la] e o [composto lb] foram obtidos por desmetalação de BChl [7a] e [7b], respectivamente, de acordo com

Rosenbach-Belkin, 1988, com uma pequena quantidade de ácido acético (o pigmento é somente dissolvido). Depois de desmetalação, a qual ocorre imediatamente, 0 ácido acético foi removido por uma corrente de N2, e o BPhe e o foram recuperados como produtos sólidos. (ív) Chlcrophyllase (Chlase) . O pó de acetona de clase foi preparado a partir das folhas da árvore da China Mel ia azedarach L. como descrito no documento EP 0584552. (v) Cultura de Célula. As células de melanoma de rato M2R são culturadas como monocamadas em meio/Fl2 de Eagle modificada de Dulbecco que contém 25 mM de HEPES a pH 7,4, 10 % de soro e bovino fetal, 2 mM de glutamina, 0,06 mg/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina a 37 °C numa atmosfera humedecida de 8 % de C02 como anteriormente descrito (Gerst et al., 1986). (vi) Estudos da fotocitotoxicidade da célula. As células de melanoma de rato M2R (1 x 10s células/cavidade) são culturadas em microplacas de 24 cavidades e cultivadas durante 24 h a cerca de 2 x 10" células/cavidade, aproximadamente 70-80 % de confluência. O derivado de [M]-Bchl é dissolvido em meio de cultura e disperso por sonicação. O fotosano-3 (HPD comercialmente disponível) é diluído a sua concentração final no meio de cultura. O meio é substituído com o meio livre de soro e as células são incubadas as escuras com a concentração desejada de fotosensibilizadores. A seguir a 2 h de incubação as células são irradiadas a temperatura ambiente durante 5 minutos a partir do fundo da placa. O meio é substituído pelo soro que contém o meio e as placas de cultura são colocadas outra vez na incubadora durante 24 h. A eficiência citotóxica na cultura de célula é determinada por (i} exame microscópico da morfologia da célula, (ii) microscopia de fluorescência de células depois do tratamento com o mancheamento vital (metiodeto de iodeto de propídio de iodeto [PID] [2,7-diamino-9-fenil-10-(dietilaminopropil)-fenatridínio]j, selectivamente se acumula em núcleos de células danificadas, e (iii) incorporação de [3H]timidina como alem disso descrito em baixo. As experiências de contrclo incluem 11) células não tratadas mantidas na escuridão, (2) células não tratadas iluminadas, e (3) as células tratadas com o fármaco mas mantidas na escuridão. (vii) Fonte de luz. A fonte de luz para a irradiação é uma lâmpada de halogéneo de 250 W de construção doméstica focada através de um filtro de água de 10 cm num suporte de vidro e ajustado com um filtro liquido (clorofila a 0. D. = 10.00 em 660 nm) . A dose de luz é ajustada a 45 m de W/crtá em todos os casos. (viii) Incorporação de [3H]timidína. Vinte e quatro horas depois de PDT, as culturas de célula são pulsadas com 1 pCi/mL de [ fimidi/na durante 2 h a 37 "C. As culturas são depois lavadas duas vezes com a salina tamponada de fosfato, tratada com 7,5 % de ácido tricloroacético frio durante 30 minuto a 4 "C e lavadas duas vezes com etanol. O hidróxido de sódio (1 N, 300 pL/cavidade) é adicionado e as placas foram mantidas durante 10 minutos a 37 °C. As amostras de 100 pL são transferidas para frascos de cintilação, neutralizadas com 100 pL de 1 N de HC1 e radioactividade foi contada por contagem de cintilação liquida em 4 mL (20:8 [vol/vol]) de mistura de lumax cintilador de xileno de acordo com Chen et al., 1988.

Exemplo 1: Preparação de [Zn]~BChl e de por metalação directa.

[Zn] -BChl [composto 6a] e [[composto 6b] fcram preparados por metalaçãc directa de BPhe [la} e [lb], respectivamente, pelo método de ácido acetato/ácído acético ou de acetato/dimetilforamida. la. Método de Acetato/dlmetilformamida (DMF) 0 [Zn] -BChl e o P*á· j rlCh!" [6a, 6b) foram preparados por se refluxar o BPhe e o BPbe^lXJMSS (la, lb), respectivamente, (-70 μΜ) em DMF com um excesso de 1000 vezes de SaiOÃdl;:;· anidro durante 60 (75) minutos a 110 "C (o refluxo a 163 "C. diminui o tempo de reacção para 5 minutos). A reacção foi seguida espectroscopicamente e correu até à conclusão. O isolamento e a purificação de produtos foram feitos quanto como para os complexos Cd 8a, 8b a partir daqui (rendimento: -80 %). lb: Método de Acetato/Ácido Acético. O [Zn]-BChl e o [.¾]HíChiOH (6a, 6b) foram preparados por se refluxar lb ou 7a, 7b, (-70 μΜ) em ácido acético glacial, com um excesso de 250 vezes de £h.:f<¥vs·):* anidro e ascorbato de sódio 5 0 mM durante 120 (30) minutos a 100 "C. O ácido acético foi depois evaporado numa corrente de N2, o complexo de Zn extraído com o éter de dietilo e purificado em uma coluna de HPLC ModCol preparativa (250 x 25,4 mm) empacotado com a Sílica Bakerbond NP (tamanho de partícula 10 pm; diâmetro de poro 150) . O composto 6a foi eluido isocraticamente (10 mL/min) de 2-propanol (5 %), metanol (5 %) e n-hexano (90 %, v/v) com um tempo de retenção de cerca de 17 minutos, com -75 % de rendimento do composto purificado. O composto 6b foi purificado pela coluna de cromatografia em gel de sílica, usando a mesma mistura de solvente como para o HPLC, dando um rendimento de 90-95 %.

Exemplo 2: Preparação de [Zn]-BChl-3-vinilo e [Zn]-BCbl-3-vinil-132-OH por metalação directa. A metalação pelo método e acetato/DMF como no Exemplo la em cima pode ser estendido a outros derivados de BPhe, quando as condições de reacção são ligeiramente variadas. Por exemplo, a metalação de 3-vinil-BPhe ou de com

AníQfch: prossegue em condições idênticas dentro de minutos -40 a 120

Exemplo 3: Preparação de [Zn] por metalação directa.

Os complexos de Zn de 13" -aec s r b^ o x i - B· B · t (ou 13- decarbometoxi-BChl) são obtidos nas mesmas condições descritas em cima no Exemplo lb. O tempo de reacção é de 30 minutos a 100 "C.; o isolamento e a purificação são idênticas a 6b.

Exemplo 4= Preparação de [Cu]-BChl, [Cu] e [Cu]- ECkl-1 zbwmfcoslis por metalação directa. O [Cu]-BChl (5a) foi preparado por se refluxar la ou 7a, (-70 pM) em ácido acético glacial, com um excesso de 250 vezes de

Cu20 anidro e de ascorbato de sódio (50 M) durante 15 minutos a 100 "C. [Cal -SCfcj "13 (5b) foi formado a temperatura ambiente por se misturar lb ou 7b, (-70 μΜ) em ácido acético glacial, com um excesso de 250 vezes de Cu20 anidro e de ascorbato de sódio 50 mM. Os derivados de Cu de 13í!ká^parbs^éip~(ou foram obtidos em condições idênticas como descrito para 5b. Apesar da utilização de Catl* os complexos de Cu foram formados em todos os casos devido à presença de oxigénio residual ou de desproporcionação. O isolamento e a purificação foram feitos como descrito no Exemplo lb em cima para os complexos de Zn preparados pelo o o 90 método do ácido acético glacial, rendendo -75 % (5a) , (5b) e -90 % (derivado de Cu de 1 ti respectivamente.

Exemplo 5: Preparação de [Cd]-BChl por metalação directa de BPbe 0 [Cd]-BChl foi preparado por se refluxarem cerca de -70 μΜ de BPhe em dimetilformamida com um excesso de 300 vezes de Cd tOàci 2 anidro durante 40 minutos a 130 A reacção foi seguida espectroscopicamente e correu até a conclusão. Os produtos brutos isolados por fraccionamento entre o éter de dietilo (DE) e água saturada de IlsHCO? podem ser purificados em gel de sílica em condições de redução (1,5 % de ascorbato de sódio misturado) com tolueno/acetona/trietilamina (88/10/2 v/v/v) como eluente. A reacção e o desenvolvimento, são executados sob a protecção de Ar estrita. A banda azul de [Cd]-BChl (Rf~0,7) puro é mecanicamente separada e extraída com o éter de dietilo/água como descrito em cima para o produto bruto. 0 produto bruto foi usado em todos os procedimentos de transmetalação descritos em baixo. As suas propriedades espectrais (composto 8a) são apresentadas na Tabela 1.

Exemplo 6: Preparação de complexos de [M] -BChl e de |M| de Pd, Co, Ni, Cu, Zn, Cd e Mn por transmetalação de [Cd] -BChl e de [Cd]

Para a preparação do derivado de [Pd)-BChl 2»: , o [CdJ-BChl (8a) do Exemplo 5 foi dissrUviífc em acetona seca (A770 = 5 cm' % -50 μΜ) sob protecção de Ar estrita para o impedir da oxidação incontcolada nas posições C-7 e C-8. Depois de cerca de 15 minutos o fáCh (Merck, p.a.) foi adicionado (solução de -30 mg/lOO mL) e a mistura de reacção foi refluxada durante 40 minutos. A reacção pode ser seguida espectroscopicamente (trocas de bandas de Qx de -590 nm para ~530 nm depois aa formação de produto). O produto essencialmente puro foi isolado pela extracção com o éter de dietilo/água como descrito no Exemplo 5 para o [Cd]-BChl. Se necessário, uma purificação adicional é executada em placas de gel de sílica como descrito para o [Cd]-BChl. As propriedades espectrais de Pd-BChl (2a) são caracterizadas na Tabela 1.

De um modo semelhante, o j (2b) foi preparado por transmetalação de j Cd] ••BCbl"·! e os complexos de metal de

Co, Ni, Cu, Zn e Mn de Bchl (compostos 3a, 4a, 5a, 6a, 9a) e de (compostos 3b, 4b, 5b, 6b, 9b) foram preparados pela reacção de [Cd] -BChl e de respectivamente, com os cloretos de metal correspondentes. Os cloretos de metal anidros foram adicionados em um excesso molar de 10 vezes (Cu: 5a, 5b; Zn: 6a, 6b), excesso molar de 100 vezes (Co: 3a, 3b), ou para a saturação como Pd (Ni: 3a, 3b; Mn: 9a, 9b). As reacções ocorreram praticamente instantaneamente a 25 °C, excepto para Pd e Ni (cerca de 30-40 minutos de refluxo), e foram seguidos espectroscopicamente. As pequenas quantidades dos produtos oxidados de C7-C8 (Amax -680 nm) foram formados devido a presença de oxigénio residual e podem ser suprimidos pela adição de ascorbato de sódio (saturado). O isolamento e a purificação dos produtos foram feitos como para o [Cd]-BChl no Exemplo 5 em cima. Os produtos foram caracterizados por absorção, fluorescência, ^H-RMN e FAB-MS como mostrado na Tabela 1. Os espectros de absorção de UV/VIS foram registados num espectrofotómetro de Perkin Eimer Lamnda 2, a intensidade de emissões de fluorescência num Spex Fluorolog 221 equipado com uma lâmpada de Xénon de 450 W e normalizados para a sensibilidade do tubo de fotomultiplicador e energia de excitação. As densidades ópticas máximas de medições de fluorescência foram < 0,1 e ” e a excitação foi na banda de absorção de Qx de la, lb a 9a, 9b. Os espectros de dicroísmo circulares (CD) foi registados em um Dicrográfico CD6 (Jobin Yvon). 0 FAB-MS foi registado em um espectrómetro CH7a/SS mas (Varian MAT) ou um Finigan MAT 9000 com um Cs-gun em que a ionização da superfície líquida foi feita em uma matriz de álcool de m-hidroxi-benzilo. Os espectros de 1H-RMN foram registados em um 360 MHz-Bruker de modelo AM360. O solvente padrão foi a piridina-ds, as trocas químicas são em ppm contra o tetrametilsilano como um padrão interno. Os coeficientes de extinção foram determinados por espectros de absorção de átomo de ICP/ICPMS (AAS) dos metais centrais; antes da combustão, as amostras de solvente de la, lb a 9a, 9b com densidades ópticas quantificadas, foram primeiro evaporadas em tubos de vidro de quartzo e as amostras depois tratadas com o ácido nítrico concentrado para permitir a libertação completa do metal.

Tabela 1. Propriedades espectrais de la, lb-9a, 9ba

Composto Absorção15 Emissão0 FAB-MS

Amax [nm] (ε ti '0 i [nm] Molecular 2¾ > .ia: «.a · [3.06] 949 ::i:: Cu) [2.48] 950 Γ* Zn) 7a( + ) 357 390 (73,3) 374 náo (57,7; resolvido 573(20,8) 612 (16,9) 8.» 1.78 1000

Cd) 362 392 587118,0) 770 (76,7)

Sa.; 1.89 941 Mn) 373 nao 601 780 (64,4) resolvido (16,4) (66,0) a Os espectros de absorção e de fluorescência dos pigmentos (lb - 9b) foram super-impcssíveis para aqueles dos respectivos compostos relacionados de 11 “«-th excepto para uma troca azul sistemática da absorção de Qx (variação de 530-600 nm) por -5 nm. Os espectros de massa foram sempre trocados por 16 unidades de massa a valores mais altos. Todos os comprimentos de onda estão em [nm]. b Coeficientes de absorção e de extinção (por AAS) em 298 K em DE (linha superior) e piridina (linha mais abaixo, em itálico) . ::: Fluorescência em DE/éter de petrólec/isopropanol (5:5:2: v/v/v) em 298 KB (77 KB) . d Electronegatividade (χΜ) e raios iónicos eficazes (r, em I0~14m) para a coordenação sêxtupla (os dados entre parêntesis rectos usam raios para a coordenação quádrupla) de Buchler, 1975. * 'if-díS em piridina-d5; ( + ) : sinais agudos, (-) : linha extensa que se alarga devido ao metal central paramagnético. f Não fluorescente (Spex fluorolog 221). 11 Sinais de ΑΗ-ΚΜΝ distintos em C2K3CN.

Exemplo 7: Transesterificação de [Pd]-BChl e BChls perifericamente modificados para o éster de

Para a preparação do éster de etilo de Pd-Bacteriofeoforbida a, o [Pd]BChl foi dissolvido em clorofórmio (i mg/mL) e um volume idêntico de etanol que contém 5 % de H2SO4 v/v foi adicionado. & mistura foi refluxada em uma atmosfera de Ar durante 90 minutos. Depois o [Pd] -BPhe (100 mg) foi transesterifiçado em 50 mL de ácido sulfúrico em etanol/clorofórmio (1:1/v:v) por se refluxar em Ar durante 2,5 horas. Depois a mistura de reacção foi diluída com o éter, lavada várias vezes com 10 % da solução de bicarbonato de sódio aquosa. Posteriormente, a fase orgânica foi seca e evaporada. Por TLC preparativo sob azoto em gel de sílica, eluindo com 8 % de acetona em tolueno, o movimento mais lento das duas bandas obtidas e o composto de título (Rf = 0,.75). VIS em qualquer: [nm] (intensidade relativa) 329 (0,45); 385 (0,39); 527 (0113); 755 0 1). [ppm] : 9,25, 8,80, 8,70 (cada s, 1H, 5-, 10-, 20-H) ; 4,55 (q, 1H, 18-H) ; 4,45 (d, 1H, 17-H) ; 4,10 (q, 2H, 8-CH2CH3) ; 3,85 (s, i 3,7 (d, I Η, 7-H); 3,6 (q, 3H, 1?MS0&C%} ; 3,50, 3/32 (cada s, 1H, 12-CH3); 3,30 (m, 1H, 8-H) ; 3/06 (s, 3H, 3-COCH3) ; 3,04 (d, 3H, 7-CH3); 2,45 (2H, llMhií 2,45 (2H, H ) 1,75 (d, 3H, I8-CH3) ; 1,65 (t, 3H, 8 CH2CH.3); 1,38 (t, 3H, Ιτ^οΛη?) ; 0,10 e -1,90 (s, 2H, 2 NH) . FAB-MS calculado para IViu 742,38 (M+l) .

Verificado 742,2 (M+l). 0 etilo e outros ésteres de outros complexos de metal estáveis ácidos, como Ni, Cu, Zn, de derivados de BChl podem ser preparados de um modo semelhante.

Exemplo 8: Preparação de éster de metilo de [Pd] ([Pd] -BChl-Ser) A transesterificação enzimática de [Pd]-BChl preparado no Exemplo 6 em cima com 0 cloridrato de éster de metilo de L-serina (Sigma) foi executada com 0 pó de acetona de clorofilase como descrito no documento EP 0584552 que produz 0 compcstc de titulo, aqui designado [Pd]-BChl-Ser, um composto de fórmula 1' aqui em que 3-:. e um resíduo de éster de metilo de serilo ligado ao grupo de COO através do grupo de hidroxilo de serina.

Pelo mesmo procedimento de transesterificação enzimática, os esteres de metilo de que correspondem a outros complexos de metal de [M]-Bchl de acordo com a invenção pode ser preparados bem como os ésteres de ;W'h"ÍvbX-cL7:':: com outros derivados de serina, por exemplo o éster de metilo de N-tritil-L-serina e o ester de metilo de N-carbobenzoxiserilo de serina, ou com derivados de tirosina, por exemplo o éster de metilo de de N-terc-butoxicarboniltirosina, como descrito no documento EP 0584552 .

Exemplo 9: Fototoxicidade in vitro de [Pd]-BChl-Ser 9a. Bactérias e Vírus O ensaio de fototoxicidade consiste de três passos discretos: a incubação de uma solução bacteriana com o sensibilizador, a iluminação e a avaliação da fototoxicidade.

As suspensões (-1 x 107 bactérias/200 pL) de S. aureus fresco em salina tamponada de fosfato (PBS) foram incubadas com as concentrações dadas dos sensibilizadores [Pd]-BChl-Ser ou BChl-Ser durante 1 hora as escuras e posteriormente lavadas sem o pigmento por centrifugação e ressuspensão em PBS. As suspensões bacterianas lavadas foram iluminadas durante 5 minutos usando como fonte de luz uma lâmpada de Xenon auto-construída com a emissão vertical de 1000 lux/cm2 ao nível do objectivo, usando um filtro líquido (clorofila a O. D. = 10.00 a 660 nm) . O dano fotodinâmico foi avaliado pela determinação da sobrevivência bacteriana: as amostras da suspensão bacteriana irradiada (30 pL) foram culturadas em 3 mL de meio de cultura bacteriano líquido de infusão de coração cerebral (BHI) durante 2 h a 37 °C sob agitação. A densidade bacteriana foi medida pela turvação a h = 660 mn.

Cada experiência consistiu de (a) um grupo experimental (as bactérias submetidas ao tratamento completo) e três grupos de controlo: (b) as bactérias irradiadas sem o sensibilizador, (c) as bactérias não irradiadas tratadas com o sensibilizador, e (d) as bactérias não tratadas (100 % da sobrevivência).

Como mostrado na FIG. 1, os efeitos fototóxicos de [Pd]-BChl-Ser são dependentes da dose com respeito as concentrações de sensibilizador 11¾¾ “ 0,6 μΜ) e nenhuma toxicidade foi conferida na escuridão. Os resultados semelhantes foram obtidos com BChl-Ser, testados como comparação nas mesmas condições, com um ligeiramente mas insignificantemente mais baixo. 0 ensaio foi repetido com B. subtilis e Propionibacterium acnes e com o Herpes do Virus Simplex 1 (HSV-1) ambos em suspensão e em células infectadas, e os resultados semelhantes da fototoxicidade foram obtidos (não mostrado). 9b. Células de melanoma 0 ensaio foi conduzido como descrito em Materiais e Métodos mais acima, nas secções (iv) a . As mono-camadas de células de M2R foram incubadas com as concentrações indicadas de [Pd]-BChl-Ser durante lhe submetidas ao tratamento fotodinâmico como descrito em cima. A fotocitotoxicidade foi avaliada por incorporação de [~H]timidina e a percentagem de sobrevivência das células tratadas e os controlos apropriados sãc descritos na FIG. 2. A sobrevivência de células não tratadas foi tcmada como o. 0 . 100

Pode ser visto na FIG. 2 que o efeito fototóxico foi dependente da dose com respeito a concentração de [Pd]-BChl-Ser com um LD50 aproximado de 0,05 μΜ. O efeito fototóxico não foi visto nos controlos escuros. 1. Buchler, J. W., 1975, "Static coordination chemistry of metalloporphyrins", em Porphyrins and Metalloporphyrins, Smith, K. M., editores, páginas 157-232, Elsevier, Nova Iorque. 2. Chen, L., Y. Mory, A. Zilberstein 4 M. Revel, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, volume 85, páginas 8037-41. 3. DeJordy, J. O., P. Bendel, A. Horowitz, Y. Salomon e H.

Degani, 1992, J. Magn. reson. Imag., volume 2, páginas 695-700. 4. Gerst, J. E., J. Sole, J. P. Mather e Y. Salomon, 1986, Mol. Cell. Endocrinal., volume 46, páginas 137-47. 5. Hynninen P. H., em: Scheer, 1991, páginas 145-209. 6. Losev et al., 1990, Opt. Spektrosk., volume 69, páginas 97- 101. 7. Matthews, J. L. et al., 1988, Transfusion, páginas 81-83. 8. Omata, T. e N. Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a,

Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., volume 24, páginas 1093-1100. 9. Rosenbach-Belkin, V., 1988, "The primary reactants in bacterial photosynthesis modelling by in vitro preparation", Ph. D. Thesis, Weizrnann Institute of Science, Israel. 10. Schaber, P. M., J. E. Hunt, R. Fries e J. J. Katz, 1984,. J. Chromatogr. 316, 25-41. 11. Scheer, H., editor, 1991, Chlorophylls, CRC Press, Boca

Raton, Florida. 12. Scherz, A. e W. W. Parson, 1984, Biochim. Biophys. Acta, volume 766, páginas 653-55. 13. Strell, M. e Ururnow, T., 1977, Liebigs Ann. Chem., páginas 970-974. 14. Struck, A., 1990, "Chemisch modifizierte

Bakteriochlorophylle und - phaeophytine in den Bindungsstellen BA, B und HA, B von photosynthetischen Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides R26: Pigmentsynthese, Pigmentaustausch und Spektroskopie", Ph. D. Thesis, University of Munich, Alemanha. 15. Struck, A. et al., 1992, Bacteriochlorophylls modified at posítion C-3: Long-range intramolecular interaction with positíon C-13.2, Biochim. Biophys. Acta, 1 101:321-328. 16. Struck, A. e Scheer, H., 1990, "Modified reaction centers from Rhodobactersphaeroides R26. Exchange of monomeric bacteriochlorophyll with 132-hydroxy-bacteriochlorophyll", FEBS Lett. 261, páginas 385-388. 17. Svec, W. A., 1991, "The distribution and extraction of the Chlorophylls", em: Scheer, 1991, páginas 89-102. 18. Wasielewsky, M. R., 1977, "A mil d method for the introduction of Magnesium into bacteriopheophytin-a", Tetrahedron Letters, páginas 1373-76.

Lisboa, 28 de Agosto de 2007

Claims (1)

1. Processo para a preparação de um derivado de bacterioclorofila metalado sintético da fórmula: [M]-BChl em que o derivado de [M]~BChi é seleccionado a partir de composto da fórmula geral I, II ou III: I