BG108534A - Фотосенсибилизатор и метод за неговото получаване - Google Patents

Abstract

Фотосенсибилизаторът се използва в медицината за откриване и лечение на тумори. Той представлява състав, съдържащ хлорин във вид на сол с алкален метал. Като хлорин се използват хлорин е6 от 80 до 90 %, пурпурин 5 от 5 до 20 % и останалата част пурпурин 18. Фотосенсибилизаторът се получава чрез екстрахиране на биомаса от Spirulina с ацетон, след което се подлага на действието на киселина. Следва неутрализация, хидролиза, екстрахиране на феофорбид алфа, разтваряне в ацетон, прибавяне на силна основа, неутрализиране и утаяване на хлорин е6. а

Description

ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И МЕТОД ЗА НЕГОВОТО ПОЛУЧАВАНЕ

Изобретението се отнася до областта на медицината, поспециално до областта на фотодинамическата терапия (ФДТ), с използване на биологично активно съединение.

Фотосенсибилизаторите (ФС) намират приложение при ФДТ в качеството на терапевтични средства, и при фотодинамичната диагностика (ФДД) в качеството си на флуоресцентни маркери за белязане.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Известен ФС е тетранатриевата сол на моно-1_-аспартил хлорин e₆“Npe6” [1]:

Посоченият ФС притежава активност при ФДТ.

Негов недостатък е трудоемкото му получаване, прекалено ускорената динамика на натрупване в тумора и екскретирането му, което съкращава времето за ефективното въздействие върху тумора, а също така и сравнително ниската степен на нетрупване в злокачествени новообразувания вследствие на значителна хидрофилност, което задейства само един от няколко възможни механизми за разрушаване на тумора в процеса на ФД, а именно само поражение на кръвоносните съдове.

Известен ФС е тринатриевата сол на лизил-хлорин р₆ “LCP” [2]:

A

Посоченият ФС притежава активност при ФДТ.

Негов недостатък е трудоемкото му получаване, а също така, че той представлява смес от моноамиди в 13 и 15 позиции в съотношение 10:1, което може да доведе до неговото нееднозначно биоразпределение и екскретиране.

Известен ФС е натриева сол на феофорбид а [3]:

Посоченият ФС притежава селективно натрупване в злокачествени новообразования и активност при ФДТ.

Негов недостатък е силната склонност към окисление (химическа нестабилност) при съхраняване в разтвор, непълна разтворимост след съхраняване в твърдо състояние, хидрофобност, и, вследствие на това, - бавно изхвърляне от организма, което води до продължителна фоточувствителност на кожата.

Известни ФС са също така производни на хлорин е₆ [4]:

където R = хидрофобен въглеводороден заместител, наситен, или ненаситен, с права, или с разклонена верига, съдържащ от 4 до 25 въглеродни атоми.

ФС, в който R = хексил, притежава тропични свойства спрямо злокачествени тумори, и е ефективно средство за ФД.

Негов недостатък е трудоемкото му получаване и пречистване в препаративно количество, висока хидрофобност, и, вследствие на това, бавно натрупване в тумора и ниска стабилност на на водните разтвори на лекарствените форми при съхранение.

Известен е метод за получаване на ФС, а по-точно състав от хлорини под формата на соли с алкални метали, предназначен за прилагане в медицинската практика, който се състои в това, че растителната биомаса се екстрахира със смес от въглеводороди, съдържащи 6-12 въглеродни атоми, и алкохол, съдържащ 2-10 въглеродни атоми, в обемно съотношение 2:1 до 8:1, получения хлорофилен разтвор се изпарява при атмосферно налягане, прибавя се алкохол, съдържащ по-малко количество въглеродни атоми, отколкото алкохола за екстрахиране, пълното отстраняване на въглеводорода от сместа при атмосферно налягане, постепенно прибавяне към хлорофилния алкохолен разтвор на основа при температурата на кипене на алкохола, но не по-ниска от 120°С, до pH 11,5 - 11,8, охлаждане, престояване в продължение на 4 часа, филтруване, екстрахиране със смес от въглеводороди, съдържащи 6-12 въглеродни атоми, отделяне на алкохолната фаза, съдържаща магнезиеви комплекси на хлора, изпаряване ва алкохола при атмосферно налягане, прибавяне към остатъка на солна киселина до pH 3,5, сместа се оставя да престои до прекратяване утаяването на хлорин, отфилтруването му, разтваряне на утайката в метанол, прибавя не на алкохолен разтвор на основа до pH 8,5, отфилтруване на разтвора на ФС, и изпаряване във вакуум [5].

Недостатък на посочения метод е използването на висока температура при отстраняване на разтворителя от екстракта, използване на алкохоли, по-специално метилов алкохол, които водят до аломеризация на екзоцикъл Е и образуване на голям брой разнообразни окислителни продукти на феофитини и феофорбиди [6], което води до сложни смеси с неопределен и трудно възпроизводим състав.

Известен е метод за получаване на ФС, а именно натриева сол на хлорин е₆, съгласно който 1N разтвор на NaOH се прибавя към разтвор на триметилов естер на хлорин е₆ в тетрахидрофуран, след това реакционната смес се разбърква в продължение на 2 денонощия при стайна температура в атмосфера на азот, и се прибавя вода, след това органичния разтворител се екстрахира с метилен, като следите от последния се отстраняват

чрез барботиране на азот през разтвора на солта на хлорин е₆ [4]·

Недостатък на посочения метод е това, че изходният триметилов естер на хлорин е₆ е трудно достъпен в големи количества, продължителността на процеса на получаване на ФС от него, като се има предвид химическата инертност на естерния остатък в 13 позиция на тетрапироловия макроцикъл, и нестабилността на лекарствените форми на ФС при съхраняване във вид на водни разтвори поради непълното осапунване на естерната група в 13 позиция на макроцикъла.

Известен е метод за получаване на ФС, а именно на фотосенсибилизатора за фотодинамична терапия “LCP” (тринатриева сол на лизил-хлорин р₆), който се състои в това, че на биомаса се действа 2-3 пъти с ацетон, за да се извлече хлорофил а, отфилтруване, или центрофугиране на биомасата, изпаряване на екстракта, обработване на екстракта с киселина, за да се отдели от молекулите на хлорофила магнезиевия йон, и хидролиза на фитиловата естерна група чрез прибавяне на метилов алкохол за едновременна естерификация, на реакционната маса се действа с вода, производното на феофорбид а се екстрахира с метилен хлорид, екстракта се неутрализира, промива се с вода, изпарява се, хроматографира се с алуминиев оксид, метилфеофорбид а изкристализира из смес от метилен хлоридметанол, и на полученото производно на феофорбид а се действа със силна минерална основа в присъствие на кислорд в пиридин-диетилов естер-н-пропанол, на реакционната смес се действа с вода, водната фаза се подкислява до pH 4, екстрахира се “нестабилния хлорин” с метилен хлорид, екстракта се изпарява, “нестабилния хлорин” се разтваря отнова в тетрахидрофуран, разтвора се изпарява, процедурата се повтаря докато поглъщането при 700 nm престане да се повишава, получения пурпурин 18 се разтваря в тетрахидрофуран, естерифицира се с диазометан, метиловият естер на пурпурин 18 се смесва с воден разтвор на лизин в метилен хлорид в присъствие на пиридин, сместа се разбърква в продължение на 12 часа при стайна темпуратура, разтворителят се отстранява при висок вакуум, след това полученият суров продукт се пречиства посредством високоефективна течна хроматография с обърната фаза (ВЕТХ), разтворителят се отстранява посредством лиофилизиране, ФС се разтваря във фосфатен буфер с цел получаване на инжекционен разтвор за ФДТ, прибавя се 0,1 N разтвор на NaOH, разтвора се дивежда до физиологичната стойност на pH 7,35 посредством 0,1 N HCI, и се филтрува през микропорест филтър [2].

Към недостатъците на посочения метод е лошата възпроизводимост, трудоемкост (използване на висок вакуум, изкристализиране, колонна хроматография и ВЕТХ, продължително протичане на реакцията с лизина), използването на силно токсични и лесно запалими реактиви (диазометан, пиридин, метанол, тетрахидрофуран, диетилов естер), което го прави малко пригоден за фармацевтично производство. Освен това, полученият водоразтворим целеви продукт е устойчив във воден разтвор само 24 часа при 4°С на тъмно, а в твърдо състояние само до 4-я месец при 4°С на тъмно, а съгласно изискването на фармакопеята е необходимо да е устойчив не по-малко от 6 месеца [7]. Освен това, от химична гледна точка, посоченият ФС представлява смес от моноамиди в 13 и 15 позиция в съотношение от порядъка на 10:1, което може да доведе до неговото нееднозначно биологично разпределение и изхвърляне от организма.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Цел на настоящето изобретение е получаването на ФС, характеризиращ се с простота на отделяне и пречистване в препаративни количества, с балансирана хидрофобност-хидрофилност, и, вследствие на това, с оптимална скорост на натрупване в тумора и изхвърляне (от тумора и от организма въобще), а също така и с висока стабилност на водните разтвори на лекарствените форми при съхраняване.

Посочената задача се решава посредством създаване на ФС, съдържащ хлорин под формата на сол с алкален метал, при което като хлорин се използват хлорин е₆ (13-карбокси-17-[2карбоксиетил]-15-карбоксиметил-17,18-транс-дихидро-3-винил-8етил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин)

(I) в количество 80 - 90 %, пурпурин 5 (13-карбокси-17-[2-карбоксиетил]-15-формил-17,18-транс-дихидро-3-винил-8-етил-2,7,12,18тетраметилпорфирин)

(И) в количество 5-20 %, а така също пурпурин 18 - хлорин р₆ (13карбокси-17-[2-карбоксиетил]-15-карбокси-17,18-транс-дихидро-

3-винил-8-етил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин)

(III) останалата част, така че посочените съставни части образуват състав, а като алкален метал може да се използва натрий, или калий.

Цел на настоящето изобретение също така е при метода за получаване на ФС да се достигне висока възпроизводимост, леснота, химическа стабилност на лекарствените форми на ФС в продължение не по-малко от 1 година, съвокупност от физикохимични и биологични свойства на ФС, които гарантират неговата ефективност при ФДТ, и също така да се избегне използването на токсични реактиви.

Същността на предоставения метод за получаване на ФС се състои в това, че на биомаса от Spirulina се действа с ацетон до пълното извличане на хлорофил а, отфилтруване, или центрофугиране на биомасата, на екстракта се действа с киселина, за да се отдели магнезиевия йон от молекулите на хлорофила, неутрализиране на екстракта, и отфилтруване на утаения феофитин а, след това феофитин а се хидролизира в смес от солна киселина-ацетон-хексан, при което на всеки 1 г непречистен феофитин а се изискват 6 - 16 мл ацетон, 0,6 - 6 мл хексан и 5 - 10 мл концентрирана солна киселина, сместа се нагрява до температура 40 - 60°С, и се разбърква в продължение на 20 минути - 1 час, след това се прибавя хексан (6-16 мл), и органичната фаза се промива със смес от ацетон и концентрирана солна киселина (2 - 10):1, водната фаза се промива с хексан, след това водната фаза, съдржаща феофорбид а се неутрализира с излишек от воден разтвор на натриев цитрат (три-, дву-, или монозаместен), утаеният феофорбид а се отфилтрува, промива се с вода, прекристализира се из смес ацетон-вода, суши се във въздух до постоянно тегло, след това феофорбид а се разтваря в ацетон, прибавя се силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация 0,05 - 1,00 %, разбърква се при 30 - 60°С в продължение на 5 - 30 минути, прибавя се допълнително количество силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация 1 - 50 %, нагрява се при 40 - 60°С в продължение на 20 - 90 минути, сместа се неутрализира с разредена солна киселина, утаеният хлорин е₆ се отделя посредством центрофугиране, промива се с дестилирана вода до изчезване на киселата реакция, получава се 55 % - 80 % хлорин е₆, хлорин е₆ се прекристализира из ацетон, за да се отделят линейните тетрапироли, отфилтрува се хлорин е₆ и се промива с дестилирана вода, хлорин е₆ се нагрява в херметично затворен съд при температури 40 - 100°С в продължение на 1 час - 30 денонощия, охлажда се и се прибавя разтвор на силна основа до pH 7,5 -

8,5, след това разтвора се калибрира с безпирогенна вода за инжектиране до концентрация на фотосенсибилизатора 6,5-7,5 %масс·

Също така, съгласно метода за получаване на ФС, след като се прибави разтвора на силната основа до pH 7,5 - 8,5, сместа може да се подложи на гел-филтруване, до съдържание на хлорин е₆ - 80 - 90 %, на пурпурин 5 - 5 - 20 %, и на пурпурен 18 - останалата част, след това се прибавя разреден разтвор на солна киселина до като падне утайка от фотосенсибилизатора, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 - 7,5 %_масс, и се получава “течен екстракт от хлорини”.

Също така, съгласно метода за получаване на ФС, след гел-филтруването към разтвора на фотосенсибилизатора може да се прибави разреден разтвор на солна киселина до като падне утайка от фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или центрофугиране, прибавят се разрешените от Государственной Фармакопеей РФ добавки до pH 7,5 - 8,5 и безпирогенна вода за инжектиране, до съдържание на фотосенсибилизатора 0,1-1 %масс> и филтруване за отстраняване на бактерии.

Също така, съгласно метода за получаване на ФС, след гел-филтруването към сместа може да се прибави разреден разтвор на солна киселина до като падне утайка от фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 - 7,5 %_масс, диспергира се “течния екстракт от хлорини” в гел-субстрат в съотношение: 0,5 - 12 %_масс, “течен екстракт от хлорини”, 5 20 %_масс диметилсулфоксид, останалото - вода, разрешените от Государственной Фармакопеей РФ добавки и гел-субстрат.

Също така, съгласно метода за получаване на ФС, след гел-филтруването към сместа може да се прибави разреден разтвор на солна киселина до като падне утайка от фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 - 7,5 %_масс, и получения “течен екстракт от хлорини” се разтваря в диметилсулфоксид в съотношение: 0,5 - 12 %_масс “течен екстракт от хлорини”, а останалото - диметилсулфоксид.

Посоченият метод се осъществява, използвайки стандартно лабораторно пилотно оборудване: биомасата се обработва в алуминиеви съдове с обем 10 - 50 л, снабдени с механични бъркалки, биомасата се филтрува през нутч-филтри с обем 5 - 20 л с маслена вакуум помпа с кондензационно гърне и охлаждане с течен азот, биомасата се центрофугира, използвайки центрофуга със чаши 4 х 1 л с охлаждане, и скорост на въртене до 6000 об/мин, на екстракта се действа с киселина в стъклени бутилки с обем 20 л, утаеният феофитин а се отфилтрира през нутч-филтри с обем 5 - 10 л с маслена вакуум помпа с кондензацион-но гърне и охлаждане с течен азот, феофитин а се хидролизира в нагрявани тригърлени облодънни колби с обем 0,1 - 0,5 л, снабдени с бъркалки, обратен хладник и захранващ отвор със стопер, разтвора се промива в делителна фуния с обем 2 л, неутрализи-ра се в химически чаши с обем 2 - 5 л, феофитин а се филтрува през нутч-филтри с обем 5 - 10 л с маслена вакуум помпа с кондензационно гърне и охлаждане с течен азот, пре-кристализира се в химически плоскодънни колби с обем 0,25 - л, феофитин а се разтваря в ацетон, и се прибавя силна минерална основа в тригърлени облодънни колби

с обем

0,1 - 0,5 л, снабдени с бър-калки, обратен хладник и

захранващ отвор със стопер, утайката от хлорин е₆ се отделя чрез центрофугиране, използвайки центрофуга с кондензационно гърне с чаши 4 х 0,5 л, с охлажда-не, и скорост на въртене до 6000 об/мин, хлорин е₆ се пре-кристализира, използвайки химически плоскодънни колби с обем 0,25 - 0,5 л, 2 - 5 л, хлорин е_б се филтрува през нутч-филтри с обем 1 - 2 л с маслена вакуум помпа с кондензационно гърне и охлаждане с течен азот, хлорин е_б се нагрява в облодънни химически колби от термоустойчиво стъкло с обем 0,05 - 0,1 л, прибавя се разтвор на силна основа и се калибрира в химически чаши с обем 0,1 - 1 л, използвайки стандартен pH-метър и спектрофотометър, сместа се подлага на гел-филтруване в колона с диаметър 50 - 100 мм и височина 100 - 15- мм, филтрува се за отстраняване на бактерии през стандартен микропорест филтър от вида Millipore с диаметър на порите 0,22 мкм, “течният екстракт от хлорини” се диспергира в гел-субстрат, използвайки хомогенизатор с нож, или с топчета, също така, за получаване на проби от разтворите и стандартните образци, се използват конични колби със запушалки с обем от 0,01 до 10 л, цилиндри с обем от 0,005 до 2 л, чаши с обем от 0,05 до 2 л, бутилки с обем 20 л, везни с обхват 1 - 1 000 г, магнитни бъркалки; за регенерирането на ацетона и хексана се използват облодънни колби с обем 5 л с термометър и прав хладник с водно охлаждане; за бързото отстраняване на разтворителя при понижена температу-ра се използва ротационен вакуум изпарител.

Съгласно метода за получаване на ФС, концентриран за разтвор на солна киселина се смята наситен воден разтвор на хлороводород при температура 20°С, който обикновенно съдържа 36 - 37 %масс хлороводород.

При превръщането на феофитин а във феофорбид а, границите на количеството на хексана и на ацетона (6 - 16 мл ацетон и 0,6 - 6 мл хексан) се обясняват от факта, че при помалко количество на разтворителите феофитин а не се разтваря напълно, а при по-голямо количество на разтворителите се получава разтвор, който е недостатъчно концентриран за бързото протичане на хидролизата. Границите за количеството на солната киселина (5-10 мл) се обясняват от факта, че при помалко количество на солната киселина добивът на феофорбид а намалява, а при по-голямо количество на солната киселина се понижава селективността на реакцията, понеже се образуват много странични продукти на пирофеофорбид а. Температурните граници 40 - 60° се обясняват с факта, че при по-ниска температура добивът на феофорбид а намалява, а при по-висока температура се понижава селективността на реакцията, понеже се образуват много странични продукти на пирофеофорбид а. Границите на времетраенето на реакцията - 20 мин - 1 час, се обясняват с факта, че ако този период е по-кратък, добивът на феофорбид а намалява, а при по-продължителен период се понижава селективността на реакцията, понеже се образуват много странични продукти на пирофеофорбид а. Количеството на прибавения хексан -6-16 мл, се обяснява с факта, че при помалко количество отделянето на един от продуктите на реакцията - фитол, из реакционната маса, е неефективно, а използването на по-голямо количество хексан е нецелесъобразно.

При пречистването на феофорбид а, органичната фаза се промива със смес от ацетон и концентрирана солна киселина, в съотношение от 2:1 до 10:1. При съотношение по-малко от 2:1 от сместа се отделя парцалеста утайка от примеси, която трудно се отделя от водната фаза, съдържаща целевия феофорбид а. При съотношение 10:1 водната фаза се пресища на ацетон, и в нея преминават примеси от хексановата фаза, и онечистват целвия феофорбид а.

При превръщането на феофорбид а в хлорин е₆ концентрацията на силната основа е в границите 0,05 - 1,00 %, като неговата по-ниска граница - минимума е необходима за протичане на реакцията на отваряне на циклопентановия пръстен (пръстен Е) на феофорбид а, а при концентрация на основата по-висока от 1 % протича реакция на аломеризация (окисление) на пръстен Е, което води вместо до желания хлорин е₈, до “нестабилен хлорин”, а след това до пурпурин 18, и след това до хлорин р₆.

След това, съгласно метода, се прибавя допълнително количество минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация 1-50 %. При концентрация на основата по-ниска от 1 % протича непълно осапунване на естерната група на 13 и/или 15 позиция. При използване на основа в концентрация повисока от 50 % тетрапироловият макроцикъл на ФС в някои от случаите се отваря.

Реакционната маса след това се разбърква при 30 - 60°С в продължение на 5 - 30 минути, като по-ниската температура способства за улеснен процес на аломеризация на пръстена Е, а по-високата - за разпадане на хлорин е₆ до хлорин е₄. По-краткото време на протичане на реакцията е недостатъчно за протичане на реакцията на отваряне на пръстен Е, а по-продължителното време увеличава добива на страничния хлорин е₄. При прибавянето на допълнително количество силна минерална основа температурният интервал остава 40 - 60°С, а времето за протичане на реакцията - 20 - 90 минути. При по-ниска температура и по-кратко време метиловият естер не успява да се хидролизира в 15² позиция, при по-висока температура и попродължително време се увеличава добива на страничния продукт хлорин е₄.

При превръщането на хлорин е_б в “течен екстракт от хлорини” протича процес на окисляване и следващи термолитични процеси на дехидратиране и декарбоксилиране на ФС с окислената метиленова група в позиция 15¹ в пурпурин 5:

При превръщането на хлорин е₆ в “течен екстракт от хлорини” и използването на температури по-ниски от 40°С изисква по-продължително време на протичане на реакцията, което технологически е неоправдано. Използването на температури по-високи от 100°С води до ускорено разпадане на субстанцията.

Продължителността на процеса по-малко от 1 час изисква използването на температура, по-висока от 100°С, или води до получаването на субстанция, имаща ниска биологична активност.

Продължителността на процеса повече от 30 денонощия се съпровожда с необратимо изменение (разпадане) на субстанцията.

Оптималната температура за провеждането на процеса е 45-70°С (фигура 1).

Оптималната продължителност на провеждането на процеса е 2 - 9 денонощия при 70°С (фигура 2), или 1 - 48 часа при 100°С (фегура 3), което води до 5 - 20 % пурпурин 5 в сместа.

Субстанцията, съдържаща 5-20 % пурпурин 5 и 80 - 95 % хлорин е₆ в състава на активната съставна част (ФС), е подходяща за получаване на водоразтворими лекарствени форми за инжектиране. Ако субстанцията съдържа по-малко от 5 % пурпурин 5, тя има ниска биологична активност. Ако субстанцията съдържа повече от 20 % пурпурин 5, нейната разтворимост във вода се влошава, което се оказва неблагоприятно за стабилността на лекарствените форми при съхраняване, и се влошава способността за филтруване през микропорести филтри. Последното свойство е необходимо за стерилизиране на лекарствените форми, тъй като лекарствените форми на тетрапиролите не трябва да се стерилизират посредством нагряване, или посредством УВ-лъчи, понеже има голяма вероятност от протичането на нежелателни химични реакции.

Присъствието на 80 - 95 % хлорин е₆ в субстанцията е необходимо, за да се поддържа пурпурин 5 във водоразтворимо състояние.

Използваният обхват за pH се обуславя от това, че неговата по-ниска граница - pH 7,5 е най-ниската граница за разтворимост на хлорините във водни разтвори с получаване на концентрации, подходящи за използване във фармацията, без добавяне на стабилизатори. Горната граница на този обхват pH 8,5, е граница за биологичната поносимост на концентрацията на хидроксилните йони [ОН].

Обхватът на концентрациите на хлорин е₆ 6,5 - 7,5 % се обуславя от използването на технологичните методи на центрофугиране, или филтруване в етапа на отделяне на утайката от хлорин е₆, водещи до получаването на продукт в този обхват на концентрация.

Изобретението се илюстрира с чертежи, на които фигура 1 се отнася до метода, и показва образуването на пурпурин 5 в зависимост от температурата, в продължение на 30 денонощия; фегура 2 показва зависимостта на съдържанието на пурпурин 5 от времето при температура 70°С; фигура 3 показва зависимостта на съдържанието на пурпурин 5 от времето при температура 100°С; фигура 4 илюстрира фармакокинетиката на субстанцията “течни екстракти от хлорини”, използвана като лекарствената форма “Радахлорин, 0,5 %-тен разтвор за инжектиране” (“Фотохлорин”) при мишки с тумори, при венозно вкарване на доза 20 мг/кг; фигура 5а показва наличието на метаболит на хлорин е₆ (формула I), а именно пурпурин 5 (формула II) в кръвта, като кривите, обозначени с “1”, са за ФС в 0,01 М боратен буфер с pH 9,18, а кривите, обозначени с “2” са за ФС в кръвта. Фигура 56 потвърждава метаболизма на хлорин е₆ (формула I) в пурпурин 5 (формула II) в черния дроб; На фигура 6 е показано изображение на ПМР-спектъра на субстанцията “течни екстракти от хлорини”, получен в пример 2; На фигура 7 е показан мас19 спектъра на субстанцията “течни екстракти от хлорини”, получен в пример 2; фигура 8 показва спектъра на поглъщане във видимата област на субстанция “течни екстракти от хлорини”, получен в пример 2, спектърът е в етанол за 5 мкг/мл субстанция; на фигура 9 е представен ПМР-спектъра на хлорин е₆; фигура 10 съдържа мас-спектъра на хлорин е₆; фигура 11 показва спектъра на поглъщане във видимата област на хлорин е₆, спектърът е в етанол, концентрацията на хлорин е_е е 15 мкг/мл (сектор Cope - 5 мкг/мл); на фигура 12 е показан ПМР-спектъра на на пурпурин 5; на фигура 13 е показан мас-спектъра на пурпурин 5; фигура 14 съдържа спектъра на поглъщане във видимата област на пурпурин 5; спектърът е в етанол, концентрацията на пурпурин 5 е 5 - 15 мкг/мл (сектор Cope - 5 мкг/мл); фигура 15 показва ПМР-спектъра на диметиловия естер на пурпурин 5; на фигура 16 е показан мас-спектъра на диметиловия естер на пурпурин 5; на фигура 17 е показан спектъра на поглъщане във видимата област на диметиловия естер на пурпурин 5, спектърът е в етанол, концентрацията на ДМЕ на пурпурин 5 е 5 -515 мкг/мл (сектор Cope - 5 мкг/мл).

ФС се илюстрира с пример 1, примерите за осъществяване на метода са дадени в примери 2, 3, специалните случаи за осъществяване на метода са илюстрирани в примери 4-9.

От химична гледна точка ФС съдържа три циклчни тетрапироли от хлориново естество (с хидриран пръстен D) - хлорин е₆ (формула I), пурпурин 5 (формула II, пример 10) и пурпурин 18, който в алкална среда (при съхранение) постепенно се превръща в хлорин р₆ (формула III).

От физикохимична гледна точка ФС има способността да поглъща светлината във видимата област, в резултат на което е неговото фотоактивиране и следващото релаксилане на възбуденото състояние с пренос на енергия върху молекулния кислород и органичните субстрати, разтворени в тъканите. Този пренос води до процеси на оксидиране и до свободни радикали в биологичните тъкани, и тяхното увреждане и следващо разрушаване (некроза). Най-предпочитаният сектор на възбудимост за ФДТ е сектора с голяма дължина на вълната (таблица 1), тъй като с повишаване дължината на вълната се повишава и проникващата способност на светлината в биологичните тъкани. По такъв начин, ФС е способен да разруши биологични обекти след възбуждане от светлина с дължина на вълните 654 - 670 нм на дълбочина до 10 мм.

От гледна точка на фармацевтиката ФС е субстанция от “течни екстракти от хлорини” (течни е прието да се смятат екстракти със съдържание на ефективните средства не по-малко от 20 %). Посочената субстанция се смята за екстракт поради необходимостта да се екстрахира от биомасата, с използването на органични разтворители.

Таблица 1

Позициите на максимумите на поглъщане и екстинкцията на стойностите на молекулярното поглъщане за сектора с голяма дъжина на вълните за “течен екстракт от хлорини” в различни среди.

ФС	1 нм Amaxi ε, М'1 cm’1 (0,01 M боратен буфер, pH 9,18)	Λ НМ лтах, ε, М'1 cm'1 (0,01 М боратен буфер с добавка на 1% човешки серум албумин, pH 7,2)	Λ НМ Λ-maxi ε, М'1 cm'1 (етанол)
“течен екстракт от хлорини”	654,5 (28270)	662 (34200)	662 (34230)

Съединението с формула II притежава способност да се натрупва селективно в злокачествени новообразувания и огнища на инфектиране, но е лошо разтворимо във вода, а съединението с формула I, заедно с изразената фотоактивност, е солюбилизиращо (подпомагащо разтворимостта) средство за съединението с формула II.

От фармакологична гледна точка (фигура 4, пример 11), еднозначността на фармакологичните показатели се достига с това, че ФС с формула (I) в организма бавно се превръща във ФС с формула (II), с което концентрацията на последната се поддържа на постоянно ниво от момента на прилагането в организма до момента на извеждане от тумора, в продължение на период от време, достатъчен за ефективното реализиране на

ФДТ. След като предоставения състав ФС се приложи в организма на мишка - носител на тумор, той попада в кръвния поток, и благодарение на циркулирането в кръвта най-вече на съединението с формула (I) през първите 3 часа след прилагането, в областта на тумора достига висока и стабилна концентрация на ФС - 0,27 - 0,32 μΜ, достатъчна за ефективно реализиране на ФДТ в интервала 0,5 - 4 часа. В рамките на този интервал от време се достига висок контраст благодарение на присъствието в състава на 5 - 20 % от съединението с формула (II), което притежава свойството да се натрупва с висока контрастност в тумора, като максимума на натрупването се достига на 3-я час след прилагането на ФС в организма на животните (коефициентът на контрастност е 14,5 за кожата, и 2,9 за мускулите). За това време съединението с формула (I) се превръща в организма в съединението с формула (II), гарантирайки висока стабилна концентрация на ФС в областта на тумора в интервала 3-5 часа след инжектирането, която постепенно се понижава, оставайки терапевтично достатъчна чак до 18 часа след инжектирането. След това съединението с формула (II) се разпада в организма до нетоксични продукти, които се изхвърлят през черния дроб.

Превръщането на хлорин е_б с формула (I) в пурпурин 5 с формула (II) се потвърждава от флуоресцентни спектри на органи от експериментални животни (фигура 5). При прибавяне на лекарствената форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране” (“Фотохлорин”) към хомогенна кръв [фигура 5а, (1)] в концентрация 10 М, и следващо спектрофотометрично изследване, се наблюдава изменение на флуоресцентния спектър с 1, 2 пъти, и преместване на максималната интензивност на флуоресценцията с 8 нм в частта от спектъра с голяма дължина на вълната. При прибавяне на “Фотохлорин” в по-малка концентрация (С = 1 μΜ) е отбелязано преместване само за частта от спектъра без разширение, което демонстрира ефекта от дозата при образуването на метаболита [фигура 5а, (2)].

Фигура 5а, (3) показва резултатите от изследване на хомогенна кръв, получени 3 часа след прилагането на “Фотохлорин” в мишка. Тук най-силно е изразен показателят на разширение на спектъра 1,5 пъти при максимално преместване на сектора с 4 нм към областта на спектъра с голяма дължина на вълната, от което следва, че в изследваната проба кръв присъства смес от “Фотохлорин” и метаболит.

Когато се прибавя “Фотохлорин” в епруветка с хомогенат от черен дроб [фигура 56, (1)] в концентрация 10 μΜ, изменението на характеристиките на спектъра се изразява преди всичко с преместването на максимума на интензивност на флуоресценцията с 9 нм в областта на спектъра с голяма дължина на вълната. Липсва разширение на спектъра.

Аналогична картина се наблюдава при прибавяне на “Фотохлорин” в по-ниска концентрация С = 1 μΜ [фигура 56, (2)].

При изследване на хомогенат от чернодробна тъкан, получен 3 часа след прилагането на препарата в животните, спектрофотометричната картина от изследваната проба е аналогична на двете предшестващи [фигура 56, (3)].

По този начин, получените данни показват присъствието на метаболита на “Фотохлорин” в чернодробния хомогенат.

Натрупването на пурпурин 5 в туморите на експериментални животни, оптимално за фотодинамичния ефект съгласно селективността, се наблюдава в интервала 3-18 часа след интравенозното, или интраперитонеалното прилагане. В случаите, когато е необходимо също така да се задейства субстанцията от хлорини, циркулираща в кръвния поток, оптималното време на облъчване е 0,5 - 4 часа след интравенозното прилагане. В найобщия случай, за провеждане на ФДТ със субстанцията на “течен екстракт от хлорини”, интервалът между прилагането на препарата и облъчването е 0,5 -18 часа.

Биологичната активност на лекарствената форма “Радахлорин, 0,5 %-тен разтвор за инжектиране” (“Фотохлорин”), съдържащ 0,5 % безводна субстанция от “течен екстракт от хлорини”, се оценява in vitro и in vivo.

Балансирането на ФС по отношение на амфифилност се потвърждава чрез стандартния експеримент in vivo [8] (таблица 2, пример 12). Коефициентът на разпределение на ФС в 1-октанол/фосфатен буфер, pH 7,4 (К_р), е 1,40. Това означава, че защитеният ФС е еднакво добре разтворим както във вода, така и в липидна фаза, и доказва липофилността на ФС, която дава възможност на това съединение да се преразпределя из вода в комплекси с транспортни белтъци и липопротеини, бързо да прониква в клетките, и да се натрупва в цитоплазмените вътреклетъчни мембрани и микрозоми, или да прониква в клетките чрез дифузия през плазмените мембрани на тези клетки.

След облъчване с лазер, съединението, натрупано по такъв начин, отделя синглетен кислород вътре в клетката, и я убива.

Противотуморната активност на ФС спрямо различни видове ракови клетки се потвърждава от резултатите, получени в експеримента in vitro, в който се използват 3 линии култивирани туморни клетки: феохромоцити от плъх PC 12, Gasser-ови ганглиони невриноми от плъхове НГУН1 и хепатоми от плъхове 27 (Нер27) (Таблица 2, пример 13).

За изследване на доза-зависимата цитотоксична (след облъчване с лазер) и биологична “тъмна” активности на ФС се използват следващите методи:

1. МТТ-тест, който позволява точно да се определи броя на живите клетки след въздействие с ФС и облъчване с лазер за изчисляване на цитотоксичния и цитофототоксичния индекси на ФС. Този тест дава възможност да се оцени доза-зависимата цитотоксична (след облъчване с лазер) и биологична “тъмна” активности на ФС [|9.

2. Определяне броя на клетките след оцветяване на клетъчния монослой с кристал виолет в края на експеримента. Този метод е по-малко трудоемък и по-евтин, отколкото МТТ-теста, и също дава вазможност за изчисляване на цитотоксичния и цитофототоксичния индекси на ФС [10], но е понеточен, тъй като кристал виолета оцветява и мъртвите клетки.

3. Сравнителното генотоксично и генофототоксично действие на ФС се оценява чрез степента на инхибиране синтезирането на ДНК в клетките. Синтезирането на ДНК се определя по степента на включване в ДНК ¹⁴С-тимидин, използвайки стандартни радиометрични методи [11].

Всичките три изследвани клетъчни линии са високочувствителни спрямо облъчването с лазер, след като им се приложи ФС (данни от МТТ-теста). По степента на чувствителност спрямо облъчване с лазер клетъчните линии се подреждат както следва: НГУК1 > РС12 > Нер27.

При продължително действие на ФС в концентрация 5 μΜ върху клетки на тъмно, преживяемостта е 96,5 - 86,2 % за РС12,

103,7 - 93,0 за НГУК1 и 109,7 - 87,9 за Нер27 (МТТ-тест кристал виолет, съответно). В тези условия синтезирането на ДНК практически не се изменя в клетки PC 12, и е понижено в клетки Нер27 и НГУК1 с 21,2 и 22,2 % съответно. Наблюдаваното увеличаване на броя на клетките НГУК1 и Нер27 при действието на 5 μΜ ФС върху клетки на тъмно, е свързано, преди всичко с индуциране на пролиферативната активност на клетките от ФС. Като цяло, за ФС в отсъствие на облъчване, е по-характерно проявяването на цитотоксична активност, отколкото индуциране на пролиферативна активност.

След лазерно облъчване на клетки, върху които е приложен ФС, се наблюдава тяхната гибел. Установява се дозазависимо цитотоксично действие на препарата, което дава възможност да се изчисли ЕС₅о, тоест, да се определи концентрацията на ФС, при която загиват 50 % от клетките. Тези данни са показани в таблица 2. Трябва да се отбележи, че ФС, при които ЕС₅о θ по-малко от 20 μΜ, се считат за ефективни за супресиране нарастването на тумор.

При определяне на генофототоксичността след въздействие върху клетките с 5 μΜ ФС и облъчване с лазер, се получава рязко понижаване на синтезирането на ДНК (96,5 % понижаване в сравнение с контролите, които са само облъчени) в клетки РС-12. В клетките Нер27 и НГУК1 при ниски концентрации на ФС след облъчване с лазер се наблюдава стимулиране на синтезирането на ДНК, което значително се понижава в присъствие на 5 μΜ ВХ. Наблюдаваното повишаване на синтезирането на ДНК може да се обясни с високата способност за синтезиране на ДНК и възстановяване на своята популация на трансформираните чернодробни и глиални клетки, преживели при ниски концентрации на ФС.

Така че, ФС е високо цитотоксичен препарат за различни видове туморни клетки. Във високи концентрации (> 5 μΜ) той е умерен инхибитор на нарастването на тумора и без облъчване.

Високата генофототоксичност на ФС дава възможност той да се смята за силен инхибитор на нарастването на тумора при облъчване.

В експериментите in vivo се изследват токсичните свойства на ФС (пример 14). Средната стойност на коефициента LD₅₀ е 210,53 ± 22,2 мг/кг тегловно, а дозата, предизвикваща смъртта на 10 % от изследваните животни (LD₁₀), е 169,87 мг/кг. Проведените изследвания дават възможност ФС да се определи като “нискотоксично вещество”.

В експериментите in vivo се изследва биоразпределението на ФС (пример 11). При интраперитонеално прилагане на ФС върху мишки с ембриокарцином Т36, инокулиран в мускула на задния крак, се наблюдават следните закономерности в разпределението на съединението. След прилагането ФС попада в кръвта, а след това се преразпределя в органите и тъканите на животните (таблица 3).

Както се вижда на таблица 3, максималното натрупване в тумора ( 0,70 μΜ) се достига 5 часа след интраперитонеалното прилагане в доза от 40 мг/кг, и продължителното й поддържане (18-24 часа). Туморната концентрация 18 часа след прилагането е 0,48 μΜ, което е с 1,5 пъти по-малко, отколкото натрупването в абсолютния максимум, при висока селективност на натрупването. Съотношението тумор/мускулна тъкан е 32, а тумор/кожа е 44.

След интравенозно прилагане в доза от 20 мг/кг се достига максимално натрупване в тумора след 0,5 часа (0,32 μΜ), която също така се поддържа продължително (до 5 часа). Максималната контрастност на натрупване при интравенозно прилагане се проявява след 3 часа, и за тумор/мускулна тъкан е 3, а за тумор/кожа е 4. ФС се изхвърля до 98 % из организма за едно денонощие.

Таблица 2

Коефициент на липофилност и активност in vitro на “Радахлорин, 0,5 % разтвор за инжектиране” (“Фотохлорин”)

Тестове, клетъчни линии	Цитотоксичност (“тъмна” токсичност), %спрямо контрола при 5 μΜ	Фотоцитотоксичност ЕСИ, μΜ1	Кр
МТТ-тест, PC 12	96,5	1,8
МТТ-тест, НГУК1	103,7	1,8
МТТ-тест, Нер27	109,7	3,9	<40
Кристал-виолеттест1,8 РС12	86,2	1,5
Кристал-виолеттест НГУК1	93,0	1,8
Кристал-виолеттест Нер27	87,9	4,7
Генотоксичност, РС12	104,7	3,5 % спрямо контрола при 5 μΜ

Генотоксичност, НГУК1	77,8	132,2 % спрямо контрола при 5 μΜ
Генотоксичност, Нер27	78,8	100,7 % спрямо контрола при 5 μΜ

¹ Без генофототоксичност

Резултатите от оценяване ефективността от действието на препарата при ФДТ на рака в експериментите in vivo при мишки (пример 15) дават възможност да се констатира факта, че е налице изразена фотодинамична активност на “Радахлорин, 0,5 % разтвор за инжектиране” (“Фотохлорин”) и на “Радахлорин, 0,05 % гел”.

Лекарствената субстанция “течен екстракт от хлорини”, включваща натриеви соли на хлорини (или соли на хлорини и други силни минерални основи), се използва за получаването на лекарствени форми с прибавяне към нея на различни добавки, разрешени от Государственной Фармакопеей РФ: калциев карбонат, захароза, глюкоза, нишесте, магнезиев стеарат, поливинилпиролидони, полиглюкани, метилглюкамин, изотоничен разтвор, диметилсулфоксид, гелни и водоемулсионни основи и т. н. (примери 4 - 9).

За външно приложение се използват мазила, мехлеми за разтриване, гелове, препарати на маслена основа, съдържащи разрешени от Государственной Фармакопеей РФ основи, 5 - 20 % диметилсулфоксид и 0,5 - 12 % субстанция “течен екстракт от хлорини”, или 0,8-14 % субстанция “течен екстракт от хлорини” и 86 - 99,2 % диметилсулфоксид (примери 8, 9).

Изборът на обхвата на съдържанието на диметилсулфоксид в комбинация с основа е свързан с това, че при негова концентрация по-малка от 5 %, проникването на субстанцията в тъканта е малко, което понижава ефективността на ФДТ. При концентрация на диметилсулфоксид повече от 20 %, лекарствени форми на други основи губят стабилност при съхраняване. Изборът на обхвата на съдържанието на субстанцията зависи от това, че при нейна концентрация по-малка от 5 %, концентрацията на субстанцията в тъканта е недостатъчна за ефективното провеждане на ФДТ. При концентрация повече от 12 %, тъканта губи прозрачност за светлинно излъчване, цялата светлина се поглъща във горния слой на тъканта, което води до изгаряне при ниска ефективност на процедурата ФДТ.

Таблица 3

Главни фармакокинетични показатели.

Изхвърляне %—ч	98—24	98—24 I
Съотноше-ни( тумор/мускул при макс. контраст J	2,9	32,0
Съотношение тумор/кожа при макс. контраст i 1	14,5	44,0
Натрупване в тумора при максимум контраст μΜ-ч	0,29 - 3	0,48-18
Съотноше-ни тумор/ мускул в макс. натрупване в тумора	co	3,0
Съотношение тумор/ кожа в макс. натрупване в тумора	’Т CD	3,9
максимум на натрупване в тумора, μΜ-ч	0,32 - 0,5	0,70 - 5
Q ζ* Ш ί S С 1 к S >» Т Ο О го Т ο ι ьс н . 2 ' ЮфЯшшщаг <Η-5ΐΧΤΟΖ1	Тънки черва 4,0-0,5	Кръв- 5,2-0,5
ФС	Фотохлорин Интравенозно 20 мг/кг	Фотохлорин интерперитониално 40 мг/кг

За външно приложение експозицията на субстанцията върху кожата преди облъчването е 0,5 - 24 часа. За време помалко от 0,5 часа субстанцията не успява да проникне в тъканта на необходимата дълбочина. За време по-голямо от 24 часа се наблюдава намаляване на величината на абсолютното натрупване на препарата, вследствие на неговото преразпределение и изхвърляне. Също така, продължителни експозиции на лекарствени форми за външно приложение върху кожата са неудобни от клинична гледна точка.

При вътрешно използване препарата се прилага във вид на 0,1-1 %-ен разтвор в каквито и да е среди, които са разрешени от Государственной Фармакопеей РФ (безпирогенна вода за инжектиране, диметилсулфоксид, физиологичен разтвор и други подобни), капково, или струйно. Използването на разтвори на субстанцията, разредени повече от 0,1 %, е нерационално, от гледна точка на обемите течност, които се въвеждат в организма. Използването на разтвори, които са по-концентрирани от 1 % е невъзможно, поради лошата филтруемост на такива разтвори в етапа на стерилизиране посредством антибактериални филтри.

За активиране на субстанцията “течен екстракт от хлорини” се използва полупроводников пазарен диоден модул за фотодинамична терапия МЛ-662-СП, разработен от фирмите ЗАО “МИЛОН” (г. Санкт-Петербург) и ООО “СИГМ ПЛЮС” (г. Москва). Този модул има следните изходни данни [12]:

- мощност 2,5 - 3 Вт във влакно от 200 мкм с отвор 0,22.

- високо интензивни лазерни диоди съвместно производство на фирмите “Полароид” (США) и ООО “СИГМ ПЛЮС” с максимална дължина на вълната на излъчване 662±3 нм.

За активиране субстанцията ФС могат да се използват модули с по-малка мощност (с по-малък брой диоди) с облъчване с максимална дължина на вълната 662±3 нм, а също така и твърдотелен лазер с напомпване на втория хармоник от итриево-алуминиев гранат YAG:Nd³⁺ с максимална дължина на вълната на облъчване 670 нм.

Големината на подаваната енергия варира от 30 до 3000 Дж. При доза на светлината по-малко от 30 Дж процедурата на ФДТ става изключително продължителна, тъй като за достигане на оптимален ефект, сканирането трябва да се осъществи върху изключително малка площ. При доза на светлината по-голяма от 3000 Дж и най-често срещаните в клиничната практика размери на туморите се наблюдава значително увреждане на здрава тъкан, водещо до по-продължителен период на нейното възстановяване.

Повърхностната плътност на подаваната енергия варира от 50 до 2500 Дж/см². При повърхностни дози светлина по-малки от 50 Дж/см² ефект не се наблюдава. При повърхностни дози светлина по-големи от 2500 Дж/см² се наблюдава значително увреждане на здрава тъкан, водещо до по-продължителен период на нейното възстановяване.

Обхватът на дължините на вълните на излъчване е свързан с техническата характеристика на използвания лазер (662±3 нм), с промяната на максимума на поглъщане на препарата в зависимост от полярността на средата (654 - 662 нм) и със съдържанието на пурпурин 5 в субстанцията (5 - 20 %, половината ширина на сектора на поглъщане с голяма дължина на вълните при 663 - 670 нм) (таблица 1).

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1. Описание на физикохимичните свойства на ФС.

Фс представлява гъста маса с черен цвят, в тънък слой придобива зелен отенък, с миризма на водорасли.

За потвърждаване автентичността на свойствата на ФС, “течен екстракт от хлорини”, 7,5 % се размесва добре, проба от екстракта (1 мг) се разтваря в 10 мл ректификационен етилов алкохол, 95 % медицински, или етилов алкохол с най-висока степен на чистота, и се измерва оптичната плътност при дължи© на на вълната 662 нм (D). Получената стойност е 0,23. Изчислява се молекулярната екстинкция ε (М'¹см‘¹) по формулата ε = D*597/(0,004). Получената стойност трябва да се намира в обхвата 33300 - 35100. След заместване се получава ε = 0,23*597/(0,004) = 34328. Следователно, “течният екстракт от хлорини” съдържа 7,5 % ФС.

Разтворът на ФС в етилов алкохол има жълто-зелен цвят. След като през слой от разтвора преминат светлинни лъчи от медицинска синя лампа от вида МДС 220-75 (ТУ 16.535.376-79) в С защитено от светлината място, разтворът придобива рубиненочервен цвят.

За количественото определяне, “течният екстракт от хлорини” се разбърква добре, проба от екстракта (5 мг) се разтваря в 10 мл ректификационен етилов алкохол, 95 % медицински, или етилов алкохол с най-висока степен на чистота, и се измерва оптичната плътност при дължина на вълната 662 нм (D). Получената стойност е 2,15. Изчислява се съдържанието на ФС по формулата: с,% = (D*597*10*100)/(34230*5). Получената стойност трябва да съответства на зададената.

След заместване, с,% = (2,15*597*10*100)/(34230*5) = 7,5 % (съответства на зададеното).

, За следващи анализи към 100 мг “течен екстракт от хлорини” се прибавя разреден разтвор на солна киселина до падане на утайка. ФС, който се отфилтрува, се суши във вакуум над фосфорен пентоксид в продължение на 12 часа, и му се снема ПМР-, мас-спектър и спектър на поглъщане с дължини на вълните в обхвата 360 - 720 нм.

Спектри ПМР на ФС (фигура 6): (в ДМСО-О6, концентриран © разтвор): 9,64, 9, 55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (с, мезо -Н хлорин е₆ и пурпурин 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2д, СН=СН₂ хлорин е₆ и пурпурин 5), 6,84 (с, γ- мезо -СНО и пурпурин 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2д, СН=СН₂), 5,43 (2s, γ- мезо - СН₂СООН), 4,60 (м, 7-Н), 4,45 (м, 8-Н), 3,80, 3,56 (кх2, 4-СН₂СН₃), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (с, ядрени СН₃ на хлорин е₆ и пурпурин 5), 2,38, 2,32 (2м, 7- СН₂СН₂СООН), 2,71, 2,20 (2м, 7- СН₂СН₂СООН), 1,76 (т, 4СН₂СН₃), -1,63, 1,91 (2с, 2ΝΗ) м. д.

Мас-спектри на ФС (фигура 7): е. i., М⁺ (%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Спектри на поглъщане на ФС във видимата област: λ (ε) (етанол), 386 (22310), 406 (113040), 506 (14870), 536 (8925), 608 (7437), 662 (34220).

Съгласно ПМР спектъра, субстанцията съдържа 80 % хлорин е₆, 15 % пурпурин 5 и 5 % пурпурин 18 (минимални сигнали при 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 м. д.), което съответства на състава, който се патентова. Съгласно масспектъра, има пикове на молекулярни йони 596 от хлорин е₆ и пурпурин 5. В спектъра на поглъщане има сектор 662 нм с големина на поглъщане, която е добре съпоставима с молекулярната екстинкция на стандартния образец на ФС _t (34230).

Следователно, изследваната проба е “течен екстракт от хлорини”, 7,5 %.

Пример2. Получаване на ФС под форма на “течен екстракт от хлорини”, 6,5 %.

На биомаса от Spirulina (2кг) се действа с ацетон (3 х 2 л) до пълно извличане на хлорофил а, биомасата се филтрува, към © екстракта се прибавя солна киселина (30 мл), за да се отдели магнезиевия йон от молекулите на хпорофила, екстракта се неутрализира, и се отфилтрува утаения феофитин а (8 г), след това феофитин а се хидролизира в смес от солна киселинаацетон-хексан, като феофитин а се разтваря в смес от 50 мл ацетон, 5 мл хексан и 40 мл солна киселина (37 %), сместа се нагрява до температура 40°С, и се разбърква в продължение на 1 час, след това се прибавя хексан (50 мл) и органичната фаза се промива със смес от ацетон и концентрирана солна киселина ф 2:1 (3 х 50 мл), водната фаза се промива с хексан (5 х 40 мл), след това водната фаза, съдържаща феофорбид а, се неутрализира с излишък от воден разтвор на натриев цитрат (три-, дву-, или еднозаместен), утаеният феофорбид а се отделя чрез филтруване, промива се с вода (3 х 50 мл), прекристализира се из смес ацетон-вода, суши се на въздуха до постоянно тегло (добив феофорбид а - 4,2 г, 7,1 мМ, 77 %), след това феофорбид а (2,7 г, 4,56 мМ) се разтваря в ацетон (100 мл), прибавя се силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация (0,05 %, 25 мл), разбърква се при 60°С в продължение на 5 минути, прибавя се допълнително количество силна минерална основа (20 %, 25 мл) във вид на воден разтвор, нагрява се при 40°С в продължение на 90 минути, сместа се неутрализира с разредена солна киселина (2 %, приблизително 250 мл), утайката от хлорин е₆ се отделя чрез центрофугиране, промива се с дестилирана вода (5x10 мл) до изчезване на киселата реакция, получават се 1,85 g (2,96 мМ, 65 %) хлорин е₆, хлорин е₆ се прекристализира из ацетон, за да се отделят линейните тетрапироли, хлорин е₆ се отфилтрува и се промива 3 пъти с дестилирана вода, хлорин е₆ се нагрява в херметичен © съд при 40°С в продължение на 30 денонощия, охлажда се и се прибавя 1 %-ен разтвор на натриев хидроксид до pH 7,5, при което се получава ФС със съдържание 15 % пурпурин 5, 80 % хлорин е₆ и 5 % пурпурин 18 (хлорин р_б), който се калибрира с дестилирана вода до 6,5 %-но съдържание на ФС, при което се получават 14,2 г (50 %) ФС под формата на 6,5 %-ен “течен екстракт от хлорини”.

ПМР спектър на получения “течен екстракт от хлорини” (фигура 6): (в ДМСО-О6, конц. разтвор): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, ф 8,90, 8,79 (с, мезо -Н хлорин е₆ и пурпурин 5), 8,09, 8,04, 7,97,

7,92 (2д, СН=СН₂ хлорин е₆ и пурпурин 5), 6,84 (с, γ- мезо - СНО пурпурин 5), 6,37, 6,32, 6,13 6,10 (2д, СН=СН₂), 5,43 (2s, γ- мезо СН₂СООН), 4,60 (м, 7-Н), 4,45 (м, 8-Н), 3,80, 3,56 (кх2, 4-СН₂СН₃), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (с, ядрени СН₃ на хлорин е₆ и пурпурин 5), 2,38, 2,32 (2м, 7- СН₂СН₂СООН), 2,71, 2,20 (2м, 7СН₂СН₂СООН), 1,76 (д, 8-СНз), -1,72 (т, 4- СН₂СН₃), -1,63, -1,91 (2с, 2ΝΗ) м. д.

Субстанцията съдържа 80 % хлорин е₆, 15 % пурпурин 5 и 5 % пурпурин 18 (хлорин р₆) (сигнали при 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 м. д.).

Мас-спектри на получената субстанция (фигура 7): е. i., М⁺ (%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 _γ (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Спектри на поглъщане във видимата област (фигура 8): λ (ε) (етанол), 386 (22320), 406 (113110), 506 (14880), 536 (8930), 608 (7440), 662 (34230).

Пример 3. Получаване на ФС под формата на субстанция “течен екстракт от хлорини”, 7,5 %.

На биомаса от Spirulina (2кг) се действа с ацетон (3 х 2 л) © до пълно извличане на хлорофил а, биомасата се отделя чрез центрофугиране, към екстракта се прибавя солна киселина (30 мл), за да се отдели магнезиевия йон от молекулите на хлорофила, екстракта се неутрализира, и се отфилтрува утаения феофитин а (8 г), след това феофитин а се хидролизира в смес от солна киселина-ацетон-хексан, като феофитин а се разтваря в смес от 100 мл ацетон, 50 мл хексан и 80 мл солна киселина (37 %), сместа се нагрява до температура 60°С, и се разбърква в продължение на 20 минути, след това се прибавя хексан (100 мл) Ф и органичната фаза се промива със смес от ацетон и концентрирана солна киселина 5:1 (3 х 50 мл), водната фаза се промива с хексан (5 х 40 мл), след това водната фаза, съдържаща феофорбид а, се неутрализира с излишък от воден разтвор на натриев цитрат (три-, дву-, или еднозаместен), утаеният феофорбид а се отделя чрез филтруване, промива се с вода (3 х 50 мл), прекристализира се из смес ацетон-вода, суши се на въздуха до постоянно тегло (добив 3,8 г, 6,4 мМ, 67 %), след това феофорбид а (2,7 г, 4,56 мМ) се разтваря вацетон (100 мл), прибавя се силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация (1 %, 25 мл), разбърква се при 30°С в продължение на 30 минути, прибавя се допълнително количество силна минерална основа (20 %, 25 мл) във вид на воден . разтвор, нагрява се при 60°С в продължение на 20 минути, сместа се неутрализира с разредена солна киселина (2 %, приблизително 250 мл), утайката от хлорин е₆ се отделя чрез центрофугиране, промива се с дестилирана вода (5x10 мл) до изчезване на киселата реакция, получават се 1,67 g (2,67 мМ,

%) хлорин е₆, хлорин е₆ се прекристализира из ацетон, за да се отделят линейните тетрапироли, хлорин е_б се отфилтрува и се © промива 3 пъти с дестилирана вода, хлорин е₆ се нагрява в херметичен съд при 100°С в продължение на 1 час, охлажда се и се прибавя 1 %-ен разтвор на калиев хидроксид до pH 8,5, в резултат на което се получава ФС със съдържание 2 % пурпурин 5, 82 % хлорин е₆ и 16 % пурпурин 18 (хлорин р₆), който се калибрира с дестилирана вода до 7,5 %-но съдържание на ФС, при което се получават 11,1 г (50 %) ФС под формата на 7,5 %-на паста.

Спектрите на получената субстанция са аналогични на ф спектрите, дадени за пример 2, и суперпозиция на спектрите на хлорин е₆ (фигури 9 -11) и пурпурин 5 (фигури 12-14).

Пример 4. Частен случай за получаване на ФС получаване на “течен екстракт от хлорини”, 7,5 %.

ФС с 2 % пурпурин 5, 82 % хлорин е₆ и 16 % пурпурин 18 (хлорин р₆), под формата на 7,5 %-на паста от предшестващия пример ке подлага на гел-филтруване през колона със Sephadex G10 с диаметър 50 мм и височина 100 мм, елуира се с 1 %-ен разтвор на калиев хидроксид до съдържание на хлорин е₆ 90 %, пурпурин 5 - 5 % и пурпурин 18-5 %. Прибавя се разреден разтвор на солна киселина до падане на утайка от ФС, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 7,5 %_масс, при което се получават . 6,8 г “течен екстракт от хлорини”, 7,5 %. Електронният спектър на продукта е показан на фигура 8.

Пример 5. Частен случай за получаване на ФС получаване на лекарствена форма “Радахлорин, 0,1 %-ен разтвор за инжектиране”.

След гел-филтруването към разтвора на ФС от пример 4, се прибавя разредена солна киселина до падане на утайка от © ФС, тази утайка се отфилтрира, прибавя се концентриран разтвор на натриев хидроксид в безпирогенна вода за инжектиране до pH 7,5, и безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на ФС 0,1 %, след което разтвора се филтрува за отстраняване на бактерии през антибактериален микропорест филтър “Millipore” с диаметър на порите 0,22 μΜ. Добив - 500 мл разтвор. Електронният спектър на продукта е показан на фигура 8.

Пример 6. Частен случай за получаване на ФС получаване на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен Ф разтвор за инжектиране” (Фотохлорин”).

След гел-филтруването към разтвора на ФС от пример 4, се прибавя разредена солна киселина до падане на утайка от ФС, тази утайка се отфилтрира, прибавя се концентриран разтвор на калиев хидроксид до pH 7, след което при контролиране чрез pH-метър разтвора се довежда до pH 8,5 с N-метил-Оглюкамин, прибавя се безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 0,5 %_мас и се филтрува за отстраняване на бактерии през антибактериален микропорест филтър “Millipore” с диаметър на порите 0,22 μΜ. Добив - 100 мл разтвор. Електронният спектър на продукта е показан на фигура 8.

j Пример 7. Частен случай за получаване на ФС получаване на лекарствена форма “Радахлорин, 1 %-ен разтвор за инжектиране”.

След гел-филтруването към разтвора на ФС от пример 4, се прибавя разредена солна киселина до падане на утайка от ФС, тази утайка се отфилтрира, прибавя се концентриран разтвор на натриев хидроксид до pH 8,5, след което се прибавя © безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 1 %_мас и се филтрува за отстраняване на бактерии през антибактериален микропорест филтър “Millipore” с диаметър на порите 0,22 μΜ. Добив - 50 мл разтвор. Електронният спектър на продукта е показан на фигура 8.

Пример 8. Частен случай за получаване на ФС получаване на лекарствена форма “Радахлорин, гел”.

След гел-филтруването към разтвора на ФС от пример 4, се прибавя разредена солна киселина до падане на утайка от 0 ФС, тази утайка се отделя чрез центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 %_мас, и след това се постъпва съгласно вариантите:

Вариант (а). Към 75 мл вода и 5 г диметилсулфоксид при стайна температура се прибавят 0,3 г Pemulen TR1, или Carbopol 2020 (BF Goodriah, UK), и се разбърква в продалжение на % - 8 часа. Прибавя се воден разтвор на основа до pH 5. Гела се суспендира отново, като се добавя “течен екстракт от хлорини”,

6,5 % и вода, така че съдържанието на хлорин е_б в готовия гел да е 0,05 %, и се вакуумира в продължение на 5 минути при 10 - 50 мм рт. ст. Добив - 100 г гел.

_f Вариант (б). Към 70 мл вода при стайна температура се прибавят 5 г диметилсулфоксид и “течен екстракт от хлорини”,

6.5 %, така че съдържанието на хлорин е₆ в готовия гел да е 0,05 %, а след това се прибавят 15 г Aculyn ЗЗА (ISP, USA). Разбърква се до хомогенна смес, и се прибавя воден разтвор на основа до pH 5. Вакуумира се в продължение на 5 минути при 10 - 50 мм рт. ст. Добив - 100 г гел.

Q След гел-филтруването към разтвора на ФС от пример 4, се прибавя разредена солна киселина до падане на утайка от ФС, тази утайка се отделя чрез центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 7,5 %_мас, и след това са възможни вариантите: Вариант (а). Към 60 мл вода и 20 г диметилсулфоксид при стайна температура се прибавят 0,7 г Pemulen TR1, или Carbopol 2020 (BF Goodriah, UK), и се разбърква в продалжение на % - 8 часа. Прибавя се воден разтвор на триетаноламин до 0 pH 8,5. Гела се суспендира отново, като се добавя “течен екстракт от хлорини”, 7,5 % и вода, така че съдържанието на хлорин е₆ в готовия гел да е 1 %, и се вакуумира в продължение на 5 минути при 10 - 50 мм рт. ст. Добив - 100 г гел.

Вариант (г). Към 55 мл вода при стайна температура се прибавят 20 г диметилсулфоксид и “течен екстракт от хлорини”,

7.5 %, така че съдържанието на хлорин е₆ в готовия гел да е 1 %, а след това се прибавят 15 г Aculyn ЗЗА (ISP, USA). Разбърква се за до хомогенна смес, и се прибавя воден разтвор на основа до pH 8,5. Вакуумира се в продължение на 5 минути при 10 - 50 мм рт. ст. Добив - 100 г гел.

Пример 9. Частен случай за получаване на ФС ·' получаване на лекарствена форма “Радахлорин, разтвор в У диметилсулфоксид за външно прилагане”.

Вариант (а). След гел-филтруването в пример 4, към сместа се прибавя разреден разтвор на солна киселина до падане на утайка от ФС, тази утайка се отфилтрува, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на ФС

7,5 %_мас, и 14 г от получения “течен екстракт от хлорини” се прибавя към 86 г диметилсулфоксид при стайна температура, © така че съдържанието на хлорин е₆ в готовия разтвор да е 1 %, и се разбърква до хомогенна смес. Добив - 100 г разтвор.

Вариант (б). След гел-филтруването в пример 4, към сместа се прибавя разреден разтвор на солна киселина до падане на утайка от ФС, тази утайка се отфилтрува, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на ФС

7,5 %_мас, и 0,8 г от дадения “течен екстракт от хлорини” се прибавя към 99,2 г диметилсулфоксид при стайна температура, така че съдържанието на хлорин е₆ в готовия разтвор да е 0,05 %, и се Ф разбърква до хомогенна смес. Добив -100 г разтвор.

Пример 10.

За идентифициране на пурпурин 5 реакционната маса от пример 2 се подлага на гел-филтруване през колонка със Sephadex G10, елуира се с N-метил-О-глюкамин. Получават се 3 фракции, от които първата и втората съдържат пурпурин 5. Те се неутрализират, утайката се филтрува, разтваря се в хлороформ-метанол 1:1 и се естерифицира с диазометан. Промива се с вода, органичната фаза се отделя, суши се с безводен магнезиев сулфат, концентрира се посредством изпаряване във вакуум, и се хроматографира със силикагел Merck, Kieselgel,

0,04 - 0,063, събира се последната (най-малко подвижната) фракция. Полученият диметилов естер на пурпурин 5 (10,1 % ₄ изчислен спрямо суха реакционна маса, взета за естерифициране) при необходимост се хроматографира още веднъж.

ПМР спектър (фигура 15):на получения “течен екстракт от хлорини” (фигура 6): (ДМСО-De, конц. разтвор): 9,64, 9,46, 8,82, (с, мезо -Н), 8,06, (2д, СН=СН₂), 6,82 (с, γ- мезо - СНО), 6,34, 6,31, 6,19, 6,16 (2д, СН=СН₂), 4,54 (м, 7-Н), 4,46 (м, 8-Н), 3,61 (к, • 4-СН₂СН₃), 4,20, 3,81, 3,57, 3,53, 3,47 (5с, -СООСН₃ и ядрени СНз), 2,38, 2,35 (2м, 7-СН₂СН₂СООН), 2,68, 1,85 (2м, 7СН₂СН₂СООН), 1,73 (д, 8-СНз), -1,70 (т, 4-СН₂СН₃) м. д.

Мас-спектри (фигура 16): е. i., М⁺ (%), 594 (8,6), 566 (100,0), 505 (5,1), 491 (9,8), 475 (8,2), 463 (1,7), 447 (1,4), 433 (1,7), 403 (2,0), 262 (5,0).

Спектри на поглъщане във видимата област (фигура 17): λ (ε) (хлороформ), 408 (117200), 501 (11380), 542 (9830), 617 (6720), 668 (35200).

©Диметиловият естер на пурпурин 5 се разтваря в ацетон и се прибавя концентрирана солни киселина (37 %) в съотношение 1:2. Разбърква се в продължение на 2 часа при 25°С, неутрализира се, пурпурин 5 се филтрува, промива се с вода, разтваря се в 10 %-ен разтвор на N-метил-О-глюкамин, и се подлага на гел-филтруване през колонка със Sephadex G10, елуира се с 1 %-ен разтвор на N-метил-О-глюкамин, събира се втората фракция, неутрализира се, утайката се филтрува, промива се с вода, суши се над безводен фосфорен пентаоксид до постоянно тегло. Получава се пурпурин 5 (5,2 % изчислен спрямо сухата реакционна маса, взета за естерифициране).

ПМР спектър (фигура 12): (ДМС0-06, конц. разтвор): 9,55, 9,39, 8,79, (с, мезо -Н), 8,09, 8,04 7,97, 7,92 (2д, СН=СН₂), 6,84 (с, γ- мезо - СНО), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2д, СН=СН₂), 4,60 (м, 7 -Н), 4,45 (м, 8-Н), 3,55 (к, 4-СН₂СН₃), 3,75, 3,46, 3,23 (с, ядрени -СНз), 2,38, 2,32 (2м, 7-СН₂СН₂СООН), 2,71, 2,20 (2м, 7 - СН₂СН₂СООН), 1,76 (д, 8-СНз), 1,72 (т, 4-СН₂СН₃) м. д.

Мас-спектри (фигура 13): е. i., М⁺ (%),566 (8,2), 494 (100,0), 447 (9,1), 435 (49,6), 421 (12,7), 405 (6,6), 254 (7,1).

Спектри на поглъщане във видимата област (фигура 14):

• λ (ε) (етанол), 408 (116900), 501 (11320), 540 (9790), 615 (6710),

665 (35090).

Пример 11. Изследване на фармакокинетиката и метаболизма на субстанция “течен екстракт от хлорини” и на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”).

На мишки от линии Bulb/c се прилага интраперитонеално 769,2 мг/кг 6,5 % субстанция “течен екстракт от хлорини” от пример 2 (50 мг/кг изчислено спрямо безводната субстанция от хлорини). 3 часа след прилагането мишките се убиват (в групи от ф хо 3 мишки). Материали от черните дробове, бъбреците, слезката, белите дробове, тънките черва, туморите, тъканта около мускулите, а също така от кръвта, урината, фекали от дебелите черва, тежащи по 100 мг, се подлагат на добро хомогенизиране в стъклени хомогенизатори с прибавяне на 4 мл физиологичен разтвор. За изследване на биологична течност (кръв, урина), се взимат по 0,1 мл от всяка една, и след това се разтваря в 4 мл физиологичен разтвор. Получените хомогенати се изследват на спектрофотометър “Perkin-Emler” (модел MPF-44A).

По аналогичен начин се провежда изследването на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”), в хомогенати от органи и тъкани на мишки, при които препаратът се прилага интраперитонеално в доза 50 мг/кг, като животните се убиват 3 часа след прилагането.

В двата случая има преместване на максимума на интензивност на флуоресценцията в тъканите от черен дроб, от тънките черва, от слезката и от от бъбреците към 670 нм (с 10 - 12 нм в сравнение с 0,01 М разтвор на боратен буфер, pH 9,2 обогатен с 1 % човешки серум албумин), което свидетелства за метаболизма на “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) (фигура 5).

Това явление във флуоресцентните спектри изглежда поразлично, отколкото обикновенното разширение на спектъра и преместване в област с голяма дължина на вълната вседствие влиянието на хидрофобността на средата (например, след хидрофобно взаимодействие с белтъци, липопротеини). Преместването на максимума на интензивност се наблюдава без разширение, или с малко разширение на сектора, което е характерно за образуването на ново съединение. Флуоресцентните спектри на пурпурин 5 в 0,01 М разтвор на боратен буфер, pH 9,2 обогатен с 1 % човешки серум албумин се характеризира с наличие в тях на сектори 670 нм.

В кръвта, в пулмонарния паренхим, а също така в кожата и в тумора се наблюдава разширение на спектрите с 1,4 - 1,5 пъти с дължина на мълната 669 нм, което свидетелства за наличието на “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) (негов комплекс с белтъци) и метаболит в хомогената.

При прибавяне на “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) директно в пробата с хомогенати от тъкани на непокътнати животни в концентрация 0,5 - 1,0 μΜ, в кръвта, в тънките черва, в черния дроб, в слезката и в белите дробове се открива метаболит на“Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) (преместване в област с голяма дължина на вълната без разширение на спектъра), и само в хомогената на кожата се наблюдава незначително увеличение на половината ширина на спектъра с 1,15 пъти, което свидетелства за присъствието на смеси “Фотохлорин” - метаболит в пробата.

При повишаване концентрацията на Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) до 5 - 10 μΜ в хомогената от органи, практически във всички проби се отбелязва наличие на смеси от хлорин е₆ - пурпурин 5 преместване в област с голяма дължина на вълната при увеличаване половината ширина на спектърите с 1,15 - 1,05 пъти).

По такъв начин, може да се смята, че образуването на метаболит при прибавянето на “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране) (“Фотохлорин”) в хомогенатити, зависи от концентрацията на препарата и от активността на ензимите в хомогенатите от тъкани.

Данните от експеримента ясно показват за превръщането на хлорин e_s в пурпурин 5 в условията in vivo и ex vivo. Това превръщане е подобно на превръщането на хлорин е₆ в пурпурин 5 при нагряване.

Пример 12. Коефициент на разпределение на н-октанол/фосфатен буфер, pH 7,4.

300 мл н-октанол и 300 мл фосфатен буфер, pH 7,4, се размесват във вортекс апарат в продължение на 20 с, и за разделяне се центрофугират в продължение на 10 минути при 10000 об/мин. Към приготвения по такъв начин буферен разтвор (2 мл) и н-октан (8 мл) се разтваря аликвотна част ФС в обем 0,1 мл с концентрация на ФС 5 мг/мл, и се определя максимума на поглъщане при дължина на вълната 406 нм.

© Получават се величините D°_k и D⁶ _k, където о - н-октанол, б - фосфатен буфер, к - контрола. Равновесното разпределение на н-октанол/фосфатен буфер се получава, като при 20°С се размесват във вортекс апарат 2 мл фосфатен буфер и 8 мл н-октанол с 0,1 мл ФС в продължение на 20 секунди, и след това се центрофугират в продължение на 10 мин при 10000 об/мин. Като се измерва оптическата плътност на всяка една от фазите при 406 нм, се получават стойностите на величините D⁰ и D⁶, където о - н-октанол, б - фосфатен буфер.

®К_Р се определя по формулата:

Кр = (D° V° D°_k V°_k) I (D⁶ V⁶ D⁶k Ά), където V° е обема на октанола, взет за определяне на равновесното разпределение (8 мл), V°k е обема на октанола, наситен с вода, взет за контролното определяне на аликвотното поглъщане (8 мл), V⁶ е обема на буфера, взет за определяне на равновесното разпределение (2 мл), V⁶k е обема на буфера, наситен с октанол, взет за контролното определяне на аликвотното поглъщане (2 мл). Експеримента се провежда в 3 повторения, и получените стойности за К_р се усредняват.

Получава се 1,4 ± 0,3.

Пример 13. Определяне на фотоцитотоксичността (биологичната активност) и цитотоксичността (клетъчна токсичност) in vitro на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”).

За това изследване се използва ламинар на фирмата “Flow Lab” (UK), СО₂-инкубатор “Flow Lab” (UK), мултискан “Bio - Tek Instruments” (USA), среди и серуми от фирмата “ПанЗко” (Россия).

За един експеримент клетки от една линия се пасират в две © 48-клетъчни блюда: едно за облъчване с лазер и едно за “тъмен експеримент. На следващия ден препарата се прибавя към клетките в слято състояние, и след това блюдата се термостатират в черна хартия. Изследват се концентрациите на препарата 0,1, 0,5, 2,0 и 5,0 μΜ. 3 часа след прибавянето на препарата клетките се облъчват с лазер, при което експозиционната доза на облъчване е 50 Дж/см², и 39 часа след това се провежда МТТ-тест и инкубиране с ¹⁴С-тимидин, за да се оцени синтезирането на ДНК (и в “тъмните” блюда също). Във всички ©случаи горната част на блюдото се използва за МТТ-тест, а долната за измерване синтезирането на ДНК, а също така и броя на клетките след тяхното оцветяване с кристал-виолет.

Резултатите, показани в таблица 2 са усреднени за 4-те успоредни експерименти.

Пример 14. Изследване на токсичните свойства на субстанция “течен екстракт от хлорини” и на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”) in vivo.

Токсичността се изследва при интравенозно прилагане на

ФС върху лабораторни бели мишки с тегло 19-21 г (развъдник

Российской Академии Медицинских Наук, отделение Крюково). Животните се държат при стандартни условия във вивариума и храненето се провежда съгласно Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.83 година Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторнь1Х животнь1Х в учреждениях здравоохранения”.

Токсичността се определя спрямо гибелта на животните, след изчисляване на средната доза на смъртност - LD₅o- Изчисляването се прави чрез статистическите методи, съгласно Государственной Фармакопеей XI издание (1,3). Въз основа на LD₅₀ се определя принадлежността на изследваното вещество към определен клас токсичност по Hodge и Sterner. Също така се провежда регистиране на реакциите на интоксикация в хода на експеримента.

За експеримент се избират 12 броя мишки (6 мъжки и 6 женски), за всяка изпитвана доза ФС. За определяне на LD₅₀ на ФС се изследват дозите: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 мг/кг. Разтвори с концентрация 5 мг/мл ФС се прилагат интравенозно, като дозите варират в зависимост от приложените обеми ФС.

Получава се стойност за LD5o21O,53±22,2 мг/кг, LD₁₀e 169,87 мг/кг.

Пример 15. Биологична активност in vivo с използване на лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”)

Изследването на фотодинамичната активност на лекарствената форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин) се провежда с мишики от линия Balb/c с ембриокарцином Т36 инокулиран в мускула на задната лапа.

Теглото на мишките е 20 - 21 г. Процедурата на обрлъчване се осъществява с диоден лазер МЛ-662-СП 2 седмици след инокулирането на тумора. Преди започване на облъчването кожата в областта на облъчване се депилира.

Препарата се прилага интраперитонеално в доза 40 мг/кг тегло, което съответства на достатъчна терапевтична доза. За провеждане на процедурата на облъчване мишките се поставят под етерна наркоза. Теглата на туморите в контролната и в експерименталната група по време на експеримента варират от 0,9 до 1 грам. Облъчването се провежда 5-6 часа след прилагането на ФС. Всяко животно, с изключение на контролните, се подлага на еднократна процедура на облъчване, след това се провежда наблюдение в продължение на един месец след процедурата, регистрират се площта на некроза на тумора и общото физиологично състояние.

Средната плътност на експозиционната доза на облъчване е 150, или 300 Дж/см².

Най-добрите резултати под формата на пълна некроза на тумора, образуване на коричка 1 седмица след ФДТ и падането ύ

1,5 месец след ФДТ се наблюдават в групата, получила светлинната доза 300 Дж/см².

Пример 16. Лечение на базално-клетъчен рак на кожата, използвайки лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор за инжектиране”) (“Фотохлорин”).

Диагнозата: базално-клетъчен рак на кожата се установява при цитологичното изследване на остъргано парченце.

Препарата се прилага интравенозно на капка, като се пресмята за концентрация 0,7 мг/кг тегло на болния след разреждането му в 100 мл 0,9 % стерилен физиологичен разтвор с

NaCI. След 2-3 часа без анестезия се провежда облъчване на тумора с диоден лазер МЛ-662-СП с дължина на вълната 662 нм с повърхностна доза 50 Дж/см². По време на прилагането на препарата и на облъчването с лазер не се отбелязват никакви нежелателни странични реакции. 2 часа след облъчването на мястото на тумора се наблюдава тъмно кафяво огнище с червеникава зона на кожата до 1 - 2 см около него. Към края на първото денонощие на мястото на тумора се образува некроза под формата на суха коричка с тъмно кафяв цвят (струпей). След Ф 2-3 седмици струпеят се отделя, и 2 седмици след отделянето на струпея, на мястото на бившата базолиома става пълно епителизиране на увреждането на кожата на мястото на тумора с добър козметичен ефект.

Пример 17. Лечение на базалноклетъчен рак на кожата, използвайки лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен гел”.

Диагнозата: базално-клетъчен рак на кожата се установява при цитологичното изследване на остъргано парченце.

Гелът се прилага на тънак слой върху тумора, по възможФ ност без да се засегне здравата част на кожата. Облъчването се провежда 20 - 40 минути след прилагането на гела. Процедурата на облъчване се осъществява с диоден лазер ML-662-SP (произведен от “Милон-СигмПлюс”, Россия) с дължина на вълната 662 нм. Плътността на експозиционната доза на облъчване е 2500 Дж/см². 2 часа след облъчването на мястото на тумора се наблюдава тъмно кафяво огнище с червеникава зона на кожата до 1 - 2 см около него. След една седмица на мястото на тумора се образува некроза под формата на суха коричка с тъмно кафяв цвят (струпей). След 2 седмици струпеят се отделя, и 2 седмици след отделянето на струпея, на мястото на бившата базолиома става пълно епителизиране на увреждането на кожата на мястото на тумора с добър козметичен ефект.

Пример 18. Отстраняване на татуировка, използвайки лекарствена форма “Радахлорин, 0,5 %-ен разтвор в диметилсулфоксид за външно приложение”).

Разтвора се нанася върху салфетка и тя се поставя върху татуировката, покрива се с черна хартия, или с тънко алуминиево фолио, и се фиксира в продължение на 30 минути. Излишния разтвор се отстранява от повърхността с памук, намокрен с алкохол. Процедурата на облъчване се осъществява с диоден лазер ML-662-SP (произведен от “Милон-СигмПлюс”, Россия) с дължина на вълната 662 нм, като облъчването се провежда, като се следва линията на рисунъка, и се внимава да не се засегне тъканта наоколо. Плътността на експозиционната доза на облъчване е 120 Дж/см². 1 часа след облъчването на мястото на рисунъка се наблюдава почервеняване и подпухване. В края на 2-то денонощие се образува “рисунък” с тъмно кафяв цвят и с червеникава зона на кожата до 1 мм около него. След 2 седмици на мястото на рисунъка се образува некроза под формата на суха коричка с тъмно кафяв цвят. След 2 седмици настъпва отлепване на коричката заедно с рисунката на татуировката. При по-малка светлинна доза процедурата протича без некроза, с обезцветяване на багрилото, но в този случай са необходими повторения на сеанса. В резултат на ФДТ, след 6 седмици на мястото на татуировката се наблюдава образуването на нежнорозова тъкан, която слабо се отличава от околната кожа, с добър козметичен ефект.

Claims (8)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Фотосенсибилизатор, съдържащ хлорин във вид на сол с алкален метал, характеризиращ се с това, че в качеството на хлорин се взима хлорин е₆₁ (13-карбокси-17-[2-карбоксиетил]-15карбоксиметил-17,18-транс-дихид ро-3-винил-8-етил-2,7,12,18тетрамети л порфири н) в количество 80 - 90 %, пурпурин 5 (13-карбокси-17-[2-карбоксиетил]-15-формил-17,18-транс-д ихидро-3-винил-8-етил-2,7,12,18© тетраметилпорфирин) ноос в количество 5-20 %, а така също пурпурин 18 - хлорин р₆ (13карбокси-17-[2-карбоксиетил]-15-карбокси-17,18-транс-дихидро-

   3-винил-8-етил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин), (Hi) който е останалата част, така че посочените съставни части образуват състава.
2. 2. Фотосенсибилизатор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че алкалният метал е натрий.
3. 3. Фотосенсибилизатор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че алкалният метал е калий.

   ©
4. 4. Метод за получаване на фотосенсибилизатор, съгласно който на биомаса от Spirulina се действа с ацетон до пълно извличане на хлорофил а, отфилтруване, или центрофугиране на биомасата, третиране на екстракта с киселина, за да се отдели от молекулите на хлорофила магнезиевия йон, и хидролиза на фитиловата естерна група, и взаимодействие на полученото производно на феофорбид а със силна минерална основа, характеризиращ се с това, че след третирането на екстракта с киселина за отстраняване на магнезиевия йон от молекулите на хлорофила, екстракта се неутрализира и утаения феофитин а се отфилтрува, след това феофитин а се хидролизира в смес от солна киселина-ацетон-хексан, при което на всеки 1 г непречистен феофитин а се изискват 6 - 16 мл ацетон, 0,6 - 6 мл хексан и 5 - 10 мл концентрирана солна киселина, сместа се нагрява до температура 40 - 60°С, и се разбърква в продължение на 20 минути - 1 час, след това се прибавя хексан 6 - 16 мл, и органичната фаза се промива със смес от ацетон и концентрирана солна киселина (2 - 10) : 1, а водната фаза се промива с хексан, след което водната фаза, съдржаща феофорбид а се неутрализира с излишек от воден разтвор на натриев цитрат (три-, дву-, или монозаместен), утаеният феофорбид а се отделя чрез отфилтруване, промива се с вода, прекристализира се из смес ацетон-вода, суши се във въздух до постоянно тегло, след това феофорбид а се разтваря в ацетон, прибавя се силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация 0,05 - 1,00 %, след което се разбърква при 30 - 60°С в продължение на 5 - 30 минути, прибавя се допълнително количество силна минерална основа във вид на воден разтвор с концентрация 1 - 50 %, нагрява се при 40 - 60°С в продължение на 20 - 90 минути, сместа се неутрализира с разредена солна киселина, утаеният хлорин е₆ се отделя посредством центрофугиране, промива се с дестилирана вода до изчезване на киселата реакция, получава се 55 % - 80 % хлорин ее, хлорин е₆ се прекристализира из ацетон, за да се отделят линейните тетрапироли, отфилтрува се хлорин е₆ и се промива с дестилирана вода, хлорин е₆ се нагрява в херметично затворен съд при температура в интервал 40 - 100°С в продължение на 1 час - 30 денонощия, охлажда се, и се прибавя разтвор на силна основа до pH 7,5 - 8,5, след това разтвора се калибрира с безпирогенна вода за инжектиране до концентрация на фотосенсибилизатора 6,5-7,5 %_масс.
5. 5. Метод за получаване на фотосенсибилизатор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че след като се прибави разтвора на силната основа до pH 7,5 - 8,5, сместа се подлага на гел-филтруване, до съдържание на хлорин е₆ - 80 - 90 %, на пурпурин 5-5-20 %, и на пурпурен 18 - останалата част, след това се прибавя разреден разтвор на солна киселина до утаяване на фотосенсибилизатора, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора © 6,5 - 7,5 %_масс, и се получава “течен екстракт от хлорини”.
6. 6. Метод за получаване на фотосенсибилизатор съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че след гел-филтруването към разтвора на фотосенсибилизатора се прибавя разреден разтвор на солна киселина до утаяване на фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или чрез центрофугиране, прибавят се разрешените от Государственной Фармакопеей РФ добавки до pH 7,5 - 8,5 и безпирогенна вода за инжектиране, до съдържание на фотосенсибилизатора 0,1-1 %масс, и се филтрува за отстраняване на © бактерии.
7. 7. Метод за получаване на фотосенсибилизатор съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че след гел-филтруването към сместа се прибавя разреден разтвор на солна киселина до утаяване на фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или чрез центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 - 7,5 %_масс, диспергира се “течния екстракт от хлорини” в гел субстрат в съотношение: 0,5-12 %_масс “течен екстракт от хлорини”, 5-20 %_масс диметилсулфоксид, а останалата час - вода, фармакологично приемливи добавки и гел субстрат.
8. 8. Метод за получаване на фотосенсибилизатор съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че след гел-филтруването към сместа се прибавя разреден разтвор на солна киселина до утаяване на фотосенсибилизатора, тази утайка се отделя чрез филтруване, или чрез центрофугиране, калибрира се с безпирогенна вода за инжектиране до съдържание на фотосенсибилизатора 6,5 - 7,5 %масс> “течния екстракт от хлорини” се разтваря в диметилсулфоксид в съотношение: 0,5 - 12 %_маСс “течен екстракт от хлорини”, а останалата част е диметилсулфоксид.