NO331426B1 - Palladium-substituert bakterioklorofyll derivat, farmasoytisk sammensetning, fremgangsmater for fremstilling samt anvendelse av nevnte derivat - Google Patents

Abstract

Palladium-substituert bakterioklorofyll derivater av formel (l), hvori A representerer OH, OR, -O- (CH2)n-Y, -S-(CH2)n-Y, -NH-(CH2)n-Y, -O-(CH2)2-NH2l -O-(CH2)2-OH, -NH-(CH2)n- +N o, X', -NH- (CH2)2-NH=BOC eller-N-(CH2-CH=CH2)2; hvori R, representerer Na+, K+, (Ca2+)05, (Mg2+)05, Li+, NH4+, +NH3-C(CH2OH)3, +NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, +NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH eller +N(Cn'H2n+1)4; R2 representerer H, OH eller COOR4, hvori Fl, er C3C12 alkyl eller C3-C12 cykloalkyl; Rs representerer H, OH eller C1-C12 alkyl eller alkoksy; n er 1, 2, 3,4, 5 eller 6, Y er -NR1R2 eller +NR1R2R3, X hvori R1 R'2 og R'3 uavhengig fra hverandre representerer -CH3 eller -C2H5; X er F, Cl, Br eller l, n' er 1,2, 3 eller 4 og deres oksiderte former, er nyttige feltet fotodynamisk terapi (PDT).

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter palladium-substituerte bakteriofyll derivater, prosesser og intermediater for deres preparering og farmasøytiske sammensetninger som omfatter det samme så vel som deres anvendelse innenfor området in vivo fotodynamisk terapi og diagnose og in vitro fotodynamisk avliving av virus og mikroorganismer.

DEFINISJONER OG FORKORTELSER

BChl = bakterioklorofyll a (Mg-inneholdende 7,8,17,18-tetrahydroporfyrin som har en fytyl eller geranylgeranyl gruppe i posisjon 17<3>, en COOCH3gruppe ved posisjon 13<2>, et H atom ved posisjon 13<2>, en acetyl gruppe i posisjon 3 og en etyl gruppe i posisjon 8).

BChlide = bakterioklorofyllid a (C-17<2->fri karboksylsyre avledet fra BChl a).

BPhe = bakteriofeofytin a (BChl hvori det sentrale Mg atomet er erstattet av to H atomer).

BPheid = bakteriofeoforbid a (C-17<2->fri karboksylsyre avledet fra BPhe).

Pd-BPheid = Pd-bakteriofeoforbid a (C-17<2->fri karboksylsyre avledet fra BPhe som har et sentralt Pd atom, en COOCH3gruppe i posisjon 13<2>, et H atom i posisjon 13<2>, en acetyl gruppe i posisjon 3 og en etyl gruppe i posisjon 8).

IUPAC nummerering av bakterioklorofyll derivater blir brukt gjennom hele beskrivelsen. Ved å bruke denne nomenklaturen, bærer naturlig bakterioklorofyller to karboksylsyre estere i posisjonene 13<2>og 17<2>, de er imidlertid esterifisert i posisjonene 13<3>og 173.

Det har vært en økende interesse i utnyttelse av fotosensibilisatorer for cancer terapi. I følge denne teknikken, kjent som fotodynamisk terapi (PDT), blir fotosensibilatorer anvendt for eksempel på en tumor og in situ fotosensibilisatoren produserer forbindelser som forgifter de maligne cellene.

Fotodynamisk terapi ved å bruke porfyriner og relaterte forbindelser har, så langt, en ganske lang historie. Tidlig arbeid, i 1940, demonstrerte at porfyrin kan fluorisere i bestrålte tumorvev. Porfyrinet så ut til å akkumulere i disse vevene, og være i stand til å absorbere lys in situ, dette tilveiebrakte en metode for å detektere tumor ved lokalisering av fluoressensen. Et mye brukt preparat i tidlige stadier av fotodynamisk behandling både for å detektere og for terapi var uforedlet derivat av hematoporfyrin, også kalt hematoporfyrin derivat, HpD, eller Lipson derivat fremstilt som beskrevet av Lipson og samarbeidspartnere i J Nati Cancer Inst (1961) 26:1-8. Mye arbeid har blitt utført ved å bruke denne prepareringen, og Dougherty og samarbeidspartnere rapporterte anvendelsen av dette derivatet i behandling av malignitet ( Cancer Res (1978) 38:2628-2635: J Nati Cancer Inst (1979) 62:231-237).

Dougherty og samarbeidspartnere fremstilte en mer effektiv form av hematoporfyrin derivat som omfatter en del av HpD som har en aggregatvekt >10 kd. Denne formen av medikamentet som er nyttig i fotodynamisk terapi er beskrevet i U.S. Patent 4,649,151, og er kommersielt tilgjengelig, og er i kliniske anvendelser.

De generelle prinsippene for anvendelse av lys-absorberende forbindelser, spesielt de

som er relatert til porfyriner, har blitt vel etablert som en behandling for tumorer når den blir administrert systemisk. Den forskjellige evnen til disse prepareringene i å ødelegge tumor, i forhold til normalt vev, skyldes målsøkningseffekten (homing effect) hos disse prepareringene i forhold til målcellene. (Se for eksempel, Dougherty, T.J., et al., "Cancer Principles and Practice og Oncology" (1982), V.T. de Vita, Jr., et al., eds. S. 1836-1844). Anstrengelser har blitt gjort for å forbedre målsøkingsevnen ved å konjugere hematoporfyrin derivat til antistoffer. (Se for eksempel, Mew, D., et al., J Immunol (1983) 130:1473-1477). Mekanismen til disse medikamentene i drepeceller ser ut til å involvere dannelse av enkel oksygen ved bestråling (Weishaupt, K.R., et al, Cancer Rescherch (1976) s. 2326-2329).

Anvendelsen av hematoporfyrin derivat eller dets aktive komponenter i behandlingen av hudsykdommer ved å bruke topisk administrering har også blitt beskrevet i U.S. Patent 4,753,958.1 tillegg, har medikamenter blitt brukt til å sterilisere biologiske prøver som inneholder infeksiøse organismer slik som bakterier og virus (Matthews, J.L., et al., Transfusion (1988): 81-83). Forskjellige andre fotosensibilisator forbindelser har også blitt brukt for dette formålet, som fremsatt, for eksempel, i U.S. Patent nr. 4,727,027.

Generelt, er fremgangsmåter for anvendelse av bestrålings sensibilisatorer med forskjellige strukturer for å selektivt svekke funksjonen til biologiske substrater både in vivo og in vitro forstått innen fagfeltet. Forbindelsene som er nyttige i disse prosedyrene må ha forskjellig affinitet for det biologiske målsubstratet som skal svekkes eller ødelegges og må være i stand til å absorbere lys slik at det bestrålte medikamentet blir aktivert på en måte slik at det har en skadelig effekt på nærliggende sammensetninger og materialer.

Fordi det alltid er ønskelig å optimalisere utførelsen av terapeutika og diagnostika, har variasjoner i porfyrin medikamentene tradisjonelt brukt i behandling og diagnoser blitt søkt. Et antall av forskjellige klasser av fotosensibilisatorer har blitt foreslått å inkludere ftalocyaniner, psoralen-relaterte forbindelser, og multicykliske forbindelser med resonant systemer generelt. Mest likt forbindelsene beskrevet heri er forskjellig feoforbid derivater hvis anvendelse i fotodynamisk terapi har blitt beskrevet i EPO søknad 220686 til Nihon Metaphysics Comapny; etylen diamin derivater fra feoforbid for dette formålet beskrevet i Japansk søknad J85/000981 fra Tama Seikayaku, K.K., og Japansk søknad J88/004805 som er rettet mot 10-hydroksyfeoforbid-a. I tillegg, angir Beems, E.M., et al, i Photochemistry and Photobiology (1987) 46:639-643 anvendelse som fotosensibilisatorer to derivater av bakterioklorofyll-a - bakterioklorofyllin-a (også kjent som bakteriofeoforbid-a, som mangler fytyl alkohol derivatisert i bakterioklorofyll-a) og bakterioklorin-a (som mangler både fytyl gruppe og Mg ion). Disse forfatterne retter deres oppmerksomhet mot disse derivater som er fordelaktige på grunn av økt vannløselighet sammenlignet med bakterioklorofyll-a.

EP 584552 og WO97/19081, begge fra Yeda Research and Development Co. Ltd., beskriver klorofyll og bakterioklorofyll derivater og deres anvendelse som PDT midler, og metalerte bakterioklorofyller og deres preparering ved transmetalering av de korresponderende Cd-BChl derivater, respektiv.

Problemet forblir å finne egnede fotosensibilisatorer som er nyttige i fotodynamisk terapi og diagnose som er optimale for spesielle mål og i spesielle sammenhenger. Derfor, tilveiebringer denne oppfinnelsen en ytterligere gruppe av fotosensibilisator forbindelser som blir en del av repertoaret av kandidater for anvendelse i spesifikke terapeutiske og diagnostiske situasjoner.

Det har nå blitt funnet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, at forbindelse med formel I, F eller I" hvori A, som definert under, representerer en substituent som er i stand til å tillate en effektiv plasma overføring og cellemembran penetrering, er nyttig som PDT midler og presenterer fordeler av økt løselighet, stabilitet og/eller effektivitet, sammenlignet med kjente forbindelser.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse som er kjennetegnet ved formel I, I' eller I"

hvori

A representerer OH,

ORi,

-0-(CH2)n-Y,

-S-(CH2)n-Y,

-NH-(CH2)n-Y,

-0-(CH2)2-OH,

-NH-(CH2)2-NH-BOC eller

-N-(CH2-CH=CH2)2

hvori

Ri representerer Na<+>, K<+>, (Ca<2+>)o,5, (Mg<2+>)o,5, Li<+>, NH/ ^NH3-C(CH2OH)3,^NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, ^NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH eller<+>N(Cn'H2n>+i)4;

Pv2 representerer H når forbindelsen ifølge formel F, og representerer H, OH eller COOR4, når forbindelsen ifølge formel I, hvori R4er Q-C12alkyl eller C3-Q2 cykloalkyl;

R3representerer H eller Ci-Ci2alkyl når forbindelsen er ifølge formel F, og representerer H, OH eller C1-C12alkyl eller alkoksy når forbindelsen er ifølge formel I; n er 1, 2, 3, 4, 5 eller 6,

Y er -NR'iR'2 eller<+>NR'iR'2R'3, X" hvori R'i, R'2og R'3uavhengig av hverandre representerer -CH3eller -C2H5;

X er F, Cl, Br eller I,

n' er 1,2, 3 eller 4,

og hvori<*>beskriver et asymmetrisk karbon og — representerer en enkelt mettet binding eller en dobbelt umettet binding.

Videre, omfatter den foreliggende oppfinnelsen prosesser for preparering av de ovenfor nevnte nye forbindelser samt farmasøytiske sammensetninger som omfatter de ovenfor nevnte nye forbindelser.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller I" som definert ovenfor for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger nyttige i fotodynamisk terapi (PDT) av tumorer.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller I" som definert ovenfor for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger nyttige i ex vivo avliving av bakterier, virus, parasitter og sopp.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller I" som definert ovenfor for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger for bruk ved tumordiagnose.

Et siste aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse som er kjennetegnet ved formel II eller III

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGER

Figur 1 viser optisk absorpsjonsspektrum av Pd-BPheid i en blanding av aceton og metanol/K buffer fosfat. Figurene 2 og 3 viser, respektiv, lave og høye resolusjons massespektra av Pd-BPheid utført på Fast Atom Bombardement (FAB-MS). Figur 4 viser tids-avhengig morfologiske endringer av A431 celler med Pd-BPheid eller BChl-SerOMe etter PDT [i figurene, står Bchl-Ser for BChl-SerOMe, seryl metyl estere til BChl]. Figur 5 viser fototoksisitet av Pd-BPheid og BChl-SerOMe testet på ECV-304 celler. Figur 6 viser fototoksisitet av Pd-BPheid og Pd-BPheid-etyl ester på dyrkede M2R muse melanoma celler. (A) pigmentene løst i 95% etanol og ytterligere fortynnet til de indikerte konsentrasjonene i kulturmedium + 10% serum til 1% etanol. (B) pigmenter løst direkte i kulturmedium + 10% serum. Figur 7 viser fototoksisitet av Pd-BPheid på dyrkede M2R muse melanoma og humane H29 kolon karsionom celler. Figur 8 viser PDT hos M2R muse melanoma med Pd-BPheid (2.5 mg/kg) løst i Cremophor og fortynnet i saltløsning. Figur 9 viser PDT fra M2R muse melanoma med Pd-BPheid (2.5 mg/kg) løst i saltløsning og fortynnet med Cremophor. Figur 10 viser helbredelse av primære C6 glioma tumorer etter PDT med Pd-BPheid eller Pd-BPheid-SerOMe [i figur, Pd-Bchl-Ser]. Figur 11 viser tilstedeværelse av C6 glioma metastaser i CD1 nakne mus etter kirurgisk inngrep (amputasjon) eller etter PDT med Pd-BPheid eller Pd-BPheid-SerOMe [i figur, Pd-Bchl-Ser].

I en foretrukket utførelsesform, har forbindelsene fra oppfinnelsen følgende formel med den optiske konfigurasjonen under:

hvori A er som over.

Når de stiplede linjene representerer binding mellom C7 og C8 og C17 og Cl 8 i den ovenfor nevnte strukturen er det en mettet enkelt binding, karbonatomene nummerert 7, 8, 17 og 18 er asymmetriske karbonatomer. Når R2eller R3er H, er C132 et asymmetrisk karbonatom.

Ved tilstedeværelsen av oksygen eller ved omkringliggende luft og under lys påvirkning, kan oksideringen av den ovenfor nevnte C7-C8 og C17-C18 bindinger forekomme, som resulterer i forbindelser med dobbelt bindinger ved nevnte posisjoner C7-C8 ogC17-C18.

Forbindelsene fra formel F og I" fra den foreliggende oppfinnelse er oksiderte former av forbindelsene fra formel I og kan erverves ved prosesser beskrevet i Chlorophyll, av Scheer H. (ed.), CRC Press, 1991, s. 147-209.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er forbindelsene de hvori A er ORi.

I den mest foretrakkede utførelsesformen, er forbindelsen fra oppfinnelsen Pd-BPheid (også noen ganger heri kalt Pd-BChl-COOH), forbindelsen fra formel I hvori A er OH, har følgende struktur:

En av prosessene for å fremstille forbindelsene fra formel I hvori A er OH, omfatter minst trinnene: a) kombinert demetalering og hydrolyse av en M-BPheid-17<3->Z forbindelse hvori Z er fytyl, geranylgeranyl (gg) eller SerOMe (seryl O-metyl ester) og M er et matall selektert fra Mg, Cd, eller Zn; b) inkorporering av Pd med et Pd reagens i forbindelsen ervervet i (a), for derved å erverve en Pd-BPheid, og, hvis ønskelig, c) etterfølgende reaksjon av det ervervede Pd-BPheid med en korresponderende forbindelse fra formel Ri-H eller A-H for å danne det korresponderende Ri salt eller

en forbindelse hvori A ikke er OH.

I en foretrukket utførelsesform, er prosessen rettet mot prepareringen av Pd-BPheid og bakterioklorofyll a (Bchla) er demetalert og hydrolysert i trinn (a), og det ervervede bakteriofeoforbid (BPheid) reageres med et Pd reagnes i trinn (b) for å produsere det ønskede Pd-BPheid.

En annen prosess for fremstilling av forbindelsen i formel I omfatter minst følgende trinn: a) transmetalering av en Bchlide-173-Z for å erverve den korresponderende Pd-BPheid- 173-Z hvori Z er fytyl, gg eller Ser OMe,

b) hydrolyse av den ervervede forbindelsen, og

c) eventuelt etterfølgende reaksjon av det ervervede Pd-BPheid med en korresponderende forbindelse fra formel Ri-H eller A-H for å danne det

korresponderende Ri salt eller en forbindelse hvori A ikke er OH.

I en foretrukket utførelsesform, er prosessen rettet mot fremstilling av Pd-BPheid og bakterioklorofyll a (Bchla) er transmetalert i trinn (a) for å erstatte det native sentrale Mg atomet med Pd, og det ervervede Pd-BPheid-17<3->Z hvori Z er fytyl blir hydrolysert i trinn (b) for å produsere det ønskede Pd-BPheid.

En annen prosess for fremstilling av forbindelsen i formel I omfatter minst trinnene:

a) enzymatisk hydrolyse av en BChlide-173-Z hvori Z er fytyl eller geranylgeranyl for å erverve en BChlide; b) sur demetalering av nevnte BChlide i (a);

c) inkorporering av Pd med et Pd reagens inn i det demetalerte BPheid i (b); og

d) eventuelt etterfølgende reaksjon av det ervervede Pd-BPheid med en korresponderende forbindelse fra formel Ri-H eller A-H for å danne det

korresponderende Ri saltet eller en forbindelse hvori A ikke er OH.

I de ovenfor nevnte prosesser for fremstilling av forbindelsene fra formel I, kan Pd reagenset være en hvilken som helst reaktiv forbindelse som tilveiebringer Pd i slike strukturer slik som, for eksempel, Pd acetat og Pd klorid.

Inkorporeringen av Pd i prosedyrene over kan oppnås ved en to-trinns prosedyre ved å bruke Na askorbat eller askorbinsyre, eller med en en-trinns prosedyre ved å bruke 6-0-palmitoyl-L-askorbinsyre.

Forbindelsene fra oppfinnelsen hvori A er forskjellig fra OH og OR]kan erverves ved reaksjon av Pd-BPheid (Pd-BChl-COOH) med den korresponderende A-H forbindelsen. Forbindelsene i formel II og III over er intermediater for forbindelser fra formel I i oppfinnelsen. Syrekloridene i formel II, Pd-BPheid-COCl, kan erverves å bruke et hvilket som helst middel som er egnet for å danne acyl klorider, slik som for eksempel SOCl2.

Syre anhydridene i formel III kan erverves ved dehydrering av forbindelsene i formel I, F, I" med eddiksyre anhydrid.

Ved reaksjon med disse intermediatene II og III med den korresponderende forbindelsen AH, kan forbindelsene fra formel I, F eller I" erverves.

Oppfinnelsen omfatter ytterligere farmasøytisk akseptable salter av de frie syrene i formlene I, F og I". Saltene kan dannes ved fremgangsmåter som er vel kjent innen fagfeltet slik som ved reaksjon av den frie syren eller et salt derav med inorganiske eller organiske reagenser slik som, men ikke begrenset til, NaOH, KOH, kalsium eller magnesium egnede salter, LiOH, NH4OH, tetraalkylammonium hydroksid, for eksempel, tetraetylammonium hydroksid, eller N-metylglukamin, glukamin og trietanolamin.

Forbindelsene fra oppfinnelsen er egnet for anvendelse i fotodymanisk terapi og diagnose når det gjelder biologiske målsubstrater. Ved "biologiske målsubstrat" menes en hvilken som helst celle, virus eller vev som er uønsket i miljøet til hvilket terapien eller annen korreksjon, slik som sterilisering, blir anvendt, eller en lokalisering man ønsker å kjenne til i et miljø hvor diagnose anvendes.

Medikamentet kan bli injisert inn i individet for nå en optimal konsentrasjon i målsubstratet. Deretter blir målsubstratet eksponert for bestråling ved en bølgelengde som er egnet til absorpsjonsspekteret i forbindelsen som administreres. Effekten av forbindelsen kan forsterkes ved samtidig økning av målsubstrat temperaturen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli formulert ved å bruke konvensjonelle eksipienter egnet for den tilsiktede anvendelsen. For systemisk administrering, generelt, blir buffrede vandige sammensetninger anvendt, med tilstrekkelig ikke-toksisk detergent for å løse den aktive forbindelsen. Siden forbindelsene fra oppfinnelsen generelt ikke er svært løselig i vann, kan en løselig mengde av et slikt detergent anvendes. Egnede ikke-toksiske detergenter inkluderer, men er ikke begrenset til, Tween-80, forskjellige gallesalter, slik som natrium glykolat, forskjellige gallesalt analoger slik som fusidater. Alternative sammensetninger benytter liposom bærere. Løsningen blir buffret ved en ønsket pH ved å bruke konvensjonelle buffere slik som Hank's løsning, Ringer's løsning, eller fosfat buffer. Andre komponenter som ikke interfererer med aktiviteten til medikamentet kan også inkluderes, slik som stabiliseringsmengder av proteiner, for eksempel, serum albumin, eller lav tetthets- eller høy tetthets-lipoprotein (LDL og HDL, respektivt).

Systemiske formuleringer kan administreres ved injeksjon, slik som intravenøst (i.v.), intraperitonealt (i.p.), intramuskulært, eller subkutant (s.c.) injeksjon, eller kan administreres ved transmembrane eller transdermale teknikker. Formuleringer som er egnet for transdermal eller transmembran administrering inkluderer sprayer, og suppositorier som inneholder penetranter, som ofte kan være detergenter som beskrevet over.

For topisk lokal administrering, kan formuleringen også inneholde en penetrant og er i form av en salve, liniment, krem eller olje. Egnede formuleringer for både systemiske og lokaliserte topisk administrering finnes i Remington ' s Pharmaceutical Sciences, siste utgave, Mack Publishing Co., Easton, PA.

For anvendelse ex vivo for å behandle, for eksempel, blod eller plasma for transfusjon av prepareringer av blodprodukter, er ingen spesiell formulering nødvendig, men forbindelsene fra oppfinnelsen blir løst i et egnet kompatibelt løsningsmiddel og blandet inn i den biologiske væsken ved en egnet konsentrasjon, typisk i størrelsen 1-100 ug/ml forut for bestrålingen.

For fotodynamisk terapeutisk og diagnostiske anvendelser, vil egnede doseområder variere med fremgangsmåten for anvendelsen og valg av forbindelse, så vel som egenskapen til tilstanden som behandles eller blir diagnostisert. Imidlertid, generelle egnede doser er i området fra 0.01 til 50 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0.1 til 10 mg/kg. For topisk administrering, anvendes mengder i området fra 5-100 mg totalt.

De generelle prosedyrene for fotodynamisk ex vivo behandling er analoge til de som er beskrevet av Matthews, J.L., et al, Transfusion (supra).

I korthet, for systemisk administrering, får en egnet tidsperiode etter administrering, typisk fra flere minutter til to dager lov å forløpe for å tillate optimal konsentrasjon av forbindelsene fra oppfinnelsen i det biologiske målsubstratet. Generelt, vil dette substratet være en vaskulær tumor, tumor celler eller en hvilken som helst annen tumor komponent, og lokaliseringen av forbindelsen kan overvåkes ved å måle den optiske absorpsjonen av målvevet sammenlignet med bakgrunnen. Etter optimaliseringen har blitt fullført, blir det biologiske målsubstratet bestrålt med et egnet bånd for bestråling, i området fra 740-800 nm, eller 500-600 nm eller 700-900 nm med en rate på 5-750 mW/cm<2>, og en totalenergi på 100-1000 J/cm<2>.

For topisk behandling, blir lokaliseringen øyeblikkelig, og den korresponderende bestrålingen kan tilveiebringes deretter. For behandling av biologiske væsker ex vivo, blir bestrålingen utført etter optimal binding/opptak av målvevet er nådd. Bestrålingsfluensen er i størrelsen 1-10 J/cm<2>. Fordi penetreringen av vevet ikke er påkrevet, kan lavere totalenergi anvendes.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen omfatter minst en forbindelse fra formel I, F eller I" som definert over sammen med en fysiologisk akseptabel bærer. Disse sammensetningene kan være i form av en løsning, en lipid emulsjon eller en gel eller i form av liposomer eller nanopartikler. Den egnede bæreren ble valgt for å tillate optimalisering av konsentrasjonen av forbindelsen fra oppfinnelsen ved målsubstratet. Eksempler på slike bærere, men ikke begrenses til, er "Tween-80", polyetylenglykol, for eksempel PEG400, "Cremophor EL", propylen glykol, etanol, basil olje, gallesalter og gallesalter analoger og blandinger derav. Liposom formuleringer kan baseres, for eksempel, på dimyristoylfosfatidyl cholin eller fosfatidyl glyserol. Bæreren kan også omfatte dipalmitoylfosfatidyl cholin.

Når nanopartikler blir brukt, kan de være i form av PEG-overtrukkede poly(melkesyre) nanopartikler. I form av lipid emulsjoner, kan lav tetthets lipoproteiner og triglyserider vanligvis anvendes.

I sammensetningen fra oppfinnelsen, blir oppfinnelsens forbindelse(r) i en mengde på 0.01 til 20%, fortrinnsvis 0.05% til 5% ved vekt av den totale vektsammensetningen.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert av de følgende ikke-begrensende eksemplene.

EKSEMPLER

Eksempel 1. Fremstilling av Pd- BPheid

Pd-BPheid ble fremstilt fra BChla ved følgende tre-trinns prosedyre,

(a) Isolering av bakterioklorofyll a ( BChla")

BChla ble ekstrahert fra lyofilisert bakterie Rhodovolum sulfidophilum som følger: Lyofiliserte celler (100 gr) ble malt til pulver, vasket 5 ganger med en total på 1250 ml aceton for å delvis vaske vekk karotenoidene, blandingen ble filtrert og BChla ble ekstrahert fra det faste stoffet med absolutt metanol (» 1200 ml, 4-5 filtreringer). Etter filtrering, ble den mørke blå-grønne løsningen delvis evaporert under vakuum, den konsentrerte løsningen (« 500 ml) ble ekstrahert 2-3 ganger med bensin eter (b.p. 80-100°C, « 1300 ml) for ytterligere å eliminere karotenoidene, og bensin eter fasen ble ekstrahert to ganger med metanol (« 550 ml). Denne fasen ble deretter kastet, den kombinerte metanol fasen ble evaporert under vakuum, og den blå-grønne residien ble gjenoppløst i metanol-aceton (1:3, volum/volum) og satt på en DEAE-Sepharose kolonne (3x10 cm) ekvilibrert med metanol-aceton (1:3, volum/volum). BChla ble eluert med metanol-aceton (1:3, volum/volum), metanol-aceton blandingen ble evaporert og det tørre Bchla ble gjenoppløst i et eksakt volum (for absorpsjonsspekter) med eter og filtrert gjennom bomull for å bli kvitt løst kolonne materiale. Etter en slutt evaporering ble det faste pigmentet lagret under argon i mørket ved -20°C. Ekstraksjonsutbytte: omtrent 700 mg BChla per 100 g lyofiliserte celler.

DEAE-Sepharose kolonnen ble fremstilt som tidligere beskrevet (Ornata og Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., vol. 24, s. 1093-1100). I korthet, ble DEAE-Sepharosen vasket med destillert vann og deretter konvertert til en acetat form ved å suspendere den i en IM natrium acetat buffer (pH=7). Det oppslammede materialet ble vasket 3 ganger med aceton og til slutt suspendert i metanol-aceton (1:3, volum/volum) for lagring ved 5°C.

(b) Preparering av bakteriofeoforbid ( BPheid)

Uforedlet Bchla ekstrakt som ervervet i (a) (omtrent 100 mg Bchla som inneholder noen residuale karotenoider) ble løst i 80% vandig trifluoreddiksyre (omtrent 15 ml) som har blitt boblet med nitrogen i 10 minutter. Løsningen ble omrørt ved omkringliggende temperatur i 2 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen helt i vann (250 ml) og ekstrahert med kloroform. Ekstraktet ble vasket to ganger med vann og tørket over vannfri Na2SC«4. Etter evaporeringen av løsningsmiddelet ble residien kromatografert på silika (3 cm x 15 cm kolonne, Kieselgel 60, Merck) og eluert med matanol i kloroform ved trinngradient: 2%, 5%, 10%, 15%. På starten, ble karotenoidene og en liten mengde med bakteriofeofytin vasket ut, etterfulgt av eluering av allo-bakteriofeofytin og karotenoider. Ved 10% metanol i kloroform, begynte produktet å samles og ble målt med TLC (Kieselgel, kloroform-metanol, 9:1). Produktet (60mg) ble evaporert, og residien tatt opp i CHCI3ble filtrert gjennom UltraPore membran for å fjerne residual silika som på annen måte kan forårsake oksideringer.

(c) Inkorporerin<g>av palladium inn i bakteriofeoforbid ( Bpheid)

BPheid (100 mg) som ervervet i (b) og Pd-acetat (80 mg) ble løst i diklorometan («10 ml) og tilsatt til en suspensjon på 200 mg natrium askorbat i 50 ml metanol. Reaksjonsblandingen ble omrørt i en lukket flaske ved romtemperatur, og prøvene fra reaksjonsblandingen ble samlet opp hvert 15-20 minutt og deres optiske absorpsjon nedtegnet. Etter omtrent 4 timer, var det meste av BPheid absorpsjonen ved 357 nm erstattet av Pd-BPheid absorpsjonen ved 330 og 390 nm.

Reaksjonsblandingen ble overført i en kloroform/vann løsning (200 ml; 50:50 volum/volum) og ristet i en separasjonstrakt. Den organiske fasen ble samlet opp, vasket med vann, tørket over vannfri natrium klorid, og evaporert. Det tørkede materialet ble tilsatt til 80 mg Pd-acetat og trinnene over ble repetert inntil den residuale absorpsjonen ved 357 nm fullstendig forsvant og ratio mellom absorpsjon mellom 765 nm (toppen av den mest røde transisjonen) og absorpsjons maksimum ved 330 nm nådde verdien w 2.4 (i kloroform).

Den tørkede reaksjonsblandingen ble løst i et minimalt volum på 2:1 kloroform:aceton og satt på en CM-Sepharose kolonne (150 mm x 25 mm) som hadde på forhånd blitt pre-ekvilibrert med aceton. Kolonnen ble først vasket med aceton og den eluerte første freksjonen ble kastet. Kolonnen ble deretter vasket med 9:1 aceton:metanol. To bånd ble tydelige og ble vasket ut, det første var hovedproduktet og det andre var et allomerisert biprodukt (som ble kastet). Produktet ble konsentrert nesten til tørrhet og overført til en 50:50 kloroform:vann system i en separasjonstrakt. Blandingen ble grundig ristet og den organiske fasen ble separert, tørket over vannfri natrium sulfat (eller natrium klorid) og evaporert til tørrhet.

Eksempel 2. Fremstilling av Pd- BPheid

(a) Isolering av Bchla

Dette trinnet i prosedyren ble utført som i eksempel l(a) over.

(b) Fremstilling av Pd- Bpheid

6-O-palmitoyl-L-askorbinsyre (246 mg, 593 umol) ble løst i MeOH (84 ml) og N2fikk passere gjennom løsningen. Bpheid (92 mg, 151 umol) og Pd(CH3COO)2(83 mg, 370 umol) ble løst i CHCI3(34 ml, degasset med N2) og tilsatt til metanol løsningen. Blandingen ble holdt under en inert atmosfære ved omrøring og reaksjonsprogresjonen ble målt ved å overvåke absorpsjonsspektra av de små reaksjonsdelene med få minutters mellomrom. Etter~30 minutter var reaksjonen fullstendig og løsningsmidlene ble evaporert.

(c) Rensing av Pd- Bpheid

Det urene Pd-BPheid ble løst i CHCI3og satt på en kolonne pakket med 15 g 0.4%-silika-Asc. En liten kolonne med CHCI3(~30 ml) fikk passere gjennom kolonnen og da ble pigmentet eluert ved å bruke MeOH:CHCl3(1:99,~250ml). Renhet av fraksjonene ble bestemt ved TLC og optisk absorpsjons spektroskopi. Masse spektroskopi og NMR deteksjon ble utført på representative prøver. Utbytte: 82.5 mg av ren Pd-BPheid (76%).

For fremstilling av 0.4%-silika-Asc, ble askorbinsyre (240 mg) løst i 240 cc av

EtOH:CHCl3:MeOH (60:60:120) blanding. Silika gel 60 (60 g, Merck, Cat. No. 107734, mesh 70-230) ble tilsatt til oppslammingsblandingen og omrørt i 10 minutter og deretter filtrert ved pumpen. Det gule silika-Asc ble til slutt tørket i~1 time ved~50°C. Denne 0.4%-silika-Asc er ferdig til anvendelse som regulær silika gel; dets egenskap er mindre polar og den har noen antioksidative egenskaper.

Eksempel 3. Fremstilling av Pd- BPheid

(a) Isolering av Bchla

Dette trinnet ble utført som i eksempel l(a) over.

(b) Fremstilling av klorofyllase ( Chlase")

Klorofyllase (Chlase) ble fremstilt fra kloroplaster fra Melia azedarach L., Chine treblader. Friske blader (50 g) ble malt i 2 minutter i en mikser som inneholdt 350 ml aceton avkjølt til -20°C. Homogenatet ble filtrert gjennom fire lag med gauze, og filtratet ble samlet og fikk stå over natt ved 4°C for ytterligere presipitering. Acetonet ble fjernet ved filtrering, og det gjenværende pulveret ble vasket få ganger med kald aceton for å fjerne spor av Chlase og karotenoider inntil filtratet var fargeløst. Chlase aceton pulveret ble til slutt tørket i en lyofilisator og ytterligere lagret ved -20°C. Under disse tilstandene, ble enzym prepareringen stabil i over et år uten merkbart tap av aktivitet. Utbytte: 20 g Chlase per 1 kg blader ble ervervet.

(c) Syntese og rensing av bakterioklorofyllid ( BChlide)

Askorbinsyre (70 mg; Merck) ble løst i vann (9 ml), pH i løsningen ble justert til 7.7 ved å bruke 10M KOH vandig løsning, og 1 ml 0.5M natrium fosfat buffer (pH 7.7) ble tilsatt for å opprettholde pH under reaksjonen. Triton X-100 (omtrent 80 (il) ble tilsatt for å oppnå en slutt detergent konsentrasjon på 0.8% (volum/volum). Chlase aceton pulveret (200 mg) ble homogenisert i 6 ml av denne løsningen ved å bruke en Polytron homogenisator. Den gjenværende løsningen ble brukt for å vaske instrumentene og ble deretter kombinert med homogenatet. Enzym løsningen ble sonikert med 20 mg fast BChla mettet med argon og inkubert i mørket i 6 timer ved 37°C, ved omrøring.

For rensing, ble reaksjonsmaterialet direkte frosset (-20°C) etter 6 timer med reaksjon og etterfølgende lyofilisert. Den tørkede residien ble løst i aceton og sonikert og løsningen ble deretter utsatt for en CM-Sepharose kolonne ekvilibrert i aceton. Kolonnen ble vasket med aceton for å eluere ureagert materiale og deretter med 5% og 7% metanol (volum/volum) i aceton for å eluere bakterioklorofyllid (Bchlide) og bakteriofeoforbid (Bpheid). Produktet ble eluert med 25% metanol i aceton. Løsningsmiddelet ble evaporert og det faste pigmentet ble lagret under argon, ved - 20°C, i mørket. Reaksjonsutbytte: 30-55%. CM-Sepharose for kromatografi ble fremstilt ved først å vaske CM-Sepharose med vann og deretter 3 ganger med aceton før pakking av en kolonne og ekvilibrering i aceton. Det kromatografiske materialet kan bli gjenbrukt etter grundig rensing med 2M NaCl vandig oppløsning inntil fargeløs, vasket med vann og resuspendert i aceton.

(d) Inkorporering av palladium inn i bakteriofeoforbid ( BPheid)

Prosedyren er den samme som i eksempel l(c) over. HPLC av det tørkede materialet viste hovedproduktet i form av to epimerer som var kjemisk identiske (88% av den fullstendige blandingen) og residuale allomerer. Det var også en liten (0.5%) kontaminering av utgangsmaterialet, BPheid.

Eksempel 4. Karakterisering av forbindelsen Pd- BPheid

(a) Absorbansspekter

Absorbansspekteret til Pd-BPheid ble bestemt med en UVICON spektrofotometer (1 cm "path"lengde) ved å bruke en PM detektor som er normalisert til basislinjen. Sensitiviteten er 0.05.

Absorbansspekteret til Pd-BPheid i aceton og en blanding av metanol/K fosfat buffer er vist i tabell 1 og i figur 1.

Absorbansspekteret til Pd-BPheid i plasma var rød-"shifted" til 763 nm.

Pic deteksjonen gav følgende topper i følge figur 1: ved 758 nm: 1.2502; ved 537 nm: 0.3239; ved 384 nm: 0.5351; og ved 329 nm: 0.7766.

(b) HPLC deteksjon av Pd- BPheid

En revers fase HPLC metode ble utviklet for å karakterisere urenhetsprofilen og kvantifisere palladium-BPheid.

Fast fase : en Cg Inertsil 5 um, 250 x 4.6mm

Flytende fase : metanol:kalium fosfat buffer 20 mM

pH = 6.59 (70%/30%)

Strømningsrate : 1 ml/min

Injeksjonsvolum : 100 ul

Deteksjon : 1- Spectroflow 783, Deuterium lampe: 385 nm

2- Spectroflow 757, Tungsten lampe: 753 nm

Som vist i tabell 2, viste HPLC analyse av produktet Pd-Bpheid som ervervet i eksempel 3, 7 topper. Hovedtoppen representerte 64 til 70% av de totale produktene.

Løsninger av Pd-BPheid lagret i aceton ved -20°C var stabil i minst 2 måneder. Når utgangsløsningen ble opprettholdt i romtemperatur i 18 timer, var det ingen endring i HPLC profilen som ble observert som viste at Pd-BPheid er en stabil forbindelse.

(c) Karakterisering av Pd- BPheid ved NMR

Etter et rensingstrinn av Pd-BPheid fremstilt i følge eksempel 3, var prosenten av hovedtoppen over 90%. Denne rensingen ble utført ved en preparativ HPLC C8. Den rensede forbindelse ble brukt for karakterisering av produktet ved NMR og masse spektrometri.

Analyse av Pd-BPheid ved NMR ble utført og de kjemiske skiftene er vist i tabell 3:

-<]>H NMR og<I3>C NMR

- 2D<]>H NMR (COSY og NOESY)

- 2D<]>H-<I3>C NMR (HMQC og HMBC: revers deteksjon).

(d) Karakterisering av Pd- BPheid ved masse spektrometri

Masse spektrometri analysen av Pd-BPheid resulterte i spekteret vist i figurene 2 og 3. Den ble utført ved Fast Atom Bombardment (FAB) under høye og lave oppløsninger. Spektrometeret var en "ZabSpec TOF Micromass" spektrometer; ioniserings "mod": LSIMS med Cs<+>, positiv akselerering: 8 kV; kildetemperatur: 40°C; løsningsmiddel brukt: mNBA (meta-nitrobenzilin alkohol); inngang: lateral.

Resultater: iontype: M+; formel: C35H36N4O61<06>Pd; teori: 714.1670 Z:l m/z teoretisk 714.1670 m/z funnet 714.1689.

Disse resultatene bekreftet NMR studiet: m/e = 714 og bekreftet insersjon av palladium metall.

Den kjemiske strukturen analysert ved NMR og masse spektrometri er palladium derivatet av den frie sy reformen av BChl - Pd-BPheid.

Eksempel 5. Biologisk aktivitet av Pd- Bpheid på murin L1210 og humane HT29 celler

( i) Cellelinjer. Murin leukemi cellelinje (L1210) ble holdt i en suspensjonskultur ved å bruke Fischer's medium supplert med 10% hesteserum, 1 mM glutamin, 1 mM merkaptoetanol og gentamicin. RIF (bestrålingsindusert fibrosarkom) tumor ble opprettholdt som spesifisert av Twentyman et al. (1980, "A new mouse tumor model system (RIF-1) for comparison of end-point studies", J. Nati. Cancer Inst., 64, 595-604).

Kulturene ble dyrket i Weymouth's medium som inneholdt 10% føtal kalveserum og gentamycin.

HT29 human kolon adenokarsinoma celler ble dyrket i RPMI 1640 uten fenol rød og med 10% FCS. Cellene ble deretter dyrket ved splitting med 0.25% trypsin i 0.02% EDTA og platet ut igjen med en 1:5 splitting.

( ii) In vitro fototoksisitet. For studier på fototoksisitet som involverer LI210 og RIF celler, ble lys tilveiebrakt av en 600 watt kvarts-halogen kilde filtrert med 10 cm vann og en 850 nm "cut-off' filter for å fjerne IR. Båndbredden var ytterligere avgrenset til 660 + 5 nm ved et interferens filter (Oriel). Cellene i suspensjonen (L1210) eller tilfesting til 24 mm diameter dekkstrimler som ble inkubert i vekstmedium (med 20 mM HEPES pH 7 som erstattet NaHC03for tilsatt buffer kapasitet) i 15 minutter ved tilstedeværelse av spesifiserte nivåer av sensibilisatorer. Cellene ble deretter vasket fri for sensibilisatorer, og overført til ferskt medium. Bestrålingene ble utført ved 10°C. I noen studier, ble cellene deretter merket med fluoressens prober og setene for fotoødeleggelse ble vurdert. I andre studier, ble cellene deretter inkubert i 60 minutter ved 37°C i friskt medium for å tillate apoptose å fortsette. Viabilitet studiene ble utført ved å bruke 96-brønners plater og en 72-timers MTT analyse, i kvadruplikat.

For HT29 modell, ble cellene inkubert i 1 time med forskjellige konsentrasjoner av Pd-Bpheid og bestrålt med en halogen lampe eller en titanium safir laser med 300 mW/cm<2>ved 10 og 25 J/cm<2>.

( iii) Celle viabilitet. Celle overlevelse ble vurdert med MTT reaksjon utført 3 dager etter utplating av 1,000-50,000 celler i 96-brønners plater. Fargeintensiteten ble

sammenlignet med en standard kurve som inneholdt forskjellige antall av kontrollceller. Absorbans ved x nm ble bestemt med en BioRad Plate avleser. For LI210, fikk veksten i friskt medium fortsette i de 3 neste dagene, og celle antallene ble estimert samtidig ved å bruke MTT analyseprosedyren.

( iv) Lipoprotein binding: Binding av Pd-BPheid til protein og lipoprotein forbindelsene til kontroll human plasma ble bestemt. Inkubering av 250 ul plasma prøve med 3 uM av forbindelsen i 30 minutter ved 37°C. Lipoprotein og protein komponenter ble deretter separert ved tetthets-gradient sentrifugator. Gradientene ble fraksjonert, fraksjonene fortynnet i 3 ml med 10 mM Triton X-100 detergent eller med fluoressens ved 750-800 nm bestemt ved eksitering ved 400 nm.

Resultater

( v) Fototoksisitet effekt av Pd- BPheid på L1210 celler

L1210 murine leukemia celler ble inkubert med 1 uM Pd-BPheid i 30 minutter ved 37°C som resulterte i en 50% celle avlivning ved å bruke en 75 mJ/cm<2>dose med lys ved 760 + 5 nm. En lignende grad av celle avlivning i PJF linjen krevde en 215 mJ/cm<2>lysdose.

( vi) Forotoksisitet effekt av Pd- BPheid på HT29 celler

Overlevelsesraten varierte mellom 100% og 79% når HT29 celler ble inkubert med Pd-BPheid uten lys. Den cellulære overlevelsesraten minsket når konsentrasjonen av Pd-BPheid var høyere og når dosene av energi som ble avlevert økte. Pd-BPheid fotosensibilisator dosen som forårsaket en 50% dødsrate (også kalt LD5o) var 48 uM under en bestråling på 25 J/cm<2>. Eksitasjons bølgelengden som induserte den viktigste fototoksisiteten var 773 nm.

( vii) Seter for fotoødeleggelse. Ved å bruke muse leukemi LI210 celler, var Pd BPheid svært spesifikke mitokondriale fotosensibilisatorer med ingen detekterbar fotoødeleggelse til plasma membranen eller lysosomene. Et slikt resultat har blitt assosiert med rask initiering av apoptose.

( viii) Plasma lipoprotein binding. Studiene som ble utført indikerte at Pd-BPheid bundet til HDL>LDL»> albumin fraksjoner i humant serum, betraktet å være en determinant for PDT selektivitet.

Eksempel 6. Formuleringer av Pd- BPheid; Løselighet og stabilitet av Pd- BPheid i løsningsmidler brukt for dyreeksperimenter.

Løsninger av Pd-BPheid ble fremstilt i forskjellige formuleringer for å erverve en konsentrasjon på 0.05 til 2%.

(a) Cremophor formulering ble fremstilt som følger: 40 mg Pd-BPheid ble løst i 2 ml Cremophor EL i et tørt rør enten ved langsom rotasjon av røret inntil løsningen var fullstendig fri for partikler, eller ved å bruke korte pulser fra en sonisk oscillator probe. Røret ble avkjølt slik at temperaturen ikke gikk over 30°C. Etter at medikamentet ble

oppløst, ble 0.6 ml av propylen glykol tilsatt og igjen blandet enten med en langsom rotasjon eller med den soniske proben. Isotonisk NaCl ble deretter tilsatt i 0.1 ml deler til et totalt volum på 4 ml. Blandingen skulle være klar etter hver tilsetting, med ingen spor av en presipitering. Sammensetningene ble kort behandlet med den soniske proben etter tilsetting av NaCl 0.9% for å holde temperaturen under 25-30°C. Konsentrasjonen av medikamenter ble vurdert ved måling av absorbansen ved 757 nm etter fortynning inn i etanol.

Når 20 mg/kg av Pd-BPheid ble brukt i eksperimentelle studier, ble dette oversatt til 0.4 mg per 20 gram mus. Siden ikke mer enn 0.1 ml av cremophor kan initieres inn i en halevene, var medikament konsentrasonen 4 mg/ml. (b) En modifisert Cremophor formulering ble fremstilt som følger: 5 mg av Pd-BPheid ble blandet med 0.4 ml Cremophor EL. Etter oppløsning, ble 0.2 ml propylen glykol tilsatt. Isotonisk saltvann (1.48 ml) ble deretter tilsatt i små porsjoner, og det samme ble balndet etter hver reaksjon. Sluttløsningen var fullstendig klar og fri for partikler. En ultrasonisk probe ble brukt for å hjelpe til i å løse medikamentet, og holdt løsningene under 25°C ved avkjøling i et isbad.

Bestemmelsen av Pd-BPheid konsentrasjonen i Cremophor løsningen ble utført ved fortynning i metanol. Absorbans spekteret ble målt over 740-780 nm. Topp verdien ble sammenlignet med resultatene fra en kjent konsentrasjon av Pd-BPheid. (c) Ytterligere formuleringer ble fremstilt ved å bruke Tween 80 og etanol for å løse Pd-BPheid (1 mg Pd-BPheid/ml løsning).

Eksempel 7. In vivo toksisitetsstudier - effekt av Pd- BPheid på marine tumor modeller

To sett av eksperimenter som involverte murine tumor modeller ble brukt for å virdere fototoksisiteten til Pd-BPheid. (a) Den fotodymaniske responsiviteten til Pd-BPheid ble først evaluert i to murine tumor modeller: BA - bryst adenokarsinom og bestrålingsindusert fibrosarkom (RIF-1). Fotodynamisk terapi parametre: Musene med tumor som målte 5-7 mm i diameter var med i PDT eksperimentene. Tre Pd-BPheid medikament doser (1, 5 og 10mg/kg) og to lys doser (100 og 300 Joules/sq.cm) ble evaluert. En formulering av Pd-BPheid løst i Cremophor ble administrert ved en intravenøs haleinjeksjon. PDT lyseksponering ble startet enten 15 minutter, 1 time eller 4 timer etter injeksjonen. Tre mus ble behandlet under hver behandlingstilstand hvis ikke initielle resultater viste letal toksisitet eller ikke-responsivitet. En titanium safir laser innstilt til 757 nm ble brukt som lyskilden for PDT. Laser generert lys ble koblet inn i kvartsfibre for avlevering av lys til tumorene. En lys kraft tetthet på 75 mW/sq.cm ble brukt. Tumor størrelsen ble målt 3 dager per uke etter PDT behandlingene og prosentandelen av tumor kurering (definert som ingen tumor tilbakevending i 40 dager etter behandling) ble bestemt.

In vivo PDT respons: Tabellene 4 og 5 heri tilveiebringer en oppsummering av PDT behandlingsresultater for C3H mus transplantert med enten BA bryst karsinom eller

RIF-1 fibrosarkom. Hver tabell indikerer følgende parametre: 1) intravenøs medikament dose uttrykt i mg/kg; 2) laser behandlings parametre, som inkluderer den totale lysdosen (J/cm<2>), bølgelengden (757 nm), og lysdose raten (mW/cm<2>), og tidsintervallet (mellom behandling for hver gruppe), 4) toksisitet (fire mus døde kort etter behandlingen), 5) tumor tilbakevending (som består av antall av dager mellom PDT behandling og tumor tilbakevendig) og 6) antall av mus (og prosentandel) med Pd-BPheid induserte tumor kureringer.

Som vist heri, Pd-BPheid mediert PDT ble funnet å indusere både en klassisk og en effektiv tumor drepende respons i to muse tumor modeller. PDT mediert tumor responsivitet var direkte korrelert med medikament dosen, lysdosen og tidsintervallet mellom medikament administrering og lysbehandlingen. Spesifikt, høyere medikament doser og/eller høyere lysdoser produsert økte responsene. BA bryst karsinoma ble funnet å være meremerponsiv til Pd-BPheid mediert PDT enn sammenlignbare PDT behandlinger fra RIF-1 fibrokarsinom. Pd-BPheid mediert PDT var effektiv når lysbehandlinger ble initiert innenfor 1 time for medikament administrering, og var ikke effektiv når en 4 timers intervall mellom medikament administrering og lysbehandling ble brukt. (b) I det andre trinnet av eksperimenter, ble fototoksisitet for Pd-BPheid målt i en muse tumor modell transplantert med HT29 human kolon adenokarsinom.

Dyr og tumor modell: Fast tumor vev (diameter 2 cm) fjernet fra donor mus umiddelbart etter at disse var døde ble mekanisk knust i 1 ml 0.9% saltvannsløsning og løsningen (0.1 ml) ble injisert subkutant i et bakben hos hver mus. Musene ble inkludert i eksperimentene når tumor diameteren var 8-10 mm. Tumorene ble transplantert subkutant i 8 uker gamle sveitsiske nakne mus 10 dager før eksperimentet.

Fototoksiske studier: 0.15 ml Pd-BPheid ble injisert intravenøst ved 15 mg/kg. Musene ble bedøvet med tiopental ved 40 mg/kg rett før bestrålingen. Ved 30 minutter, 1 time, 4 timer eller 24 timer etter injeksjon, ble musene bestrålt med en titanium safir laser ved 300 mW/cm<2>, gjennomsnittsdiameteren ble målt for å justere tidsbestrålingen for å erverve 200 eller 300 J/cm<2>. Kontroll musene som ikke ble injisert med Pd-BPheid ble også bestrålt under samme forhold. Tumor vekst forsinkelse indusert av PDT ble analysert ved ekvivalens med tester iverksatt ved eksperimentell radioterapi. For in vivo studier og for hvert separate eksperiment, ble alle resultatene hvor gjennomsnittet på 2 eller 3 separate eksperimenter og for hvert separat eksperiment 2 mus brukt for hver eksperimentell tilstand.

Når det gjelder tumorale vekst studier, blir resultatene uttrykt som tumoral indeksvairasjoner med referanse (=1) korresponderende til tumoral indeks fra ikke-behandlede celler. Den tumorale indeksen ble beregnet som følger: Tumoral indeks = (største tumorale diameter + perpendikulær motsatt diameter)/2.

Temperatur variasjonsstudiene: for å sikre at den termiske effekten ikke var overdreven, ble temperatur variasjonen målt for halogenlampen og titanium safir laserbestrålingen ved å bruke ikke-absorberende aluminium innkapslede mikrotermokoblinger.

Resultatene fra dette eksperimentet er som følger:

( i) 763 nm bestråling ved 200 J/ cm2:

En tumor vekstnedgang (som sammenlignet med kontrollene) ble observert for tilstandene 30 minutter og 4 timer etter injeksjon. En nedgang av tumor indeks ble observert opptil 7 dager for tilstandene 1 time og 24 timer etter injeksjonen.

( ii) 763 nm bestråling ved 300 J/ cm2:

En tumor vekstnedgang ble observert (i forhold til sammenligning med kontrollene) for tilstandene 30 minutter og 24 timer etter injeksjon. En nedgang av tumor indeks ble observert opptil 7 dager for tilstandene 1 time og 4 timer etter injeksjonen.

( iii) 300 J/ cm2 bestråling 1 timer etter injeksjonen:

En tumor vekstnedgang ble observert (i forhold til sammenligning med kontrollene) for forholdene 773 nm opptil 5 dager og for forholdene 753 nm og 763 nm opptil 12 dager. Den maksimale tumor vekstnedgangen ble observert for 763 nm.

( iv) 300 J/ cm2 bestråling 24 timer etter injeksjonen:

En tumor vekstnedgang ble observert (som sammenlignet med kontrollene) for forholdene 753 nm opptil 4 dager og for forholdene 763 nm og 773 nm opptil 12 dager. Den maksimale tumor vekstnedgangen ble observert for 773 nm.

Ingen overdrevet temperatur variasjon ble observert under halogenlampen eller titanium safir bestrålingen av musene.

Som en oppsummering av dette studiet, var den optimale bølgelengden for bestråling funnet å være 773 nm. Forsinkelsen mellom injeksjon og illuminering har en innflytelse på tumor responsen. Ved 764 nm, ble en times forsinkelser vist å være den mest effektive. Når en bruker en 773 nm bølgelengde, var den mest effektive forsinkelsen 24 timer.

Eksempel 8. Morfologisk evaluering av A431 human epitel karsinoide celler etter Pd- BPheid og BChl- Ser basert PDT

Dette eksperimentet ble utført for å undersøke tidsavhengige morfologiske endringer som forekommer etter PDT med Pd-BPheid eller BChl-SerOMe på A431 humane epitel karsinoid celler.

( i) Materialer: Pd-BPheid ble fremstilt som i eksempel 1 over og serin metylester BChl-SerOMe ble fremstilt som i EP584552.

( ii) Lyskilde: Halogenlampe (Osram, Tyskland, 100 W), med 4.5 cm vann filter og "cut off filter > 650 nm. Cellene ble illuminert i 10 minutter, 15 mW/cm<2>, en total energi fluens på 9 J/cm<2>. For illuminering, ble kulturplatene plassert på et glassbord for å tilveiebringe lys fra bunnen.

( iii) Fototoksisitets studie: A431 celler (5x10<4>celler) ble sådd i 3 cm plater i duplikat og dyrket til 75% konfluens i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) + F12 (1:1), buffret med HEPES (25 mM, pH 7.4), føtal kalveserum (FCS) med penicillin (0.06 mg/ml) og streptomycin (0.1 mg/ml). Pd-BPheid eller BChl-Ser ble tilsatt til cellene ved korresponderende LD90konsentrasjon (0.1 og 1 uM, respektiv). Etter en 4 timers periode ble cellene vasket med kultur medium og cellene ble belyst med lyskilden over. Fase kontrast mikroskopisk undersøkelse ble utført på forskjellige tidspunkter etter belysningen (0, 0.5, 4 og 24 timer etter-PDT) ved å bruke Zeiss Axiovert-35 lys mikroskop (forstørrelse X320) utstyrt med en Contax 35 mm SLR kamera. I den andre platen av hver duplikat, ble celle viabilitet målt 24 timer etter-PDT ved å bruke en nøytral rød viabilitets analyse (Zhang SZ., 1990, Cell Biol Toxicol 6(2):219-234).

( iv) Resultater: Begge sensibilisatorene forårsaket signifikante endringer i celle morfologien. Pd-BPheid forårsaket en fast endring i celle membran strukturen (30 minutter), cellene skrumpet raskt og fibrøse forbindinger ble dannet, som forbandt celle membranene med orginale fokale tilfestingspunkter (fibrøs fenotype). Etter 4 timer, mistet 90% av cellene det meste av deres indre volum og en stor del av dem mistet festet fra skålen, ingen ytterligere endringer ble observert etter 24 timer (figur 4, høyre kolonne). Bchl-Ser viste et forskjellig mønster for tidsavhengig morfologiske endringer som kunne bli observert etter bare 4 timer. Membran utposinger kunne sees som mørke vesikler som knoppet av fra celle membranen. Ingen signifikant volum nedgang ble

observert etter 24 timer og etter denne perioden var de fleste av cellene ikke lenger festet til skålen men fremsto som hule (utposnings fenotype, figur 4, venstre kolonne). 24 timer etter illumineringen, ble en nøytral rød viabilitets analyse utført som bekreftet at 90 + 7% celle avlivning i begge de eksperimentelle gruppene. I figur 4, blir den fibrøse fenotypen representert ved høyre kolonne og utposnings fenotypen er representert i den venstre kolonnen. Den hel-trukne hvite pilen viser dannelse av fibre eller utposninger.

Eksempel 9. Fotocytotoksisitet av Pd- BPheid og BChl- SerOMe på human blære karsinom cellelinje ECV304

Dette eksperimentet ble utført for å vurdere de fotocytotoksiske effektene av fotosensibilisatorene Pd-BPheid og BChl-SerOMe på ECV304 human blære karsinom celler.

(i) Materialer: som i eksempel 8(i).

(ii) Lyskilde: som i eksempel 8(ii).

(iii) Fototoksisitets studie: ECV304 celler (2x10<4>celler per brønn) ble dyrket i M-l99,10% FCS med penicillin (0.06 mg/ml) og streptomycin (0.1 mg/ml) i 96-brønner til konfluens (~2xl0<5>celler per brønn). Inkubering med økende konsentrasjoner av Pd-BPheid eller BChl-SerOMe med cellene i 4 timer ble etterfulgt av vasking med ferskt kultur medium og illuminering som beskrevet over i avsnitt 1. 24 timer etter illuminering, ble celle viabiliteten vurdert ved å bruke nøytral rød viabilitets analyse. De følgende kontroller ble brukt. Lys kontroll: bestrålte celler, ikke behandlet med sensibilisator. Mørk kontroll: ikke-bestrålte celler, behandlet med sensibilisator i mørket. Ubehandlet kontroll: celler ikke behandlet med sensibilisator og ikke-bestrålt ble brukt for beregning av 100% overlevelse (Rosenbach-Belkin V. Et al., 1996, Photochem Photobiol 64(1):174-181). (iv) Resultater; Både Pd-BPheid og BChl-SerOMe utviste dose og lysavhengig cytotoksisitet på ECV304 celler (figur 5). Korresponderende LD5overdier er 19 og 1000 nM. Morfologiske endringer etter-PDT var i overensstemmelse med observasjoner gjort med A431 celler (data ikke vist).

Eksempel 10. PDT av Pd- BPheid og Pd- BPheid- etvl ester på M2R muse melanom celler

Formålet med dette eksperimentet var å teste effekten av Pd-BPheid og Pd-BPheid-etyl ester på M2R celler.

( i) Materialer: Pd-BPheid ble fremstilt som i eksempel 1 over og Pd-bakteriofeoforbid a etyl ester (Pd-BPheid-etyl ester) ble fremstilt som beskrevet i WO 97/19081.

( ii) Lyskilde: Som over i eksempel 8(ii) men cellene ble belyst i 10 minutter, 12mW/cm<2>, en total energifluens på 7 J/cm<2>.

( iii) Fototoksisitets studie: M2R celler ble dyrket som monolag i Dulbecco's modifisert Eagle's medium (DMEM) + F12 (1:1), buffret med HEPES (25 mM, pH 7.4). Føtal bovin serum (FBS) (10%), glutamin (2 mM), penicillin (0.06 mg/ml) og streptomycin (0.1 mg/ml) ble inkludert og cellene ble dyrket ved 37°C i fuktig atmosfære som inneholdt 8% CO2. For fototoksisitets analyse ble cellene (1 x 10<4>celler/brønn) dyrket i 96-brønners plater i 24 timer til en omtrentlig tetthet på 2xl0<4>celler/brønn. Pigmentene ble lost direkte i kultur medium eller i etanol 95% og ytterligere fortynnet i kultur medium til en sluttkonsentrasjon på 1% etanol. De fortynnede pigmentene ble tilsatt og cellene ble inkubert i mørket i 4 timer ved 37°C. Forut for illuminering, ble cellene vasket en gang og erstattet med ferskt kultur medium. Platene ble deretter belyst fra bunnen i 10 minutter ved romtemperatur og plassert i kultur inkubatoren ved 37°C i mørket. Celle overlevelsen ble bestemt 24 timer senere. De følgende kontrollsystemer ble brukt: Mørk kontroll —ubehandlede celler holdt i mørket; Lys kontroll - celler ikke behandlet med sensibilisator som ble belyst; Mørk toksisitet - celler behandlet med pigment men holdt i mørket. Celle overlevelsen ble bestemt ved [<3>H]-tymidin inkorporering som beskrevet tidligere (WO 97/19081).

( iv) Resultater: Som det kan sees i figur 6A, når pigmentene ble løst i 95% etanol, hadde Pd-BPheid en LD50på 0.03 uM, mens Pd-BPheid-etyl ester hadde en LD50på 0.07 uM. Når pigmentene ble løst direkte i kultur medium som inneholdt 10% serum, var bare Pd-BPheid fullstendig aktiv mens Pd-BPheid-etyl ester ikke var aktiv i det hele tatt opptil 1 uM, den høyeste konsentrasjonen som ble testet (figur 6B).

Eksempel 11. PDT av Pd- BPheid på M2R muse melanom og human HT29 kolon karsinom celler

Disse eksperimentene hadde som formål å bestemme den fototoksiske effekten til Pd-BPheid mot to cellelinjer: M2R muse melanom og human HT29 kolon karsinom celler.

( i) Materialer: Pd-BPheid ble preparert som i eksempel 1 over.

( ii) Lyskilde: Lyskilden var en Xenon fluorin LS3-PDT lampe (Bio-Spec, Russland), med 10 cm vann filter og 720-850 nm lysbånd. Cellene ble belyst i 10 minutter, 12 mW/cm<2>, med en total energi på 7 J/cm<2>.

( iii) Fototoksisitets studie: Analyse ble utført med samme protokoll som beskrevet over (eksempel 10) med følgende endringer: Pd-BPheid ble løst direkte i medium som inneholdt 10% serum og deretter tilsatt til cellene. Overlevelse av M2R celler ble bestemt ved [<3>H]-tymidin inkorporering og de av human HT29 celler med MTT analyse (merlin JL et al, 1992 Eur. J. Cancer 28A:1452-1458).

( iv) Resultater: Som det kan sees i figur 7, viste human kolon HT-29 celler lavere sensitivitet mot dette pigmentet (LD50på 0.5 uM), mens M2R celler var omtrent 10 ganger mer sensitive (LD5opå 0.03 uM).

Eksempel 12. In vivo PDT av M2R muse melanom tumorer med Pd- BPheid

Formålet med dette eksperimentet var å studere PDT hos M2R muse melanom tumorer i CD1 nakne mus med 2.5 mg/kg Pd-BPheid.

( i) Materialer: Pd-BPheid ble fremstilt som i eksempel 1 over.

( ii) Mus: CD1 nakne mus (25-30g)

( iii) Bedøvelse: intraperitoneal injeksjon av 50 ul ketamin/rumpon (vol/vol=85/15).

( iv) Tumor implantasjon: Mus ble implantert med IO<6>M2R celler på ryggen og tumoren vokste til behandlingsstørrelse (7-8 mm) innen 2-3 uker.

( v) Lyskilde: Osram 150 W halogen foto-optisk lampe 64643 (D.K. Keller et al 1999, Int. J. Hyperthermia 15,467-474) utstyrt med en X=650-900 mn spektralt vindu, 300 mW/cm"<2>. Illumineringen foregikk i 30 minutter.

( vi) PDT protokoll: De bedøvede musene ble intravenøst injisert med pigment og tumoren umiddelbart belyst. På slutten av behandlingen, ble musene plassert tilbake i buret. Fotografier av tumorene ble tatt før og etter tidene som er indikert.

Eksperiment 1:

Fremstilling av sensibilisator: To mg Pd-BPheid ble lost i 0.25 ml cremophor EL etterfulgt av 20 minutters sonikering. 0.075 ml l,2.propylen glykol ble tilsatt og sonikeringen fortsatte i ytterligere 15 minutter. Deretter ble 0.9 ml av 0.15mM NaCl tilsatt etterfulgt av 5 minutters sonikering. Prøven ble sentrifugert i 12 minutter ved 13,000 rpm (Eppendorf). Slutt beregningskonsentrasjonen av Pd-BPheid basert på spekter i kloroform var 0.5 mg/ml.

PDT av tumor: Pd-BPheid 2.5 mg/kg ble intravenøst injisert i CD 1-nakne mus som bar M2R melanom tumor. Tumoren ble belyst i 30 minutter med 300mW cm"<2>. Temperaturen på muse hud tumor området var 37.7-38°C. Responsen på tumoren var etter 1 og 4 dager etter behandlingen. Resultatene er vist i figur 8.

Eksperiment 2:

Preparering av sensibilisator: To mg Pd-BPheid ble løst i 0.1 ml metanol, 0.1 ml 0. IM KH2P04, pH=8.0 og 0.9 ml PBS og sonikert i 10 minutter. Metanolen ble evaporert med argon og 20% av cremophor EL: 1,2-propylen glykol (3:1) ble tilsatt etter 15 minutter sonikering. Prøvene ble sentrifugert i 8 minutter ved 13,000 rpm ble slutt beregnede konsentrasjonen av Pd-BPheid basert på spekter i kloroform 0.5 mg/ml.

PDT av tumor: Pd-BPheid 2.5 mg/kg (120 ul) ble intravenøst administrert til CD1-nakne mus som bar M2R melanom tumor. Tumor vevet ble belyst i 30 minutter ved 300mW/cm"<2>. Temperaturen av muse tumor området var 37.7-38°C. Responsen av tumor fulgte 1 og 4 dager etter behandlingen. Resultatene er vist i figur 9.

Resultater: Som vist i figurene 8 og 9, induserer PDT av M2R melanom tumorer med 2.5 mg/kg Pd-BPheid som beskrevet over alvorlige innflammatorisk respons med nekrose av tumoren inne 24 timer.

Eksempel 13. Pd- BPheid basert PDT reduserer raten av C6 glioma metastase dannelse i mus; fordel over kirurgi

Disse eksperimentene ble utført for å sammenligne terapeutisk potensiale av Pd-BPheid og BChl-SerOMe basert PDT, og muligheten for metastase spredning ved Pd-BPheid og BChl-SerOMe basert PDT.

( i) Materiale: Pd-BPheid (fremstilt som i eksempel 1) eller Pd-BPheid-SerOMe 5 mg/kg i 20% cremophor EL.

( ii) Lyskilde: Lyskilden var Xenon fluorin LS3-PDT lampe (Bio-Spec, Russland), med 10 cm vann filter og 720-850 nm lysbånd.

( iii) Mus: CD1 nakne mus.

( iv) Tumorer: Mus ble implantert med IO<6>C6 glioma celler i foten av bakleggen. Tumorene ble behandlet når den nådde en lengde på 7-8 mm.

( v) Bedøvelse: 50 ul av vetalar/rumpon (vol/vol=85/15).

( vi) Smertestillende middel: Oxycodone (12 mg/liter) tilsatt i 5% sukrose drikkevann, som behandling (amputering eller PDT) i en uke.

( vii) ProtokoU: Tre grupper (10 mus i hver) ble intravenøst injisert med 5 mg/kg av sensibilisator (Pd-BPheid eller Pd-BPheid-SerOMe) og umiddelbart belyst ved 200 mw/cm<2>, i 30 minutter, og dyrene fikk lov å komme seg i buret. Gruppene 1 og 2: Dyrene mottok PDT Pd-BPheid og Pd-BPheid-SerOMe, respektiv. Tumor responsen og metastase dannelse i lysken ble fulgt i 4 uker. Gruppe 3: Dyrene som ble amputert ved ankelleddet (i par med gruppe 1) og metastase dannelse i lysken ble fulgt i 4 uker. Parameterne for respons til PDT var prosent av dyrene med tumor nekrose og bortfall, ut av det totale antallet av behandlede dyr. Metastase ble manifestert ved synliggjøring av tumorer i lysken eller andre steder. Sluttpunktene som ble tatt i betraktning var: oppfølging i 4 uker, spontan død, tumor nådde en diameter på 2 cm, metastase, hvilken som helst kom først.

( viii) Resultater: Resultatene av tumor utflating (forsvinning) er vist i figur 10. Mens på dag 11, var responsen for Pd-BPheid sterkere enn til Pd-BPheid-SerOMe (100% og 80% tumor utflatning, respektiv), senere på dag 28, var prosenten av responsen lik, omtrent 60%. Nedgangen i tumor utflatning over tid skyldes tumor tilbakevendene vekst i noen av de behandlede dyrene, antagelig på grunn av dårlig overensstemmelse av lys området og tumor området. Resultatene av metastase forekomsten er vist i figur 11. Kirurgisk behandling ved legg amputering ga en vesentlig høyere prosent av metastase sammenlignet med PDT (opptil 78%). I tillegg, kom metastasene etter amputering mye tidligere. Frekvensen av metastase etter PDT med Pd-BPheid var den laveste (opptil 23%). Dette resultatet er lik det som ble ervervet med Pd-Bpheid-SerOMe og hovedfordelen av Pd-BPheid er en forsinkelse av metastase forekomst. PDT med Pd-BPheid eller Pd-BPheid-SerOMe er kurativ for C6 gliom tumorer. Metastase dannelse etter PDT er i det vesentlige lavere sammenlignet med kirurgisk behandling.

Claims (23)

1. En forbindelse,karakterisert vedformel I, F eller I"

hvori A representerer OH, ORj, -0-(CH2)n-Y, -S-(CH2)n-Y, -NH-(CH2)n-Y, -0-(CH2)2-OH, -NH-(CH2)2-NH-BOC eller -N-(CH2-CH=CH2)2 hvori Ri representerer Na<+>, K<+>, (Ca<2+>)o,5, (Mg<2+>)o,5, Li<+>, NH/ ^NH3-C(CH2OH)3,^NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, ^NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH eller ^(CVH^n-i^; Pv2 representerer H når forbindelsen ifølge formel F, og representerer H, OH eller COOR4, når forbindelsen ifølge formel I, hvori R4er Q-C12alkyl eller C3-Q2 cykloalkyl; R3representerer H eller C1-C12alkyl når forbindelsen er ifølge formel F, og representerer H, OH eller C1-C12alkyl eller alkoksy når forbindelsen er ifølge formel I; n er 1, 2, 3, 4, 5 eller 6, Y er -NR'iR'2 eller<+>NR'iR'2R'3, X" hvori R'i, R'2og R'3uavhengig av hverandre representerer -CH3eller -C2H5; X er F, Cl, Br eller I, n' er 1,2, 3 eller 4, og hvori<*>beskriver et asymmetrisk karbon og — representerer en enkelt mettet binding eller en dobbelt umettet binding.

2. Forbindelse I ifølge krav 1,karakterisert vedformelen og optisk konfigurering som indikert under:

hvori A er OH eller ORi, og Ri er som definert i krav 1.

3. Forbindelse ifølge krav 2,karakterisert vedat A er OH, heri identifisert som Pd-bakteriofeoforbid a (Pd-BPheid).

4. Forbindelse med formel I, F eller F' som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3 som et medikament.

5. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter minst en forbindelse med formel I, F eller I" som definert i kravene 1 til 3 sammen med en fysiologisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 5,karakterisertv e d at nevnte sammensetning er på form av en løsning, en lipidemulsjon eller en gel eller på form av liposomer eller nanopartikler.

7. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 5 eller 6,karakterisert vedat forbindelsen(e) er til stede i en mengde på 0,01 til 20 vekt-% basert på den totale vekten av sammensetningen.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1,karakterisert vedat A er OH, som omfatter følgende trinn: a) kombinert demetylering og hydrolyse av en M-BPheid-173-Z forbindelse hvori Z er fytyl, geranylgeranyl eller serylmetylester (SerOMe) og M er et metall selektert fra Mg, Cd, og Zn; og b) inkorporering av Pd med et Pd reagens inn i forbindelsen ervervet i a).

9. Fremgangsmåten ifølge krav 8 for fremstilling av Pd-BPheid,karakterisert vedat bakterioklorofyll a (Bchla) er demetallert og hydrolysert i trinn (a), og den ervervede bakteriofeoforbid (BPheid) reageres med en Pd reagens i trinn (b) for å produsere det ønskede Pd-BPheid.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I i krav 1,karakterisert vedatAer OH, som omfatter følgende trinn: a) transmetalering av en BChlide-173-Z for å erverve den korresponderende Pd-BPheid-17<3->Z hvori Z er fytyl, geranylgeranyl eller SerOMe; og b) hydrolyse av forbindelsen ervervet i (a).

11. Fremgangsmåten ifølge krav 10 for fremstilling av Pd-BPheid,karakterisert vedat bakterioklorofyll a (Bchla) er transmetallert i trinn (a) for å erstatte det native sentrale Mg-atom med Pd, og det ervervede Pd-BPheid- ll3-Z hvori Z er fytyl blir hydrolysert i trinn (b) for å produsere det ønskede Pd-BPheid.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1,karakterisert vedat A er OH, som omfatter følgende trinn: a) enzymatisk hydrolyse av en BChlide-17<3->Z hvori Z er fytyl eller geranylgeranyl for å erverve en BChlide, b) sur demetallering av BChlide i (a); og c) inkorporering av Pd med et Pd-reagens inn i den demetallerte forbindelsen i (b).

13. Fremgangsmåten ifølge krav 12 for fremstilling av Pd-BPheid,karakterisert vedat bakterioklorofyll a (Bchla) blir hydrolysert enzymatisk i trinn (a), demetallert i trinn (b) og reagert med et Pd-reagens i trinn (c) for å produsere det ønskede Pd-BPheid.

14. Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 13,karakterisert vedat den ytterligere omfatter trinnet for reaksjon av den ervervede Pd-BPheid forbindelsen med en korresponderende A-H forbindelse for å erverve en forbindelse med formel I hvori A er forskjellig fra OH.

15. Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 14,karakterisert vedat Pd-reagenset er Pd-acetat eller Pd-klorid.

16. Fremgangsmåten ifølge krav 15,karakterisert vedat inkorporeringen av Pd blir utført ved en to-trinns prosedyre ved å bruke Na-askorbat eller askorbinsyre, eller ved en et-trinns prosedyre ved å bruke 6-O-palmitoyl-L-askorbinsyre.

17. Anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller F' som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3 for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger nyttige i fotodynamisk terapi (PDT) av tumorer.

18. Anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller I" som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3 for fremstilling av sammensetninger nyttige i ex vivo avliving av bakterier, virus, parasitter og sopp.

19. Anvendelse ifølge krav 17 eller 18 av Pd-BPheid.

20. Anvendelse av en forbindelse med formel I, F eller I" som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3 for fremstillilng av farmasøytiske sammensetninger for bruk ved tumordiagnose.

21. Anvendelse ifølge krav 20 av en forbindelse med formel I.

22. Anvendelse ifølge krav 21, der nevnte forbindelse med formel I er Pb-bakteriofeoforbid a.

23. Forbindelse,karakterisert vedformel II eller III