CN1160069C - 钯取代的细菌叶绿素衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

钯取代的式(I)细菌叶绿素衍生物可用于光动力疗法(PDT)领域，其中A代表OH、OR1、-O-(CH2)n-Y、-S-(CH2)n-Y、-NH-(CH2)n-Y、-O-(CH2)2-NH2、-O-(CH2)2-OH、-NH-(CH2)n-+No、X-、-NH-(CH2)2-NH＝BOC或-N-(CH2-CH＝CH2)2；其中R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、NH4+、+NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH、+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或+N(Cn′H2n′+1)4；R2代表H、OH或COOR4，其中R4为C1-C12烷基或C3-C12环烷基；R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；n为1、2、3、4、5或6，Y为-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互独立地代表-CH3或-C2H5；X为F、Cl、Br或I，n′为1、2、3或4以及它们的氧化形式。

Description

钯取代的细菌叶绿素衍生物及其应用
发明领域
本发明涉及钯取代的细菌叶绿素衍生物、其制备方法和中间体、和包含所述钯取代的细菌叶绿素衍生物的药用组合物、及其在体内光动力疗法和诊断领域以及在体外光动力杀伤病毒和微生物领域的应用。
定义和缩写
BChl＝细菌叶绿素a(含Mg的7，8，17，18-四氢卟啉，具有一个植基或香叶基香叶基位于位置173、一个COOCH3基团位于位置132、一个H原子位于位置132、一个乙酰基位于位置3和一个乙基位于位置8)。
BChlide＝细菌脱植基叶绿素a(衍生自BChla的C-172游离羧酸)。
BPhe＝细菌脱镁叶绿素a(其中中心Mg原子被2个H原子取代的BChl)。
BPheid＝细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游离羧酸)。
Pd-BPheid＝Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游离羧酸，具有一个中心Pd原子、一个COOCH3基团位于位置132、一个H原子位于位置132、一个乙酰基位于位置3和一个乙基位于位置8)。
在本说明书中，全文用所述细菌叶绿素衍生物的IUPAC编号。采用该命名法，虽然所述天然细菌叶绿素在位置132和172携带二个羧酸酯，但是它们在位置133和173被酯化。
发明背景
人们对利用光敏剂治疗癌症兴趣目益增加。根据被称为光动力疗法(PDT)的该技术，将光敏剂例如用于肿瘤，并且在原位光敏化产生使恶性肿瘤细胞中毒的化合物。
迄今为止，采用卟啉和相关化合物的光动力疗法已具有悠久的历史。二十世纪四十年代(1940s)的早期研究，证明可以引起卟啉在被照射的肿瘤组织中发荧光。所述卟啉看来在这些组织中累积，并能够在原位吸收光，提供根据荧光的部位探测肿瘤的一种方法。在光动力疗法的早期阶段，一种既用于检测又用于治疗、广泛应用的制剂是一种血卟啉的粗制衍生物，也称为血卟啉衍生物HpD，或是按照Lipson和合作者在 J Natl Cancer Inst(1961)26：1-8中描述的方法制备的Lipson衍生物。已经用该制剂进行大量的研究工作，并且Dougherty和合作者报道了该衍生物在治疗恶性肿瘤方面的用途( Cancer Res(1978)38：2628-2635； J Natl Cancer Inst(1979) 62：231-237)。
Dougherty和合作者制备了一种更有效形式的血卟啉衍生物，所述衍生物包含聚集体重量(aggregate weight)＞10kd的HpD的一部分。可用于光动力疗法的该种形式的药物是美国专利4,649,151的主题，是市场上可得到的，并正处于临床试验中。
已经完全确立了应用吸收光的化合物，尤其是与卟啉相关的那些化合物的一般原则，作为系统给药时用于肿瘤的一种疗法。这些制剂破坏肿瘤组织但不破坏正常组织的鉴别能力(differential ability)，是由于这些制剂对有害细胞的寻靶效应(homing effect)产生的。(参见，例如，Dougherty，T.J.等，“Cancer：Principles and Practice of Oncology”(1982)，V.T.de Vita，Jr等编著，第1836-1844页)。人们一直努力通过将血卟啉衍生物缀合到抗体来提高寻靶能力(homing ability)。(参见，例如，Mew，D.等， J Immunol.(1983) 130：1473-1477)。这些药物在杀伤细胞中的机制看来涉及照射后单线态氧的生成(Weishaupt，K.R.等，Cancer Research(1976)第2326-2329页)。
美国专利4,753,958中也已经描述了，采用局部给药，应用血卟啉衍生物或其有效成分治疗皮肤病。另外，已经用所述药物消毒含可感染生物如细菌和病毒的生物样品(Matthews，J.L.等，Transfusion(1988)：81-83)。也已经将各种其它光敏化合物用于该目的，如例如美国专利第4,727,027号中所陈述的。
一般来说，应用各种各样结构的辐照致敏剂来选择性地削弱生物底物在体内和体外的作用的方法是本领域已知的。可用于这些方法的化合物必须对待削弱或破坏的靶生物底物具有差别亲和力，还必须能够吸收光，使得照射药物以某种方式被活化，以便对相邻的组合物和物质具有有害作用。
因为人们总是希望使治疗学和诊断学性能的最佳化，所以一直在探索传统用于治疗和诊断的卟啉药物的变化。已经提出了许多普通类型的光敏剂，总的来讲包括酞菁、补骨脂素相关化合物和具有共振体系的多环化合物。最类似于本文公开的化合物是：各种脱镁叶绿甲酯一酸衍生物，其在光动力疗法中的应用已经描述于Nihon MetaphysicsCompany的EPO申请220686中；用于该目的的脱镁叶绿甲酯一酸的乙二胺衍生物，描述于Tama Seikayaku，K长.的日本申请J85/000981中；以及日本申请J88/004805涉及的10-羟基脱镁叶绿甲酯一酸-a。另外，Beems，E.M.等，在 Photochemistry and Photobiology(1987)46：639-643中公开了用作光敏剂的细菌叶绿素-a的二种衍生物-细菌叶绿酸-a(也称为细菌脱镁叶绿甲酯一酸-a，其在细菌叶绿素-a中缺乏衍生的植醇(phythl alcahol))和细菌二氢卟酚-a(其既缺乏植基又缺乏所述Mg离子)。这些作者注意这些衍生物，因为基于与细菌叶绿素-a相比这些衍生物的水溶性增强，它们是有利的。
EP 584552和WO97/19081，两个专利均属于Yeda Research andDevelopment Co.Ltd.，分别描述了叶绿素和细菌叶绿素衍生物及其作为PDT药物的用途，以及金属化的细菌叶绿素及其通过对应的Cd-BChl衍生物的金属转移作用的制备方法。
问题仍是发现合适的可用于光动力疗法和诊断的光敏剂，所述光敏剂最适于特定靶和特定范围。因此，本发明提供了另一类的光敏化合物，为了用于具体治疗和诊断情况，所述光敏化合物成为候选化合物所有组成部分的一部分。
发明概述
按照本发明现在已经发现，以下式I、I’或I”化合物可用作PDT药物，并且与已知化合物比较存在溶解度增加、稳定性和/或效率提高的优点，在所述式中如以下定义的A代表一个能够提供有效血浆转移和穿透细胞膜的取代基。
本发明因此涉及式I、I’或I”化合物
其中
A代表OH，
OR1，
-O-(CH2)n-Y，
-S-(CH2)n-Y，
-NH-(CH2)n-Y，
-O-(CH2)2-NH2，
-O-(CH2)2-OH，
-NH-(CH2)n-+No，X-，
-NH-(CH2)2-NH＝BOC或
-N-(CH2-CH＝CH2)2
其中
R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、
NH4 + +NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，
+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或
+N(Cn′H2n′+1)4；
R2代表H、OH或COOR4，其中R4为C1-C12烷基或C3-C12环烷基；
R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；
n为1、2、3、4、5或6，
Y为-NR′1 R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互独立地代表-CH3或-C2H5；
X为F、Cl、Br或I，
n′为1、2、3或4，
并且其中*表示不对称碳，而—代表饱和单键或不饱和双键。
此外，本发明涉及以上新化合物的制备方法。
因此，一方面，本文描述了实现削弱或破坏靶生物底物的方法，所述方法包括用一定量的式I、I’或I”化合物处理靶底物，以有效光致敏所述底物，然后用被式I、I’或I”化合物吸收的波长谱带中的辐照所述靶底物一段时间，以有效削弱或破坏所述底物。
另一方面，本发明因此涉及包括至少一种作为活性剂的式I、I’或I”化合物以及药学上可按受的载体的药用组合物。根据众所周知的光动力技术，所述组合物可用于肿瘤的体内光动力疗法和诊断并可用于杀伤样品中以及活组织中的细胞、病毒和细菌、寄生物和真菌。
此外，本发明涉及应用式I、I’或I”化合物制备可用于光动力疗法的药用组合物。
本发明还涉及应用本发明化合物制备可用于诊断和活体外杀伤细菌、寄生物、病毒和真菌的组合物。
本发明还涉及下文作为中间体的相应的式II或式III的酰基氯和酸酐。
Figure C9981605800161
附图简述
图1描述了Pd-BPheid在丙酮和甲醇/K缓冲磷酸盐的混合物中的光学吸收光谱。
图2和图3分别描述了由快速原子轰击进行的Pd-BPheid的低分辨率质谱和高分辨率质谱(FAB-MS)。
图4显示在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe的PDT后A431细胞的时间依赖性形态变异[在所述图中，Bchl-Ser代表BChl-SerOMe，即BChl的丝氨酰甲酯]。
图5显示被测Pd-BPheid和BChl-SerOMe对ECV-304细胞的光毒性。
图6显示Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯对培养的M2R小鼠黑素瘤细胞的光毒性。(A)将色素溶于95％乙醇中，然后在培养基+10％血清中进一步稀释至所示浓度至1％乙醇。(B)将色素直接溶于培养基+10％血清中。
图7显示Pd-Bpheid对培养的M2R小鼠黑素瘤细胞和人H29结肠癌细胞的光毒性。
图8显示M2R小鼠黑素瘤用溶于Cremophor和稀释于盐溶液的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)进行的PDT。
图9显示M2R小鼠黑素瘤用溶于盐溶液和用Cremophor稀释的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)进行的PDT。
图10图示说明用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述图中为Pd-Bchl-Ser]进行PDT后，治愈原发性C6神经胶质瘤。
图11显示外科手术(切断术)后或用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述图中为Pd-Bchl-Ser]进行PDT后，CD1裸鼠中的C6神经胶质瘤转移的表象(appearance)。
发明详述
在一个优选实施方案中，本发明的化合物具有以下光学构型的以下结构式：
Figure C9981605800181
其中A为如上所述。
如果在上述结构中代表C7和C8以及C17和C18之间键的虚线为一个饱和单键时，则编号7、8、17和18的碳原子为不对称碳原子。如果R2或R3为H时，则C132为一个不对称碳原子。
在氧存在下或于环境空气下及在光作用下，上述C7-C8和C17-C18键的氧化作用可以发生，产生在所述位置C7-C8和C17-C18具有双键的化合物。
本发明的式I’和式I”化合物为式I化合物的氧化形式，并可以通过描述于Chlorophyll(由Scheer H.(编著)，CRC Press，1991，第147-209页)中的方法获得。
在本发明的一个优选实施方案中，所述化合物是其中A为OR1的那些化合物。
在一个最优选实施方案中，本发明化合物为Pd-PBheid(本文有时也命名为Pd-BChl-COOH)，这是其中A为OH、具有以下结构的式I化合物：
Figure C9981605800191
其中A为OH的式I化合物的制备方法之一，至少包括以下步骤：
a)将M-BPheid-173-Z化合物联合脱金属和水解，其中Z为植基、香叶基香叶基(gg)或SerOMe(丝氨酰O-甲酯)，而M为选自Mg、Cd或Zn的金属；
b)用Pd试剂将Pd掺入(a)中获得的化合物中，由此获得Pd-BPheid，并且，如有需要，
c)随后，将获得的Pd-BPheid与对应的式R1-H或A-H化合物反应，生成对应的R1盐或其中A不为OH的化合物。
在一个优选实施方案中，本方法涉及Pd-BPheid的制备，而细菌叶绿素a(Bchla)在步骤(a)中脱金属并水解，然后将获得的细菌脱镁叶绿甲酯一酸(BPheid)在步骤(b)中与Pd试剂反应，产生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一种制备方法至少包括以下步骤：
a)对BChlide-173-Z进行金属转移，获得对应的其中Z为植基、gg或SerOme的Pd-BPheid-173-Z，
b)水解所获得的化合物，和
c)随后，任选地将获得的Pd-BPheid与对应的式R1-H或A-H化合物反应，生成对应的R1盐或其中A不为OH的化合物。
在一个优选实施方案中，所述方法涉及Pd-BPheid的制备，而细菌叶绿素a(Bchla)在步骤(a)进行金属转移以由Pd取代天然中心Mg原子，然后将获得的其中Z为植基的Pd-BPheid-173-Z在步骤(b)中进行水解，产生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一种制备方法至少包括以下步骤：
a)酶促水解其中Z为植基或香叶基香叶基的BChlide-173-Z，获得Bchlide；
b)将(a)的所述BChlide进行酸性脱金属；
c)用Pd试剂将Pd掺入到(b)的所述脱金属的BPheid中；和
d)随后，任选地将获得的Pd-BPheid与对应的式R1-H或A-H化合物反应，生成对应的R1盐或其中A不为OH的化合物。
在式I化合物的上述制备方法中，所述Pd试剂可以是在这类结构中提供Pd的任何方便的反应性化合物，例如乙酸钯和氯化钯。
经采用抗坏血酸钠或抗坏血酸的两步法，或者经采用6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸的一步法，可以实现上述方法中的Pd的掺入。
通过将Pd-BPheid(Pd-BChl-COOH)与对应的A-H化合物反应，可以获得其中A不同于OH和OR1的本发明化合物。
以上式II和式III化合物是本发明式I化合物的中间体。经采用适合于生成酰氯的任何试剂例如SOCl2，可以获得式II的酰基氯，即Pd-BPheid-COCl。
通过用乙酸酐使式I、I’、I”化合物脱水，可以获得式III的酸酐。
通过使这些中间体II和III与对应的化合物AH反应，可以获得式I、I’或I”化合物。
本发明还包括式I、I’和I”化合物游离酸的药学上可接受的盐。用本领域众所周知的方法，例如通过使游离酸或其盐与无机或有机试剂反应，可以制备所述盐，所述无机或有机试剂例如但不限于NaOH、KOH、钙或镁合适的盐、LiOH、NH4OH、氢氧化四烃基铵例如氢氧化四乙铵或N-甲基葡糖胺、葡糖胺和三乙醇胺。
本发明化合物可用于靶生物底物的光动力疗法和诊断。所谓“靶生物底物”是指在采用疗法或其它矫正作用例如灭菌的环境中、或在应用诊断的环境中需要知道的位置中不希望有的任何细胞、病毒或组织行。
按照本发明，将所述药物注射到受治疗者体内，并容许在靶底物中达到最佳浓度。然后将所述靶底物暴露于适于所给予化合物吸收光谱的波长下的辐照。通过伴随的所述靶底物温度的升高，可以提高所述化合物的作用。
采用适于计划用途的常规赋形剂，配制本发明化合物供本发明的方法之用。对于系统给药，一般来说，使用缓冲水性组合物，其含有足够的无毒去垢剂以溶解所述活性化合物。因为本发明化合物一般不大溶于水，因此可以使用增溶量的这种去垢剂。合适的无毒去垢剂包括但不限于吐温80、多种胆汁盐例如甘氨胆酸钠(sodium glycholate)、各种胆汁盐类似物例如梭链孢酸盐。替代组合物应用脂质体载体。采用常规缓冲液例如Hank溶液、Ringer溶液或磷酸盐缓冲液，于所需的pH下缓冲所述溶液。也可以包括不干扰所述药物活性的其它成分，诸如稳定量的蛋白例如血清白蛋白、或低密度脂蛋白或高密度脂蛋白(分另为LDL和HDL)。
系统性制剂可以经注射给予，例如静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、肌内、或皮下(s.c)注射，或者可以通过经膜或经皮技术给予系统性制剂。适于经皮或经膜给药的制剂包括含有渗透剂的喷雾剂和栓剂，所述渗透剂通常可以是上述去垢剂。
对于局部给药，所述制剂也可以含有渗透剂，为软膏、油膏、搽剂、乳膏或油的形式。合适的既可用于系统给药又可用于局部给药的制剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack PublishingCo.，Easton，PA中找到。
对于活体外治疗应用，例如用于输血的血液或血浆或者血液制品的制剂，不需要特殊的配制，但将本发明化合物溶于合适的相容性溶剂中并在辐照前以合适的浓度、通常约为1-100μg/ml，混合到所述生物流体中。
对于光动力治疗应用和诊断应用，合适的剂量范围将随应用的模式和化合物的选择以及待治疗或诊断的病症的性质而变化。然而，一般来说，合适的剂量约为0.01-50mg/kg体重，最好是0.1-10mg/kg。对于局部给药，通常使用的总剂量约为5-100mg。
用于光动力活体外疗法的通用方法类似于由Mattews，J.L.等，Transfusion(参见上文)描述的那些方法。
简而言之，对于系统给药，给药后经过一段合适的时间，通常为数分钟至2天，以便在靶生物底物中使本发明化合物的浓度达到最佳。一般来说，这种底物将是肿瘤血管系统、肿瘤细胞或任何其它肿瘤组分，并通过测量与背景相比靶组织的光吸收，可以监测所述化合物的定位。已经达到最优化后，用范围为740-800nm或500-600nm或700-900nm的合适谱带的辐照；以5-750mW/cm2的辐射率和100-1000J/cm2的总能量，，照射所述靶生物底物。
对于局部疗法，定位是快速的，因此此后可以提供相应的辐照。对于生物液体活体外的疗法，在达到靶组织最佳结合/摄取后应用辐照。辐照通量(radiation fluence)约为1-10J/cm2。因为不需要穿透组织，所以可以使用较低的总能量。
本发明组合物包括至少一种如上定义的式I、I’或I”化合物以及生理上可接受的载体。这些组合物可以为溶液、脂乳浊液或凝胶的形式或为脂质体或纳级粒子(nanoparticles)的形式。选择合适的载体以使本发明化合物在靶底物的浓度最大。这类载体的实例包括但不限于“吐温80”、聚乙二醇例如PEG400、“Cremophor EL”、丙二醇、乙醇、罗勒油、胆汁盐和胆汁盐类似物及它们的混合物。脂质体制剂可以基于例如二豆蔻酰基磷脂酰胆碱或磷脂酰甘油。所述载体也可以包括棕榈酰基磷脂酰胆碱。
当使用纳粒子时，它们可以为PEG包衣的聚乳酸纳级粒子的形式。在脂乳浊液的形式中，通常使用低密度脂蛋白和甘油三酯。
在本发明组合物中，本发明化合物的量为组合物总重量的0.01-20％，最好是0.05％-5％(重量)。
现在通过以下非限制性实施例说明本发明。
                        实施例
实施例1.Pd-BPheid的制备
用以下3-步法从BChla制备Pd-BPheid。
(a) 细菌叶绿素a(BChla)的分离
如下从冻干细菌嗜硫小红卵菌(Rhodovolum sulfidophilum)中提取BChla：
将冻干细胞(100gr)研磨成粉，用总共1250ml丙酮洗涤5次，以部分洗去类胡萝卜素，过滤该混合物，用无水甲醇从所述固体物中提取(约1200ml，4-5次过滤)BChla。过滤后，将深蓝绿色溶液真空下部分蒸发，用石油醚(b.p.80-100℃，约1300ml)萃取所述浓缩溶液(约500ml)2-3次，进一步除去类胡萝卜素，用甲醇(约550ml)萃取石油醚相2次。然后除去该相，将混合的甲醇相真空蒸发，并将蓝绿色残留物再溶于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，上样于用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)平衡的DEAE-琼脂糖凝胶柱(3×10cm)。用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)洗脱BChla，蒸发甲醇-丙酮混合物，将干燥的Bchla再溶于精确体积(用于吸收光谱)的乙醚中，通过棉绒(coton wool)过滤，去除溶解的柱材料。在最后一次蒸发后，将所述固体色素于氩气下避光贮藏于-20℃。提取得率：约700mgBChla/100g冻干细胞。
如先前所述制备DEAE-琼脂糖凝胶柱(Omata和Murata，1983，“通过用DEAE-琼脂糖凝胶Cl-6B和琼脂糖凝胶C1-6B的柱层析，制备叶绿素a、叶绿素b和细菌叶绿素a”，Plant Cell Physiol.，第24卷，第1093-1100页)。简而言之，用蒸馏水洗涤DEAE-琼脂糖凝胶柱，然后通过将其悬浮于1M乙酸钠缓冲液(pH＝7)，使其转化成乙酸盐形式。将所述浆液用丙酮洗涤3次，最后悬浮于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，贮藏于5℃。
(b) 细菌脱镁叶绿甲酯一酸(BPheid)的制备
将如(a)中得到的粗制Bchla提取物(含一些残留类胡萝卜素的约100mg Bchla)溶于80％三氟乙酸水溶液(约15ml)中，所述三氟乙酸水溶液已经用氮通气10分钟。于环境温度下搅拌所述溶液2小时。然后将反应混合物倾入水(约250ml)中，并用氯仿萃取。将提取物用水洗涤2次，经无水Na2SO4干燥。蒸发所述溶剂后，残留物在二氧化硅上层析(3cm×15cm柱，Kieselgel 60，Merck)，用甲醇的氯仿溶液的分段梯度：2％、5％、10％、15％洗脱。首先，洗出类胡萝卜素和少量的细菌脱镁叶绿素，然后洗出异细菌脱镁叶绿素和类胡萝卜素。于10％甲醇的氯仿溶液，开始收集产物并通过TLC(Kieselgel，氯仿-甲醇，9∶1)监测。蒸发所述产物(60mg)，然后将溶解于CHCl3的残留物经UltraPore膜过滤，除去可能在其它情况下引起氧化作用的二氧化硅。
(c) 将钯掺入细菌脱镁叶绿甲酯一酸(Bpheid)中
将如(b)中得到的BPheid(100mg)和乙酸钯(80mg)溶于二氯甲烷(约10ml)，然后加入到200mg抗坏血酸钠在50ml甲醇中的悬浮液中。于室温下在密闭的烧瓶中搅拌所述反应混合物，然后每15-20分钟从所述反应混合物中收集样品，并记录其光吸收。约4小时后，大多数于357nm的BPheid吸收被于330nm和390nm的Pd-BPheid吸收取代。
将反应混合物转移到氯仿/水溶液(200ml；50∶50 v/v)中，并在分液漏斗中振荡。收集有机相，用水洗涤，经无水氯化钠干燥，然后蒸发。将干燥的物质加入到80mg乙酸钯中，重复以上步骤直到于357nm的所述残留的吸收完全消失，并且于765nm的吸收(红峰-最大跃迁)和于330nm的最大吸收之间的比率达到数值≈2.4(在氯仿中)为止。
将所述干燥反应混合物溶解于最小体积的2∶1氯仿∶丙酮中，然后上样于已经用丙酮预平衡的CM-琼脂糖凝胶柱(150mm×25mm)。首先用丙酮洗涤所述柱，并弃去洗脱的第一流分。然后用9∶1丙酮∶甲醇洗涤所述柱。二条带占优势，并被洗出一第一条为主要产物，而第二条为加氧(allomerized)副产物(被弃去)。将所述产物浓缩几乎至干，然后转移到分液漏斗中的50∶50氯仿∶水体系中。充分振摇所述混合物，分离有机相，经无水硫酸钠(或氯化钠)干燥，然后蒸发至干。
实施例2.Pd-BPheid的制备
(a) Bchla的分离
如以上实施例1(a)进行所述方法的该步骤。
(b)Pd-Bpheid的制备
将6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸(246mg，593μmol)溶于MeOH(84ml)，并用N2通过所述溶液。将Bpheid(92mg，151μmol)和Pd(CH3COO)2(83mg，370μmol)溶于CHCl3(34ml，用N2脱气)，然后加入到所述甲醇溶液中。于惰性氛围下经连续搅拌保持所述混合物，并通过每几分钟记录小部份反应物的吸收光谱，监测反应进程。约30分钟后，完成所述反应，并蒸发所述溶剂。
(c)Pd-Bpheid的纯化
将粗制Pd-BPheid溶于CHCl3，然后上样于用15g 0.4％-二氧化硅-Asc装填的柱。将少量体积的CHCl3(约30ml)通过该柱，然后用MeOH∶CHCl3(1∶99，约250ml)洗脱所述色素。经TLC和光学吸光谱法测定所述流分的纯度。对代表性样品进行质谱分析和NMR检测。产量：82.5mg纯的Pd-BPheid(76％)。
对于制备0.4％-二氧化硅-Asc，将抗坏血酸(240mg)溶于240ccEtOH∶CHCl3∶MeOH(60∶60∶120)混合物中。加入硅胶60(60g，Merck，Cat.No.107734，70-230目)，将所述浆液混合物搅拌10分钟，然后在泵下过滤。最后将所述淡黄色二氧化硅-Asc于约50℃干燥约1小时。该0.4％-二氧化硅-Asc随时可以用作标准硅胶；其性质为极性较少并且它具有某些抗氧化特性。
实施例3.Pd-BPheid的制备
(a) Bchla的分离
如以上实施例1(a)进行本步骤。
(b) 叶绿素酶(Chlase)的制备
从Melia azedarach L.，Chine树叶的叶绿体制备叶绿素酶(Chlase)。将新鲜叶片(50g)在含有350ml冷却至-20℃的丙酮溶液的捣碎机中研磨2分钟。将所述匀浆通过4层纱布过滤，收集滤液，于4℃放置过夜以进一步进行沉淀。经过滤除去丙酮，用冷丙酮将余下的粉末洗涤几次以去除痕量Chlase和类胡萝卜素，直到所述滤液无色为止。最后将Chlase丙酮粉在冻干机中干燥，并再贮藏于-20℃。在这些条件下，所述酶制备物可稳定1年以上，而不显著损失活性。得率：每1kg叶片获得20g Chlase。
(c) 细菌脱植基叶绿素(BChlide)的合成和纯化
将抗坏血酸(70mg；Merck)溶于水(9ml)中，用10M KOH水溶液将所述溶液的pH调节至7.7，加入1ml 0.5M磷酸钠缓冲液(pH 7.7)以在反应期间保持所述pH。加入Triton X-100(约80μl)以达到去垢剂终浓度为0.8％(v/v)。用Polytron匀浆器，将Chlase丙酮粉末(200mg)在6ml该溶液中匀浆。用剩余溶液洗涤该装置，然后与所述匀浆混合。所述酶溶液与20mg用氩气(Argon)饱和的固体BChla一起超声处理，然后于37℃避光搅拌温育6小时。
对于纯化，反应6小时后，将所述反应物质直接冰冻(-20℃)，并随后冻干。将所述干残留物溶于丙酮，超声处理，然后将所述溶液上样于平衡于丙酮的CM-琼脂糖凝胶柱。用丙酮洗涤该柱以洗出未反应的物质，然后用5％和7％甲醇(v/v)的丙酮溶液洗涤，以洗脱细菌脱植基叶绿素(Bchlide)和细菌脱镁甲酯一酸(Bpheid)。用25％甲醇的丙酮溶液洗脱所述产物。蒸发溶剂，然后将所述固体色素在氩气下避光贮藏于-20℃。反应得率：30-55％。
在填充柱和平衡于丙酮之前，首先用水洗涤CM-琼脂糖凝胶，然后用丙酮洗涤3次，制备用于色谱法的CM-琼脂糖凝胶。在用2M NaCl水溶液彻底漂洗至无色后，可以重复使用所述色谱材料，用水洗涤并重新悬浮于丙酮。
(d) 将钯掺入到细菌脱镁叶绿甲酯一酸(BPheid)
本方法与以上实施例1(c)中的方法相同。干燥的物质的HPLC显示出2个差向异构体形式的主要产物和残余异分同晶体，所述2个差向异构体在化学上是相同的(全部混合物的88％)。也有微量(0.5％)污染的原材料BPheid。
实施例4.化合物Pd-BPheid的表征
(a) 吸收光谱
采用标准化到基线的PM检测器，用UVICON分光光度计(1cm光程长度)，测定Pd-BPheid的吸收光谱。灵敏度为0.05。
Pd-BPheid在丙酮中的吸收光谱以及甲醇/磷酸钾缓冲液混合物中的吸收光谱报告于表1和图1中。
Pd-BPheid在血浆中的吸收光谱红移至763nm。
                          表1
             丙酮     甲醇/磷酸钾20mM pH 6.59(70％/30％)
    λ     吸光度     λ     吸光度
    753nm530nm385nm331nm     2.430.491.251.45     758nm537nm384nm329nm     1.250.3240.5350.777
照片检测显示按照图1的以下峰值为：758nm：1.2502；537nm：0.3239；384nm：0.5351；和329nm：0.7766。
(b)Pd-BPheid的HPLC检测
开发出反相HPLC方法以表征杂质图形(impurity profile)并定量钯-BPheid。
固相      ：C8 Inertsil 5μm，250×4.6mm
液相      ：甲醇∶磷酸钾缓冲液20mM
            pH＝6.59(70％∶30％)
流速      ：1ml/分钟
注射体积  ：100μl
检测      ：1-Spectroflow 783，氘灯：385nm
            2-Spectroflow 757，钨灯：753nm
正如表2中所示，实施例3中获得的产物Pd-Bpheid的HPLC分析显示出7个峰。主峰代表了总产物的64-70％。
于-20℃储存于丙酮中的Pd-BPheid溶液至少稳定2个月。将所述储备液于室温保持18小时时，则在HPLC图形中没有观察到变化，表明Pd-Bpheid是一种稳定的化合物。
               表2.Pd-BPheid的HPLC检测
峰    ％385nm检测    ％753nm检测     吸收光谱(最大波长nm)
 B1    0.7    0.78
 B2    3.4    4.31     754，537，384，330
 C    1.07    1.25
 D    2.49    2.76     758，535，384，330
 E    64.11    69.98     758，537，384，329
 F    9.62    3.61     753，531，358
 G    13.56    14.46     758，537，384，329
(c)用NMR表征Pd-BPheid
在按照实施例3制备的Pd-BPheid的纯化步骤后，主峰的百分比为90％以上。经制备HPLC C8进行该纯化。用这种纯化的化合物经NMR和质谱法表征所述产物。
用NMR进行Pd-BPheid的分析，化学位移列于表3中：
-1H NMR和13C NMR
-2D1H NMR(COSY和NOESY)
-2D1H-13C NMR(HMQC和HMBC：逆检测)
  表3.1H、13C化学位移(ppm)甲基      质子    碳
 1-CH3     3.44    14.42-CH3     3.07    33.13-CH3     1.75    23.64-CH3     1.06    10.85-CH3     3.36    12.58-CH3     1.65    23.910-CH3    3.85    53.3
内消旋
α    9.11    101.5β    8.50    102.9δ    8.45    98.7
C-H
 3-H     4.35    47.24-H     4.09    55.27-H     4.10    49.28-H     4.34    49.210-H    5.92    65.10
其它
4-CH2      2.08；2.22    30.6*7′-CH2    2.30；2.52    30.6*7″-CH2    2.15；2.35    35*
无质子的碳
2-CO    1999-CO    188  12-C    158.513-C    159.5
 17-CO2H    170.210-CO2Me   174.31-C         1412-C         135.65-C         126.96-C         130.111-C        142.3  14-C    151.515-C    140.516-C    152.517-C    109.818-C    152.319-C    158.6
(d)用质谱法表征Pd-BPheid
Pd-BPheid的质谱法分析产生示于图2和图3中波谱。于低分辨率和高分辨率下经快速原子轰击(FAB)进行该分析。分光计为“ZabSpecTOF Micromass”分光计；电离方式：利用Cs+的LSIMS，正性，加速：8kV；源温度：40℃；所用的溶剂：mNBA(间硝基二苯乙醇(meta-nitrobenzilic alcohol))；输入：侧部。
结果：离子型：M+；分子式：C35H36N4O6 106Pd；理论值：714.1670Z∶1 m/z理论值714.1670 m/z实测值714.1689。
这些结果证实所述NMR研究：m/e＝714，并证实钯金属的嵌入。
经NMR和质谱法分析的化学结构是BChl游离酸形式的钯衍生物-Pd-BPheid。
实施例5.Pd-Bpheid对鼠L1210和人HT29细胞的生物活性
(i)细胞系。用补充10％马血清、1mM谷胺酰胺、1mM巯基乙醇和庆大霉素的Fischer培养基，在悬浮培养物中保持鼠白血病细胞系(L1210)。按照Twentyman等的说明(1980，“用于比较终点研究的新型小鼠肿瘤模型系统(RIF-1)(A new mouse tumor model system(RIF-1)forcomparison of end-point studies)”，J.Natl.Cancer Inst.，64，595-604)保持RIF(辐照诱发的纤维肉瘤)肿瘤。在含10％胎牛血清和庆大霉素的Weymouth培养基中培育培养物。
在无酚红而含有10％FCS的RPMI 1640中培养HT29人结肠腺癌细胞。通过用0.25％胰蛋白酶使细胞分散在0.02％EDTA，传代培养细胞，然后将1瓶分成5瓶(at a 1∶5 split)再接种。
(ii)体外光毒丝。对于涉及L1210和RIF细胞的光毒性研究，由600瓦具有10cm水滤光器和850nm截止滤光片滤波以去除IR的石英-卤素光源，提供光源。通过干涉滤光片(Oriel)，将所述带宽进一步限定于660±5nm。在生长培养基(为加入缓冲能力，用20mM HEPES pH7取代NaHCO3)中，在规定浓度的致敏剂存在下，将悬浮液中的细胞(L1210)或贴壁至24mm直经盖玻片的细胞温育15分钟。然后将所述细胞洗涤直至不含致敏剂，将其转移至新鲜培养基中。于10℃进行照射。对于某些研究，然后将所述细胞用荧光探针标记，确定光损伤部位。在其它研究中，然后将所述细胞于37℃在新鲜培养基中温育60分钟，让编程性细胞死亡开始发生。用96孔板和72小时MTT测定，以四个复份进行生存力研究。
对于HT29模型，将细胞与不同浓度的Pd-Bpheid一起温育1小时，然后用卤素灯或钛蓝宝石激光于10J/cm2和25J/cm2，以300mW/cm2进行照射。
(iii)细胞生存力。通过在96孔板中接种1,000-50,000细胞后3天进行的MTT反应，评价细胞存活率。与含可变数对照细胞的标准曲线比较颜色强度。用BioRad平板读出器于x nm测定吸光度。对于L1210，在下一个3天内让其在新鲜培养基中发生生长，采用MTT测定方法，类似估计细胞数目。
(iv)脂蛋白结合：测定Pd-BPheid与对照人血浆的蛋白和脂蛋白化合物的结合。将250μl血浆样品与3μM所述化合物一起于37℃温育30分钟。然后用密度梯度离心机分离脂蛋白和蛋白组分。分级分离所述梯度，分级分离部分在3ml 10mM Yriton X-100去垢剂中稀释或在400nm激发下测定分级分离部分的750-800nm荧光。
结果
(v)Pd-Bpheid对L1210细胞的光毒性效应
将L1210鼠白血病细胞与1μM Pd-BPheid一起于37℃温育30分钟，于760±5nm下采用75mJ/cm2的光剂量，导致50％细胞致死。在RIF系中相似程度的细胞致死需要215mJ/cm2的光剂量。
(vi)Pd-Bpheid对HT29细胞的光毒性效应
当HT29细胞在无光照下与Pd-BPheid一起温育时，存活率在100％和79％之间变化。当Pd-BPheid浓度较高，并且所传递能量的剂量增加时，所述细胞的存活率降低。引起50％死亡率的Pd-BPheid光敏剂剂量(也称为LD50)在25J/cm2的照射下为48μM。引发最严重光毒性的激发波长为773nm。
(vii)光损伤部位。采用小鼠白血病L1210细胞，Pd BPheid是高度特异性线粒体光敏剂，而对质膜或对溶酶体没有可检测的光损伤。这种结果与快速引发编程性细胞死亡相关。
(viii)血浆脂蛋白结合。进行的研究指出，Pd-BPheid结合于HDL＞LDL＞＞＞人血清白蛋白部分，认为是一种PDP选择性的决定子。
实施例6.Pd-Bpheid的制剂：Pd-Bpheid在动物实验所用溶剂中的溶解和稳定性
以不同的配方构成Pd-BPheid的溶液，以获得0.05-2％的浓度。
(a)如下制备Cremophor制剂：将40mg Pd-BPheid溶于2ml干管中的Cremophor EL中，或者通过缓慢旋转所述管形瓶直至所述溶液已经完全无微粒，或者采用超声振荡探头的短脉冲处理进行溶解。将所述管冷却，以便使温度不上升至30℃以上。所述药物溶解后，加入0.6ml丙二醇，再次或者通过缓慢旋转法或者用超声探头混合。然后以0.1ml部份加入等渗NaCl至总体积为4ml。每次加入后，所述混合物应是澄清的，无沉淀迹象。所述组合物在每次加入NaCl 0.9％后，简单地用所述超声探头处理，并小心地保持温度在25-30℃以下。稀释到乙醇中后，通过于757nm测量吸光度，评估所述药物的浓度。
当将20mg/kg Pd-BPheid用于实验研究时，这变成每20克小鼠为0.4mg Pd-BPheid。由于可以将不超过0.1ml的cremophor注射到尾静脉，于是所述药物的浓度为4mg/ml。
(b)如下制备改进的Cremophor制剂：将5mg Pd-BPheid与0.4mlCremophor EL混合。溶解后，加入0.12ml丙二醇。然后以小份儿加入等渗盐水(1.48ml)，并且每次加入后混合所溶液。最终溶液应是完全澄清的并且不含微粒。用超声探头帮助溶解所述药物，按照需要通过在冰浴中冷却，保持所述溶液的温度在25℃以下。
通过在甲醇中稀释，进行Pd-BPheid在Cremophor溶液中浓度的测定。在740-780nm范围内测量吸收光谱。将所述峰值与来自已知浓度的Pd-BPheid的结果进行比较。
(c)用吐温80和乙醇溶解Pd-BPheid(1mg Pd-BPheid/ml溶液)，制备其它的制剂。
实施例7.体内毒性研究-Pd-BPheid对鼠肿瘤模型的作用
用涉及鼠肿瘤模型的两组实验评估Pd-BPheid的光毒性。
(a)首先，在两种鼠肿瘤模型：BA-乳腺癌和辐照诱发性纤维肉瘤(RIF-1)中，评价Pd-BPheid的光动力反应性。
光动力疗法参数：用患有肿瘤(测量直经为5-7mm)的小鼠进行PDT实验。评价3种Pd-BPheid药物剂量(1、5和10mg/kg)和2种光剂量(100和300焦耳/cm2)。通过尾静脉注射给予溶于Cremophor的Pd-BPheid制剂。注射后15分钟、1小时或4小时，开始PDT光照射。在每种治疗条件下处理3只小鼠，除非最初结果已证实致死毒性或无反应性。将调至757nm的钛蓝宝石激光用作PDT的光源。将激光产生的光耦合到石英纤维中，用于将光传递至肿瘤。使用75mW/cm2的光功率密度。PDT治疗后，3天/周测量肿瘤大小，然后确定肿瘤治愈(定义为治疗后40天无肿瘤复发)的百分比。
体内PDT反应：下文表4和5提供或者移植BA乳腺瘤或者移植RIF-1纤维肉瘤的C3H小鼠的PDT治疗结果的小结。每个表指出以下参数：1)静脉内药物剂量，以mg/kg表示；2)激光疗法参数，包括总光剂量(J/cm2)、波长(757nm)、光剂量率(mW/cm2)和时间间隔(每组治疗之间)；4)毒性(治疗后不久4只小鼠死亡)；5)肿瘤再生长(包括PDT治疗和肿瘤复发之间的天数)；和6)用Pd-BPheid PDT诱发的肿瘤治愈的小鼠数目(和百分比)。
如本文所述，发现Pd-BPheid介导的PDT在两种小鼠肿瘤模型中诱发标准而有效的杀肿瘤反应。PDT介导的肿瘤反应性直接与药物剂量、光剂量和药物给予和光治疗之间的时间间隔相关。具体来讲，较高的药物剂量和/或较高的光剂量产生增强的反应。发现BA乳腺癌对Pd-BPheid介导的PDT的反应性比RIF-1纤维肉瘤的相当PDT疗法的反应性更强。如果在给予药物的1小时内开始光疗法，则Pd-BPheid介导的PDT有效；而如果在药物给予和光疗法之间采用4小时间隔，则Pd-BPheid介导的PDT无效。
(b)在第二组实验中，在移植HT29人结肠腺癌的小鼠肿瘤模型中评估Pd-BPheid的光毒性。
动物和肿瘤模型：从刚死的供体小鼠中立即取出的实体瘤组织(直经2cm)，在1ml 0.9％盐水溶液中机械地压碎，然后将所述溶液(0.1ml)皮下注射到每只小鼠的一条后腿中。当肿瘤直经为8-10mm时，将小鼠用于实验。在实验之前10天，在8周龄瑞士裸鼠中进行肿瘤皮下移植。
光毒性研究：以15mg/kg静脉内注射0.15ml Pd-BPheid。恰好在照射之前，用40mg/kg硫喷妥麻醉小鼠。注射后30分钟、1小时、4小时或24小时，于300mW/cm2用钛蓝宝石激光照射小鼠，测量平均直经以调节照射时间，以达到200或300J/cm2.不用Pd-BPheid注射的对照小鼠也以相同条件进行照射。用在实验性放疗已完成的试验，同等地分析PDT诱发的肿瘤生长延迟。对于体内研究和对于每个独立的实验，所有结果都是2个或3个独立实验的平均值，并且对于每个独立的实验，每种实验条件均使用2只小鼠。
对于肿瘤生长研究，结果以肿瘤指数变化表示，参比(＝1)相当于来自未处理细胞的肿瘤指数。如下计算所述肿瘤指数：
肿瘤指数＝(最大肿瘤直经+垂直相对的直经(perpendicularlyopposite diameter))/2
温度变化研究：为保证热效应不是太大，采用不吸收性氧化铝包埋的精密热电偶，测量卤素灯和钛蓝宝石激光照射的温度变化。
该实验结果如下：
(i)于200J/cm2 763nm照射：
对于注射后30分钟和4小时的所述条件，观察到肿瘤生长减少(与对照比较)。对于注射后1小时和24小时的所述条件，观察到肿瘤指数减少多达7天。
(ii)于300J/cm2 763nm照射：
对于注射后30分钟和24小时的所述条件，观察到肿瘤生长减少(与对照比较)。对于注射后1小时和4小时的所述条件，观察到肿瘤指数减少多达7天。
(iii)注射后1小时300J/cm2照射：
对于773nm下的所述条件，观察到肿瘤生长减少(与对照比较)多达5天，而对于753nm和763nm下的所述条件，则肿瘤生长减少多达12天。对于763nm观察到最大肿瘤生长减少。
(iv)注射后24小时300J/cm2照射：
对于753nm下的所述条件，观察到肿瘤生长减少(与对照比较)多达4天，而对于763nm和773nm下的所述条件，肿瘤生长减少则多达12天。对于773nm观察到最大肿瘤生长减少。
在卤素灯或钛蓝宝石照射小鼠期间，没有观察到太大的温度变化。
该研究总起来说，发现照射的最适波长为773nm。在注射和照射之间的延迟对肿瘤反应有影响。于764nm，1小时延迟显示最有效。当使用773nm波长时，最有效延迟为24小时。
                          表4
              C3H/BA乳腺癌对Pd-BPheid的反应
药物       光          所治疗     毒性(疗    有原发性肿瘤     小结
剂量       参数        的动物     法相关     再生长的动物     (治愈)
(mg/Kg)                数目       的死亡)    数(至复发的天    ％
                                             数)
1i.v.      300J/cm2   1          0          1(1天)           -
           757nm                                              无反应
           75mW/cm2
           15分钟间隔
5i.v       300J/cm2   3          0                           +
           757nm                                              2(41天)
           75mW/cm2                                          2(40天)
           15分钟间隔                                         100％
5i.v       300J/cm2   3          0          1(11天)          +
           757nm                                              1(41天)
           75mW/cm2                                          66.66％
           1小时间隔
10i.v      300J/cm2   3          0                           +
           757nm                                              2(41天)
           75mW/cm2                                          1(41天)
           1小时间隔                                          100％
10i.v      300J/cm2   2          0          2(1天)           -
           757nm                                              无反应
           75mW/cm2
           4小时间隔
10i.v      100J/cm2   3          0                           +
           757nm                                              2(42天)
           75mW/cm2                                          1(41天)
           15分钟间隔                                         100％
10i.v      100J/cm2   3          0          1(5天)           +
           757nm                                              2(40天)
           75mW/cm2                                          66.66％
           1小时间隔
                                表5
                       RIF-1对Pd-BPheid的反应
药物       光          所治疗    毒性(疗    有原发性肿瘤       小结
剂量       参数        的动物    法相关     再生长的动物       (治愈)
(mg/Kg)                数目      的死亡)    数(至复发的天      ％
                                            数)
1 i.v.     300J/cm2   2         0          2(1天)             -
           757nm                                               无反应
           75mW/cm2
           15分钟间隔
5i.v       300J/cm2   3         0          1(5天)             +
           757nm                            1(12天)            1(40天)
           75mW/cm2                                           33.33％
           15分钟间隔
5i.v       300J/cm2   3         0          1(4天)             +
           757nm                            1(2天)
           75mW/cm2                        1(7天)
           1小时间隔
10i.v      300J/cm2   3         2                             +
           757nm                 2(1天)                        1(41天)
           75mW/cm2                                           33.33％
           15分钟间隔
10i.v      300J/cm2   4         2          1(20天)            +
           757nm                 2(1天)                        1(40天)
           75mW/cm2                                           25.00％
           1小时间隔
10i.v      300J/cm2   1         0                             -
           757nm                                               无反应
           75mW/cm2
           4小时间隔
10i.v      100J/cm2   3         0          2(12天)            +
           757nm                            1(7天)
           75mW/cm2
           15分钟间隔
10i.v    100J/cm2      3         0          2(3天)           +
         757nm                              1(6天)
         75mW/cm2
         1小时间隔
实施例8.基于Pd-BPheid和BChl-Ser的PDT后A431人上皮类癌瘤细胞的形态学评估
为了检查在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe对A431人上皮类癌瘤细胞进行PDT后发生的时间依赖性形态变异，进行本实验。
(i)材料：如以上实施例1制备Pd-BPheid，而按照EP 584552制备丝氨酸甲酯BChl-SerOMe。
(ii)光源：卤素灯(Osram，德国，100W)，具有4.5cm水滤光器和＞650nm的截止滤光片。以15mW/cm2、总能注量为9J/cm2，将所述细胞照射10分钟。对于照射，将培养板置于玻璃台上，以从底部提供光源。
(iii)光毒性研究：以两个复份将A431细胞(5×104细胞)接种于3cm平皿内，然后在Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM)+F12(1∶1)中培养至75％铺满，所述培养基用HEPES(25mM，pH7.4)缓冲、含有胎牛血清(FCS)以及青霉素(0.06mg/ml)和链霉素(0.1mg/ml)。于对应的LD90浓度(分别为0.1μM和1μM)，将Pd-BPheid或BChl-Ser加入所述细胞中。4小时后，用培养基洗涤所述细胞，然后用以上所述光源照射所述细胞。采用装备Contax 35mm SLR照相机的Zeiss Axiovert-35光学显微镜(放大倍数×320)，于照射后的不同时间点(PDT后0、0.5、4和24小时)，进行相差显微镜检查。在每种重复的第二个平皿中，采用中性红生存力测定(Zhang SZ.，1990，Cell Biol Toxicol 6(2)：219-234)，于PDT后24小时，评价细胞生存力。
(iv)结果：在所述细胞形态学方面，两种致敏剂均引起显著变化。Pd-BPheid引起所述细胞膜结构的快速改变(30分钟)，所述细胞快速萎缩并且形成纤维性连接，将所述细胞膜与原始粘着斑点(纤维表型)连接。4小时后，90％所述细胞丧失其大部份内水体积并且其大部分脱离所述平皿，24小时后没有观察到进一步的变化(图4，右栏)。BChl-Ser显示可能仅在4小时后观察到的不同型式的时间依赖性形态变异。观察到膜泄漏(blabbing)为从所述细胞膜芽生的暗色小泡。24小时内没有观察到显著的体积减少，而该时期后，大多数细胞附着于所述平皿，但出现中空(泄漏(blabbing)表型，图4，左栏)。照射后24小时，在两个实验组中，进行中性红生存力测定，证明已杀伤90％±7％细胞。在图4中，右柱图代表所述纤维表型，而左柱图代表所述泄漏表型。实心白色箭头显示纤维或泄漏物(blab)的形成。
实施例9.Pd-BPheid和BChl-SerOMe对人膀胱癌细胞系ECV304的光细胞毒性
为了评价光敏剂Pd-BPheid和BChl-SerOMe对ECV304人膀胱癌细胞的光细胞毒性效应，进行本实验。
(i)材料：如实施例8(i)所述材料。
(ii)光源：如实施例8(ii)所述光源。
(iii)光毒性研究：在96孔中的含有青霉素(0.06mg/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的M-199、10％FCS中，培养ECV304细胞(2×104细胞/孔)至铺满(约2×105细胞/孔)。用增加浓度的Pd-BPheid或BChl-SerOMe与所述细胞一起温育4小时，然后用新鲜培养基进行洗涤，并如以上小节1所述进行照射。照射后24小时，采用中性红生存力测定评价细胞生存力。使用以下对照： 光对照：不用致敏剂处理的照射细胞； 黑暗对照：在黑暗中用致敏剂处理的非照射细胞； 未处理对照：为了计算100％存活率，使用既不用致敏剂处理也不照射的细胞(Rosenbach-Belkin V.等，1996，Photochem Photobiol 64(1)：174-181)。
(iv)结果：Pd-BPheid和BChl-SerOMe两者均表现出对ECV304细胞的依赖于剂量和光的细胞毒性(图5)。相应的LD50值为19nM和1000nM。PDT后的形态变异与用A431细胞进行的观察一致(数据未显示)。
实施例10.Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯在M2R小鼠黑素瘤细胞上的PDT
本实验的目的是测试Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯对M2R细胞的作用。
(i)材料：如以上实施例1制备Pd-Bpheid，而按照WO 97/19081所描述的方法制备Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a乙酯(Pd-Bpheid-乙酯)。
(ii)光源：如以上实施例8(ii)所述光源，但以12mW/cm2、总能注量为7J/em2，将细胞照射10分钟。
(iii)光毒性研究：将M2R细胞在用HEPES(25mM，pH 7.4)缓冲的Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM)+F12(1∶1)中培养为单层。包括胎牛血清(FBS)(10％)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和链霉素(0.1mg/ml)，并于37℃在含8％CO2的湿润氛围中培育所述细胞。对于光毒性分析，将细胞(1×104细胞/孔)在96孔板中培养24小时至2×104细胞/孔的合适密度。将色素直接溶于培养基中或95％乙醇中，并在培养基中进一步稀释至终浓度为1％乙醇。加入所述稀释的色素，于37℃在黑暗中将所述细胞温育4小时。照射之前，用新鲜培养基将所述细胞洗涤一次，并更换新鲜培养基。然后将所述板于室温下从底部照射10分钟，并置于37℃避光培养箱中。24小时后测定细胞存活率。使用以下对照系统： 黑暗对照-保持在黑暗中的未处理细胞； 光照 对照-未用致敏剂处理的照射细胞； 黑暗毒性-用色素处理但保持在黑暗中的细胞。通过如先前(WO 97/19081)所述的[3H]-胸苷掺入，测定细胞存活率。
(iv)结果：正如可以在图6A中所观察的，如果将所述色素溶于95％乙醇中，则Pd-BPheid的LD50为0.03μM，而Pd-BPheid-乙酯的LD50为0.07μM。如果将所述色素直接溶于含10％血清的培养基中，则只有Pd-BPheid是完全有活性，而Pd-BPheid-乙酯在高达所测试的最高浓度1μM下都完全没有活性(图6B)。
实施例11.Pd-BPheid在M2R小鼠黑素瘤细胞和人HT29结肠癌细胞上的PDT
这些实验目的在于测定Pd-BPheid对两种细胞系：M2R小鼠黑素瘤细胞和人HT29结肠癌细胞的光毒性效应。
(i)材料：如以上实施例1所述制备Pd-Bpheid。
(ii)光源：光源为氟氙LS3-PDT灯(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水滤光器和720-850nm光带。以12mW/cm2、总能量为7J/cm2，将细胞照射10分钟。
(iii)光毒性研究：用具有以下变化如上所述(实施例10)的相同方案进行分析：将Pd-BPheid直接溶于含10％血清的培养基中，然后将其加入到所述细胞中。通过[3H]-胸苷掺入，测定M2R细胞的存活率，而用MTT分析测定人HT29细胞的存活率(Merlin JL等，1992 Eur.J.Cancer28A：1452-1458)。
(iv)结果：如可以在图7中所观察的，人结肠HT-29细胞显示对该色素较低的敏感性(0.5μM的LD50)，而M2R细胞的敏感性高约10倍(0.03μM的LD50)。
实施例12.用Pd-BPheid的M2R小鼠黑素
本实验的目的是研究在CD1裸鼠中用2.5mg/kg Pd-BPheid的M2R小鼠黑素瘤肿瘤的PDT。
(i)材料：如以上实施例1所述制备Pd-Bpheid。
(ii)小鼠：CD1裸鼠(25-30g)。
(iii)麻醉法：腹膜内注射50μl氯胺酮/Rumpon(体积/体积＝85/15)。
(iv)肿瘤植入法：用106M2R细胞植入小鼠背部，并在2-3周内使肿瘤生长至所述处理的大小(7-8mm)。
(v)光源：Osram 150W卤素光学照相灯64643(D.K.Keller等1999，Int.J.Hyperthermia 15，467-474)，装备λ＝650-900mn光谱窗，300mW/cm-2.照射30分钟。
(vi)PDT方案：将所述已麻醉的小鼠静脉内注射所述色素，然后立即照射所述肿瘤。在疗法结束时，将所述小鼠放回笼中。于指定的时间之前或于指定的时间，对所述肿瘤进行照相。
实验1：
致敏剂的制备：将2mg Pd-BPheid溶于0.25ml cremophor EL中，然后超声处理20分钟。加入0.075ml 1，2-丙二醇，再继续进行超声处理15分钟。加入0.9ml 0.15mM NaCl，然后超声处理5分钟。将所述样品于13,000rpm(Eppendorf)离心1 2分钟。根据氯仿中的光谱，计算出Pd-BPheid的终浓度为0.5mg/ml。
肿瘤的PDT：将带有M2R黑素瘤肿瘤的CD1裸鼠静脉内注射Pd-BPheid 2.5mg/kg。于300mW cm-2照射所述肿瘤30分钟。所述小鼠皮肤肿瘤区的温度为37.7-38℃。处理后1和4天继续肿瘤的反应。结果示于图8中。
实验2：
致敏剂的制备：将2mg Pd-BPheid溶于0.1ml甲醇、0.1ml 0.1MKH2PO4、pH＝8.0和0.9ml PBS中，然后超声处理10分钟。用氩气蒸发甲醇，加入20％cremophor EL∶1，2-丙二醇(3∶1)，然后超声处理15分钟。将所述样品于13,000rpm离心8分钟，根据氯仿中的光谱，计算出Pd-BPheid的终浓度为0.5mg/ml。
肿瘤的PDT：将带有M2R黑素瘤肿瘤的CD1裸鼠静脉内给予Pd-BPheid 2.5mg/kg(120μl)。于300mW cm-2照射所述肿瘤组织30分钟。所述小鼠皮肤肿瘤区的温度为37.7-38℃。处理后1和4天继续肿瘤的反应。结果示于图9中。
结果：如图8和图9所示，如上所述用2.5mg/Kg Pd-Bpheid的M2R黑素瘤肿瘤的PDT在24小时内诱发严重的炎症反应和肿瘤坏死。
实施例13.基于Pd-BPheid的PDT降低小鼠中C6神经胶质瘤转移形成的比率：比外科手术有利
为了比较基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT的治疗潜力，以及由基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT引起的转移扩散的可能性，进行这些实验。
(i)材料：20％Cremophor EL中的Pd-BPheid(如实施例1所述制备)或Pd-BPpheid-SerOMe 5mg/kg。
(ii)光源：光源为氟氙LS3-PDT灯(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水滤光器和720-850nm光带。
(iii)小鼠：CD1裸鼠。
(iv)肿瘤：用106C6神经胶质瘤细胞移植至小鼠后腿的爪内。当达到长度为7-8mm时，治疗肿瘤。
(v)麻醉：50μl Vetalar/Rumpon(体积/体积＝85/15)。
(vi))镇痛：在5％蔗糖饮水中加入羟考酮(12mg/升)，从(切断术或PDT)时起持续1周。
(vii)方案：用5mg/Kg致敏剂(Pd-BPheid或Pd-BPpheid-SerOMe)静脉内注射3组小鼠(每组10只小鼠)，然后立即于200mw/cm2下照射30分钟，让动物在其笼中恢复。组1和组2：分别接受PDT Pd-Bpheid和Pd-BPpheid-SerOMe的动物。在腹股沟中的肿瘤反应和转移形成持续4周。组3：切断踝关节，并且在腹股沟中的肿瘤转移形成持续4周的动物(与组1成对)。对PDT的反应参数为肿瘤坏死和消失的动物占处理动物总数的百分比。转移表现为肿瘤在腹股沟或其它部位的出现。认为的终点是：跟踪4周，自然死亡，肿瘤达到直经2cm，转移，无论哪种反应先出现均是终点。
(vii)结果：肿瘤变平(消失)的结果示于图10中。而在第11天，对Pd-BPheid的反应比对Pd-BPheid-SerOMe强(分别为100％和80％肿瘤变平)，过后，在第28天，反应的百分比相似，约60％。从长远观点来看，在某些处理的动物中，肿瘤变平下降是由于某些肿瘤再生长引起的，或可能是由于光场(light field)与肿瘤区错配引起的。转移出现的结果示于图11中。通过腿切断的外科手术疗法与PDT比较产生显著更高的转移百分比(高达78％)。此外，切断后的转移出现得更早。用Pd-Bpheid进行PDT后的转移频率最低(至多23％)。该结果类似于用Pd-BPheid-SerOMe获得的结果，并且Pd-BPheid的主要优点是延迟转移出现。用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe的PDT治愈C6神经胶质肿瘤。PDT后的转移形成如果与外科手术疗法比较则显著较低。

Claims (40)

1.一种式I、I’或I”的化合物
Figure C9981605800021
其中
A代表OH，
OR1，
-O-(CH2)n-Y，
-S-(CH2)n-Y，
-NH-(CH2)n-Y，
-O-(CH2)2-OH，
-NH-(CH2)2-NH-BOC或
-N-(CH2-CH＝CH2)2
其中
R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、
NH4 + +NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，
+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或
+N(Cn′H2n′+1)4；
当所述化合物是式I’的化合物时，R2代表H或C1-C12烷基，以及当所述化合物是式I的化合物时，R2代表H、OH或COOR4，其中R4为C1-C12烷基或C3-C12环烷基；
当所述化合物是式I’的化合物时，R3代表H或C1-C12烷基，以及当所述化合物是式I的化合物时，R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；
n为1、2、3、4、5或6，
Y为-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互独立地代表-CH3或-C2H5；
X为F、Cl、Br或I，
n′为1、2、3或4，
并且其中*表示一个不对称碳，而—代表一个饱和单键或一个不饱和双键。
2.具有如下所示结构式和光学构型的权利要求1的化合物：
Figure C9981605800041
其中A为OH或OR1，而R1如权利要求1中所限定。
3.具有如下所示结构式和光学构型的化合物，其中A为OH：
所述化合物在此鉴定为Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)。
4.一种药用组合物，其包含至少一种如在权利要求1所限定的式I、I’或I”化合物和药学上可接受的载体。
5.权利要求4的药用组合物，用于肿瘤的光动力疗法(PDT)。
6.权利要求4的药用组合物，其中所述组合物为溶液、脂质乳剂或凝胶的形式，或为脂质体或纳级粒子的形式。
7.权利要求4的药用组合物，其中所述至少一种化合物的存在量为所述组合物的总重量的0.01％-20％重量。
8.一种药用组合物，其包含至少一种权利要求2的化合物作为活性剂和药学上可接受的载体。
9.权利要求8的药用组合物，该药用组合物用于肿瘤的光动力疗法(PDT)。
10.权利要求8的药用组合物，其中所述组合物为溶液、脂质乳剂或凝胶的形式，或为脂质体或纳级粒子的形式。
11.权利要求8的药用组合物，其中所述至少一种化合物的存在量为所述组合物的总重量的0.01％-20％重量。
12.一种药用组合物，其包含Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a作为活性剂和药学上可接受的载体。
13.权利要求12的药用组合物，该药用组合物用于肿瘤的光动力疗法(PDT)。
14.一种药用组合物，其包含Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a化合物和药学上可接受的载体，其中所述组合物为溶液、脂质乳剂或凝胶的形式，或为脂质体或纳级粒子的形式。
15.权利要求14的药用组合物，其中所述至少一种化合物的存在量为所述组合物的总重量的0.01％-20％重量。
16.一种制备权利要求1中的式I化合物的方法，其中A为OH，所述方法包括以下步骤：
a)将M-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a173-Z化合物联合脱金属和水解，其中Z为植基、香叶基香叶基或丝氨酰甲酯(SerOMe)，而M为选自Mg、Cd和Zn的金属；和
b)用Pd试剂将Pd掺入(a)中获得的化合物中。
17.按照权利要求16用于制备Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)的方法，其中细菌叶绿素a(Bchla)在步骤(a)中被脱金属和水解，并将所获得的细菌脱镁叶绿甲酯一酸(BPheid)在步骤(b)中与Pd试剂反应，产生所需的Pd-BPheid。
18.按照权利要求16或17的方法，其中所述Pd试剂是乙酸钯或氯化钯。
19.按照权利要求18的方法，其中通过采用抗坏血酸钠或抗坏血酸的两步法，或者通过采用6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸的一步法，进行所述Pd的掺入。
20.一种制备权利要求1化合物的方法，该化合物是式I的Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸(Pd-BPheid)，其中A不为OH，所述方法包括以下步骤：
a)将细菌叶绿素a(Bchla)联合脱金属和水解，以获得细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Bpheida)；
b)用Pd试剂将Pd掺入(a)中获得的化合物中，以获得Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)化合物；和
c)将步骤(b)所获得的化合物与对应的A-H化合物反应，其中A不为OH。
21.一种制备权利要求1中的其中A为OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)对BChlide-173-Z进行金属转移，获得对应的Pd-BPheid-173-Z，其中Z为植基、香叶基香叶基或SerOMe；和
b)水解(a)中所获得的化合物。
22.按照权利要求21用于制备Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)的方法，其中细菌叶绿素a(Bchla)在步骤(a)中被进行金属转移，以由Pd取代所述天然中心Mg原子，并将所获得的其中Z为植基的Pd-BPheid-173-Z在步骤(b)中水解，产生所需的Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)。
23.按照权利要求21或22的方法，其中所述Pd试剂是乙酸钯或氯化钯。
24.按照权利要求23的方法，其中通过采用抗坏血酸钠或抗坏血酸的两步法，或者通过采用6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸的一步法，进行所述Pd的掺入。
25.一种制备权利要求1化合物的方法，该化合物是式I的Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸(Pd-BPheid)，其中A不为OH，所述方法包括以下步骤：
a)对细菌叶绿素a(Bchla)进行金属转移，以由Pd取代所述天然中心Mg原子；
b)将步骤(a)所获得的化合物水解，以获得Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)化合物；和
c)将步骤(b)所获得的化合物与对应的A-H化合物反应，其中A不为OH。
26.一种制备权利要求1中的其中A为OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)酶促水解其中Z为植基或香叶基香叶基的细菌脱植基叶绿素a(Bchlide)-173-Z，获得BChlide；
b)将(a)的所述Bchlide进行酸性脱金属；和
c)用Pd试剂将Pd掺入到(b)的所述脱金属的化合物中。
27.按照权利要求26用于制备Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)的方法，其中细菌叶绿素a(Bchla)在步骤(a)中进行酶促水解、在步骤(b)中脱金属并在步骤(c)中与Pd试剂反应，产生所需的Pd-BPheid。
28.按照权利要求26或27的方法，其中所述Pd试剂是乙酸钯或氯化钯。
29.按照权利要求28的方法，其中通过采用抗坏血酸钠或抗坏血酸的两步法，或者通过采用6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸的一步法，进行所述Pd的掺入。
30.一种制备权利要求1化合物的方法，该化合物是式I的Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)，其中A不为OH，所述方法包括以下步骤：
a)酶促水解细菌叶绿素a(Bchla)；
b)将(a)的产物进行酸性脱金属；
c)用Pd试剂将Pd掺入到(b)的脱金属的化合物中，以产生Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a(Pd-BPheid)；
d)将步骤(c)所获得的化合物与对应的A-H化合物反应，其中A不为OH。
31.如在权利要求1所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制备用于包括转移性肿瘤的肿瘤的光动力疗法(PDT)的药用组合物。
32.如在权利要求2所限定的化合物的用途，用于制备用于包括转移性肿瘤的肿瘤的光动力疗法(PDT)的药用组合物。
33.如在权利要求1所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制备用于肿瘤诊断的药用组合物。
34.根据权利要求32或33的用途，其中所述化合物是Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a。
35.根据权利要求31-33任一项的用途，其中所述药用组合物作为注射剂制备。
36.根据权利要求31-33任一项的用途，该药用组合物用于局部给药。
37.如在权利要求1所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制备用于活体外杀伤样品中的细菌、病毒、寄生物和真菌的组合物。
38.根据权利要求37的用途，其中式I化合物是Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸a。
39.根据权利要求37或38的用途，其中所述样品是用于输血或者用于制备血液制品的血液或血浆。
40.一种作为中间体的式II或式III化合物
或
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