PL206902B1 - Fotosensybilizator i sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest fotosensybilizator i sposób jego wytwarzania. Wynalazek dotyczy sfery medycyny, w szczególności sfery terapii fotodynamicznej (PDT) z użyciem związków aktywnych biologicznie.

Fotosensybilizatory (PS) są używane jako czynniki lecznicze w PDT i jako etykiety fluorescencyjne w diagnostyce fotodynamicznej (PDD).

Sól tetrasodowa mono-L-aspartylo-chloryny e6 „Npe6 jest znana jako PS (opis patentowy USA nr: 4977177:

Ten PS jest aktywny w PDT.

Jego wadami są: pracochłonność wytwarzania, zbyt szybka dynamika akumulacji i wydalania z guza, która obniża czas skutecznej ekspozycji w guzie i względnie niski stopień akumulacji w tworze złośliwym (guzie), z powodu wysokiej hydrofilowości, co aktywuje tylko jeden z kilku możliwych mechanizmów niszczenia guza w procesie PDT, mianowicie tylko efekt na naczynia krwionośne. Sól trisodowa lizylo-chloryny p6 „LCP jest znana jako PS (opis patentowy USA nr 5330741):

PL 206 902 B1

Ten PS jest aktywny w PDT.

Jego wadami są: pracochłonność wytwarzania oraz fakt, że jest on mieszaniną dwóch monoamidów w pozycjach 13 i 15 w stosunku 10:1, co może prowadzić do niespójności biodystrybucji i wydalania.

Sól sodowa feoforbidu a jest znana jako PS (opis patentowy USA nr 5378835):

Ten PS może swoiście akumulować się w guzach złośliwych i jest aktywny w PDT.

Jego wadami są: tendencja do utleniania (niestabilność chemiczna) podczas przechowywania w postaci roztworu, niepełna rozpuszczalność w wodzie po przechowywaniu w postaci ciała stałego, hydrofobowość i w konsekwencji powolne wydalanie z ustroju, co prowadzi do przedłużonej fotowrażliwości naskórka.

Pochodne chloryny e6 są również znane jako PS (opis patentowy USA nr 5002962):

gdzie R= hydrofobowy podstawnik węglowodorowy, nasycony lub nienasycony, prosty lub rozgałęziony, składający się z 4 do 25 atomów węgla.

PS, w którym R jest heksylem, wykazuje tropizm do guzów złośliwych i jest skutecznym czynnikiem dla PDT.

Jego wadami są: pracochłonność wytwarzania syntetycznego i oczyszczania, wysoka hydrofobowość i w konsekwencji powolna akumulacja w guzie i niska trwałość roztworów wodnych medycznych postaci przechowywania.

Znany jest sposób wytwarzania PS, mianowicie kompozycji chloryn jako soli z metalami alkalicznymi, przeznaczonej dla praktyki medycznej. Sposób ten składa się z następujących etapów: biomasa roślinna poddawana jest ekstrakcji mieszaniną 2:1 do 8:1 węglowodoru, zawierającego 6-12 atomów węgla i alkoholu, zawierającego 2-10 atomów węgla, otrzymany roztwór chlorofilu zostaje odparowany pod ciśnieniem atmosferycznym, dodawany jest alkohol, zawierający mniej atomów węgla niż alkohol użyty do ekstrakcji, węglowodór oddestylowuje się całkowicie z mieszaniny pod ciśnie4

PL 206 902 B1 niem atmosferycznym, zasadowy roztwór alkoholu dodawany jest powoli (stopniowo) do roztworu alkoholowego chlorofili w temperaturze wrzenia alkoholu, lecz niższej niż 120°C, aż pH osiągnie 11,5 -11,8, mieszanina zostaje schłodzona, inkubowana przez 4 godziny, sączona, ekstrahowana węglowodorem, zawierającym 6-12 atomów węgla, faza alkoholowa, zawierająca kompleksy magnezowe chloryn zostaje oddzielona, alkohol zostaje odparowany pod ciśnieniem atmosferycznym, do pozostałości dodaje się kwas solny aż pH osiągnie 3,5, mieszaninę inkubuje się aż do zakończenia wytrącania chloryn i sączy, osad rozpuszcza się w metanolu, dodaje się zasadowy roztwór alkoholu aż pH osiągnie 8,5, roztwór PS zostaje odsączony i odparowany pod próżnią (opis patentowy USA nr 3102891).

Wadami tego sposobu są: zastosowanie wysokich temperatur podczas usuwania rozpuszczalników z ekstraktu, zastosowanie alkoholi, szczególnie alkoholu metylowego, co prowadzi do allomeryzacji pierścienia egzocyklicznego E i tworzenie rozmaitych, różnorodnych produktów utleniania feofityn i feoforbidów (K. Hyvarinen, J. Helaja, P. Kurchen, I. Kipelainen, P.H. Hynninen. H-1 and C-13 NMR spectra of the methanolic allomerization products of 13(2)-(R)-chlorophyll a. // Magnetic Resonance in Chemistry. - 1996. - V. 33. - N8. - p. 646-656), to prowadzi do złożonej mieszaniny, której skład jest niezdefiniowany i trudny do odtworzenia.

Znany jest sposób wytwarzania PS, mianowicie soli sodowej chloryny e6, składający się z następujących etapów: 1N roztwór NaOH dodawany jest do roztworu eteru trimetylowego chloryny e6 w tetrahydrofuranie, mieszanin ę miesza się przez 2 dni w temperaturze pokojowej pod azotem, do mieszaniny dodaje się wodę, następnie rozpuszczalnik organiczny ekstrahuje się chlorkiem metylenu, ślady tego ostatniego są usuwane przez przepuszczanie bąbli azotu przez roztwór soli chloryny e6 (opis patentowy USA nr 5002962).

Wadami tego sposobu są: niska dostępność wystarczających ilości wyjściowego eteru trimetylowego chloryny e6, długotrwałość wytwarzania PS ze względu na inertność chemiczną rodnika estru w pozycji 13 makrocyklu tetrapirolowego i nietrwałość form medycznych PS podczas przechowywania w postaci roztworu wodnego, ze względu na niepełne zmydlenie grupy estrowej w pozycji 13 makrocyklu.

Inny sposób wytwarzania czystej chloryny e6 został podany w rosyjskim opisie patentowym RU 2 054 476. Sposób ten obejmuje późniejsze etapy obróbki gorącym alkalicznym wodno-organicznym rozpuszczalnikiem, ekstrakcję etanolem, traktowanie kwasem octowym następujące po obróbce heksanem, traktowanie układem alkalia-woda-etanol, pozbawionym tlenu.

Sposób ten jest całkowicie różny od sposobu według wynalazku.

W publikacji Andrei V. Reshetnickov, i innych, „Novel drug form of chlorin e6, w: Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Theraphy IX. - T.J. Dougherty (wyd.), tom 3909, str. 124-129 (2000) została ujawniona nowa, trwa ła, rozpuszczalna w wodzie postać dobrze znanego fotosensybilizatora chloryny e6. Postać ta został a wytworzona z cyjanobakterii Spirulina Platensis jako niekowalencyjny kompleks z N-metylo-D-glukozoaminą .

Fotosensybilizator według wynalazku nie zawiera takiej postaci, jak ujawniona w wyżej wymienionej publikacji.

Znany jest sposób wytwarzania PS, mianowicie fotosensybilizatora „LCP dla terapii fotodynamicznej (sól trisodowa lizylo-chloryny p6), składający się z następujących etapów: biomasę poddaje się 2- 3 krotnemu działaniu acetonu, w celu wyekstrahowania chlorofilu a, biomasę sączy się lub wiruje, ekstrakt odparowuje się, poddaje działaniu kwasu w celu usunięcia jonu magnezu z cząsteczki chlorofilu i hydrolizy fitylowej grupy estrowej, przy dodawaniu alkoholu metylowego dla równoczesnej estryfikacji, masę reakcyjną poddaje się działaniu wody, pochodna feoforbidu a jest ekstrahowana chlorkiem metylenu, ekstrakt zostaje zobojętniony, przemyty wodą, odparowany, poddany chromatografii na tlenku glinu, metylofeoforbid a zostaje wykrystalizowany z mieszaniny chlorek metylenu metanol, a powstała pochodna feoforbidu a zostaje poddana reakcji z mocną zasadą nieorganiczną w obecnoś ci tlenu w mieszaninie pirydyna - eter dietylowy - n-propanol, masę reakcyjną poddaje się działaniu wody, fazę wodną zakwasza się do pH 4, „nietrwała chloryna ekstrahuje się chlorkiem metylenu, ekstrakt odparowuje się, „nietrwała chloryna rozpuszcza się w tetrahydrofuranie, roztwór odparowuje się, tą procedurę powtarza się aż do zaprzestania wzrostu absorpcji przy 700 nm, otrzymaną purpurynę 18 rozpuszcza się w tetrahydrofuranie, estryfikuje diazometanem, ester metylowy purpuryny 18 miesza się z wodnym roztworem lizyny w chlorku metylenu w obecności pirydyny, mieszaninę miesza się przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, rozpuszczalniki usuwa się pod wysoką próżnią, następnie otrzymany produkt surowy oczyszcza się za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC), rozpuszczalniki usuwa się przez liofilizację, PS rozpuszcza się w buforze fosforanowym, aby otrzymać roztwór do zastrzyków dla PDT, dodaje się 0,1 N roztworu

PL 206 902 B1

NaOH, pH ustala się na fizjologiczną wartość 7,35 za pomocą 0,1 N HCl, a roztwór sączy się przez filtr mikroporowy (opis patentowy USA nr 5330741).

Wadami tego sposobu są: niska powtarzalność, pracochłonność (zastosowanie wysokiej próżni, krystalizacja, chromatografia kolumnowa i HPLC, długotrwałość reakcji z lizyną), zastosowanie wysoce trujących i palnych odczynników (diazometan, pirydyna, metanol, tetrahydrofuran, eter dietylowy). Te wady czynią ten sposób nieużytecznym dla przemysłu farmaceutycznego. Poza tym, powstający, rozpuszczalny w wodzie, produkt docelowy jest trwały tylko przez 24 godziny w temperaturze 4°C w ciemności, a w postaci ciała stałego jest trwały tylko przez 4 miesiące w temperaturze 4°C w ciemności, gdy tymczasem według wymagań farmakopei powinien być trwały nie mniej niż przez 6 miesięcy (Leach M.W., Higgins R.J., Boggan, J.E., Lee, S.-J., Autry S., Smith K.M. Effectiveness of a Lysylchlorin p6/Chlorin p6 mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Research 1992, V.52, 1235-1239). Ponadto, o ile chodzi o skład chemiczny, ten PS przedstawia mieszaninę monoamidów w pozycjach 13 i 15 w przybliżonym stosunku 10:1, co może prowadzić do niespójności dystrybucji biologicznej i wydalania z organizmu.

Celem tego wynalazku jest otrzymanie PS, który charakteryzuje się łatwym wyodrębnieniem syntetycznym i oczyszczaniem, zrównoważona, hydrofobowością - hydrofilowością i w konsekwencji optymalną prędkością akumulacji w guzie i wydalania z guza i całego organizmu, a także wysoką trwałością roztworów wodnych postaci medycznych. Cel ten zostaje osiągnięty przez otrzymanie PS, zawierającego chlorynę w postaci soli z metalem alkalicznym, chloryna złożona z chloryny e6 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-karboksymetylo-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-2,7,12,18-tetrametyloporfiryny)

stanowiącego 80-90%, purpuryny 5 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-formylo-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-2,7,12,18-tetrametyloporfiryny)

PL 206 902 B1 stanowiącej 5-20% i purpuryny 18 - chloryny p6 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-karboksy-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-2,7,12,18-tetrametyloporfiryny)

stanowiącej pozostałość, tak że wspomniane składniki tworzą kompozycję, sód i potas mogą zostać użyte jako metal alkaliczny.

Celem tego wynalazku jest również osiągnięcie wysokiej powtarzalności sposobu wytwarzania PS, przy prostym sposobie postępowania, trwałości chemicznej postaci medycznych PS nie mniejszej niż przez 1 rok, a także osiągnięcie pełni właściwości fizykochemicznych i biologicznych PS, które zapewniają skuteczność tego PS w PDT oraz uniknięcia użycia odczynników trujących.

Zasada proponowanego sposobu wytwarzania PS jest następująca: biomasa Spirulina jest poddawana działaniu acetonu aż do całkowitej ekstrakcji chlorofilu, biomasę odsącza się lub odwirowuje, ekstrakt poddaje się działaniu kwasu w celu usunięcia jonów magnezu z cząsteczki chlorofilu, ekstrakt zobojętnia się, a wytrąconą feofitynę a odsącza, następnie feofitynę a hydrolizuje się w mieszaninie kwas solny - aceton-heksan, zużywając 6-16 ml acetonu, 0,6-6 ml heksanu i 5-10 ml stężonego kwasu solnego na 1 g surowej feofityny a, mieszaninę podgrzewa się do temperatury 40-60°C i miesza przez 20 min - 1 godziny, nastę pnie dodaje się heksan (6-16 ml), a fazę organiczną przemywa się mieszaniną acetonu i kwasu solnego (2-10 : 1), fazę wodną przemywa się heksanem, następnie fazę wodną, zawierającą feoforbid a, zobojętnia się nadmiarem roztworu wodnego cytrynianu sodu (tri-, di- lub mono-podstawionego), wytrącony feoforbid a zostaje odsączony, przemyty wodą, rekrystalizowany z mieszaniny aceton - woda, wysuszony powietrzem, aż do ustalenia się wagi, następnie feoforbid a rozpuszcza się w acetonie, dodaje się mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego o stężeniu 0,05-1,00%, miesza się w temperaturze 30-60°C przez 5-30 min, dodaje się dodatkową objętość mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego o stężeniu 1-50%, mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 40-60°C przez 20- 90 min, zobojętnia rozcieńczonym kwasem solnym, osad chloryny e6 oddziela się przez wirowanie, przemywa wodą destylowaną aż do zaniku reakcji kwasowej, otrzymuje się 55-80% chloryny e6, następnie chloryna e6 rekrystalizuje się z acetonu, w celu oddzielenia tetrapiroli liniowych, chloryna e6 odsącza się i przemywa wodą destylowaną, chloryna e6 podgrzewa się w zamkniętym szczelnie zbiorniku w temperaturze 40-100°C przez 1 godzinę -30 dni, następnie ochładza się go i dodaje roztwór mocnej zasady, aż do pH 7,5-8,5, a następnie roztwór jest dopełniany wodą do zastrzyków, wolną od pirogenów, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas.

Ponadto w sposobie wytwarzania PS, po etapie dodawania mocnej zasady do ustalenia pH 7,5 - 8,5 mieszaninę można przesączyć na żelu, aby uzyskać zawartość procentową chloryny e6 do 80-90%, purpuryny 5 do 5-20% i purpuryny 18 - pozostałość, następnie dodaje się rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, roztwór jest dopełniany wodą do zastrzyków, wolną od

PL 206 902 B1 pirogenów, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas, uzyskując w ten sposób „Płynny ekstrakt chloryn.

Ponadto, w sposobie wytwarzania PS, po etapie przesączenia na żelu, można dodać do roztworu fotosensybilizatora rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, następnie osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, substancje dodatkowe, dopuszczone przez Farmakopeę Państwową FR, są dodawane, do pH 7,5-8,5, dodaje się wodę do zastrzyków, wolną od pirogenów, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 0,1-1%mas, następnie odsącza się bakterie.

Również w sposobie wytwarzania PS, po etapie przesączenia na żelu, można dodać do roztworu fotosensybilizatora rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, ten osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, dopełniony wodą do zastrzyków, wolną od pirogenów, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas, „Płynny ekstrakt chloryn zostaje rozproszony w nośniku żelowym zgodnie z następującym stosunkiem: 0,5-12%mas „Płynnego ekstraktu chloryn, 5-20%mas dimetylosulfotlenku, pozostałość stanowi woda, substancje dodatkowe, dopuszczone przez Farmakopeę Państwową FR oraz nośnik żelowy.

Ponadto w sposobie wytwarzania PS, po etapie przesączenia na żelu, można dodać do roztworu fotosensybilizatora rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, ten osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, dopełniony wodą do zastrzyków, wolną od pirogenów, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas, a uzyskany „Płynny ekstrakt chloryn zostaje rozpuszczony w dimetylosulfotlenku zgodnie z następującym stosunkiem: 0,5-12%mas „Płynnego ekstraktu chloryn, pozostałość stanowi dimetylosulfotlenek.

Ten sposób jest wykonywany z użyciem standardowego pilotowego chemicznego sprzętu laboratoryjnego: biomasa jest poddawana reakcjom w naczyniach aluminiowych 10-50 l, wyposażonych w mieszadł a mechaniczne, biomasę sączy się przez filtry siatkowe 20 l, za pomocą olejowej pompy próżniowej i pułapki chłodzonej ciekłym azotem, biomasę wiruje się w chłodzonej wirówce w naczyniach 4x1 l i przy prędkości wirowania 6000 obr./min, ekstrakt zakwasza się w 20 l butlach szklanych, wytrąconą feofitynę a sączy się przez filtry siatkowe 10 l, za pomocą olejowej pompy próżniowej i pułapki chłodzonej ciekłym azotem, feofitynę a hydrolizuje się w ogrzewanych okrągłodennych kolbach trój szyjnych 0,1-0,5 l, wyposażonych w mieszadło, chłodnicę zwrotną i otwór do nalewania z korkiem, roztwory przemywa się w rozdzielaczach 2 l, zobojętnia w zlewkach chemicznych 2-5 l, feoforbid a sączy się przez filtry siatkowe 2-5 l, za pomocą olejowej pompy próżniowej i pułapki chłodzonej ciekłym azotem, rekrystalizuje w płaskodennych kolbach chemicznych 0,25-1 l, feoforbid a rozpuszcza się w acetonie i poddaje reakcji z mocną zasadą nieorganiczną w ogrzewanych okrągłodennych kolbach trój szyjnych 0,5-2 l, wyposażonych w mieszadło, chłodnicę zwrotną i otwór do nalewania z korkiem, osad chloryny e6 oddziela się w chłodzonej wirówce w naczyniach 4x0,5 l i przy prę dkoś ci wirowania 6000 obr./min, chloryna e6 rekrystalizuje się w płaskodennych kolbach chemicznych 0,25-0,5 l, 2-5 l, chlotynę sączy się przez filtry siatkowe 1-2 l, za pomocą olejowej pompy próżniowej i pułapki chłodzonej ciekłym azotem, chlorynę e ogrzewa się w okrągłodennych kolbach chemicznych 0,05-0,1 l, ze szkła odpornego na temperaturę, poddaje reakcji z roztworem mocnej zasady i ustala w zlewkach chemicznych 0,1-1 l za pomocą standardowego pH-metru i spektrofotometru, mieszaninę filtruje się na żelu na kolumnie o średnicy 50-10 mm i wysokości 100-150 mm, bakterie odsącza się przez standardowe filtry mikroporowe 0,22 μm typu Millipore, „Płynny ekstrakt chloryn zostaje rozproszony w nośniku żelowym za pomocą krajarki lub homogenizatora kulkowego, ponadto do przygotowywania próbek i roztworów używane są kolby koniczne 0.01 - 10 l z korkami, cylindry 0,005 - 2 l, zlewki 0,05 - 21, butle 20 l, waga o zakresie 1 - 1000 g i mieszadła magnetyczne; do odzyskiwania acetonu i heksanu używane są kolby okrągłodenne 5 l z termometrami i chłodnicami wodnymi o przepływie prostym; wyparka próżniowa używana jest do szybkiego usuwania rozpuszczalników w niskiej temperaturze.

Według sposobu wytwarzania PS za stężony kwas solny uważany jest nasycony roztwór wodny chlorowodoru w temperaturze 20°C, który zazwyczaj zawiera 36-37%mas chlorowodoru.

Na etapie przekształcania feofityny a w feoforbid a zakresy objętości heksanu i acetonu (6-16 ml acetonu i 0,6-6 ml heksanu) uzasadnia fakt, że jeśli stosuje się mniejsze objętości rozpuszczalników, to rozpuszczanie feofityny a jest niecałkowite, a jeśli objętości będą większe, to roztwór nie miałby stężenia wystarczającego dla szybkiej hydrolizy. Zakres objętości kwasu solnego (5-10 ml) uzasadnia fakt, że jeśli objętość jest mniejsza, to wydajność otrzymywania feoforbidu a spada, a jeśli objętość jest większa, to selektywność reakcji obniża się z powodu tworzenia produktu ubocznego, pirofeofor8

PL 206 902 B1 bidu a. Zakres temperatur 40-60°C uzasadnia fakt, że jeśli temperatura jest niższa, to wydajność otrzymywania feoforbidu a spada, a jeśli temperatura jest wyższa, to selektywność reakcji obniża się z powodu tworzenia produktu ubocznego, pirofeoforbidu a. Zakres czasów 20 min - 1 godziny uzasadnia fakt, że jeśli ten okres jest krótszy, to wydajność otrzymywania feoforbidu a spada, a jeśli ten okres jest dłuższy, to selektywność reakcji obniża się z powodu tworzenia produktu ubocznego, pirofeoforbidu a. Objętość dodanego heksanu (6-16 ml) uzasadnia fakt, że jeśli ta objętość jest mniejsza, to oddzielenie jednego z produktów reakcji, fitolu, od mieszaniny reakcyjnej jest nieefektywne, a użycie większej objętości heksanu nie jest racjonalne. Na etapie oczyszczania feoforbidu a fazę organiczną przemywa się mieszaniną acetonu i stężonego kwasu solnego w stosunku 2:1 do 10:1. Jeśli ten stosunek jest mniejszy niż 2:1, to tworzy się łuskowaty osad domieszek, który trudno oddzielić od fazy wodnej, zawierającej pożądany feoforbid a. Jeśli ten stosunek jest większy niż 10:1, to faza wodna przesyca się acetonem i domieszki przechodzą do niej z fazy heksanowej, zanieczyszczając pożądany feoforbid a.

Na etapie przekształcania feofityny a w chlorynę e6 stężenie mocnej zasady znajduje się w zakresie 0,05-1,00%, którego dolny limit jest minimum koniecznym dla reakcji otwierania pierścienia cyklopentanonowego (pierścienia E) feoforbidu a, a jeśli stężenie zasady jest większe niż 1%, to ma miejsce reakcja allomeryzacji (utleniania) pierścienia E, prowadząc do „nietrwałej chloryny zamiast docelowej chloryny e6, a następnie prowadząc do purpuryny 18 i dalej - do chloryny p6.

Następnie, według sposobu, dodaje się dodatkową objętość mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego o stężeniu 1-50%. Jeś li to stężenie jest mniejsze niż 1%, to ma miejsce niecałkowite zmydlenie grupy estrowej w pozycji 13 lub 15. Jeśli stężenie zasady jest większe niż 50%, to w pewnych przypadkach otwiera się makrocykl tetrapirolowy PS. Następnie masę reakcyjną miesza się w temperaturze 30-60°C przez 5-30 min, niższa temperatura ułatwia proces allomeryzacji pierścienia E, a wyższa temperatura ułatwia rozkład chloryny e6 do chloryny e4. Przy dodawaniu dodatkowej ilości mocnej zasady nieorganicznej zakres temperatur wynosi 40-60°C, a zakres czasu to 20-90 min. Jeś li czas i temperatura są mniejsze niż podano, to ester metylowy w pozycji 15² nie ma czasu na hydrolizę , jeś li czas i temperatura są wię ksze niż podano, to roś nie udział produktu ubocznego chloryny e4.

Przy przekształcaniu chloryny e6 w „Płynny ekstrakt chloryn ma miejsce proces utleniania i następujące po nim termolityczne procesy dehydratacji i dekarboksylacji PS z utlenioną grupą metylenową w pozycji 15¹ do purpuryny 5:

Przy przekształcaniu chloryny e6 w „Płynny ekstrakt chloryn zastosowanie temperatury niższej niż 40°C wymaga długiego czasu reakcji, co jest bezsensowne technologicznie. Zastosowanie temperatury wyższej niż 100°C powoduje przyspieszenie rozkładu substancji.

Czas trwania procesu krótszy niż 1 godzina wymaga zastosowania temperatur powyżej 100°C lub daje w wyniku substancję posiadającą niską aktywność biologiczną.

Czasowi trwania procesu dłuższemu niż 30 dni towarzyszy nieodwracalna zmiana (rozkład) substancji. Optymalną temperaturą procesu jest 45-70°C (rys. 1). Optymalnym czasem trwania procesu jest 2-9 dni przy temperaturze 70°C (rys. 2) lub 1-48 godzin przy temperaturze 100°C (rys. 3), co daje 5-20% purpuryny 5 jako domieszki.

PL 206 902 B1

Kompozycja, zawierająca 5-20% purpuryny 5 i 80-95% chloryny e6 w kompozycji czynnika aktywnego (PS) jest odpowiednia dla wytwarzania rozpuszczalnych w wodzie postaci medycznych do zastrzyków. Jeśli kompozycja zawiera mniej niż 5% purpuryny 5, to ma niską aktywność biologiczną. Jeśli kompozycja zawiera więcej niż 20% purpuryny 5, to jej rozpuszczalność w wodzie pogarsza się, co niekorzystnie wpływa na trwałość postaci medycznych podczas przechowywania i pogarsza możliwość sączenia przez filtry mikroporowe. Ta ostatnia właściwość jest konieczna dla wyjaławiania postaci medycznych, gdyż tetrapirolowych postaci medycznych nie można wyjaławiać przez ogrzewanie lub napromieniowanie UV, z powodu wysokiego prawdopodobieństwa niepożądanych zmian chemicznych.

Zawartość 80-95% chloryny e6 w kompozycji jest konieczna dla utrzymania purpuryny 5 w stanie rozpuszczalnym w wodzie.

Zakres pH wynika z faktu, że jego niższa wartość - pH 7,5 - jest dolnym limitem rozpuszczalności chloryn w wodzie, dającym stężenia odpowiednie dla wykorzystania farmaceutycznego. Limit górny pH 8,5 - jest limitem tolerancji biologicznej dla jonów hydroksylowych, [OH^-]. Zakres stężeń chloryny e6, 6,5-7,5%, wynika z zastosowania technologicznych metod wirowania lub sączenia na etapie oddzielania osadu chloryny e6, te metody dają produkt w tym zakresie stężeń.

Wynalazek jest ilustrowany rysunkami, spośród których rys. 1 dotyczy sposobu i pokazuje tworzenie purpuryny 5 w zależności od temperatury, przy inkubacji przez 30 dni; rys. 2 pokazuje zależność zawartości purpuryny 5 od czasu inkubacji w temperaturze 70°C; rys.3 pokazuje zależność zawartości purpuryny 5 od czasu inkubacji w temperaturze 100°C; rys. 4 ilustruje farmakokinetykę kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn, stosowanej jako postać medyczna „Radachlorin, roztwór 0,5% do zastrzyków („Photochlorin) u myszy z guzami przy podaniu dożylnym w dawce 20 mg/kg; rys. 5a pokazuje obecność metabolitu chloryny e6 (wzór I) , mianowicie purpuryny 5 (wzór II) we krwi, krzywe oznaczone jako „1 uzyskano dla PS w 0,01 M buforze boranowym o pH 9,18, a krzywe oznaczone jako „2 uzyskano dla PS we krwi; rys. 5b potwierdza metabolizm chloryny e6. (wzór I) do purpuryny 5 (wzór II). rys. 6 pokazuje widmo PMR kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn, uzyskanej w przykładzie 2; rys. 7 pokazuje widmo mas kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn, uzyskanej w przykładzie 2; rys. 8 przedstawia widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn, uzyskanej w przykładzie 2, widmo zebrano w etanolu, stężenie kompozycji wynosi 5 mkg/ml; rys. 9 ukazuje widmo PMR chloryny e6; rys. 10 pokazuje widmo mas chloryny e6. Rys. 11 przedstawia widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym chloryny e6, widmo zebrano w etanolu, stężenie chloryny e6 wynosi 15 mkg/ml (pasmo Soreta - 5 mkg/ml); rys. 12 pokazuje widmo PMR purpuryny 5; rys. 13 pokazuje widmo masowe purpuryny 5; rys. 14 przedstawia widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym purpuryny 5, widmo zebrano w etanolu, stężenie chloryny e6. wynosi 15 mkg/ml (pasmo Soreta - 5 mkg/ml); rys. 15 pokazuje widmo PMR estru dimetylowego purpuryny 5; rys. 16 pokazuje widmo mas estru dimetylowego purpuryny 5; rys. 17 przedstawia widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym estru dimetylowego purpuryny 5, widmo zebrano w etanolu, stężenie DME purpuryny 5 wynosi 15 mkg/ml (pasmo Soreta - 5 mkg/ml).

PS jest ilustrowany przez przykład 1, przykłady wykonywania sposobu są podane w przykładach 2 i 3, przypadki specjalne w wykonywaniu sposobu zilustrowano w przykładach 4-9.

Z punktu widzenia chemii PS zawiera trzy cykliczne tetrapirole typu chloryny (z uwodornionym pierścieniem D) -chlorynę e6 (wzór 1), purpurynę 5 (wzór 2, przykład 10) oraz purpurynę 18, która stopniowo przekształca się w chlorynę p6 w roztworze zasadowym (podczas przechowywania) (wzór III).

Z punktu widzenia chemii fizycznej PS posiada zdolność absorbowania światła w widmie widzialnym, co daje fotoaktywację PS i następującą po niej relaksację stanu wzbudzonego i transfer energii do tlenu molekularnego i substratów organicznych, rozpuszczonych w tkankach. Ten transfer prowadzi do procesów utleniania i wolnorodnikowych w tkankach biologicznych i ich uszkodzenia, a dalej zniszczenia (nekrozy). Najbardziej korzystnym pasmem wzbudzenia dla PDT jest pasmo o duż ych długościach fali (tab. 1), gdyż zdolność przenikania światła w próbkach biologicznych wzrasta wraz ze wzrostem długości fali. Zatem PS jest w stanie uszkadzać obiekty biologiczne na głębokość do 10 mm po wzbudzeniu za pomocą światła o długości 654-670 nm.

Z punktu widzenia nauki o leku PS jest substancją „Płynny ekstrakt chloryn (ekstrakty są uważane za płyny, jeśli efektywne stężenie czynnika jest mniejsze niż 20%).

Dana substancja jest brana pod uwagę jako ekstrakt, z powodu konieczności jej ekstrakcji z biomasy za pomocą rozpuszczalników organicznych.

PL 206 902 B1

T a b e l a 1

Położenia maksimów absorpcji i wartości ekstynkcji cząsteczkowej absorpcji dla długofalowego pasma „Płynnego ekstraktu chloryn w różnych środowiskach.

PS	λmaks, nm ε, M1cm1 (0,01M bufor boranowy, pH 9,18)	λmaks, nm ε, M1cm1 0,01M bufor boranowy, z 1% albuminą osocza człowieka, pH 7,2)	λmaks, nm ε, M1cm1 0,01M (etanol)
„Płynny ekstrakt chloryn	654,5 (28270)	662 (34200)	662 (34230)

Związek o wzorze II posiada zdolność do swoistej akumulacji w nowotworach złośliwych i ogniskach infekcji, ale jest słabo rozpuszczalny w wodzie, a związek o wzorze I, równocześnie z wykazywaną aktywnością fotodynamiczną, jest czynnikiem ułatwiającym rozpuszczanie związku o wzorze II.

Z punktu widzenia farmakologii (rys. 4, przykład 11) wyją tkowość parametrów farmakokinetycznych jest uzyskiwana dzięki faktowi, że w organizmie PS o wzorze (I) przeobraża się powoli w PS o wzorze (II), ten proces utrzymuje stężenie tego ostatniego na stałym poziomie od chwili wprowadzenia do organizmu do chwili wydalenia z guza, w okresie czasu wystarczającym dla wykonania skutecznej PDT. Po wprowadzeniu sugerowanej kompozycji PS do organizmu myszy z guzem, dostaje się ona do krwiobiegu, a ze względu na krążenie we krwi głównie związku o wzorze I, w ciągu pierwszych godzin po wprowadzeniu do obszaru guza osią ga się wysokie i stabilne stężenie

PS - 0,27-0, 32 μΜ, wystarczające dla skutecznej PDT w czasie 0,5-4 godzin. W tym okresie, dzięki obecności w kompozycji 5-20% związku o wzorze (II), osiąga się wysoki kontrast, ten związek posiada zdolność gromadzenia się w guzie z wysokim kontrastem, maksimum akumulacji spada od chwili upłynięcia 3 godzin po wprowadzeniu PS do organizmu zwierzęcia (wskaźnik kontrastu wynosi 14,5 dla skóry i 2,9 dla mięśni). W tym czasie związek o wzorze (I) przekształca się w organizmie w związek o wzorze (II), zapewniając wysokie, stabilne stężenie PS w obszarze guza w ciągu 3-5 godzin po wstrzyknięciu, stężenie to stopniowo spada, pozostając wystarczającym terapeutycznie aż do 18 godzin po wstrzyknięciu. Potem związek o wzorze (II) dysocjuje w organizmie na produkty nietoksyczne, które są wydalane przez wątrobę.

Przekształcenie chloryny e6 o wzorze (I) w purpurynę 5 o wzorze (II) jest potwierdzone przez widma fluorescencyjne organów i próbek tkanek zwierząt doświadczalnych (rys. 5). Przy dodawaniu postaci medycznej „Radachlorin, roztwór 0,5% do zastrzyków („Photochlorin) do homogenatu krwi [rys. 5a, (1) ] w stężeniu 10 μM i wykonaniu następnie analizy spektrofotometrycznej, obserwuje się zmianę widma fluorescencyjnego w postaci poszerzenia 1,2 raza i przesunięcia maksimum intensywności o 8 nm w stronę długofalowego obszaru widma. Przy dodawaniu „Photochlorin w niższym stężeniu (C = 1 μM), obserwuje się jedynie przesunięcie widma, bez poszerzenia, co obrazuje efekt dawki przy powstawaniu metabolitów [rys. 5a, (2)].

Rys. 5a, (3) ukazuje wynik analizy homogenatu krwi, otrzymany 3 godziny po podaniu myszom „Photochlorin. Tutaj najsilniej uwidocznionym parametrem jest poszerzenie widma 1,5 raza, przesunięcie maksimum intensywności o 4 nm w stronę długofalowego obszaru widma, to wskazuje, że w analizowanej próbce krwi obecna jest mieszanina „Photochlorin i metabolitu.

Przy dodawaniu „Photochlorin w stężeniu 10 μM do probówki, zawierającej homogenat wątroby [rys. 5b, (1)], zmiana parametrów spektroskopowych wyraża się przede wszystkim w przesunięciu maksimum intensywności fluorescencji o 9 nm w stronę długofalowego obszaru widma. Poszerzenie widma nie jest obserwowane.

Podobny obraz obserwuje się przy podawaniu „Photochlorin w niższym stężeniu C = 1 μM [rys. 5b, (2)]. Gdy jest analizowany homogenat tkanki wątroby, pozyskany 3 godziny po podaniu zwierzęciu, to obraz spektrofotometryczny próbki jest podobny do dwu poprzednich [rys. 5b, (3)]. Uzyskane dane pokazują zatem obecność metabolitu „Photochlorin w homogenatach wątroby.

Akumulacja purpuryny 5 w guzach zwierząt doświadczalnych, optymalna dla efektu fotodynamicznego ze względu na selektywność, jest obserwowana w czasie 3-18 godzin po podaniu dożylnym lub dootrzewnowym. W przypadkach, gdy konieczne jest również umożliwienie cyrkulacji kompozycji chloryny w krwiobiegu, to optymalny czas napromieniowywania wynosi 0,5-4 godziny po podaniu dożylnym. Ogólnie, dla wykonania PDT za pomocą „Płynnego ekstraktu chloryn, okres pomiędzy podaniem preparatu i napromieniowywaniem wynosi 0,5-18 godzin.

PL 206 902 B1

Aktywność biologiczna postaci medycznej „Radachlorin, roztwór 0,5% do zastrzyków („Photochlorin), zawierającej 0,5% bezwodnej kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn, jest oceniana in vitro i in vivo.

Bilans PS pod względem amfifilowości wyznacza się za pomocą standardowego eksperymentu in vitro (Kessel D. Biochemistry. 1977. V. 16. p. 3443-3449) (tab. 2, przykład 12). Współczynnik podziału w układzie oktanol-1/bufor fosforanowy, pH 7,4 (Cd) wynosi 1,40. To oznacza, że zastrzegany PS jest równie dobrze rozpuszczalny zarówno w fazie wodnej, jak i lipidowej oraz potwierdza lipofilowość PS, która umożliwia temu związkowi redystrybucję z wody do kompleksów z białkami transportowymi i lipoproteinami, szybkie wnikanie do komórek i akumulację w wewnątrzkomórkowych błonach cytoplazmatycznych i mikrosomach, lub wnikanie do komórek przez dyfuzję przez błonę komórkową tych komórek. Po napromieniowaniu laserem związek zgromadzony w ten sposób wydziela tlen singletowy wewnątrz komórki i zabija je.

Aktywności, antynowotworowej PS wobec różnych rodzajów komórek rakowych dowodzą wyniki uzyskane w eksperymencie in vitro, w którym użyto 3 linii hodowanych komórek nowotworowych: guza chromochłonnego szczura PC12, nerwiaka osłonkowego zwojów Gassera szczura RGGN1 i wątrobiaka szczura 21 (Hep27) (tab. 2, przykład 13).

Do badań zależnej od dawki aktywności cytofototoksycznej (po napromieniowaniu laserem) i biologicznej „ciemnej PS, stosuje się następujące sposoby:

1. Test MTT, który umożliwia precyzyjne określenie liczby żywych komórek po poddaniu ich działaniu PS i napromieniowaniu laserem, aby obliczyć wskaźniki cytotoksyczny i cytofototoksyczny PS. Ten sam test pozwala na określenie zależnej od dawki aktywności cytotoksycznej i „ciemnej biologicznej PS (Andrei V.Reshetnickov, Gelii V.Ponomarev, Andrei V.Ivanov, Olga Yu. Abakumova, Tatyana A. Tsvetkova, Artashes V. Karmenyan, Aleksei G. Rebeko, Rudolf Ph.Baum. Novel drug form of chlorin e6 // W Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX. - T.J.Dougherty, wyd., Tom 3909, 124-129 (2000)).

2. Wyznaczenie liczby komórek po wybarwieniu monowarstwy komórek za pomocą fioletu krystalicznego przy końcu eksperymentu. Ten sposób jest mniej pracochłonny i kosztowny niż test MTT i umoż liwia również obliczenie wskaźników cytotoksycznego i cytofototoksycznego PS (A. E. Medvedev i wsp., Biomed. Science, 1990, t.1, s. 261), lecz jest mniej dokładny, gdyż fiolet krystaliczny wybarwia również martwe komórki.

3. Porównawczy efekt genotoksyczny i genofototoksyczny PS szacuje się za pomocą stopnia hamowania syntezy DNA w komórkach. Syntezę DNA określa się przez poziom inkorporacji ¹⁴C tymidyny do DNA, z zastosowaniem standardowych sposobów radiometrycznych (O.Yu. Abakumova i wsp., J. Neural Transm. Supl. 3, 1998, T. 52, s. 87).

Wszystkie trzy badane linie komórkowe są wysoce wrażliwe na efekt napromieniowania laserem po poddaniu działaniu PS (dane z testu MTT). Stopniowanie linii komórkowych pod względem podatności na napromieniowanie laserem jest taka: RGGN1>PC12>Hep27.

Przy przedłużonym działaniu PS w stężeniu 5 μΜ na komórki w ciemności przeżywalność wynosiła 96,5-86,2% dla PC-12, 103,7-93,0% dla RGGN1 i 109,7-87,9% dla Hep27 (odpowiednio test MTT - fiolet krystaliczny). W tych samych warunkach synteza DNA w komórkach PC-12 pozostała praktycznie niezmieniona, a w komórkach Hep27 i RGGN1 była obniżona odpowiednio o 21,2 i 22,2%. Zauważalny wzrost liczby komórek RGGN1 i Hep27 pod działaniem 5 μM PS na komórki w ciemności jest najprawdopodobniej związany z wywoływaniem podziałów komórkowych przez PS. Ogólnie, pod nieobecność promieniowania dla PS bardziej typowa jest aktywność cytotoksyczna, niż wywoływanie podziałów komórkowych.

Po napromieniowaniu laserem komórek, poddanych działaniu PS, obserwuje się śmierć komórek. Wyznaczana jest zależna od dawki aktywność cytotoksyczna kompozycji, która pozwala na obliczenie EC50, tj. ustalenie stężenia PS, przy którym umiera 50% komórek. Te dane podano w tabeli 2. Należy zaznaczyć, że PS o wartości EC₅₀ mniejszej niż 20 μM uważa się za skuteczne w hamowaniu wzrostu guza.

Synteza DNA w komórkach PC-12, w momencie wyznaczania genofototoksyczności po poddaniu komórek działaniu 5 μM PS i napromieniowaniu laserem, jest silnie obniżona (spadek o 96,5% w porównaniu do grupy kontrolnej, którą tylko napromieniowano). Pobudzenie syntezy DNA po napromieniowaniu laserem, przy niskich stężeniach PS, obserwuje się w komórkach Hep27 i RGGN1, ta synteza jest znacząco obniżona w obecności 5 μM PC. Zauważalne pobudzenie syntezy DNA można

PL 206 902 B1 wyjaśnić faktem, że przekształcone komórki wątroby i gleju, które przeżyły przy niskich stężeniach PS, posiadają dużą zdolność syntezy DNA i regeneracji populacji.

PS jest zatem kompozycją wysoce cytofototoksyczną dla różnych rodzajów komórek rakowych. W wysokich stężeniach (>5 μ M) jest umiarkowanym inhibitorem wzrostu guza nawet bez napromieniowywania. Z powodu wysokiej genofototoksyczności PS można uważać za silny inhibitor wzrostu guza przy napromieniowywaniu.

Właściwości toksyczne PS badano w eksperymentach in vivo (przykład 14). Średnia wartość LD50 wynosi 210,53±22,2 mg/kg, przy uwzględnieniu współczynnika wagowego, a dawka, która powoduje śmierć 10% zwierząt doświadczalnych (LD10) wynosi 169,87 mg/kg. Te eksperymenty pozwalają na określenie PS jako „substancji o niskiej toksyczności.

Biodystrybucję PS badano w eksperymentach in vivo (przykład 11). Przy podawaniu PS dootrzewnowo myszom z rakiem zarodkowym T36, wszczepionym do mięśnia tylnej nogi, stwierdza się następujące mechanizmy dystrybucji związków. Po wstrzyknięciu PS dostaje się do krwi, a następnie ulega redystrybucji do organów i tkanek zwierzęcia (tab. 3). Jak widać w tabeli 3, maksimum akumulacji w guzie (0,70 μΜ) zostaje osiągnięte w 5 godzin po zastrzyku dootrzewnowym w dawce 40 mg/kg i utrzymuje się przez długi okres (18-24 godziny). Stężenie w guzie 18 godz. po zastrzyku wynosi 0,48 μM, to jest 1,5 raza mniej, niż absolutne maksimum akumulacji przy wysokiej selektywności akumulacji. Stosunek guz/tkanka mięśniowa wynosi 32, a stosunek guz/skóra wynosi 44. Maksimum akumulacji w guzie (0,32 μM) zostaje osiągnięte 0,5 godziny po zastrzyku dożylnym w dawce 20 mg/kg i również utrzymuje się przez długi okres (aż do 5 godzin). Maksymalny kontrast akumulacji przy zastrzyku dożylnym zostaje osiągnięty w ciągu 3 godzin, wartość ta wynosi 3 dla stosunku guz/ tkanka mięśniowa i 4 dla stosunku guz/skóra. PS jest wydalany z organizmu w ilości 98% dziennie.

T a b e l a 2

Współczynnik lipofilowości i aktywność in vitro „Radachlorin, roztwór 0,5% do zastrzyków („Photochlorin).

Testy, linie komórkowe	Cytotoksyczność (toksyczność „ciemna) % do kontroli przy 5 pM	Fotocytotoksyczność, EC50, pM1	(Cd)
Test MTT, PC-12	96,5	1,8	1,40
Test MTT, RGGN1	103,7	1,8
Test MTT, Hep 27	109,7	3,9
Test fioletu krystalicznego, PC-12	86,2	1,5
Test fioletu krystalicznego, RGGN1	93,0	1,8
Test fioletu krystalicznego. Hep 27	87,9	4,7
Genotoksyczność, PC-12	104,7	3,5% do kontroli przy 5 pM
Genotoksyczność, RGGN1	77,8	132,2% do kontroli przy 5 pM
Genotoksyczność, Hep 27	78,8	100,7% do kontroli przy 5 pM

Z wyjątkiem genofototoksyczności

Wyniki oszacowania skuteczności kompozycji w PDT raka w eksperymentach in vivo na myszach (przykład 15) pozwalają stwierdzić, że „Radachlorin, roztwór 0,5% do zastrzyków („Photochlorin) i „Radachlorin, żel 0,5% posiadają uwidocznioną aktywność fotodynamiczną.

Kompozycja medyczna „Płynny ekstrakt chloryn, zawierająca sole sodowe chloryn (lub sole chloryn i innych mocnych zasad nieorganicznych) jest stosowana do wytwarzania postaci medycznych przez dodawanie odpowiednich substancji dodatkowych, dopuszczonych przez Farmakopeę Państwową FR: węglanu wapnia, sacharozy, glukozy, skrobi, stearynianu magnezu, poliwinylopirolidonów, poliglukanów, metyloglukaminy, roztworu izotonicznego, dimetylosulfotlenku, podłoży żelowych i emulsji wodnych itd. (przykłady 4-9).

Maści, płyny do wcierania, żele, kompozycje na bazie oleju są stosowane zewnętrznie, te postaci zawierają podłoża dopuszczone przez Farmakopeę Państwową FR, 5-20% dimetylosulfotlenku i 0,5-12% kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn lub 0,8-14% kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn i 86-99,2% dimetylosulfotlenku (przykłady 8, 9).

PL 206 902 B1

Zakres stężeń dimetylosulfotlenku w połączeniu z podłożami uzasadnia fakt, że przenikanie kompozycji do tkanek jest niskie przy stężeniu niższym niż 5%, a to obniża skuteczność PDT. Jeśli stężenie dimetylosulfotlenku jest wyższe niż 20%, to postaci medyczne na innych podłożach tracą trwałość przy przechowywaniu. Zakres stężeń kompozycji uzasadnia fakt, że jeśli to stężenie jest niższe niż 0,5%, to stężenie w tkance jest niewystarczające dla skutecznej PDT. Jeśli stężenie kompozycji jest wyższe niż 12%, to tkanka traci przezroczystość dla promieniowania świetlnego, całe światło ulega absorpcji w górnej warstwie tkanki, co powoduje oparzenie przy niskiej skuteczności procedury PDT.

PS	Bezwzględne maksimum akumulacji organ-μΜ- -godzina	Maksimum akumulacji w guzie, μΜ-godzina	Stosunek guz/skóra w maksimum akumulacji w guzie	Stosunek guz/mięśnie w maksimum akumulacji w guzie	Maksimum akumulacji w kontraście, μΜ-godzina	Stosunek guz/skóra w maksimum kontrastu	Stosunek guz/mięśnie w maksimum kontrastu	Wydalanie, %-godzina
Photochlorin dożylnie, 20 mg/kg	jelito cienkie 4,0 - 0,5	0,32 - 0,5	6, 4	1,6	0,29 - 3	14,5	2,9	98 - 24
Photochlorin dootrzewnowo, 40 mg/kg	Krew 5,2 - 0,5	0,70 - 5	3,9	3,0	0,48 - 18	44,0	32,0	98 - 24

Ekspozycja kompozycji na skórze przed napromieniowaniem wynosi 0,5-24 godziny przy stosowaniu zewnętrznym. Kompozycja nie ma czasu na wniknięcie w głąb tkanki na konieczną głębokość w czasie niższym niż 0,5 godziny. Jeśli odstęp czasu wynosi więcej niż 24 godziny, to obserwuje się spadek bezwzględnej wartości akumulacji, z powodu redystrybucji i wydalania. Poza tym, długotrwała ekspozycja postaci medycznych stosowania zewnętrznego na skórze jest niekorzystna z klinicznego punktu widzenia.

Kompozycja jest stosowana do podawania dożylnego kroplowego lub strumieniowego w postaci roztworów 0,1-1% w dowolnym podłożu dopuszczonym przez Farmakopeę Państwową FR (wolna od pirogenów woda do zastrzyków, dimetylosulfotlenek, roztwór soli fizjologicznej, itd.). Zastosowanie roztworów kompozycji o stężeniu niższym niż 0,1% jest bezsensowne, przy uwzględnieniu objętości roztworów, wprowadzanych do organizmu. Zastosowanie roztworów o stężeniu wyższym niż 1% jest niemożliwe ze względu na niską przesączalność takich roztworów na etapie sterylizacji przez filtry przeciwbakteryjne.

Moduł diodowego lasera półprzewodnikowego dla terapii fotodynamicznej ML-662-SP, zaprojektowany przez ZAO „MYLON (Sankt Petersburg) i OOO „SIGM PLUS (Moskwa) jest stosowany do aktywacji kompozycji PS „Płynny ekstrakt chloryn. Ten moduł posiada następujące dane wyjściowe (Certyfikat Rosyjskiego Ministerstwa Zdrowia, nr rej. 29/10-679-96):

- moc 2,5-3 W we wł óknie 200 mikronów z aperturą 0,22.

- diody laserowe wysokiego natężenia, koprodukcji korporacji „Polaroid (USA) i OOO „SIGM PLUS o długości fali maksimum napromieniowywania 662±3 nm.

Do aktywacji kompozycji PS można zastosować moduły o niższej mocy (z mniejszą liczbą diod), o długości fali maksimum napromieniowywania 662±3 nm, można również zastosować laser na ciele stałym z pompowaniem na drugą składową harmoniczną granatu itrowo-glinowego YAG:Nd³⁺, o długości fali maksimum napromieniowywania 670 nm. Zakres emitowanych energii zmienia się od 30 do 3000 J. Przy dawkach światła niższych niż 30 J procedura PDT staje się nadmiernie długa, gdyż skanowanie powinno być przeprowadzone na skrajnie niskich powierzchniach, dla uzyskania efektu optymalnego. Przy dawkach światła wyższych niż 3000 J i rozmiarach guzów spotykanych najczęściej w praktyce klinicznej obserwuje się znaczne uszkodzenie zdrowej tkanki, prowadzące do wydłużenia procesu regeneracji. Gęstość powierzchniowa emitowanej energii zmienia się od 50 do 2500 J/cm². Przy dawkach powierzchniowych światła niższych niż 50 J/cm² nie obserwuje się żadnego efektu. Przy dawkach powierzchniowych światła, wyższych niż 2500 J/cm², obserwuje się znaczne uszkodzenie zdrowej tkanki, prowadzące do wydłużenia procesu regeneracji. Zakres długości fal promieniowania wzbudzającego jest powiązany z charakterystyką techniczną stosowanego lasera (662±3 nm), przesunięcia maksimum absorpcji kompozycji, w zależności od polarności podłoża (654-662 nm) i zawartości purpuryny 5 w kompozycji (5-20%, szerokość połówkowa pasma absorpcyjnego w długich falach przy 663-670 nm) (tab. 1).

PL 206 902 B1

P r z y k ł a d 1. Opis właściwości fizykochemicznych PS. PS stanowi gęstą czarną masę , przybierającą zielony odcień w cienkiej warstwie, o zapachu alg.

W celu potwierdzenia autentycznoś ci wł a ś ciwoś ci PS, „Pł ynny ekstrakt chloryn, 7,5%, miesza się dokładnie, porcję ekstraktu (1 mg) rozpuszcza się w 10 ml medycznego lub najlepiej oczyszczonego, rektyfikowanego alkoholu etylowego, 95% i mierzy się gęstość optyczną w 662 nm (D). Wartość wynosi 0,23. Ekstynkcję molekularną ε (M^-1cm^-1) oblicza się według równania ε = D*597/(0,004). Otrzymana wartość powinna leżeć w zakresie 33300-35100. Po podstawieniu, ε = 0,23*597/(0,004) = 34328. Zatem, „Płynny ekstrakt chloryn, zawiera 7,5% PS.

Roztwór PS w alkoholu etylowym ma kolor żółtozielony. Roztwór przybiera zabarwienie rubinowe, jeśli przez warstwę roztworu w miejscu osłoniętym od światła przepuszcza się promienie światła z niebieskiej lampy medycznej MDS 220-75 (specyfikacje techniczne 16.535.376-79).

Dla oznaczenia ilościowego „Płynny ekstrakt chloryn miesza się dokładnie, porcję ekstraktu (5 mg) rozpuszcza się w 10 ml medycznego lub najlepiej oczyszczonego, rektyfikowanego alkoholu etylowego, 95% i mierzy się gęstość optyczną w 662 nm (D). Wartość wynosi 2,15. Zawartość PS oblicza się według równania: c,% = (D*597*10*100)/ (34230*5). Otrzymana wartość powinna odpowiadać podanej. Po podstawieniu, c,% = (2,15*597*10*100)7(34230*5) = 7,5% (odpowiada podanej).

Dla dalszych analiz do 100 mg „Płynnego ekstraktu chloryn dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, osad zostaje odsączony, wysuszony pod próżnią, nad pięciotlenkiem fosforu przez 12 godzin, po czym rejestruje się widma PMR, masowe i absorpcyjne w zakresie długości fal 360-720 nm.

Widmo PMR PS (Rys. 6): (w DMSO-D6, roztwór stęż.): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (s, mezo-H chloryny e₆ i purpuryny 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2d, CH=CH₂ chloryny e₆ i purpuryny 5), 6,84 (s, γ-mezo-CHO purpuryny 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2d, CH=CH₂), 5,43 (2s, γ-mezoCH^COOH), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H), 3,80, 3,56, (qx2, 4-CH₂CH₃), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (c, centralny CH3 chloryny e₆ i purpuryny 5), 2,38, 2,32, (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71, 2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8-CH3), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃),-1,63,-1,91 (2s, 2NH) ppm.

Widmo mas PS (Rys. 7): e.i., M+(%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym: λ (ε) (etanol), 386 (22130), 406 (113040), 506 (14870), 536 (8925), 608 (7437), 622 (34220).

Zgodnie z widmem PMR kompozycja zawiera 80% chloryny e6, 15% purpuryny 5 15% purpuryny 18 (małe sygnały przy 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 ppm), co odpowiada kompozycji według wynalazku. Zgodnie z widmem mas obecne są sygnały jonów molekularnych 596 chloryny e6, i 566 purpuryny 5. W widmie absorpcyjnym obecne jest pasmo przy 662 nm o wartości absorpcji, która dobrze zgadza się z ekstynkcją cząsteczkową PS w etanolu (34230).

A zatem, badaną próbką jest „Płynny ekstrakt chloryn.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie PS jako „Płynnego ekstraktu chloryn, 6,5%.

Biomasę Spirulina (2 kg) poddaje się działaniu acetonu (3x2 l), aż do całkowitej ekstrakcji chlorofilu, biomasę odsącza się, ekstrakt poddaje działaniu kwasu solnego (30 ml) aby usunąć jon magnezu z cząsteczki chlorofilu, ekstrakt zobojętnia się i odsącza się wytrąconą feofitynę a (8 g), następnie hydrolizuje się feofitynę a w mieszaninie kwas solny - aceton-heksan, dla tego celu feofitynę a rozpuszcza się w mieszaninie 50 ml acetonu, 5 ml heksanu i 40 ml kwasu solnego (37%), mieszaninę podgrzewa się do temperatury 40°C i miesza przez 1 godzinę, następnie dodaje się heksan (50 ml), a fazę organiczną przemywa się mieszaniną acetonu i kwasu solnego (2:1, 3x50 ml), fazę wodną przemywa się heksanem (5x40 ml), następnie fazę wodną, zawierającą feoforbid a, zobojętnia się nadmiarem roztworu wodnego cytrynianu sodu (tri-, di- lub mono-podstawionego), wytrącony feoforbid a zostaje odsączony, przemyty wodą (3x50 ml), rekrystalizowany z mieszaniny aceton - woda, wysuszony powietrzem, aż do ustalenia się wagi, (uzysk feoforbidu a wynosi 4,2 g, 7,1 mM, 77%), następnie feoforbid a (2,7 g, 4,56 mM) rozpuszcza się w acetonie (100 ml), dodaje się mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego (0,05%, 25 ml) miesza się w 60°C przez 5 min, dodaje się dodatkową objętość mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego (20%, 25 ml) mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 40°C przez 90 min, zobojętnia rozcieńczonym kwasem solnym (2%, około 250 ml), osad chloryny e6 oddziela się przez wirowanie, przemywa wodą destylowaną (5x10 ml) aż do zaniku reakcji kwasowej, otrzymuje się 1,85 g (2,96 mM, 65%) chloryny e6, następnie chlorynę e6 rekrystalizuje się z acetonu, w celu oddzielenia tetrapiroli liniowych, chlorynę e6 odsącza się i przemywa trzy razy wodą destylowaną, chlorynę e6 podgrzewa się w zamkniętym szczelnie

PL 206 902 B1 zbiorniku w temperaturze 40°C przez 30 dni, następnie ochładza się go i dodaje 1% roztworu wodorotlenku sodu, aż do pH 7,5, otrzymany PS zawiera 15% purpuryny 5, 80% chloryny e6 i 5% purpuryny 18 (chloryny p6), następnie roztwór PS jest dopełniany wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5%, co daje 14,2 g (50%) PS w postaci 6,5% „Płynnego ekstraktu chloryn.

Widmo PMR otrzymanego „Płynnego ekstraktu chloryn (Rys. 6): (w DMSO-D6, roztwór stęż.):

9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (s, mezo-H chloryny e₆ i purpuryny 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2d, CH=CH₂ chloryny e₆ i purpuryny 5), 6,84 (s, γ-mezo-CHO purpuryny 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6 10 (2d, CH=CH₂), 5,43 (2s, Y-mezo-CH₂COOH), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H), 3,80, 3,56, (qx2, 4-CH₂CH₃) 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (s, centralny CH₃ chloryny e₆ i purpuryny 5), 2,38, 2,32, (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71, 2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8-CH₃), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃), -1,63,-1,91 (2s, 2NH) ppm.

Kompozycja zawiera 80% chloryny e6, 15% purpuryny 5 i 5% purpuryny 18 (chloryny p6) (sygnały przy 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 ppm).

Widmo mas otrzymanej kompozycji (Rys. 7): e.i., M⁺(%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100, 0), 494 (7,3), 447 (9, 4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym (Rys. 8): λ (ε) (etanol), 386 (22320), 406 (113110), 506 (14880), 536 (8930), 608 (7440), 622 (34230).

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie PS jako „Płynnego ekstraktu chloryn, 7,5%.

Biomasę Spirulina (2 kg) poddaje się działaniu acetonu (3x2 l), aż do całkowitej ekstrakcji chlorofilu, biomasę odwirowuje się, ekstrakt poddaje działaniu kwasu solnego (30 ml) aby usunąć jon magnezu z cząsteczki chlorofilu, ekstrakt zobojętnia się i odsącza się wytrąconą feofitynę a (8 g), następnie hydrolizuje się feofitynę a w mieszaninie kwas solny - aceton-heksan, dla tego celu feofitynę a rozpuszcza się w mieszaninie 100 ml acetonu, 50 ml heksanu i 80 ml kwasu solnego (37%), mieszaninę podgrzewa się do temperatury 60°C i miesza przez 20 minut, następnie dodaje się heksan (100 ml), a fazę organiczną przemywa się mieszaniną acetonu i kwasu solnego (5:1, 3x50 ml), fazę wodną przemywa się heksanem (5x40 ml), następnie fazę wodną, zawierającą feoforbid a zobojętnia się nadmiarem roztworu wodnego cytrynianu sodu (tri-, di- lub mono-podstawionego), wytrącony feoforbid a zostaje odsączony, przemyty wodą (3x50 ml), rekrystalizowany z mieszaniny aceton - woda, wysuszony powietrzem, aż do ustalenia się wagi, (wydajność feoforbidu a wynosi 3,8 g, 6,4 mM, 67%), następnie feoforbid a (2,7 g, 4,56 mM) rozpuszcza się w acetonie (100 ml), dodaje się mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego (1%, 25 ml) miesza się w temperaturze 30°C przez 30 min, dodaje się dodatkową objętość mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego (20%, 25 ml) mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 60°C przez 20 min, zobojętnia rozcieńczonym kwasem solnym (2%, około 250 ml), osad chloryny e6 oddziela się przez wirowanie, przemywa wodą destylowaną (5x10 ml) aż do zaniku reakcji kwasowej, otrzymuje się 1,67 g (2,67 mM, 55%) chloryny e6, następnie chlorynę e6 rekrystalizuje się z acetonu, w celu oddzielenia tetrapiroli liniowych, chlorynę e6 odsącza się i przemywa trzy razy wodą destylowaną, chlorynę e6 podgrzewa się w zamkniętym szczelnie zbiorniku w temperaturze 100°C przez 1 godzinę, następnie ochładza się go i dodaje 1% roztworu wodorotlenku potasu, aż do pH 8,5, otrzymany PS zawiera 2% purpuryny 5,82% chloryny e6 i 16% purpuryny 18 (chloryny p6), następnie roztwór PS jest dopełniany wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 7,5%, co daje 1,1 g (50%) PS w postaci pasty 7,5%.

Widma otrzymanej kompozycji są podobne do widm podanych w przykładzie 2 i odpowiadają złożeniu widm chloryny e6 (rys. 9-11) i purpuryny 5 (rys. 12-14).

P r z y k ł a d 4. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie „Płynnego ekstraktu chloryn, 7,5%.

PS, zawierający 2% purpuryny 5, 82% chloryny e6 i 16% purpuryny 18 (chloryny p6) w postaci pasty 7,5%, opisany w poprzednim przykładzie, sączy się na żelu na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex G10, o średnicy 50 mm i wysokości 100 mm, z użyciem 1% roztworu wodorotlenku potasu jako eluenta, aż zawartość chloryny e6 wyniesie 90%, purpuryny 5 -5% i purpuryny 18 - 5%. Dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, do PS dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 7,5%mas co daje 6,8 g „Płynnego ekstraktu chloryn, 7,5%. Widmo elektronowe produktu - patrz rys. 8.

P r z y k ł a d 5. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie postaci medycznej „Radachlorin, 0,1% roztwór do zastrzyków.

Po sączeniu na żelu, do roztworu PS, opisanego w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, do PS dodaje się stężonego roztworu wodorotlenku sodu w wolnej od

PL 206 902 B1 pirogenów wodzie do zastrzyków, aż do pH 7,5, potem dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie PS 0,1%, następnie bakterie odsącza się od roztworu przez przeciwbakteryjne filtry mikroporowe „Millipore z porami 0,22 μm. Wydajność wynosi 500 ml roztworu. Widmo elektronowe produktu - patrz rys. 8.

P r z y k ł ad 6. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin).

Po sączeniu na żelu, do roztworu PS, opisanego w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, do PS dodaje się stężonego roztworu wodorotlenku sodu w wolnej od pirogenów wodzie do zastrzyków, aż do pH 7, następnie do roztworu dodaje się N-metylo-D-glukaminę do pH 8, pod kontrolą pH-metru, dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie PS 0,5%mas, następnie bakterie odsącza się od roztworu przez przeciwbakteryjne filtry mikroporowe „Millipore z porami 0,22 um. Wydajność wynosi 100 ml roztworu. Widmo elektronowe produktu - patrz rys. 8.

P r z y k ł a d 7. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie postaci medycznej „Radachlorin, 1% roztwór do zastrzyków

Po sączeniu na żelu, do roztworu PS, opisanego w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, osad odsącza się, dodaje się stężonego roztworu wodorotlenku sodu do pH 8,5, następnie dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 1%mas, następnie bakterie odsącza się od roztworu przez przeciwbakteryjne filtry mikroporowe „Millipore z porami 0,22 um. Wydajność wynosi 50 ml roztworu. Widmo elektronowe produktu patrz rys. 8.

P r z y k ł a d 8. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie postaci medycznych „Radachlorin, żel.

Po sączeniu na żelu do roztworu PS, opisanego w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, osad odwirowuje się, potem dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5%nias, następnie wykonuje się następujące warianty:

Wariant (a). Do 75 ml wody i 5 g dimetylosulfotlenku dodaje się w temperaturze pokojowej 0,3 g Pemulen TRI lub Carbopol 2020 (BF Goodrich, Wielka Brytania) i miesza przez ¹/-8 godzin. Dodaje się wodny roztwór zasady do pH 5. Żel zawiesza się ponownie, dodając „Płynny ekstrakt chloryn, 6,5% i wodę, aby uzyskać w powstałym żelu stężenie 0,05% chloryny eg, żel poddaje się działaniu próżni przez 5-10 minut przy 10-50 mm Hg. Wydajność wynosi 100 g żelu.

Wariant (b). Do 70 ml wody dodaje się 5 g dimetylosulfotlenku i „Płynny ekstrakt chloryn, 6,5%, aby uzyskać w powstałym żelu stężenie 0,05% chloryny e6, następnie dodaje się 15 g Aculyn 33A (ISP, USA). Substancję miesza się do uzyskania homogenności i dodaje się wodny roztwór zasady do pH 5. żel poddaje się działaniu próżni przez 5 minut przy 10-50 mm Hg. Wydajność wynosi 100 g żelu. Po sączeniu na żelu do roztworu PS, opisanego w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, osad odwirowuje się, potem dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 7,5%mas, następnie wykonuje się następujące warianty:

Wariant (c). Do 60 ml wody i 20 g dimetylosulfotlenku dodaje się w temperaturze pokojowej 0,7 g Pemulen TR1 lub Carbopol 2020 (BF Goodrich, Wielka Brytania) i miesza przez ¹/-8 godzin. Dodaje się wodny roztwór trietanoloaminy do pH 8,5. Żel zawiesza się ponownie, dodając „Płynny ekstrakt chloryn, 7,5% i wodę, aby uzyskać w powstałym żelu stężenie 1% chloryny e6, żel poddaje się działaniu próżni przez 5-10 minut przy 10-50 mm Hg. Wydajność wynosi 100 g żelu.

Wariant (d). Do 55 ml wody dodaje się 20 g dimetylosulfotlenku i „Płynny ekstrakt chloryn, 7,5%, aby uzyskać w powstałym żelu stężanie 1% chloryny e6, następnie dodaje się 15 g Aculyn 33A (ISP, USA). Substancję miesza się do uzyskania homogenności i dodaje się wodny roztwór zasady do pH 5. Żel poddaje się działaniu próżni przez 5 minut przy 10-50 mm Hg. Wydajność wynosi 100 g żelu.

P r z y k ł a d 9. Szczególny przypadek wytwarzania PS wytwarzanie postaci medycznych „Radachlorin, roztwór w dimetylosulfotlenku dla stosowania zewnętrznego.

Wariant (a). Po sączeniu na żelu w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, ten osad odsącza się, dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 7,5%mas, a 14 g powstałego „Płynnego ekstraktu chloryn dodaje się do 86 g dimetylosulfotlenku w temperaturze pokojowej, aby uzyskać w powstałym roztworze stężenie 1% chloryny e6 i miesza do homogenności. Wydajność wynosi 100 g żelu.

PL 206 902 B1

Wariant (b). Po sączeniu na żelu w przykładzie 4, dodaje się rozcieńczony kwas solny aż do wytrącenia PS, ten osad odsącza się, dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 7,5%mas a 0,8 g powstałego „Płynnego ekstraktu chloryn dodaje się do 99,2 g dimetylosulfotlenku w temperaturze pokojowej, aby uzyskać w powstałym roztworze stężenie 0,05% chloryny e6 i miesza do homogenności. Wydajność wynosi 100 g żelu.

P r z y k ł a d 10

Dla identyfikacji purpuryny 5, mieszaninę reakcyjną z przykładu 2 sączy się na żelu na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex G10, z użyciem 1% roztworu N-metylo-D-glukaminy jako eluenta, by uzyskać 3 frakcje, pierwsza i druga frakcja zawierają purpurynę 5. Te frakcje zobojętnia się, osad odsącza się, rozpuszcza w mieszaninie chloroform - metanol 1:1 i estryfikuje diazometanem. Mieszaninę przemywa się wodą, fazę organiczną oddziela się, suszy bezwodnym siarczanem magnezu, zatęża przez odparowanie pod próżnią i poddaje chromatografii na silikażelu Merck, Kieselgel, 0,04-0,063, zbiera się ostatnią (najmniej ruchliwą) frakcję. Jeśli konieczne, to powstały ester dimetylowy purpuryny 5 (10,1%, w przeliczeniu na suchą masę reakcyjną, użytą do estryfikacji) poddaje się ponownej chromatografii.

Widmo PMR (Rys. 15): (DMSO-D6, roztwór stęż.): 9,64, 9,46, 8,82 (s, mezo-H), 8,06 (2d, CH=CH₂), 6,82 (s, γ-mezo-CHO), 6,34, 6,31, 6,19, 6,16 (2d, CH=CH₂), 4,54 (m, 7-H), 4,46 (m, 8-H) 3,61 (q, 4-CH₂CH₃), 4,20, 3,81, 3,57, 3,53, 3,47 (5s,-COOCH₃ i centralny CH₃), 2,38, 2,35 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,68, 1,85 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,73 (d, 8-CH₃), 1,70 (t, 4-CH₂CH₃) ppm.

Widmo mas PS (Rys. 16): e.i., M+(%), 594 (8,6), 566 (100), 505 (5,1), 491 (9,8), 475 (8,2), 463 (1,7), 447 (1,4), 433 (1,7), 403 (2,0), 262 (5,0).

Widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym (Rys. 17): λ (ε) (chloroform), 408 (117200), 501 (11380), 542 (9830), 617 (6720), 668 (35200).

Ester dimetylowy purpuryny 5 rozpuszcza się w acetonie i dodaje się stężony kwas solny (37%) w stosunku 1:2. Mieszaninę miesza się przez 2 godziny w temperaturze 25°C, zobojętnia, purpurynę 5 odsącza się, przemywa wodą, rozpuszcza się w 10% roztworze N-metylo-D-glukaminy i sączy na żelu na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex G10, z użyciem 1% roztworu N-metylo-D-glukaminy jako eluenta, drugą frakcję zbiera się, zobojętnia, osad odsącza, przemywa wodą, suszy nad pięciotlenkiem fosforu aż do stałej wagi, aby uzyskać purpurynę 5 (5,2%, w przeliczeniu na suchą masę reakcyjną, użytą do estryfikacji).

Widmo PMR (Rys.12): (DMSO-D6, roztwór stęż.): 9,55, 9, 39, 8, 79 (s, mezo-H), 8,09, 8, 04, 7, 97, 7, 92 (2d, CH=CH₂), 6,84 (s, γ-mezo-CHO), 6,37, 6,32, 6,13, 6, 10 (2d, CH=CH₂), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H) 3,55 (q, 4-CH2CH3), 3,75, 3,46, 3,23 (s, centralny CH₃), 2,38,2, 32 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71,2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8-CH₃), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃)

Widmo mas (Rys. 13): e.i., M+(%), 566 (8,2), 494 (100,0), 447 (9,1), 435 (39,6421 (12,7), 405 (6,6), 254 (7,1).

Widmo absorpcyjne w zakresie widzialnym (Rys. 14): λ (ε) (etanol), 408 (116900), 501 (11320), 540 (9790), 615 (6710), 665 (35090).

P r z y k ł a d 11. Badania farmakokinetyki i metabolizmu kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn i postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin).

Myszom z linii Balb/c podano dootrzewnowo 769,2 mg/kg kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn 6,5% z przykładu 2 (50 mg/kg, w przeliczeniu na bezwodną substancję chloryn). Myszy zabito 3 godziny po zastrzyku (każda grupa składała się z 3 myszy). Materiał z wątroby, nerek, śledziony, płuc, jelita cienkiego, guza, otaczającej tkanki mięśniowej, a także z krwi, moczu, kału z jelita grubego, o wadze 100 mg każdy, zhomogenizowano dokładnie w homogenizatorach szklanych, dodając 4 ml roztworu soli fizjologicznej. Dla badania płynów biologicznych (krew, mocz) pobrano 0,1 ml każdego płynu, które następnie rozpuszczono w 4 ml roztworu soli fizjologicznej. Uzyskane homogenaty badano za pomocą spektrofluorymetru „Perkin-Elmer (model MPF-44A).

Badanie postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) przeprowadzono w podobny sposób w homogenatach organów i tkanek myszy, którym podano preparaty dootrzewnowo w dawce 50 mg/kg, zwierzęta zabito 3 godziny po zastrzyku.

W obu przypadkach występuje przesunięcie maksimum natężenia fluorescencji w tkankach wątroby, jelita cienkiego, śledziony i nerek do 670 nm (o 10-12 nm, w porównaniu do 0,01 M roztworu buforu boranowego, pH 9,2 i o 5-6 nm, w porównaniu do 0,01 M roztworu buforu boranowego z 1% albuminy osocza człowieka, co wskazuje na istnienie metabolizmu „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) (rys. 5). W widmie fluorescencji to zjawisko wygląda inaczej, niż zwykłe poszerzenie i przesunięcie w stronę zakresu fal długich, spowodowane efektem hydrofobowości śro18

PL 206 902 B1 dowiska (na przykład po oddziaływaniu hydrofobowym z białkami, lipoproteinami). Obserwuje się przesunięcie maksimum natężenia fluorescencji bez lub z niewielkim poszerzeniem pasma, co jest typowe dla tworzenia nowego związku. Widma fluorescencji purpuryny 5 w 0,01 M roztworze buforu boranowego z 1% albuminy osocza człowieka charakteryzują się obecnością pasma 670 nm.

We krwi, miąższu płuc oraz skórze i guzie obserwuje się poszerzenie widm 1,4-1,5 raza przy długości fali 669 nm, co wskazuje na obecność mieszaniny „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) (jego kompleksu z białkami) i metabolitu w homogenatach.

Jeśli „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) jest dodawany bezpośrednio do probówek z homogenatami nienaruszonych tkanek zwierząt w stężeniach 0,5 - 1,0 μM, we krwi, jelicie cienkim, wątrobie, śledzionie i płucu wykrywa się metabolit „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) (przesunięcie w stronę zakresu fal długich, bez poszerzania widma), a tylko w homogenacie skóry obserwuje się niewielki, 1,15 raza, wzrost szerokości połówkowej widma, co wskazuje na obecność w próbce mieszaniny „Photochlorin - metabolit.

Jeśli stężenie „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) w homogenatach tkanek zwiększa się do 5-10 μM, to obecność mieszaniny chloryna e₆ purpuryna 5 rejestruje we wszystkich praktycznie próbkach (przesunięcie w stronę zakresu fal długich, przy poszerzeniu szerokości połówkowej widma o 1,05-1,15 raza).

Można zatem założyć, że tworzenie metabolitu przy dodaniu „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) do homogenatów zależy od stężenia preparatu i aktywności enzymów zhomogenizowanej tkanki.

Te eksperymenty jasno wykazują przekształcenie chloryny e6 w purpurynę 5 w warunkach in vivo oraz ex vivo. To przekształcenie jest podobne do przekształcenia chloryny e6 w purpurynę 5 przy ogrzewaniu.

P r z y k ł a d 12. Współczynnik podziału n-oktanol/bufor fosforanowy, pH 7,4.

300 ml n-oktanolu i 300 ml buforu fosforanowego, pH 7,4 wiruje się manualnie przez 20 sek i za pomocą wirówki przez 10 min przy 10000 rpm dla rozdzielenia. Próbkę 0,1 ml PS o stężeniu PS 5 mg/ml rozpuszcza się w otrzymanym roztworze buforu (2 ml) i n-oktanolu (8 ml), maksimum absorpcji wyznacza się przy 406 nm.

Uzyskuje się wartości D^oc i D^bc, gdzie o to n-oktanol, b to bufor fosforanowy, c to próbka kontrolna. Podział równowagowy n-oktanol/bufor fosforanowy uzyskuje się przez wirowanie manualne 2 ml buforu fosforanowego i 8 ml n-oktanolu z 0,1 M PS przez 20 sek w temperaturze 20°C, z następującym później wirowaniem przez 10 min przy 10000 rpm. Gęstość optyczną każdej z faz mierzy się przy 406 nm, co daje wartości D^o i D^b, gdzie o to n-oktanol, b to bufor fosforanowy.

Cd wylicza się zgodnie ze wzorem:

Cd = (D^o V^o D^oc V^oc) / (D^b V^b D^bc, V^bc), gdzie V^o - objętość oktanolu, użytego do wyznaczenia podziału równowagowego (8 ml), V^oc - objętość oktanolu, nasyconego wodą, użytego w eksperymencie kontrolnym do wyznaczenia absorpcji próbki dodawanej (8 ml), V^b - objętość buforu, użytego do wyznaczenia podziału równowagowego (2 ml), V^bc - objętość buforu, nasyconego oktanolem, użytego w eksperymencie kontrolnym do wyznaczenia absorpcji próbki dodawanej (2 ml). Eksperyment przeprowadza się trzy razy, a uzyskane wartości Cd uśrednia się.

Wartość końcowa wynosi 1,4±0,3.

P r z y k ł a d 13. Wyznaczanie fototoksyczności in vitro (aktywności biologicznej) i cytotoksyczności (toksyczności komórkowej) postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin).

Dla tej pracy zastosowano laminar „Flow Lab (Wielka Brytania), inkubator CO2 „Flow Lab (Wielka Brytania), multiskan „Bio-Tek Instruments (USA), pożywki i surowice „PanEco (Rosja).

W jednym eksperymencie komórki z jednej linii przenosi się do dwóch płytek 48-komorowych: jednej dla napromieniowania laserem, a drugiej dla eksperymentu „ciemnego. Następnego dnia kompozycję dodaje się do komórek w stanie konfluencji, a płytki termostatuje się w czarnym papierze. Bada się stężenia kompozycji 0,1, 0,5, 2,0 i 5,0 μM. 3 godziny po dodaniu preparatu, komórki napromieniowuje się laserem, przy dawce ekspozycji na promieniowanie 50 J/cm², a 39 godzin później przeprowadza się test MTT oraz inkubację z -¹⁴C-tymidyną dla oceny syntezy DNA („ciemna płytka jest również testowana). We wszystkich przypadkach górną część płytki używa się do testu MTT, a dolną część używa się do pomiaru syntezy DNA i liczby komórek po wybarwieniu fioletem krystalicznym.

Dane przedstawione w tab. 2 są średnią 4 równoległych eksperymentów.

PL 206 902 B1

P r z y k ł a d 14. Wyznaczanie właściwości toksycznych in vivo kompozycji „Płynny ekstrakt chloryn i postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin).

Toksyczność bada się przy wstrzyknięciu dożylnym PS myszom laboratoryjnym, ważącym 19-21 g (hodowla Rosyjskiej Akademii Nauk Medycznych, Krukowo). Zwierzęta trzyma się w standardowych warunkach wiwarium i żywi zgodnie z Rozporządzeniem Ministerstwa Zdrowia ZSRR nr 1179 z 10.10.83 „O zatwierdzeniu specyfikacji wydatków na karmę dla zwierząt laboratoryjnych w instytucjach ochrony zdrowia. Toksyczność wyznacza się na podstawie śmierci zwierząt, po obliczeniu średniej dawki śmiertelnej - LD50. Obliczenia przeprowadza się zgodnie z metodami statystycznymi, zalecanymi przez Farmakopeę Państwową, wydanie XI (1,3). Na podstawie LD50 preparat badany jest zaliczany do odpowiedniej klasy toksyczności według Hodge'a i Sternera. Podczas eksperymentu rejestruje się również reakcje na zatrucie.

Dla każdej badanej dawki PS używa się 12 myszy (6 samców i 6 samic). Do wyznaczenia LD50 PS używa się następujących dawek: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 mg/kg. Roztwór o stężeniu PS 5 mg/ml wprowadza się do myszy dożylnie, dawkę zmienia się przez objętość wprowadzanego PS.

Wartość końcowa LD50 wynosi 210,53+22,2 mg/kg, wartość LD10 wynosi 169, 87 mg/kg.

P r z y k ł a d 15. Aktywność biologiczna in vivo z uż yciem postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin).

Aktywność fotodynamiczną postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin) bada się na myszach z linii Balb/c z rakiem zarodkowym T36, wszczepionym do mięśnia tylnej nogi. Waga myszy wynosi 20-21 g. Procedurę napromieniowania wykonuje się za pomocą lasera diodowego ML-662-SP 2 tygodnie po wszczepieniu guza. Skórę na obszarze napromieniowania depiluje się przed procedurą. Preparat wprowadza się dootrzewnowo w dawce 40 mg/kg, która odpowiada wystarczającej dawce terapeutycznej. Dla przeprowadzenia procedury napromieniowania myszy usypia się eterem. Waga guza w grupach eksperymentalnej i kontrolnej w chwili eksperymentu zmienia się od 0,9 do 1 g. Napromieniowanie przeprowadza się 5-6 godzin po wstrzyknięciu PS. Każde zwierzę, z wyjątkiem kontrolnych, jest napromieniowywane raz, potem obserwowane przez miesiąc po przeprowadzeniu procedury, a obszar nekrozy guza i ogólny stan fizjologiczny rejestruje się.

Średnia gęstość dawki ekspozycyjnej napromieniowania wynosi 150 do 300 J/cm².

Najlepsze wyniki w postaci całkowitej nekrozy guza, utworzenia skorupy w ciągu 1 tygodnia po PDT i odpadnięcia tej skorupy w ciągu 1,5 miesiąca po PDT obserwuje się w grupie, która otrzymała dawkę światła 300 J/cm².

P r z y k ł a d 16. Leczenie raka podstawnokomórkowego skóry z uż yciem postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór do zastrzyków („Photochlorin). '

Rak podstawnokomórkowy skóry jest diagnozowany podczas badania cytologicznego wycinka. Preparat wprowadza się kroplami dożylnie, aby uzyskać stężenie 0,7 mg/kg wagi pacjenta po rozcieńczeniu w 100 ml jałowego 0,9% roztworu NaCl. Po 2-3 godzinach przeprowadza się napromieniowanie guza za pomocą lasera diodowego ML-662-SP przy długości fali 662 nm z dawką powierzchniową 50 J/cm², bez znieczulenia. Podczas wstrzyknięcia preparatu i napromieniowania laserem nie rejestruje się żadnych niepożądanych efektów ubocznych. Po 2 godzinach po napromieniowaniu w miejscu guza tworzy się ciemnobrązowe ognisko z otaczającą 1-2 cm strefą zaczerwienienia. Pod koniec pierwszego dnia w miejscu guza tworzy się nekroza w postaci ciemnobrązowej skorupy (strupa). W cią gu 2-3 tygodni ma miejsce odrzucenie skorupy, a 2 tygodnie póź niej w miejscu uprzedniego raka podstawnokomórkowego skóry ma miejsce pełne pokrycie defektu skóry nabłonkiem, z dobrym efektem kosmetycznym.

P r z y k ł a d 17. Leczenie raka podstawnokomórkowego skóry z uż yciem postaci medycznej „Radachlorin, żel 0,05%).

Rak podstawnokomórkowy skóry jest diagnozowany podczas badania cytologicznego wycinka. Żel nakłada się na guz cienką warstwą, w miarę możności nie dotykając zdrowej skóry. Napromieniowanie przeprowadza się po 20-40 minutach po nałożeniu żelu. Procedurę napromieniowania przeprowadza się za pomocą lasera diodowego ML-662-SP („Mylon-Sigm Plus, Rosja) przy długości fali 662 nm. Gęstość dawki ekspozycyjnej napromieniowania wynosi 2500 J/cm². Po 2 godzinach po napromieniowaniu w miejscu guza tworzy się ciemnobrązowe ognisko z otaczającą 1-2 cm strefą zaczerwienienia. W ciągu tygodnia w miejscu guza tworzy się nekroza w postaci suchej ciemnobrązowej skorupy (strupa). W ciągu 2 tygodni ma miejsce odrzucenie skorupy, a 2 tygodnie później w miejscu uprzedniego

PL 206 902 B1 raka podstawnokomórkowego skóry ma miejsce pełne pokrycie defektu skóry nabłonkiem, z dobrym efektem kosmetycznym.

P r z y k ł a d 18. Usuwanie tatuażu z użyciem postaci medycznej „Radachlorin, 0,5% roztwór dimetylosulfotlenku dla stosowania zewnętrznego.

Roztwór nakłada się na chusteczkę, a następnie na tatuaż, przykrywa czarnym papierem lub cienką folią aluminiową i trzyma przez 30 min. Nadmiar roztworu usuwa się z powierzchni za pomocą wacika, zwilżonego alkoholem. Procedurę napromieniowania przeprowadza się za pomocą lasera diodowego ML-662-SP („Mylon-Sigm Plus, Rosja) przy długości fali 662 nm, napromieniowanie wykonuje się wzdłuż linii wzoru, starając się unikać działania na otaczające tkanki. Gęstość dawki ekspozycyjnej napromieniowania wynosi 120 J/cm². Po 1 godzinie od napromieniowania w miejscu tatuażu obserwuje się zaczerwienienie skóry i opuchliznę. Pod koniec drugiego dnia tworzy się ciemnobrązowy „obrazek z otaczającą go 1 mm sferą zaczerwienienia. W ciągu 2 tygodni w miejscu guza tworzy się nekroza w postaci suchej ciemnobrązowej skorupy. 2 tygodnie później ma miejsce odpadnięcie skorupy wraz z tatuażem. Przy mniejszych dawkach światła procedura przebiega bez nekrozy, przez odbarwienie skóry, ale w tym przypadku istnieje potrzeba powtarzania zabiegu. W miejscu tatuażu w wyniku PDT tworzy się w ciągu 6 tygodni miękka różowa tkanka, ta tkanka różni się nieznacznie od otaczającej skóry, obserwuje się dobry efekt kosmetyczny.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Fotosensybilizator, zawierający chlorynę w postaci soli z metalem alkalicznym, znamienny tym, że chloryna składa się z chloryny e6 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-karboksymetylo-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-2,7,12,18-tetrametyloporfiryny)

   HOOC stanowiącego 80-90%, purpuryny 5 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-formylo-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-12,18-tetrametyloporfiryny)

   PL 206 902 B1 stanowiącej 5-20% i purpuryny 18 - chloryny p6 (13-karboksy-17-[2-karboksyetylo]-15-karboksy-17,18-trans-dihydro-3-winylo-8-etylo-2,7,12,18-tetrametyloporfiryny) stanowiącej pozostałość tak, że wspomniane składniki tworzą kompozycję.
2. 2. Fotosensybilizator według zastrz. 1, znamienny tym, że jako metal alkaliczny użyty jest sód.
3. 3. Fotosensybilizator według zastrz. 1, znamienny tym, że jako metal alkaliczny użyty jest potas.
4. 4. Sposób wytwarzania fotosensybilizatora, według którego biomasa Spirulina jest poddawana działaniu acetonu aż do całkowitej ekstrakcji chlorofilu a, biomasę odsącza się odwirowuje, ekstrakt poddaje się działaniu kwasu w celu usunięcia jonów magnezu z cząsteczki chlorofilu i zhydrolizowania fitylowej grupy estrowej, a powstająca pochodna feoforbidu a reaguje z mocną zasadą nieorganiczną, znamienny tym, że po poddaniu ekstraktu działaniu kwasu w celu usunięcia jonów magnezu z cząsteczki chlorofilu, ekstrakt zobojętnia się, a wytrąconą feofitynę a odsącza się, następnie feofitynę a hydrolizuje się w mieszaninie kwas solny - aceton-heksan, zuż ywają c 6-16 ml acetonu, 0,6-6 ml heksanu i 5-10 ml stężonego kwasu solnego na 1 g surowej feofityny a, mieszaninę podgrzewa się do temperatury 40-60°C i miesza przez 20 min - 1 godziny, następnie dodaje się heksan (6-16 ml), a fazę organiczną przemywa się mieszaniną acetonu i kwasu solnego (2-10 : 1), fazę wodną przemywa się heksanem, następnie fazę wodną, zawierającą feoforbid a zobojętnia się nadmiarem roztworu wodnego cytrynianu sodu (tri-, di- lub mono-podstawionego), wytrącony feoforbid a zostaje odsączony, przemyty wodą, rekrystalizowany z mieszaniny aceton - woda, wysuszony powietrzem, aż do ustalenia się wagi, następnie feoforbid a rozpuszcza się w acetonie, dodaje się mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego, o stężeniu 0,05-1,00%, miesza się w temperaturze 30-60°C przez 5-30 min, dodaje się dodatkową objętość mocnej zasady nieorganicznej w postaci roztworu wodnego, o stężeniu 1-50%, mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 40-60°C przez 20-90 min, zoboję tnia rozcieńczonym kwasem solnym, osad chloryny e6 oddziela się przez wirowanie, przemywa wodą destylowaną aż do zaniku reakcji kwasowej, otrzymuje się 55-80% chloryny e6, następnie chlorynę e6 rekrystalizuje się z acetonu, w celu oddzielenia tetrapiroli liniowych, chlorynę e6 odsącza się i przemywa

   PL 206 902 B1 wodą destylowaną, chlorynę e6 podgrzewa się w zamkniętym szczelnie zbiorniku w temperaturze 40-100°C przez 1 godzinę - 30 dni, następnie ochładza się go i dodaje roztworu mocnej zasady, do pH 7,5-8,5, a następnie roztwór jest dopełniany wolną od pirogenów wodą do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas.
5. 5. Sposób wytwarzania fotosensybilizatora według zastrz. 4, znamienny tym, że po etapie dodawania mocnej zasady do pH 7,5 -8,5 mieszaninę sączy się na żelu, aby uzyskać zawartość procentową chloryny e6 do 80-90%, purpuryny 5 do 5-20% i purpuryny 18 - pozostałość, następnie dodaje się rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, roztwór jest dopełniany wolną od pirogenów wodą do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5% mas uzyskując w ten sposób „Płynny ekstrakt chloryn.
6. 6. Sposób wytwarzania fotosensybilizatora według zastrz. 5, znamienny tym, że po etapie przesączenia na żelu, do roztworu fotosensybilizatora dodaje się rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, następnie osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, substancje dodatkowe, dopuszczone przez Farmakopeę Państwową FR są dodawane do pH 7,5-8,5, dodaje się wolną od pirogenów wodę do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 0,1-1%mas, następnie odsącza się bakterie.
7. 7. Sposób wytwarzania fotosensybilizatora według zastrz. 5, znamienny tym, że po etapie przesączenia na żelu, do roztworu fotosensybilizatora dodaje się rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, ten osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, dopełniony wolną od pirogenów wodą do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas. „Płynny ekstrakt chloryn zostaje rozproszony w podłożu żelowym zgodnie z następującym stosunkiem: 0,5-12%mas. „Płynnego ekstraktu chloryn, 5-20%mas dimetylosulfotlenku, pozostałość stanowi woda, substancje dodatkowe, dopuszczone przez Farmakopeę Państwową FR oraz podłoże żelowe.
8. 8. Sposób wytwarzania fotosensybilizatora według zastrz. 5, znamienny tym, że po etapie przesączenia na żelu, do roztworu fotosensybilizatora dodaje się rozcieńczony roztwór kwasu solnego, aż do wytrącenia fotosensybilizatora, ten osad zostaje odsączony lub oddzielony przez wirowanie, dopełniony wolną od pirogenów wodą do zastrzyków, aby uzyskać stężenie fotosensybilizatora 6,5-7,5%mas, a uzyskany „Płynny ekstrakt chloryn zostaje rozpuszczony w dimetylosulfotlenku zgodnie z następującym stosunkiem: 0,5-12%mas „Płynnego ekstraktu chloryn, pozostałość stanowi dimetylosulfotlenek.