CN103003282B

CN103003282B - 一种制备新的卟啉衍生物的方法及其作为pdt试剂和荧光探针的用途

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Publication number: CN103003282B
Application number: CN201180006844.1A
Authority: CN
Inventors: D·拉迈亚; S·C·卡鲁纳卡兰; J·S·瓦达坎彻里尔; C·K·塔瓦雷克尔; S·阿拉加; M·R·皮莱; S·A·奈尔; S·B·P·萨拉斯; M·C·拉奥; K·S·拉奥
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2031-01-21
Also published as: US9040687B2; JP2013518042A; JP5823413B2; CN103003282A; EP2526103A1; US20120308485A1; EP2526103B1; WO2011089509A1

Abstract

本发明提供了由通式I表示的作为NIR敏化剂用于光动力治疗和诊断，生物和工业应用的新的卟啉衍生物和/或其药学上可接受的衍生物。这些卟啉衍生物在生物发色团没有吸收的区域具有吸收(400-700nm)和发射(600-750nm)，且因此可用作理想的用于生物学中医学应用的NIR？PDT试剂和荧光传感器的候选物。这些染料上的取代基例如羟基和乙醇基单元使得其具有两亲性因此提高了其在水性介质中的溶解度以及细胞吸收和定位。这些染料在黑暗中无毒而且对肿瘤细胞显示了高度选择性以及对细胞核染色非常迅速。因此，这些卟啉衍生物在光动力治疗和诊断，生物和工业应用中作为NIR？PDT荧光传感器非常有用。

Description

一种制备新的卟啉衍生物的方法及其作为PDT试剂和荧光探针的用途

技术领域

本发明涉及卟啉衍生物，其用作在光动力治疗、诊断、和生物学、生物化学和工业应用中的PDT试剂和近红外(NIR)荧光探针。更具体地，本发明也涉及一种制备通式1的卟啉衍生物的方法和其在光动力应用中用作近红外荧光探针用于人或动物中的癌症和其他疾病的检测。

背景技术

光动力学疗法(PDT)是一种快速发展的用于诊断和治疗肿瘤和非肿瘤疾病的方式，而且其涉及通过光敏剂(photosensitizingagent)、光和氧的相互作用的光化学反应的应用来治疗恶性或良性疾病。PDT有两个步骤的过程。在第一个步骤，光敏剂通过多个途径之一(例如，局部、口服、静脉内)给药患者，而且可被靶细胞吸收。第二个步骤涉及在氧的存在下，具体波长的光直接作用于靶组织活化光敏剂。由于光敏剂首选通过过度增殖组织吸收而且光源直接作用于病变组织，PDT可同时实现选择性和对邻近健康结构最小损害。参考文献可见例如Lane，N.ScientificAmerican2003，38，45；Bonnett，R.Chem.Soc.Rev.1995，24，19；Dougherty，T.J.Photochem.Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.；Dougherty，T.J.PhorphyrinPhotosensitization；PlenumPublishingCorp.NewYork，1983；Bissonette，R.；Bergeron，A.；Liu，Y.d.JDrugs.Dermatol.2004，3，26-31；Jeffes，E.W.；McCullough，J.L.；Weinstein，G.D.；Fergin，P.E.；Nelson，J.S.；Shull，T.F.Arch.Dermatol，1997，133，727-732。该方法要求在光敏剂的存在下，使其能够被靶组织吸收，而且通过特定波长的光辐射，产生对那些组织有毒性的高反应物质(reactivespecies)。光动力学疗法由于光动力方法的选择性，相对于许多其他常规疗法具有优势。在肿瘤组织中相对于正常组织中更敏感；这减少了对正常组织破坏的可能性。此外，通过使用光导纤维技术指导光特别作用于靶细胞和组织的能力进一步增加了该方法的选择性。而且，光敏剂的使用(直到用光辐射不产生响应)显著降低了副作用的可能性。参考文献可见如Jeffes，E.W.；McCullough，J.L.；Weinstein，G.D.；Kaplan，R.；Glazer，S.D.；Taylor，J.R.J.Am.Acad.Dermatol，2001，45，96-104；Kurwa，H.A.；Yong-Gee，S.A.；Seed，P.T.；Markey，A.C.；Barlow，R.J.J.Am.Acad.Dermatol，1999，41，414-8；Pariser，D.M.；Lowe，N.J.；Stewart，D.M，；Jarratt，M.T.；Lucky，A.W.；Pariser，R.J.J.Am.Acad.Dermatol，2003，48，227-32。

在PDT中，对肿瘤组织的探测(诊断)当与通过肿瘤细胞凋亡或坏死的破坏(治疗)相比较时同等重要。近红外(NIR)染料作为探测癌症的荧光探针最近引起了很多兴趣。参考文献可见例如Lin，Y.；Weissleder，R.；andTung，C.H.BioconjugateChem.200213，605-610；Achilefu，S.；Jimenez，H.N.；Dorshow，R.B.；Bugaj，J.E.；Webb，E.G.；Wilhelm，R.R.；Rajagopalan，R.；Johler，J.；Erion，J.L.J.Med.Chem.200245，2003-2015；Mujumdar，S.R.；Mujumdar，R.B.；Grant，C.M.；Waggoner，A.S.BioconjugateChem.1996，7，356-362。由于组织对NIR光是相对可透过的，近红外荧光成像(NIRF)和PDT能够分别探测和治疗甚至皮下肿瘤。在该背景下，本发明目的旨在开发用于生物学应用的基于卟啉的有效NIR吸收荧光探针。我们已合成出在NIR区域显示出吸收和发射的基于卟啉的分子且其具有取代基如羟基和乙醇基(glycolicgroup)，使得其具有两亲性因此提高了其溶解度、荧光强度和增强了其细胞摄取。

在诊断技术中，给药染料且在治疗技术的情况下使其分布于体内。然而，除了肿瘤选择性，在生理环境下，诊断技术中的敏化剂应当显示出显著的荧光产率。因此开发在长波区域具有强吸收、对正常组织无毒、在生理pH的缓冲剂中可溶而且显示高治疗效率的光敏剂仍然是期望的。而且可以靶向具体癌症细胞的功能分子设计是非常重要的，其原因在于其生物化学和生物医学应用。

卟啉分子是目前研究的光敏化剂中的一种。卟啉是一种具有环状四吡咯母核的大环化合物。参考文献可见例如Mahler，H.R.；Cordes，E.H.BiologicalChemistry，2ded.1966，418；Jori，G.；RReddi，E.IntJBiochem，1993，25，1369-75。Wiehe，A.；Shaker，Y.M.；Brandt，J.C.；Mebs，S.；Senge，M.O.Tetrahedron，2005，61，5535-5564；和Pushpan，S.K.；Venkatraman，S.；Anand，V.G.；Sankar，J.；Parameswaran.D.；Ganesan，S.；Chandrashekar，T.K.Curr.Med.Chem.-AnticancerAgents，2002，2.187-207。就其本身，卟啉通常被发现以双阴离子形式络合至金属离子上。四吡咯母核的独特性质赋予卟啉在许多生物系统中处于中心地位，其在许多生命过程中扮演了一个关键的角色。一些化合物对于基本生物学过程是非常重要的，例如叶绿素和血红素，其来源于卟啉核与金属离子的配位(coordination)。卟啉能与许多种金属离子，包括：钴、铜、铁、镁、镍、银和锌形成金属螫合物。血红素是一种卟啉的铁螯合物，而叶绿素和细菌叶绿素是镁螯合物。这些卟啉通常可从前体甘氨酸和丁二酰CoA合成得到。参考文献可见例如L.Stryer，Biochemistry，2nded.504-507(1981)。其进一步被证实亲水或亲油光敏剂强烈影响了光敏剂结合至靶细胞，而且因此影响其细胞毒性活性。参考文献可见例如Merchatetal.，J.Photochem.Photobiol.B：Biol，35：149-157(1996)。现今已知的基于卟啉的光敏剂包括血卟啉衍生物(HpD)以及被称为第一代光敏剂的光敏素(photofrin)。HpD面临的主要的缺陷包括(a)它是至少九种组分的混合物，(b)制备对于反应条件高度敏感以及(c)导致皮肤光过敏。其它的基于卟啉的光敏剂是5，10，15，20-四(间羟基苯基)-二氢卟吩，商业名为foscan。它们现在的合成方法和其用途的已知技术对于很多预期应用是不合适的。参考文献可见Konan，Y.N.；Cerny，R.；Favet，J.；Berton，M.；Gurny，R.；Alleman，E.Eur.J.PHarm.Biopharm.2003，55，115-124；和Nawalany，K.；Rusin，A.；Kepczynki，M.；Mikhailov，A.；Kramer-Marck，G.；Snictura，M.；Poltowicz，J.；Krawcyzk，Z.；Nowakowska，M.J.photochem.Photobiol.B；Biology，2009，97，8-17。这是真实的，部分由于需要高浓度的试剂和需要延长辐射周期。这些因素导致该方法是繁琐的和不便利的。另外，这种条件对于很多医疗和/或工业应用是不合适的。因此存在着用于医疗或其他应用的新的光敏剂的需求。提供一种利用一种钝化或杀死非突变的有机体的途径的试剂是本领域的改进。最后，提供一种能够在低浓度和超过目前本领域已知的和教导的短期内有效作用的光敏剂将是另外的改进。

在本领域我们的兴趣来自于利用现有存在的卟啉衍生物的衍生物用于光动力应用。最近，开发了许多用于PDT的非卟啉敏化剂。亚甲基蓝，一种红光吸收吩噻嗪(phenothiaxinium)染料，过去已广泛用作生物染色检测，以及可用作对许多疾病的临床检测以及作为外科肿瘤标志物。然而，由于被普遍存在的细胞酶削减为无光动力活性的无色形式，其作为体内光敏剂受到限制。罗丹明是一种重要的激光染料，现在其用作红光发射激光染料已经很久。由于线粒体对其独特的摄取以及其作为生化荧光探针，罗丹明系列的分子可用作治疗恶性肿瘤的敏化剂。但是在另一方面，容易获得的商用染料-罗丹明123由于其高的荧光量子产率，是一种弱的光毒素，这导致了较低的三线态量子产率。参考文献可见例如Yamamoto，H.；Okunaka，T.；Furukawa，K.；Hiyoshi，T.；Konaka，C.；Kato，H.Curr.Sci，1999，77，894；Sharman，W.M.；Allen，C.M.；vanLier，J.E.；DrugDiscoveryToday，1999，4，507；Milgrom，L.；MacRobert，S；Chem.Britain，1998，45；Bonnett，R.Chem.Soc.Rev，1995，24，19.Dolphin，D.Can.J.Chem，1994，72，1005。

另一种在我们小组中用于PDT开发的分子是方酸内鎓盐(squaraine)。方酸内鎓盐是一种具有在近红外区域具有尖锐和强烈吸收和存在显著三线态量子产率的染料。在已开发的多种方酸内鎓盐染料之中，通过体内或体外实验，发现双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)方酸内鎓盐可作为潜在的光敏剂，其具有临床应用。该染料被发现可在PDT中作为有效的NIR光敏剂的有希望的化合物。参考文献可见例如美国专利6770,787B2；Ramaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekar，N.；Eldho，N.V.；Das，S.；George，M.V；Photochem.Photobio，1997，65，783-790；Ramaiah，D.；Eckert，I.；Arun，K.T.；Weidenfeller，L.；Epe，B.Photochem.Photobiol，2002，76，672-677。

虽然已有多种非卟啉光敏剂可用，但自然存在的染料例如卟啉可作为PDT的药物选择的事实依然驱使着对基于卟啉大环的更好的光敏剂的研究。这些四吡咯环形成了在可见至近红外区域具有尖锐和强烈吸收带的一类染料。由于其吸收和光化学性质使得它们高度适合用于很多生物学和工业应用，其光物理和光化学性质已经被广泛研究。参考文献可见例如美国专利4,649,151；R.Bonnet，R.D.White，U.J.Winfield，M.C.Berenbaum.Biochem.J.，1989，261，277-280；D.Kessel.Photochem.Photobiol，1984，39，851-859。

本专利申请中请求保护的新的通式1的卟啉衍生物是四苯基卟啉衍生物。我们的初步研究显示对卟啉中间苯基环的多个羟基取代使得相当相较于目前存在的卟啉，增加了在水性介质中的溶解度和提高了系统间穿越效率。当相较于其他不溶于水的卟啉时，本发明请求保护的衍生物显示出高水溶性。

而且，在卟啉大环中插入例如锌的重金属也导致增加系间(intersystem)穿越效率以及因此高单线态氧产生效率(generationefficiency)。这些染料显示出在400-700nm范围的吸收以及600-800nm范围的荧光发射。这些染料具有0.15-0.23范围内几乎好的荧光量子产率。而且这些卟啉衍生物的三线态激发态(Φ_T)的量子产率在0.60-0.75范围内，和单线态氧(Φ_D(¹O₂))的量子产率在0.40-0.75范围内，其依赖于中间苯环的取代基的存在以及插入的金属。对使用哺乳动物细胞系和菌株的这些卟啉衍生物细胞毒性、诱变性、摄取和释放动力学和细胞内定位研究表明这些染料在可见光激发下显示出显著的细胞毒性，而且其生物活性的机理可归因于单线态氧的体外产生。

对合成的卟啉衍生物的细胞定位研究显示它们在可见光激发期间优选积聚在具有红色荧光的细胞核。因此这些衍生物可用于用作核染色的NIR荧光探针。大多数已报道的卟啉例如二氢卟吩e6和血卟啉衍生物主要定位在质膜，然而，我们的定位于细胞核的光敏剂将在产生光动力损伤上更有效。

对本发明的卟啉衍生物细胞摄取研究显示它们远更有效。本发明的新的卟啉衍生物显示最大细胞摄取在10分钟之内，这可通过如图10所示的荧光显微镜图片确认，而光敏素R(PhtofrinR)的细胞摄取最大仅在4小时之内。

而且本研究也显示了卟啉衍生物对于蛋白质，例如血清蛋白具有结合亲和力，因此可用作蛋白标记的NIR荧光探针。

在本发明中，我们已合成了新的卟啉衍生物而且显示其作为用于生物学和生物化学应用的NIRPDT试剂和荧光探针的可能性。

发明目的

本发明的主要目的是提供卟啉衍生物在光动力治疗、诊断、和生物学、生物化学和工业应用中用作PDT试剂和近红外(NIR)荧光探针。

本发明的另一个目的是提供卟啉衍生物和或其药学上可接受的衍生物，在检测肿瘤的光动力诊断应用中用作NIR荧光探针。

本发明的另一个目的是提供卟啉衍生物和或其药学上可接受的衍生物，用作生物学、生物化学和工业应用的近红外荧光传感器。

而本发明的另一个目的是提供可用作蛋白标记中的NIR荧光探针的卟啉衍生物。

而本发明的另一个目的是提供可用作核染色中的NIR荧光探针的卟啉衍生物。

而本发明的另一个目的是提供在免疫测定中用作NIR荧光标记的通式1的卟啉衍生物。

附图说明

在说明书附图中：

图1通式1的卟啉衍生物(其中R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)在水中的吸收光谱。

图2通式1的卟啉染料(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)在水中的荧光发射光谱。

图3通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝Zn)在水中的吸收光谱。

图4通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝Zn)在水中的荧光发射光谱。

图5通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)在甲醇中的三线态吸收光谱。激光激发波长，532nm。插页显示在甲醇中在氧的存在和不存在下在440nm通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)瞬变衰减(transientdecay)特征。

图6(a)矩形图显示所研究的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)在口腔癌细胞(SCC131)的细胞毒性。图显示在用各种浓度研究的通式1的卟啉衍生物治疗48小时后人的口腔癌细胞(SCC131)的细胞增生，其中使用或不使用来自钠蒸汽灯的辐射(50J/cm²590nm)。(b)各种浓度的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)的口腔癌细胞(SCC131)％生长抑制图。％生长抑制数据是在钠蒸汽灯的可见光(50J/cm²590nm)用各种浓度的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)治疗48小时后给出。

图7(a)矩形图显示所研究通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)在哺乳动物乳腺癌细胞中(MDAMB)的细胞毒性。图显示在用各种浓度的通式1的卟啉衍生物治疗48小时后哺乳动物乳腺癌细胞(MDAMB)的细胞增生，其中使用或不使用来自钠蒸气灯的可见光辐射(50J/cm²590nm)。(b)各种浓度的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)的哺乳动物乳腺癌细胞中(MDAMB)生长抑制图。％生长抑制数据是在钠蒸汽灯的可见光(50J/cm²590nm)用各种浓度的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)治疗48小时后给出。

图8矩形图显示通过FACS分析，通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)作用的口腔癌细胞(SCC131)的细胞死亡的机理。细胞凋亡种群(P3)显示出在FACS直方图中对细胞计数vs.FITC染色的右移。

图9经所研究的通式1的卟啉衍生物(其中R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)培育的哺乳动物乳腺癌细胞(MDAMB231)的荧光显微图片显示，在很短的时间内，在此为1小时内，通式1的卟啉衍生物(其中R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)被癌细胞摄取。合并的照片证明细胞内有药物的存在。

图10通式1的卟啉衍生物(其中R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)的口腔癌细胞(SCC131)在每5分钟间隔的不同时间的荧光显微图片显示，在很短的时间内，在此为10分钟内，通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)被癌细胞摄取。

图11哺乳动物乳腺癌细胞(MDAMB231)的核染色，(a)用研究的通式1的卟啉衍生物(其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H)培育后，(b)用Hoechst(一种商用核染料)培育后以及(c)显示了a和b的合并图片。

发明概述

因此，本发明涉及在光动力治疗、诊断、和生物学、生物化学和工业应用中用作PDT试剂和近红外(NIR)荧光探针的卟啉衍生物。

在本发明的一个具体实施方式中，通式1的卟啉衍生物，

其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝2H

其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝H；M＝Zn，Co，Cu，Fe，Au

其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝I；M＝2H

其中，R₁，R₃，R₅＝OH；R₂，R₄＝I；M＝Zn，Co，Cu，Fe，Au

其中，R₁，R₂，R₄，R₅＝H；R₃＝(OCH₂CH₂)_nOH(其中n＝3-7)；M＝2H

其中，R₁，R₂，R₄，R₅＝H；R₃＝(OCH₂CH₂)_nOH(其中n＝3-7)；M＝Zn，Co，Cu，Fe，Au。

在本发明的另一个实施方式中，一种通式1的卟啉衍生物的制备方法，其中所述方法包括：

a.将2，4，6-三甲氧基或4-(三甘醇)取代的苯甲醛与吡咯以1∶25mmol比例混合，然后惰性气氛和避光(lightprotection)下在25-30℃下搅拌15-20分钟；

b.逐滴加入三氟乙酸至步骤(a)获得的反应混合物中，然后再搅拌20-30分钟；

c.通过加入溶剂淬灭步骤(b)获得的混合物；

d.使用氢氧化钠溶液中和步骤(c)获得的反应混合物中过量的三氟乙酸；

e.从步骤(d)获得的反应混合物中分离有机层，然后用水洗涤以及用无水硫酸钠干燥以获得无水有机层；

f.减压下浓缩步骤(e)获得的有机层以获得粘稠物质；

g.在硅胶上用乙酸乙酯和己烷(2∶8)的混合物对步骤(f)获得的粘稠物质进行色谱，以获得2，4，6-三甲氧基或4-(三甘醇)取代的苯基二吡咯甲烷(phenyldipyrromethane)；

h.将步骤(g)获得的取代的苯基二吡咯甲烷溶于2，4，6-三甲氧基或4-(三甘醇)取代的苯甲醛的溶剂中；

i.缓慢加入三氟乙酸至步骤(h)获得的混合物中，然后在25-30℃温度下搅拌；

j.加入2，3-二氯-5，6-二氰基苯醌(DDQ)至步骤(i)获得的混合物中，然后在25-30℃温度下搅拌1-3小时的时间段；

k.将步骤(j)获得的反应混合物倾入至氧化铝垫上并用溶剂洗脱，然后减压下除去溶剂以获得黑色固体；

l.在硅胶上用二氯甲烷对步骤(k)获得的黑色固体进行色谱，以获得卟啉衍生物。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(c)，(h)和(k)中使用的溶剂选自由二氯甲烷和氯仿组成的组。

在本发明的另一个实施方式中，卟啉衍生物用作光动力、诊断、生物学和工业应用的近红外荧光传感器。

在本发明的另一个实施方式中，卟啉衍生物用于在检测人或动物中的癌症和其它疾病的光动力应用中用作NIR荧光探针。

在本发明的另一个实施方式中，卟啉衍生物用于例如在可见光辐射下的蛋白标记和核染色的生物学应用中用作近红外荧光探针。

在本发明的另一个实施方式中，卟啉衍生物用于在可见光辐射下的免疫测试中用作NIR荧光标记。

在本发明的另一个实施方式中，卟啉衍生物用于无害辐射。

发明详述

在本发明中，已经合成出通式1的卟啉衍生物。使用二醇部分修饰预期会导致这些染料具有两亲性，以及因此增加了细胞渗透性和带来实施例1-4表示的典型合成的通式1化合物和实施例5-7表示的在体外评估的通式1的卟啉衍生物的靶向特异性，其中R₁＝R₂＝R₃＝OH,M＝2H，用于使用哺乳动物癌细胞的光动力学疗法。

以下实施例以说明方式给出，因此其不应当被认为是对本发明范围的限制。

实施例1

制备通式1的卟啉衍生物,其中R₁＝R₃＝R₅＝OH,R₂＝R₄＝H,M＝2H。2,4,6-三甲氧基苯甲醛(5.1mmol)加入到蒸馏的吡咯(127mmol)中，且在氩气氛和避光下搅拌15分钟。三氟乙酸(0.5mmol)逐滴加入至反应混合物中并再次搅拌20分钟)。加入二氯甲烷(25mL)淬灭反应和用氢氧化钠溶液中和过量的三氟乙酸。分离有机层并用蒸馏水洗涤，用无水硫酸钠干燥和减压浓缩。在硅胶上对粘稠物质进行色谱，柱洗脱用乙酸乙酯和己烷(2:8)的混合物，以获得75％的2,4,6-三甲氧基苯基二吡咯甲烷。mp120-122℃；¹HNMR(500MHz,CDCl₃,30℃,TMS):δ＝3.72(s,6H,-OCH₃),3.79(s,3H,-OCH₃),5.55(s,1H,-CH),5.88-5.89(d,2H,J＝8.00Hz,Ar-吡咯-H),6.07-6.09(d,2H,J＝8.5Hz,Ar-吡咯-H),6.11-6.6.23(d,2H,J＝8.5Hz,Ar-吡咯-H),6.61-6.62(d,2H,J＝7.0Hz,Ar-H),8.46(s,2H,吡咯-NH)；¹³CNMR(125MHz,CDC1₃,30℃,TMS):δ＝30.95,32,32,37.32,55.37,56.40,92.47,105.70,106.73,107.72,108.54,112.22,116.05,117.32,131.13,133.38,158.88,160.08；IR(纯):ν_max3375,1593,1463,1413,1313,1219,945cm^-1；FAB-MS:m/z＝312.56(计算值312.36C₁₈H₂₀N₂O₃)。

于1L圆底烧瓶中，将2,4,6-三甲氧基苯基二吡咯甲烷(3.2mmol)和2,4,6-三甲氧基苯甲醛(3.2mmol)溶于干燥二氯甲烷(500mL)，且三氟乙酸(1.3mmol)在超过15分钟内缓慢加入。反应混合物在氩气氛下30℃搅拌2小时。2小时后，加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)(4.8mmol)，而且反应混合物在30℃下搅拌2小时。完成的反应混合物倾入氧化铝垫(50mm最大直径x150mm长度)并用二氯甲烷(1L)洗脱。减压下除去溶剂得到黑色固体，在硅胶上进行色谱。使用二氯甲烷洗脱柱得到25％的5,10,15,20-(2,4,6-三甲氧基苯基)卟啉，mp>300℃；¹HNMR(500MHz,CD₂C1₂,30℃,TMS):δ3.48(s,24H,-OCH₃),4.20(s,12H,-OCH₃),6.52(s,8H,-Ar-H),8.64(s,8H,Ar-H,吡咯)；IR(纯):ν_max2949,2794,1660,1600,1573,1556,1462,1411,1334cm^-1；元素分析计算值(％)C₃₆H₅₂N₂O₁₀:C,68.98；H,5,58；N,5.75；实验值:C,67.44；H,5.88；N,5.23；MALDI-TOF-MS:m/z＝975.22(计算值974.37C₅₆H₅₄N₄O₁₂)。

三溴化硼(7.4mmol)加入至干燥蒸馏的二氯甲烷(10mL)中，且混合物冷却至-78℃。装置装有氯化钙干燥管。5,10,15,20-(2,4,6-三甲氧基苯基)卟啉(0.3mmol)溶于最小量的干燥二氯甲烷(10ml),置于滴液漏斗中在超过20分钟内缓慢加入。混合物在-78℃搅拌2小时，然后在25℃搅拌12小时。在用冰浴冷却至0℃后，加入过量的甲醇以溶解任何过量的三溴化硼，和分解卟啉-三溴化硼复合物。加入三乙胺中和反应混合物且减压下浓缩得到无定形紫色固体，从甲醇和氯仿混合物中重结晶得到70％的通式1的卟啉衍生物，其中,R₁＝R₃＝R₅＝OH,R₂＝R₄＝H,M＝2H。mp>300℃；¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆,30℃,TMS):δ＝6.268(s,8H,-Ar-H),8.746(s,8H,-Ar-H,吡咯),9.016(d,8H,-Ar-OH),9.388(s,4H,-Ar-OH)；¹³CNMR(125MHz,CD₃OD,30℃,TMS):δ＝93.94,94.18,98.60,103.92,108.58,113.22,115.23,131.05,132.19,132.84,139.15,146.76,158.63,159.06；IR(纯):ν_max3280,2948,1614,1584,1469,1348,1047cm^-1；MALDI-TOF-MS:m/z＝808.97(计算值806.72C₄₄H₃₀N₄O₁₂)。

实施例2

制备通式1的卟啉衍生物，其中R₁＝R₃＝R₅＝OH,R₂＝R₄＝H,M＝Zn。通式1的卟啉衍生物，其中R₁＝R₃＝R₅＝OH,M＝2H(0.62mmol)于25mL的甲醇和氯仿(1:2)混合物中的溶液，用醋酸锌(3.1mmol)回流6小时。溶剂在减压下蒸馏，获得的残留物用多份蒸馏水洗涤以除去过量的醋酸锌。获得的粗原料从甲醇和氯仿混合物中重结晶以获得85％的通式1的卟啉衍生物，其中，R₁＝R₃＝R₅＝OH,M＝Zn,mp>300℃；¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆,30℃,TMS):δ＝6.24(s,8H,Ar-H),8.69(s,8H,-OH),8.74(s,8H,Ar-吡咯-H),9.26(s,4H,-OH)；¹³CNMR(125MHz,CD₃OD,30℃,TMS):δ＝93.94,94.18,98.60,103.92,108.58,113.22,115.23,131.05,132.19,132.84,139.15,146.76,158.63,159.06；IR(纯):ν_max3281,1614,1469,1151,1047cm^-1；MALDI-TOF-MS:m/z＝865.76(计算值65.85C₄₄H₂₈N₄O₁₂Zn)。

实施例3

制备通式1的卟啉衍生物,其中R₁＝R₂＝R₄＝R₅＝H，R₃＝(OCH₂CH₂)₃OH,M＝2H。4-(三甘醇)(triethyleneglycol)苯甲醛(3.9mmol)加入蒸馏的吡咯(98.3mmol)中并在氩气氛下搅拌以及避光15分钟。三氟乙酸(0.39mmol)逐滴加入至反应混合物中并再次搅拌20分钟。加入二氯甲烷(20mL)淬灭反应和用氢氧化钠溶液中和过量的三氟乙酸。分离有机层，然后用蒸馏水洗涤以及用无水硫酸钠干燥，减压下浓缩。在硅胶上对粘稠物质进行色谱，用乙酸乙酯和己烷(1:1)的混合物洗脱柱，以获得80％的4-(三甘醇)苯基二吡咯甲烷。mp100-102℃；¹HNMR(300MHz,CDC1₃,30℃,TMS):δ＝3.47(t,2H,-CH₂),3.66(t,2H,-OCH₂),4.07(m,6H,-OCH₂),4.20(t,2H,-OCH₂),5.45(s,1H,-CH),5.89(d,2H,J＝8.00Hz,Ar-吡咯-H),6.09(d,2H,J＝8.5Hz,Ar-吡咯-H),6.6.23(d,2H,J＝8.5Hz,Ar-吡咯-H),7.02(d,2H,J＝8.6Hz,Ar-H),7.81(d,2H,J＝8.6Hz,Ar-H),8.51(s,2H,吡咯-NH)；¹³CNMR(125MHz,CDCl₃,30℃,TMS):δ＝43.7,61.3,69.3,70.0,70.2,107.3,108.3,114.0,118.3,129.0,130.1,155.9；IR(纯):ν_max3442,3415,2877,1600,1584,1257,651cm^-1；FAB-MS:m/z＝370.36(计算值370.44C₂₁H₂₆N₂O₄)。

于1L圆底烧瓶中，4-(三甘醇)苯基二吡咯甲烷(2.7mmol)和4-(三甘醇)苯甲醛(2.7mmol)溶于干燥二氯甲烷(450mL)，且三氟乙酸(1.1mmol)在超过60秒内缓慢加入。反应混合物30℃下搅拌。在1小时后，加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)(4mmol)，而且反应混合物在30℃下再搅拌1小时。完成的反应混合物倾入氧化铝垫(50mm最大直径x150mm长度)并用二氯甲烷(IL)洗脱，然后用甲醇和氯仿(1:1)混合物洗提。减压下除去溶剂得到黑色固体，在硅胶上进行色谱。使用甲醇和氯仿(1:19)混合物洗脱柱，得到28％的5,10,15,20-(4-(三甘醇)苯基)卟啉。mp>300℃；¹HNMR(300MHz,CDC1₃,30℃,TMS):δ＝-2.76(s,2H,吡咯-NH),3.71-3.90(m,24H,-CH₂),4.08(t,8H,-CH₂),4.32(t,8H,-CH₂),4.45(t,8H,-OCH₂),7.31(d,8H,J＝8.5,-ArH),8.12(d,8H,J＝8.4,-ArH)；¹³CNMR(125MHz,CDC1₃,30℃,TMS):δ＝61.84,67.67,70.32,70.46,112.86,114.97,119.70,126.23,126.85,131.42,134.92,135.56,158.53；IR(纯):ν_max3311,2875,1604,1506,1350,1246,966cm^-1；MALDI-TOF-MS:m/z＝1207.7(计算值1207.36C₆₈H₇₈N₄O₁₆)。

实施例4

制备通式1的卟啉衍生物,其中R₁＝R₂＝R₄＝R₅＝HR₃＝(OCH₂CH₂)₃OH,M＝Zn。通式1的卟啉衍生物的溶液(0.41mmol)，于20mL的干燥氯仿中，用醋酸锌(2.1mmol)回流5小时。溶剂在减压下蒸馏，获得的残留物用多份蒸馏水洗涤以除去过量的醋酸锌。获得的粗原料从甲醇和氯仿混合物中重结晶以获得92％的通式1的卟啉衍生物，其中,R₁＝R₂＝R₄＝R₅＝HR₃＝(OCH₂CH₂)₃OH,M＝Zn,mp>300℃；¹HNMR(300MHz,CDC1₃,30℃,TMS):3.71-3.90(m,24H,-CH₂),4.08(t,8H,-CH₂),4.32(t,8H,-CH₂),4.45(t,8H,-OCH₂),7.28-7.31(d,8H,J＝8.5,-ArH),8.12(d,8H,J＝8.4,-ArH)；¹³CNMR(125MHz,CDC1₃,30℃,TMS):δ＝61.84,67.67,70.32,70.46,112.86,114.97,119.70,126.23,126.85,131.42,134.92,135.56,158.53；IR(纯):ν_max3416,2875,1604,1506,1350,1246,681cm^-1；MALDI-TOF-MS:m/z＝1266.33(计算值1265.48C₆₆H₇₆N₄O₁₂Zn)。

实施例5

通过测试细胞增殖确定细胞毒性。

3,(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基四唑(tetrazolium)溴化物(MTT)测定是用于测试细胞增殖(细胞生长)的标准比色测定。其用来确定通式1的卟啉衍生物的细胞毒性。人类颈部口腔癌细胞(SCC131细胞)(5x10³细胞孔^-1)加入到两块96孔微量滴定板的孔中。一块用于暗细胞毒性(darkcytotoxicity)，且另一块用于光细胞毒性(lightcytotoxicity)，使用150μLDMEM培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)与10％血清并培养24小时。然后加入3.125至25μΜ的连续稀释的通式1卟啉衍生物(使用DPBS(Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水)稀释100mM原液)用于测定，0.025％DMSO(二甲亚砜)用于对照和培养3小时并且将一块板用钠蒸汽灯(70w15分钟)辐射，而另一块置于暗处。在光辐射后，吸出DPBS并加入150μL具有10％血清的DMEM至每个孔中并培养48小时。培养48小时后，从培养器中除去板，并加入10μL的MTT(5mg/ml原液)至板上的每个孔。在4小时后，小心除去上清液，并使得形成的甲簪(formazan)晶体不被除去，并加入100μL的异丙醇至每个孔中。用铝箔覆盖板上，并保持摇动直至晶体溶解。读取吸收值在570nm。

生长抑制百分比按照以下计算：

％生长抑制＝((对照-测试)/对照)x100

图6.A显示在用各种浓度(3.125,6.25,12.5和25μΜ)的通式1的卟啉衍生物治疗48小时后口腔癌细胞(SCC131)的细胞增殖，其中使用或不使用来自70W钠蒸汽灯的辐射(590nm)。从柱形图可证明当无辐射时没有明显的生长抑制。

图6.B显示48小时后各种浓度(3.125,6.25,12.5和25μΜ)的通式1的卟啉衍生物的口腔癌细胞(SCC131)％生长抑制图。通式1的卟啉衍生物显示其IC₅₀值为4μΜ。

图7.A显示在用各种治疗浓度(3.125,6.25,12.5和25μΜ)的通式1的卟啉衍生物治疗48小时后在乳腺癌细胞中(MDAMB231)细胞增殖，其中使用或不使用来自70w钠蒸汽灯的辐射(590nm)。从柱形图可证明当无辐射时没有明显的生长抑制。

图7.B显示48小时后各种浓度(3.125,6.25,12.5和25μΜ)的通式1的卟啉衍生物的乳腺癌细胞(MDAMB231)％生长抑制图，从该图可以看出，通式1的卟啉衍生物显示其IC₅₀值为7μΜ。

实施例6

通过细胞计量术确定细胞凋亡测定。

使用膜联蛋白V-共轭荧色物(fluorochome)例如FITC用于在早期细胞凋亡阶段细胞的简单的流式细胞检测识别。使用三个60mm的板，用2mLDMEM培养基培育SCC131(2x10⁵细胞/板)并培养24h。一块板用作光对照(无药品)以及一块板用作暗(有药品而无光)对照并保留一块用作测试(药品+光)。然后加入浓度为25μΜ的通式1的卟啉衍生物(使用DPBS稀释100mM原液)加入至两块板中，而且第三块中加入.025％DMSO并培养3小时，并且之后用钠蒸汽灯(70w,590nm)光辐射两块板(亮对照和测试)15分钟。光辐射后，吸出DPBS并加入150μL具有10％血清的DMEM至每块35mm的板中并培养48小时。48小时后，细胞使用胰蛋白酶处理并离心，颗粒使用1XPBS洗涤并将200μl的结合缓冲液加入至颗粒中。过滤至流式细胞检测管。加入3μL膜联蛋白V-FITC并涡旋以及在暗处培养15分钟。使用200μl的结合缓冲液稀释细胞悬浮液，悬浮液进行FACS分析。

图8显示膜联蛋白VFITC荧光(对数)对细胞计数(线性)的矩形图，在此P2代表底部没有吸收染料的细胞的底部荧光(健康正常细胞)。P3代表荧光结合至膜联蛋白VFITC的细胞(细胞凋亡细胞)。在MDAMB231-对照细胞(亮和暗)中，观察到绝大多数细胞如P2种群所示，显示为正常细胞而没有细胞凋亡。通式1的卟啉在PDT之后，观察到有一个弱的由P2至P3种群的平移，这意味着细胞凋亡。

实施例7

用荧光显微镜研究药物摄入

接种哺乳动物乳腺癌细胞，其中使用2mLDMEM培养基培育MDAMB231(2x10⁵细胞/板)24小时。然后加入浓度为1mΜ的研究的通式1的卟啉衍生物(使用DPBS稀释100mM原液)并培养1小时。然后通过荧光显微镜使用绿色滤光片以5分钟的时间间隔，观察药品被细胞摄入的过程。

图9.A显示MDAMB23l细胞的强反差影像。4B显示通式1的卟啉衍生物染色的MDAMB231细胞荧光图片。9.C显示极佳的图片A和B合并，表明药物摄入至细胞内。

图10显示时间间隔为5min的通式1的卟啉衍生物作用的荧光图片。从图片中确定通式1的卟啉衍生物的摄取在药品加入至细胞10分钟之内。这意味着所述通式1的卟啉衍生物快速摄入细胞内，这预示药物潜力。

实施例8

药物定位研究(核染色)。

接种哺乳动物乳腺癌细胞,其中使用2mLDMEM培养基培育MDAMB231(2x10⁵细胞/板)24h。然后加入浓度为1mΜ的研究的通式1的卟啉衍生物(使用DPBS稀释100mM原液)至上述细胞中并另外培养1小时。然后加入Hoechst染料作为参考，并且通过荧光显微镜使用UV及绿色滤光片观察定位。

图11A显示通式1的卟啉衍生物染色的MDAMB231细胞的荧光照片。图11B显示标准核染色Hoechst染色的MDAMB231细胞荧光图片。图11C显示极佳的合并，其证明通式1的卟啉衍生物的核定位性质。

有益效果

用于本发明卟啉染料具有令人满意的NIRPDT试剂特性，并能在光动力治疗、诊断、生物学、生物化学和工业应用中用作荧光探针。该系统的主要优点包括：

1.式1表示的卟啉衍生物是新的和纯的单一物质。

2.它们的合成方法非常经济。

3.式1表示的卟啉衍生物具有可见至近红外区域(400-700nm)吸收。

4.式1表示的卟啉衍生物具有近红外区域(620-740nm)的荧光发射。

5.式1表示的卟啉衍生物在水性介质中具有0.1-0.2范围内的发射量子产率。

6.式1表示的卟啉衍生物在水性介质中具有0.5-0.7范围内的三线态量子产率。

7.其可用于光动力应用，例如流体灭菌等。

8.基于卟啉的染料可用作用于蛋白标记的NIR荧光探针。

9.基于卟啉的染料可用作核染色的NIR荧光探针。

10.通式1的卟啉衍生物可用作免疫测定中的NIR荧光标记。

11.它们可在生理环境下用于检测生物学上重要的金属离子。

12.这些新的染料可在生物学和工业应用中用作近红外荧光传感器。

Claims

1.通式1的卟啉衍生物,

其中,R₁,R₃,R₅=OH;R₂,R₄=H;M=2H

其中,R₁,R₃,R₅=OH;R₂,R₄=H;M=Zn

其中,R₁,R₂,R₄,R₅=H;R₃=(OCH₂CH₂)_nOH，其中n=3;M=2H

其中,R₁,R₂,R₄,R₅=H;R₃=(OCH₂CH₂)_nOH，其中n=3;M=Zn。

2.一种如权利要求1所请求保护的通式1的卟啉衍生物的制备方法，其中所述方法包括：

a.将4-(三甘醇)取代的苯甲醛与吡咯以1:25mmol比例混合，然后在惰性气氛和避光下在25-30℃的温度下搅拌15-20分钟的时间段；

b.逐滴加入三氟乙酸至步骤a获得的反应混合物中，然后再搅拌20-30分钟的时间段；

c.通过加入溶剂淬灭步骤b获得的混合物；

d.使用氢氧化钠溶液中和步骤c获得的反应混合物中过量的三氟乙酸；

e.从步骤d获得的反应混合物中分离有机层，然后用水洗涤以及用无水硫酸钠干燥以获得无水有机层；

f.减压下浓缩步骤e获得的有机层以获得粘稠物质；

g.在硅胶上用乙酸乙酯和己烷的2:8的混合物对步骤f获得的粘稠物质进行色谱，以获得4-(三甘醇)取代的苯基二吡咯甲烷；

h.将步骤g获得的4-(三甘醇)取代的苯基二吡咯甲烷溶于含有4-(三甘醇)取代的苯甲醛的溶剂中；

i.缓慢加入三氟乙酸至步骤h获得的混合物中，然后在25-30℃温度下搅拌；

j.加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌至步骤i获得的混合物中，然后在25-30℃温度下搅拌1-3小时；

k.将步骤j获得的反应混合物倾入至氧化铝垫上并用溶剂洗脱，然后减压下除去溶剂以获得黑色固体；

l.在硅胶上用二氯甲烷对步骤k获得的黑色固体进行色谱，以获得卟啉衍生物。

3.如权利要求2中请求保护方法，其中步骤中c,h和k所用的溶剂选自由二氯甲烷和氯仿组成的组。

4.如权利要求1中请求保护的卟啉衍生物用于在制备光动力治疗应用的药剂中的用途，其中所述药剂是近红外荧光探针，且所述光动力治疗应用选自检测癌症和其它疾病。

5.如权利要求1中请求保护的卟啉衍生物在制备用于生物学应用中的药剂的用途，其中所述药剂是近红外荧光探针，且所述生物学应用选自在可见光辐射下诊断、蛋白标记和核染色。

6.如权利要求1中请求保护的卟啉衍生物在制备在可见光辐射下的免疫测定中的药剂中的用途，所述药剂是近红外荧光标记。