KR20040025911A - 감광제 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의약에 관한 것으로서, 종양의 감지 및 치료를 위한 감광제와 관련된다. 본 발명의 감광제는 염과 알칼리 금속 염 형태의 클로린을 함유하는 조성물의 형태로 구체화된다. 클로린 e6이 80-90%, 퍼퓨린 5가 50-20%이고, 나머지가 퍼퓨린 18인 것이 클로린으로 사용된다. 상기 감광제는 스피룰리나 바이오매스를 아세톤의 도움을 받아 추출하는 것에 의하여 제조된다. 그 다음, 상기 바이오매스를 산 처리, 중화, 가수분해, 페오포비드 α의 추출, 아세톤에의 용해, 강염기 첨가, 중화, 및 클로린 e6의 재침전에 노출시킨다.
Description
감광제(photosensitizer, PS)는 PDT에서 치료제로서 및 광 역학 진단(photodynamic diagnostics, PDD)에서 형광 표지(fluorescent labels)로서 사용된다.
모노-L-아스파틸 클로린e 6(mono-L-aspartil chlorine 6) 테트라소듐 염 "Npe6"는 PS인 것으로 알려져 있다(미국 특허 제4,977,177호).
상기 PS는 PDT에서 활성이다.
그 단점은 제조상의 어려움, 종양에 대한 효과적인 노출 시간을 감소시키는 지나치게 빠른 속도의 종양 축적(tumor accumulation) 및 배설 동력학(excretion dynamics), 및 PDT 과정에서 가능한 여러 종류의 종양 파괴 메커니즘 중에서 단지 하나, 즉, 혈관에 대한 영향(affection) 만을 활성화하는 높은 친수성(hydrophily) 때문에, 악성 형성(malignant formation) (종양)에서의 축적의 정도가 상대적으로 낮다는 점이다.
리실 클로린(lysil chlorin)p 6트리소듐 염 "LCP"는 PS인 것으로 알려져 있다(미국특허 제5,330,741호).
상기 PS는 PDT에서 활성이다.
그 단점은 제조가 어렵다는 점과, 13번과 15번 위치에 각각 아미드기가 존재하는 두 개의 모노아미드의 10:1 비율의 혼합물이라는 사실로서, 이는 분명하지 않은 생물학적 분배(biodistrubution) 및 배설 작용을 수반할 수 있다.
페오포비드(pheophorbid) α 소듐 염은 PS 인 것으로 알려져 있다 (미국특허제5,378,835호).
상기 PS는 악성 종양에 선택적으로 축적될 수 있고, PDT에서 활성이다.
그 단점은 용액 상태로 보관하는 경우에 산화하는 경향 (화학적 불안정성)이 있고, 고체 상태로 보관한 후에는 물에 완전히 용해되지 않으며, 소수성 (hydrophoby)이고, 그 결과, 유기체의 외부로 느리게 배설되며, 이는 피부 외피(skin integument)의 지연된 감광성(prolonged photosensitivity)을 수반한다는 점이다.
클로린(chlorin)e 6유도체들 역시 PS인 것으로 알려져 있다(미국특허 제5,002,962호).
식 중, R은 4 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 선형 또는 가지형의 소수성 탄화수소 치환기이다.
R이 헥실인 PS는 악성 종양에 대하여 회귀성(tropic)이고, PDT를 위한 효과적인 작용제이다.
그 단점은 제제의 제조(preparative producing) 및 정제가 어렵다는 점, 소수성이 높다는 점, 및 그 결과로서, 종양에서의 축적이 낮으며 보관 시 약물 제형 수용액의 안정성이 낮다는 점이다.
PS, 즉, 의료적 실시(medical practice)용으로 예정된, 알칼리 금속 염으로서의 클로린(chlorins)의 조성물을 제조하는 공지의 방법이 있다. 이 방법은 식물(꽃)의 바이오매스(biomass)를 6 - 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소와 2 - 10 개의 탄소 원자를 갖는 알콜의 2:1 내지 8:1 혼합물로 추출하고, 여기서 얻어지는 클로로필 용액을 상압에서 증발시키고, 추출 알콜에 비하여 탄소 원자수가 적은 알콜을 첨가하고, 상압에서 탄화수소를 혼합물로부터 완전히 증류시켜 제거하고, 알콜의 끓는점에서, 그러나 120℃ 보다는 낮은 온도에서 알칼리 알콜 용액(alcoholalkaline solution)을 클로로필 알콜 용액에 pH 11.5 - 11.8이 될 때까지 서서히(점차적으로) 가하고, 혼합물을 냉각시키고, 4 시간 동안 숙성시키고(incubated), 여과하고, 6 - 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소로 추출하고, 클로린의 마그네슘 착화합물(complexes)을 함유하는 알콜 상(alcohol phase) 을 분리하고, 알콜을 상압에서 증발시키고, 잔류물에 pH가 3.5가 될 때까지 염산을 가하고, 혼합물을 클로린이 완전히 침전될 때까지 숙성시킨 다음 여과하고, 침전물을 메탄올에 용해시키고, 알칼리 알콜 용액을 pH가 8.5가 될 때까지 가하고, PS 용액을 여과한 다음 진공 하에서 증발시키는 것으로 구성되어 있다 (미국특허 제3,102,891호).
이 방법의 단점은 추출물로부터 용매를 높은 온도에서 제거하여야 한다는 점과 알콜, 특히 메탄올의 사용으로서, 이는 E 엑소 사이클(exo cycle)의 동질 이형화(allomerisation)와 페오피틴(pheophytins) 및 페오포비드(pheophorbids)의 서로 다른 여러 종류의 산화 생성물의 형성을 초래하는 것 (K. Hyvarinen, J. Helaja, P. Kurchen, I. Kipelainen, P.H. Hynninen. H-1 and C-13 NMR spectra of the methanolic allomerization products of 13(2)-(R)-chlorophyll a. // Magnetic Resonance in Chemistry. - 1996, - V.33. -N8. -p.646-656) 으로서, 이는 정의되지 않은(defined)은, 또한 다시 제조하기 어려운 조성을 갖는 복잡한 혼합물에 이르게 한다는 점이다.
PS, 즉 클로린e 6소듐 염을 제조하는 공지의 방법이 있는데, 이는 1N NaOH 용액을 클로린e 6트리메틸 에테르의 테트라하이드로퓨란 용액에 가하고, 이 혼합물을 질소 분위기 하의 실온에서 2일 동안 교반하고, 혼합물에 물을 가한 다음, 유기 용매를 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 클로린e 6염 용액에 질소 기체를 버블링(bubbling)시켜 메틸렌 클로라이드를 제거하는 것으로 구성된다 (미국특허 제5,002,962호).
이 방법의 단점은 충분한 양의 클로린e 6트리메틸 에테르의 입수 가능성이 낮다는 점, 테트라피롤 거대 고리(macrocycle)의 13번 위치에 있는 에스테르 라디칼의 화학적 비활성(inertness)에 기인하는 장시간의 PS 제조 시간, 및 수용액 형태로 보관하는 경우에 거대 고리의 13번 위치에 있는 에스테르기의 불완전한 가수분해 (saponification)에 기인하는 PS 의약 제형이 불안정성이다.
PS, 즉 광역학 치료를 위한 "LCP" 감광제 (리실-클로린p 6의 트리소듐 염)를 제조하는 공지의 방법은 다음과 같이 구성된다. 바이오매스를 클로로필 α를 추출하기 위하여 아세톤으로 2-3 차례 처리하고, 바이오매스를 여과 또는 원심분리하고, 추출물을 증발시키고, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하고 프탈릴 에스테르기를 가수분해하기 위하여 산으로 처리하고, 동시에 에스테르화하기 위하여 메틸 알콜을 첨가하고, 반응 매스(reaction mass)를 물로 처리하고, 페오포비드 α 유도체를 클로로메틸렌으로 추출하고, 추출물을 중화하고, 물로 세정하고, 증발시키고, 알루미나 상에서 크로마토그래피하고, 메틸페오포비드 α를 클로로메틸렌과 메탄올의 혼합물로부터 결정화하고, 얻어진 페오포비드 α 유도체를 산소가 존재하는 피리딘-디에틸에테르-n-프로판올 내에서 강한 무기 염기와 반응시키고, 반응 매스를 물로 처리하고, 수층을 pH 4가 될 때까지 산성화하고, "불안정한 클로린(unstable chlorin)"을 클로로메틸렌으로 추출하고, 추출물을 증발시키고, "불안정한 클로린"을 테트라하이드로퓨란에 다시 용해시키고, 용액을 증발시키고, 이러한 절차를 700 nm에서의 흡수(absorption)의 증가가 멈출 때까지 계속하고, 얻어진 퍼퓨린(purpurine) 18을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 디아조메탄으로 에스테르화하고, 퍼퓨린 18 메틸 에스테르를 피리딘 존재 하에서 클로로메틸렌 중의 리신 수용액과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하고, 용매를 고 진공 상태에서 제거한 다음, 얻어진 조생성물(crude product)을 역상 고성능 액체 크로마토그리피(HPLC)로 정제하고, 용매를 동결건조(lyophilisation)으로 제거하고, PS를 PDT용 주사액(injection solution)을 얻기 위하여 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, 0.1N NaOH 용액을 첨가하고, pH를 0.1N HCl를 사용하여 생리적 값인 pH 7.35로 조절하고, 용액을 미세 기공 필터(microporous filter)를 통과시켜 여과한다(미국특허 제5,330,741호).
이 방법의 단점은 낮은 재생산성, 고생스러움(고진공, 결정화, 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC의 사용, 리신과의 오랜 반응시간), 및 독성이 높고 가연성인 시약(디아조메탄, 피리딘, 메탄올, 테트라하이드로퓨한, 디에틸 에테르)을 사용한다는 점이다. 이러한 단점은 이 방법을 의약 산업 분야에 부적합하게 한다. 그 외에, 얻어지는 수용성 목적 생성물은 수용액 상태에서는 4℃의 어두운 곳에서 단지 24 시간 동안 안정할 뿐이고, 고체 물질 상태에서는, 약전(pharmacopoeia)의 요건에 따르면 6 개월 이상 안정하여야 하지만, 4℃의 어두운 곳에서 단지 4 개월 동안 안정할 뿐이다(Leach M.W., Higgins R.J., Boggan J.E., Lee S.-J., Autry S., Smith K.M. Effectiveness of a Lysylchlorin p6/Chlorin p6mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Research 1992, V.52, 1235-1239). 그 외에도, 화학적 조성에 있어서, 이 PS는 13번과 15번 위치에 있는 모노 아미드의 대략 10:1 비율의 혼합물이며, 이는 유기체에서의 불분명한 생물학적 분배 및 배설을 일으킬 수 있다.
본 발명은 의약 분야(sphere of medicine), 특히 생물학적 활성 화합물을 사용하는 광 역학 치료(photodynamic therapy, PDT) 분야에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 30일 동안 배양(incubation) 하였을 때의 온도에 따른 퍼퓨린 5의 생성을 보여주는 것이다.
도 2는 퍼퓨린 5 함량의, 70℃에서의 배양 시간에 대한 의존성을 보여주는 것이다.
도 3은 퍼퓨린 5 함량의, 100℃에서의 배양 시간에 대한 의존성을 보여주는 것이다.
도 4는 의약 제형 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액" ("Photochlorin")을 종양 마우스(tumorous mice)에 20 mg/kg의 투여량으로 정맥 주사한 경우에, "클로린의 액체 추출물" 물질의 약물 동력학을 설명한 것이다.
도 5a는 혈액 내의 클로린 e6의 대사 산물 (식 I), 즉 퍼퓨린 5 (식 II)의 존재를 보여주는 것으로서, "2"로 표시된 곡선은 혈액 내의 PS에 대한 것이다.
도 5b는 클로린 e6(식 I)이 간에서 퍼퓨린 5 (식 II)로 대사된다는 것을 확인시켜 준다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 "클로린의 액체 추출물"의 PMR 스펙트럼을 보여주는 것이다.
도 7은 실시예 2에서 얻어진 "클로린의 액체 추출물"의 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 보여주는 것이다.
도 8은 실시예 2에서 얻어진 "클로린의 액체 추출물"의 가시광선 흡수 스펙트럼을 보여주는 것으로서, 이 스펙트럼은 에탄올 용액 상태에서 측정된 것이며, 물질의 농도는 5 mkg/ml이다.
도 9는 클로린 e6의 PMR 스펙트럼을 보여주는 것이다.
도 10은 클로린 e6의 질량 스펙트럼을 보여주는 것이다.
도 11은 클로린 e6의 가시광선 흡수 스펙트럼을 보여주는 것으로서, 이 스펙트럼은 에탄올 용액 상태에서 측정된 것이며, 클로린 e6의 농도는 15 mkg/ml (Sore band - 5 mkg/ml)이다.
도 12는 퍼퓨린 5의 PMR 스펙트럼이다.
도 13은 퍼퓨린 5의 질량 스펙트럼이다.
도 14는 퍼퓨린 5의 가시광선 흡수 스펙트럼을 보여주는 것으로서, 이 스펙트럼은 에탄올 용액 상태에서 측정된 것이며, 퍼퓨린 5의 농도는 15 mkg/ml (Sore band - 5 mkg/ml)이다.
도 15는 퍼퓨린 5 디메틸 에스테르의 PMR 스펙트럼이다.
도 16은 퍼퓨린 5 디메틸 에스테르의 질량 스펙트럼이다.
도 17은 퍼퓨린 5 디메틸 에스테르의 가시광선 흡수 스펙트럼을 보여주는 것으로서, 이 스펙트럼은 에탄올 용액 상태에서 측정된 것이며, 퍼퓨린 5 DME는 15 mkg/ml (Sore band - 5 mkg/ml)이다.
본 발명의 목적은 용이한 제조 분리 및 정제, 조화된 소수성-친수성, 및 그 결과로서, 최적화된 종양 축적 속도, 종양 및 유기체의 완전한 배설, 및 보관 시에 높은 안정성을 갖는 수용액 형태의 의약 제형인 것을 특징으로 하는 PS를 얻는 것이다.
상기의 목적은 알칼리 금속 염 상태의 클로린을 포함하는 PS를 제조하는 것에 의하여 달성되며, 상기 클로린은 클로린 e6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시메틸-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린) 80-90%,
퍼퓨린5(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-포밀-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린) 5-20%, 및
그 나머지가 퍼퓨린18- 클로린 p6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린)로 구성되어,
상기 성분들이 조성물을 형성하며, 소듐 및 포타슘이 알칼리 금속으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 PS의 PDT에서의 유효성(effectiveness)을 제공하는 PS의 물리화학적 및 생물학적 특성을 완전하게 달성하는 것은 물론, PS 제조방법의 높은 재현성(reproducibility)과 단순성(simplicity), 및 PS 의약 제형(medicinal forms)의 1 년 이상의 기간 동안의 화학적 안정성을 달성하는 것과, 독성 작용제(reagents)의 사용을 피하는 것이다.
본 발명에 따른 PS 제조방법의 요지는 다음과 같다.스피룰리나(Spirulina) 바이오매스를 클로로필 a가 완전히 추출될 때까지 아세톤으로 처리하고, 바이오매스를 여과하거나 또는 원심 분리하고, 추출물을 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 산으로 처리하고, 추출물을 중화하고, 침전된 페오피틴 α를 여과한 다음, 조 (crude) 페오피틴 α 1 g에 대하여 6-16 ml의 아세톤, 0.6-6 ml의 헥산 및 5-10 ml의 진한 염산으로 구성된 염산-아세톤-헥산 혼합물을 사용하여 페오피틴 α를 가수분해하고, 혼합물을 40-60℃ 로 가열하면서 20 분 - 1 시간 동안교반한 다음, 헥산 (6-16 ml)을 가하고, 유기층을 아세톤과 염산의 혼합물 (2-10 : 1)로 세정하고, 수층을 헥산으로 세정한 다음, 페오포비드 α를 함유하는 수층을 과량의 소듐 시트레이트 (트리-, 디- 또는 모노 치환된) 수용액으로 중화하고, 침전된 페오포비드 α를 여과하고, 물로 세정하고, 아세톤 - 물 혼합물로 재결정하고, 무게가 일정하게 될 때까지 공기 중에서 건조한다. 그 다음, 페오포비드 α를 아세톤에 용해시키고, 0.05-1.00% 농도의 무기 강염기 수용액을 가하고, 30-60℃에서 5-30 분 동안 교반하고, 1-50% 농도의 무기 강염기 수용액을 추가로 가한 다음, 혼합물을 40-60℃에서 20-90 분 동안 가열하고, 묽은 염산으로 중화하고, 클로린 e6침전을 원심분리하여 분리하고, 산 반응이 사라질 때까지 증류수로 세정하여, 55-80%의 클로린 e6을 얻는다. 그 다음, 선형 테트라피롤(tetrapyrrols)을 분리시키기 위하여 클로린 e6을 아세톤으로 재결정하여 여과하고, 증류수로 세정하고, 클로린 e6을 밀봉 저장기(sealed reservoir)에 넣고 40-100℃의 온도에서 1 시간 - 30일 동안 가열한 다음, 냉각시키고, pH 7.5-8.5가 될 때까지 강염기 용액을 가하고, 얻어진 용액을 주사용 아피로젠 수(apyrogenic water for injections)로 조절하여, 감광제의 농도를 6.5-7.5 중량%(mass %)로 만든다.
그 외에, PS의 제조방법에 있어서, pH 7.5-8.5가 될 때까지 강염기를 첨가하는 단계 이후에 그 혼합물을 젤 여과(gel filtrated)하여 클로린 e6의 퍼센트를 80-90%까지, 퍼퓨린5를 5-20% 까지, 그 나머지가 퍼퓨린18이 되도록 만들고, 그다음에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 가하고, 용액을 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만들어서, "클로린의 액체 추출물(Liquid extract of chlorins)"을 얻을 수 있다.
더 나아가서, PS의 제조방법에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 가한 다음, 침전물을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, 러시아 연방국 약전(RF State Pharmacopeia)에서 공인된 첨가제(additives)를 pH 7.5-8.5가 될 때까지 가하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제 농도를 0.1-1 중량%로 만든 다음, 박테리아를 여과하여 제거할 수 있다.
또한, PS의 제조방법에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 혼합물에 가하고, 이 침전물을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만들고, 얻어진 "클로린의 액체 추출물"을 0.5-12 중량%가 상기 "클로린의 액체 추출물"이고, 5-20 중량%가 디메틸설폭사이드이고, 나머지가 물, 러시아 연방국 약전에서 공인된 첨가제 및 젤 기재(gel substrate)인 비율에 따라 젤 기재에 분산시킬 수 있다.
더 나아가서, PS 의 제조방법에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 혼합물에 가하고, 이 침전물을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만들고, 여기서 얻어진 "클로린의 액체 추출물"을 0.5-12 중량%가 "클로린의 액체 추출물"이고 나머지가 디메틸설폭사이드가 되는 비율로 디메틸설폭사이드에 용해시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 표준 실험실 화학 파일럿(pilot) 장비를 사용하여, 기계적 교반기가 장치된 10-50 리터의 알루미늄 용기에서 바이오매스를 처리하고, 바이오매스를 오일 진공 펌프 및 액체 질소-냉각 트랩(trap)을 갖는 5-20 리터의 너치(nutch) 여과기를 통과시켜 여과하고, 바이오매스를 4 x 1 리터 버킷(buckets)을 갖는 냉각될 플로어(floor) 원심 분리기 내에서 6000 rpm의 회전 속도로 원심 분리하고, 추출물을 20 리터 유리병 내에서 산성화하고, 침전된 페오피틴 α를 오일 진공 펌프 및 액체 질소-냉각 트랩을 갖는 5-10 리터의 너치 여과기를 통과시켜 여과하고, 페오피틴 α를 교반기, 역류 냉각기 (backflow condenser) 및 마개 달린 공급 구멍(feeding hole)이 장치된 0.1-0.5 리터의 가열된 3구 둥근 바닥 플라스크 내에서 가수분해하고, 용액을 2 리터의 분액깔때기 내에서 세정하고, 2-5 리터의 비이커 내에서 중화하고, 페오포비드 α를 오일 진공 펌프 및 액체 질소-냉각 트랩을 갖는 2-5 리터 너치 여과기를 통과시켜 여과하고, 0.25-1 리터 평바닥 플라스크(chemical flat-bottom flasks) 내에서 재결정하고, 페오포비드 α를 아세톤에 용해시키고, 교반기, 역류 냉각기 및 마개 달린 공급 구멍(feeding hole)이 장치된 0.5-2 리터의 가열된 3구 둥근 바달 플라스크 내에서 무기 강염기와 반응시키고, 클로린 e6침전을 4 x 0.5 리터 버킷을 갖는 냉각된 플로어 원심 분리기 내에서 6000 rpm의 회전 속도로 분리하고, 클로린 e6를0.25-0.5 리터, 2-5 리터 평바닥 플라스크 내에서 재결정하고, 클로린 e6를 오일 진공 펌프 및 액체 질소-냉각 트랩을 갖는 1-2 리터 너치 여과기를 통과시켜 여과하고, 클로린 e6를 0.05-0.1 리터의 내열성 유리 둥근 바닥 플라스크 내에서 가열하고, 표준 pH 미터 및 분광 광도계를 사용하여 0.1-1 리터 비이커 내에서 조절하면서 강염기 용액과 반응시키고, 혼합물을 50-10 mm 직경 및 100-150 mm 높이를 갖는 칼럼 상에서 젤 여과하고, 밀리포어(Millipore) 타입의 표준 0.22 ㎛ 미세 기공 필터를 통과시켜 박테리아를 여과시켜 제거하고, "클로린의 액체 추출물"을 커터(cutter) 또는 비드 균질화기(bead homogenizer)를 사용하여 젤 기재에 분산시키는 방법으로 실시되며, 추가로 0.01 - 10 리터의 마개 달린 원뿔형 플라스크, 0.005 - 2 리터 실린더, 0.05 - 2 리터의 비이커, 20 리터의 병(bottles), 1 - 1000 g 범위의 계량기(weigher) 및 자석 교반기(magnetic stirrers)가 시료 및 용액의 제조에 사용되고; 온도계 및 직류 수류 냉각기(direct-flow water condenser)가 장치된 5 리터 둥근 바닥 플라스크가 아세톤과 헥산의 재생(regeneration)에 사용되며; 로터리 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)가 낮은 온도에서 용매를 신속하게 제거하기 위하여 사용된다.
PS를 제조하는 방법에 있어서, 진한 염산 용액은 20℃의 온도에서 통상적으로 36-37 중량%의 염화수소를 함유하는 포화 염화 수소 수용액인 것으로 간주된다.
페오피틴 α를 페오포비드 α로 전환시키는 단계에 있어서, 헥산과 아세톤의 부피 범위(6-16 ml의 아세톤과 0.6-6 ml의 헥산)는 사용되는 용매의 부피가 이보다 작은 경우에 페오피틴 α가 완전히 용해되지 못하고, 부피가 이보다 큰 경우에는용액이 신속한 가수 분해에 충분한 정도로 진하지 않을 것이라는 사실에 의하여 설명된다. 염산의 부피 범위 (5-10 ml)는 부피가 이 보다 작은 경우에는 페오포비드 α의 수율이 감소하고, 부피가 이 보다 큰 경우에는 부산물인 파이로페오포비드 α의 생성에 기인하여 반응 선택성이 낮아진다는 사실에 의하여 설명된다. 온도 범위가 40-60℃인 것은 온도가 이 보다 낮은 경우 페오포비드 α의 수율이 감소하고, 온도가 이 보다 높은 경우에는 부산물인 파이로페오포비드 α의 생성에 기인하여 반응의 선택성이 낮아지기 때문이다. 시간 범위가 20 분 - 1 시간인 것은 시간이 이 보다 짧은 경우 페오포비드 α의 수율이 감소하고, 시간이 이 보다 긴 경우에는 부산물인 파이로페오포비드 α의 생성에 기인하여 반응의 선택성이 낮아지기 때문이다. 첨가되는 헥산의 부피 (6-16 ml)는 부피가 이 보다 작은 경우 생성물 중의 하나인 피톨(phytol)을 반응 매스로부터 분리하는 것이 효과적이지 않고, 이 보다 저 큰 부피의 헥산을 사용하는 것은 합리적이지 않다는 사실에 의하여 설명된다.
페오포비드 α의 정제 단계에서는 유기 층을 아세톤과 진한 염산의 2:1 내지 10:1 비율의 혼합물로 세정한다. 혼합 비율이 2:1 보다 낮은 경우 박편 혼합물 침전(flaky admixture precipitate)이 생성되어, 이를 목적물인 페오포비드 α를 함유하는 수층으로부터 분리하는 것이 어렵다. 이 비율이 10:1 보다 큰 경우에는 수층이 아세톤으로 과포화되어, 헥산 층과의 혼합물이 형성되어 목적물인 페오포비드 α를 오염시킨다.
페오포비드 α를 클로린 e6로 전환시키는 단계에 있어서, 강염기의 농도는0.05-1.00% 범위인데, 하한 값은 페오포비드 α의 시클로펜탄온 고리 (E 고리)의 개환 반응에 필요한 최소값이고, 염기의 농도가 1% 보다 큰 경우에는 E 고리의 동질 이형화(산화) 반응이 일어나서 목적물인 클로린 e6대신 "불안정한 클로린"을, 그 다음 퍼퓨린18을, 더 나아가서 클로린 p6까지 생성시킨다.
그 다음, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 추가적인 부피의 무기 강염기가 1-50% 농도의 수용액 상태로 첨가된다. 이 농도가 1 % 보다 낮은 경우, 13번 또는 15번 위치에 있는 에스테르기의 가수분해가 불완전하게 일어난다. 염기의 농도가 50% 보다 높은 경우에는 PS의 테트라피롤 거대 고리가 개환되는 경우가 있다.
그 다음, 반응 매스를 30-60℃에서 5-30분 동안 교반하는데, 이 보다 낮은 온도는 E 고리의 동질 이형화 과정을 용이하게 하며, 이 보다 높은 온도는 클로린 e6가 클로린 e4로 분해되기 쉽게 한다. 추가적인 부피의 무기 강염기를 첨가할 때의 온도 범위는 40-60℃이고, 시간 범위는 20-90분이다. 시간과 온도가 이 보다 작은 경우 152위치에 있는 메틸 에스테르가 가수분해되지 않으며, 시간과 온도가 이 보다 큰 경우 부산물인 클로린 e4의 수율이 증가한다.
클로린 e6를 "클로린의 액체 추출물"로 전환시킬 때, 산화 및 이에 이어 151위치에 산화된 메틸렌기를 갖는 PS가 퍼퓨린 5 로 전환되는 탈수 및 탈 카르복실화 반응인 열 반응(thermolytic process)이 일어난다.
클로린 e6를 "클로린의 액체 추출물"로 전환시킬 때, 온도가 40℃ 보다 낮으면 긴 반응 시간이 필요하고, 이는 기술적으로 합리적이지 않다. 온도가 100℃ 보다 높은 경우에는 물질의 분해를 가속화하는 결과를 초래한다.
1 시간 미만의 공정 시간(duration of the process)은 온도가 100℃ 이상일 것을 필요로 하거나, 또는 생물학적 활성이 낮은 물질을 생성시킨다.
30 일 보다 긴 공정 시간은 물질의 비가역적인 변화(분해)를 수반한다.
최적의 공정 온도는 45-70℃ 이다 (도 1).
최적의 공정 시간은 70℃에서 2-9 일이거나 (도 2), 또는 100℃에서 1-48 시간이며 (도 3), 이 경우 혼합물 내에 5-20%의 퍼퓨린 5가 생성된다.
활성제 (PS)의 조성에 있어서, 5-20%의 퍼퓨린 5 및 80-95%의 클로린 e6을 함유하는 물질이 수용성 주사 의약 제형의 제조에 적합하다. 상기 물질이 5% 미만의 퍼퓨린 5를 함유하는 경우, 생물학적 활성이 낮다. 상기 물질이 20% 보다 많은 퍼퓨린 5를 함유하는 경우, 물에 대한 용해도가 나빠져서 보관 시에 의약 제형의 안정성에 바람직하지 않은 영향을 미치고, 미세 기공 필터를 통과하는 여과력이 나빠지게 한다. 테트라피롤 의약 제형은 바람직하지 않은 화학적 변화의 가능성이 높기 때문에 가열 또는 UV 조사에 의하여 멸균할 수 없으므로, 상기 후자의 성질은 의약 제형의 멸균을 위하여 필수적인 것이다.
상기 물질 내의 클로린 e6함량이 80-95% 인 것은 퍼퓨린 5를 수용성(water soluble) 상태로 유지하는 데에 필수적이다.
pH 범위는 그 작은 값, 즉 pH 7.5는, 수용액에 대한 클로린의 용해도가, 안정제를 첨가하지 않은 상태에서, 의약적인 사용에 적합한 농도가 되도록 하는 하한 값이라는 사실로부터 도출된 것이다. 상한 값, 즉 pH 8.5는 수산화 이온(OH-)에 대한 생물학적 허용 한계이다.
클로린 e6의 농도 범위 6.5-7.5%는 클로린 e6침전을 분리하는 단계에서의 원심 분리 또는 여과의 기술적 방법의 사용으로부터 도출된 것으로서, 이 방법들은 이 농도 범위를 갖는 생성물을 제공한다.
PS가 실시예 1에서 설명되고, 방법의 실시예가 실시예 2, 3에서 제공되며, 방법 실시의 특정예(special cases of method realization)가 실시예 4-9에서 설명된다.
화학적 관점에서 PS는 (수소화된 D 고리를 갖는) 클로린 본래의 3 종의 고리 테트라피롤 - 클로린 e6(식 I), 퍼퓨린 5 (식 II, 실시예 10) 및 (보관 시에) 알칼리성 매질 내에서 점차로 클로린 p6로 전환되는 퍼퓨린 18 (식 III) - 을 포함한다.
물리화학적 관점에서 PS는 가시광선 영역의 빛을 흡수하는 능력을 갖고 있으며, 이는 PS 광활성(photoactivation)과 이에 이어지는 조직 내에 용해된 분자 산소 및 유기 기질에의 에너지 전달(transfer)을 갖는 여기 상태(excited state)의 이완(relaxation)을 야기한다. 이러한 전달은 생체 조직 내에서의 산화 및 자유 라디칼 반응과 상기 조직의 손상 및 이에 이어지는 파괴 (괴사)를 일으킨다. PDT를 위한 가장 바람직한 여기 밴드(excitation band)는 장파장(long wavelength) 밴드 (표 1) 인데, 이는 생체 조직 내에서의 빛의 투과력이 파장의 증가에 따라 증가하기 때문이다. 따라서 PS는 654 - 670 nm의 파장을 갖는 빛에 의한 여기(excitation) 이후에 최대 10 mm 깊이까지 생물체(biological objects)를 손상시킬 수 있다.
제약학적 관점에서 PS는 "클로린의 액체 추출물"물질 (추출물은 유효 작용제의 농도가 20% 미만인 경우 액체로 간주된다)이다. 상기 물질은 바이오매스를 유기 용매를 사용하여 바이오매스를 추출하는 것이 필요하기 때문에 추출물로 간주된다. 표 1은 서로 다른 매질 내에 존재하는 "클로린의 액체 추출물"의 장파장 밴드에서의 흡수 최대 위치 및 분자의 소멸 흡수 값이다.
| PS | λmax, nmε, M-1㎝-1(0.01M 보레이트 완충용액, pH 9.18) | λmax, nmε, M-1㎝-1(1% 인간 혈청 알부민을 함유하는0.01M 보레이트 완충 용액, pH 7.2) | λmax, nmε, M-1㎝-1(에탄올) |
| "클로린의 액체추출물" | 654.5 (28270) | 662 (34200) | 662 (34230) |
식 II의 화합물은 악성 종양(malignant neoplasms) 및 감염된 환부(infectedfocuses)에 선택적으로 축적되는 능력을 갖지만, 물에 대한 용해성이 나쁘고, 식 I의 화합물은 분명한 광 역학적 활성과 더불어 식 II 화합물을 위한 용해 작용제(solubilizeing agent)이다.
약물학적 관점 (도 4, 실시예 11)에 있어서, 약물 동력학 변수의 특성(uniqueness)은, 유기체 내에서 식 I의 PS가 서서히 식 II의 PS로 전환되며, 이러한 반응이, 유기체 내에 주입(introduction)되는 순간부터 종양의 외부로 배설되는 순간까지, PDT가 효과적으로 실시(realization) 되기에 충분한 시간 동안, 식 II의 PS의 농도를 일정한 수준으로 유지시키는 것에 의하여 달성된다. 종양 마우스의 유기체 내에 주입된 이후에 제안된 PS 조성물은 혈류(blood flow) 내로 들어가고, 혈액 순환에 의하여 주로 식 I의 화합물이 0.5-4 시간 범위에서의 효과적인 PDT에 충분한 정도로 높고 안정한 PS 농도 - 0.27-0.32 μM - 가 종양 영역에 주입된 이후 최초 3 시간 내에 달성된다. 조성물 내에 식 (II)의 화합물이 5-20% 존재하는 것으로 인하여, 이 시간 내에 현저한 대조(high contrast)가 달성되는데, 이는 이 화합물이 현저한 대조로서 종양에 축적되는 능력을 갖고 있어, PS가 동물의 유기체(organism of animals) 내에 주입된 후 최초 3 시간이 된 순간에 최대 축적이 나타나기 때문이다 (대조 지수(index of contrast)는 피부에서 14.5이고, 근육에서 2.9이다). 이 시간 내에 식 (I) 화합물은 유기체 내에서 식 (II) 화합물로 전환되어 주입 이후 3-5 시간 범위에서 종양 영역에 높고 안정한 PS 농도를 제공하며, 이 농도는 점차 감소하여, 주입 후에 최대 18 시간까지 치료학적으로 충분하게 남아 있게 된다. 그 다음 식 (II) 화합물은 유기체 내에서 간을 통하여 배설되는독성이 없는 생성물로 분해된다.
식 (I)의 클로린 e6가 식 (II)의 퍼퓨린 5로 전환되는 것은 실험 동물의 장기(organs) 및 조직 시료의 형광 스펙트럼에 의하여 증명된다(도 5). "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형을 혈액 균질물(homogenate)에 10 μM의 농도로 첨가하고 (도 5a, (1), 이어서 광 분광 분석(spectrophotometric analysis)을 실시한 결과, 1.2 배 넓어진 형태의 형광 스펙트럼 변화 및 8 nm 긴 파장 스펙트럼 영역으로의 형광 세기 최대값의 전이(shift)가 관찰된다. "Photochlorin"을 더 낮은 농도 (C = 1 μM)로 첨가한 경우, 넓어짐이 없이 단지 스펙트럼의 전이만이 관찰되는데, 이는 대사산물 생성에서의 투여량 효과(dose effect)를 보여주는 것이다(도 5a, (2)).
도 5a, (3)은 "Photochlorin"을 마우스에 주입한 후 3 시간이 되었을 때 얻은 혈액 균질물 분석 결과를 보여주는 것이다. 여기서 가장 분명한 변수는 4 nm 긴 파장 스펙트럼 영역으로 전이된 최대 밴드에서 스펙트럼이 1.5 배 넓어진 것으로서, 이는 혈액 분석 시료 내에 "Photochlorin"과 대사 산물의 혼합물이 존재한다는 것을 나타내는 것이다.
"Photochlorin"을 10 μM 농도로 간 균질물이 담긴 시험관에 첨가한 경우 (도 5b, (1)), 스펙트럼의 특징적인 변화는 우선 형광 세기 최대값이 9 nm 긴 파장 스펙트럼 영역으로 전이된 것으로 나타난 것이다. 스펙트럼의 넓이 변화는 관찰되지 않는다.
유사한 도면(pictures)이 "Photochlorin"을 보다 낮은 농도, C = 1 μM로 첨가한 경우에도 관찰된다(도 5b, (2)).
동물에 제제를 주입(preparation introduction)한 후 3 시간이 되었을 때 얻은 간 조직 균질물(liver tissue homogenate)을 분석한 경우, 시료의 광 분광 분석 도면은 앞의 두 개의 도면과 유사하다(도 5b, (3)).
따라서 여기서 얻은 데이터는 간 균질물 내에 "Photochlorin" 대사 산물이 존재한다는 것을 보여준다.
선택성에 따른 광역학 효과에 최적인 실험동물 종양에서의 퍼퓨린 5의 축적이 정맥내 또는 복강내(intraperitoneal) 주입 후 3-18 시간 범위에서 관찰된다. 클로린 물질이 혈류 내에서 순환될 수 있는 것 또한 필요한 경우, 조사(irradiation) 최적 시간은 정맥내 주입 후 0.5-4 시간이 되었을 때이다. 통상적으로, "클로린의 액체 추출물"로 PDT를 실시하기 위해서는 제제 주입과 조사 사이의 간격을 0.5-18 시간으로 한다.
0.5%의 무수 "클로린의 액체 추출물" 물질을 함유하는 의약 제형 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")의 생물학적 활성이 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 평가된다.
양쪽 친화성(amphiphilicity)과 관련된 PS 균형(balance)이 생체 외 표준 실험에 의하여 증명된다(Kessel D. Biochemistry, 1977, V.16, p.3443-3449)(표 2, 실시예 12). 1-옥탄올/포스페이트 완충 용액, pH 7.4 (Cd) 내에서의 PS 분배 계수(distribution coefficient)는 1.40이다. 이는 청구된 PS가 수층 및 지질층 양쪽 모두에 균등하게 잘 용해된다는 것을 의미하는 것이며, 이는 이 화합물이 물로부터 운송 단백질(transport proteins) 및 지방 단백질(lipoproteins)을 함유하는 복합체(complexes) 쪽으로 재분배됨으로써, 세포의 내부로 신속하게 침투하여 세포질 세포내 멤브레인(cytoplasmic intracellular membrane) 및 마이크로좀(microsomes)에 축적되는 것, 또는 이들 세포의 형질 멤브레인(plasmatic membrane)을 통과하는 확산에 의하여 세포 내로 침투하는 것을 허용하는, PS의 친지성(lipophily)을 입증하는 것이다. 레이저 조사 후에 이러한 방법으로 침착된(deposited) 화합물은 세포 내에 단일항 산소(singlet oxygen)를 방출하여 그 세포를 사멸시킨다.
다른 유형의 암 세포에 대한 PS의 항암 활성이 3 열(lines)의 배양된 종양 세포: 래트 페오크로모시톰(pheochromocytomes) PC 12, 래트 Gasser 씨 신경 섬유종(rat Gasser's ganglion neurinoma) RGGN1 및 래트 간암 27 (Hep27)를 사용하는 생체 외 실험에서 얻어진 결과에 의하여 입증된다 (표 2, 실시예 13).
이하에서 설명하는 방법이 PS의 투여량 의존성 세포 독성(레이저 조사 후) 및 생물학적 "암흑(dark)" 활성의 연구에 이용된다.
1. PS의 세포 독성(cytotoxic) 및 광 세포 독성(cytophototoxic) 지수를 계산하기 위하여, PS 처치 및 레이저 조사 후에 살아있는(living) 세포의 수를 정확하게 정의하는 것을 가능하게 하는 MTT-테스트. 이 실험은 PS의 투여량 의존성 세포 독성 및 생물학적 "암흑"활성을 계산하는 것을 가능하게 한다(Andrei V. Reshetnickov, Gelii V. Ponomarev, Andrei V. Ivanov, Olga Yu. Abakumova,Tatyana A. Tsvetkova, Artashes V. Karmenyan, Aleksei G. Rebeko, Rudolf Ph. Baum. Novel drug form of chlorin e6// In Optical Method for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX, - T. J. Dougherty 편집, Vol.3909, 124-129 (2000)).
2. 실험의 종료 시점에서 세포 단층(monolayer)을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후의 세포 수 결정. 이 방법은 MTT-테스트에 비하여 덜 힘들고 비용이 덜 들며, PS의 세포 독성 및 광 세포 독성 또한 계산할 수 있게 하지만(A. E. medvedev 등, Biomed. Science, 1990, v. 1, p.261), 크리스탈 바이올렛은 죽은 세포 역시 염색시키므로 정확성이 낮다.
3. PS의 상대적인 유전자 독성(genotoxic) 및 광 유전자 독성(genophototoxic)이 세포 내에서의 DNA 합성 억제 정도에 의하여 평가된다. DNA 합성은 표준 방사선 측정법(radiometric methods, O. Yu. Abakumova, 등, J. Neural. Transm. Suppl. 3, 1998, V.52, p.87)을 이용하여,14C 티미딘(thymidine)이 DNA에 도입(incorporation)되는 수준에 의하여 계산된다.
연구되는 세 개의 셀라인(cell lines)은 모두 PS 처치 후에 레이저 조사 효과에 대하여 고도로 민감하다(MTT-테스트의 데이터). 레이저 조사에 대하여 민감한 정도에 따라 셀라인은 RGGN1 > PC12 > Hep27 로 분류된다.
암흑 생존(darkness survival)에서 세포에 대한 5 μM 농도에서의 지연된 PS 효과(prolonged PS effect)는 PC-12의 경우 96.5-86.2%, RGGN1의 경우 103.7-93.0%이고, Hep27에서 109.7-87.9% 이었다(각각, MTT-테스트 - 크리스탈 바이올렛). 동일한 조건에서, PC-12 세포에서의 DNA 합성은 실질적으로 영향을 받지 않은 상태로 유지되었으며, 그 값은 21.2이었고, Hep27과 RGGN1 세포에서는 각각 22.2% 감소하였다. 암흑에서 세포에 대한 5 μM PS 효과에 있어서 RGGN1과 Hep27 세포 수의 주목할 만한 증가는 PS에 의한 세포 증식 활성의 유도와 가장 큰 관련이 있을 것이다. 일반적으로 세포독성 활성은 증식 활성의 유도에 비하여 조사가 없는 경우에 PS에서 보다 통상적이다.
세포 사멸(cell death)이 PS로 처치된 셀에 레이저 조사를 한 후에 관찰된다. 제제의 투여량 의존성 광 세포 독성 활성이 검출되고, 이는 EC50을 계산하는 것, 즉, 50%의 세포가 죽는 PS 농도를 결정하는 것을 가능하게 한다. 이 데이터가 표 2에 제시된다. 20 μM 미만의 EC50값을 갖는 PS가 종양 성장 억제에 유효한 것으로 간주된다는 것이 주목되어야 한다.
5 μM PS 및 레이저 조사로 세포를 처리한 후에 광 유전자 독성(genophototoxicity)을 결정한 경우에 PC-12 세포에서의 DNA 합성이 크게 감소된다(조사만 실시된 제어군에 비하여 96.5% 감소). 낮은 PS 농도에서 레이저 조사 후의 DNA 합성 자극(stimulation)이 Hep27 및 RGGN1 세포에서 관찰되는데, 이러한 합성은 5 μM RC가 존재하는 경우에 상당히 감소된다. 주목할 만한 DNA 합성 자극은 낮은 PS 농도에서 생존한 변형(transformed) 간 및 신경(glia) 세포가 높은 DNA 합성 능력 및 개체 수 재생 능력을 갖는다는 사실로 설명될 수 있다.
따라서 PS는 서로 다른 유형의 종양 세포에 대한 고도의 광 세포 독성 제제이다. 높은 농도(> 5 μM)의 경우, 조사가 없더라도 적당한 종양 성장 억제제이다. 높은 광 유전자 독성 때문에 PS는 조사 시에 강한 종양 성장 억제제로 간주될 수 있다.
PS 독성이 생체 내 실험 (실시예 a4)으로 연구되었다. 평균 LD50값은 무게 계수로 고려하였을 때 210.53 ±22.2 mg/kg 로서, 실험 동물 10%를 사망하게 하는 투여량 (LD10)은 169.87 mg/kg이다. 이들 실험은 PS를 "독성이 낮은 물질"로 여기게 할 수 있다.
PS 생체 분배(biodistribution)가 생체 내 실험 (실시예 11)으로 연구되었다. 화합물의 다음과 같은 분배 메커니즘을, 뒤 다리 근육에 T36 배아 암종(embryocarcinoma)이 접종된 마우스의 복강 내에 PS를 주사하여 관찰하였다. 주사 후에 PS는 혈액 내로 들어간 다음, 동물의 장기 및 조직 내에 재분배된다 (표 3).
표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 종양 축적 최대값 (0.70 μM)이 복강 내에 40 mg/kg의 투여량으로 주사 후 5 시간이 되었을 때 달성되며, 이것이 오랜 시간 (18-24 시간) 동안 유지된다. 주사 후 18 시간이 되었을 때의 종양 농도(tumoral concentration)는 0.48 μM 이고, 이는 선택성이 높은 축적에서의 축적 절대 최대값(accumulation absolute maximum)에 비하여 1.5배 작은 것이다. 종양/근육 조직 비는 32이고, 종양/피부 비는 44이다.
종양 축적 최대값 (0.32 μM)이 정맥 내에 20 mg/kg의 투여량으로 주사한 후 0.5 시간이 되었을 때 달성되며, 이 또한 오랜 시간(최대 5 시간) 동안 유지된다. 정맥내 주사에서의 최대 대조가 3 시간이 되었을 때 달성되는데, 이 값은 종양/근육 조직 비를 3으로, 종양/피부 비를 4로 만든다. PS는 하루에 98%까지 유기체의 외부로 배설된다. 아래의 표 2는 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")의 친지성 계수 및 생체 외 활성을 보여주는 것이다.
| 테스트, 셀라인 | 세포 독성("암흑"독성),5 μM에서 대조군에 대한 % | 광 세포 독성,EC50, μM1 | (Cd) |
| MTT 테스트, PC-12 | 96.5 | 1.8 | 1.40 |
| MTT 테스트, RGGN1 | 103.7 | 1.8 | |
| MTT 테스트, Hep27 | 109.7 | 3.9 | |
| 크리스탈 바이올렛 테스트,PC-12 | 86.2 | 1.5 | |
| 크리스탈 바이올렛 테스트,RGGN1 | 93.0 | 1.8 | |
| 크리스탈 바이올렛 테스트,Hep27 | 87.9 | 4.7 | |
| 유전자 독성, PC-12 | 104.7 | 5 μM에서 대조군에 대하여 3.5% | |
| 유전자 독성, RGGN1 | 77.8 | 5 μM에서 대조군에 대하여 132.2% | |
| 유전자 독성, Hep27 | 78.8 | 5 μM에서 대조군에 대하여 100.7% |
1광 유전자 독성 제외
마우스에 대한 생체 내 실험에 있어서 암 PDT 시의 제제의 효과 계산 결과는 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 및 " "Radachlorin, 0.05% 젤"이 분명한 광 역학적 활성을 갖는 것으로 주장할 수 있게 한다.
클로린 소듐 염(또는 클로린과 다른 무기 강염기의 염)을 포함하는 "클로린의 액체 추출물" 의약 물질은, 칼슘 카보네이트, 자당(saccharose), 포도당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글루칸, 메틸글루카민, 등장액(isotonic solution), 디메틸설폭사이드, 젤 및 물-에멀전 기재(water-emulsion substrates) 등과 같은, 러시아 연방국 약전에서 공인된 다른 첨가제를 보충하는 것에 의하여 의약 제형으로 제조하는 데에 사용된다 (실시예 4-9).
연고, 바르는 약(liniments), 젤, 오일 기반 제제(oil-based preparations)가 외용으로 사용되며, 이들 제형은 러시아 연방국 약전에서 공인된 기재, 5-20%의 디메틸설폭사이드 및 0.5-12%의 "클로린의 액체 추출물" 물질을 함유하거나, 또는 0.8-14%의 "클로린의 액체 추출물" 물질과 86-99.2%의 디메틸설폭사이드를 함유한다(실시예 8, 9).
기재와 병용되는 디메틸설폭사이드의 농도 범위는, 농도가 5% 보다 낮은 경우 조직 내로의 물질 침투가 낮아, PDT 효과를 감소시킨다는 사실에 의하여 설명된다. 디메틸설폭사이드의 농도가 20% 보다 높은 경우에는 다른 기재(bases)에 기반을 둔 의약 제형이 보관 시에 안정성을 상실한다. 물질의 농도 범위는 이 농도가 0.5% 보나 낮은 경우에는 조직 내에서의 물질 농도가 효과적인 PDT에 충분하지 않다는 사실에 의하여 설명된다. 물질 농도가 12% 보다 높은 경우, 조직은 광 조사에 대한 투과성을 상실하게 되어 모든 빛이 조직의 상층에서 흡수되고, 이는 PDT 절차의 효율이 낮은 상태에서 화상을 초래한다. 아래의 표 3은 주요 약물 동력학 변수를 보여주는 것이다.
| PS | 절대축적최대값,장기-μM-시간 | 종양축적최대값,μM-시간 | 종양축적최대값에서의종양/피부 비 | 종양축적최대값에서의종양/근육 비 | 대조최대값에서의종양 축적,μM-시간 | 대조최대값에서의종양/피부 비 | 대조최대값에서의종양/근육 비 | 배설,%-시간 |
| Phochlo-rine정맥내,20 mg/kg | 소장-4.0-0.5 | 0.32-0.5 | 6.4 | 1.6 | 0.29-3 | 14.5 | 2.9 | 98-24 |
| Phochlo-rine복강내,40 mg/kg | 혈액-5.2-0.5 | 0.70-5 | 3.9 | 3.0 | 0.48-18 | 44.0 | 32.0 | 98-24 |
외용에 있어서, 조사 0.5-24 시간 전에 물질을 피부에 도포한다. 이 시간이 0.5 시간 미만인 경우 상기 물질이 필요한 깊이의 조직으로 침투할 시간이 되지 않는다. 시간 간격이 24 시간 보다 긴 경우에는 제제의 재분배 및 배설에 기인하여 제제의 절대 축적 값이 낮아지는 것이 관찰된다. 그 외에, 피부에 외용 의약 제형을 오랜 시간 동안 도포하는 것은 임상적인 관점에서 불편하다.
제제는 러시아 연방국 약전에 의하여 공인된 매질 중의 어떤 것(주사용 아피로젠 수, 디메틸설폭사이드, 식염수 등)에 용해된 0.1-1% 용액 형태로, 정맥내 점적 또는 흐름 주입(stream introduction)을 위하여 사용된다. 상기 물질의 용액을 0.1% 미만의 농도로 사용하는 경우 유기체에 주입되는 액체의 부피를 고려하였을 때 불합리하다. 1% 보다 높은 농도의 용액을 사용하는 것은, 이러한 용액은 항균 필터를 통과시켜 멸균하는 단계에서의 여과력(filterability)이 낮기 때문에 불가능하다.
ZAO "MYLON" (세인트 페테르스부르그) 및 OOO "SIGM PLUS" (모스크바)에 의하여 고안된 광 역학 요법을 위한 반도체 레이저 다이오드 모듈 ML-662-SP가 PS "클로린의 액체 추출물" 물질의 활성화에 사용된다. 상기 모듈은 다음과 같은 출력 데이터(output data)를 갖는다(러시아 보건부(Russian Ministry of Health)의 검증서, 등록 번호 29/10-679-96):
- 0.22 구경(aperture)을 갖는 200 마이크론의 파이버(fibre)에서 2.5-3W 의 전력(power).
- "Polaroid" 사(미국)와 OOO "SIGM PLUS" 가 공동 생산한, 662 ±3 nm의 최대 조사 파장을 갖는 고 강도 레이저 다이오드.
662 ±3 nm의 최대 조사 파장을 갖는 낮은 전력(적은 수의 다이오드를 갖는) 모듈이 PS 물질 활성화에 사용될 수도 있으며, 670 nm의 최대 조사 파장을 갖는 이트륨-알루미늄 심홍색(garnet) YAG:Nd3+의 제 2 조파(harmonic) 상에서 펌핑을 갖는 고상 레이저(solid-state laser) 가 사용될 수도 있다.
공급되는 에너지의 크기는 30부터 3000 J 까지 변한다. 30 J 미만의 광 조사 시에는 최적의 효과를 얻기 위하여 극도로 작은 영영에서 주사(scanning)가 실시되어야 하기 때문에 PDT 절차가 지나치게 오래 걸린다. 3000 J이 넘는 광 조사 및 임상에서 가장 자주 발생하는 종양 크기(tumor dimensions)에 있어서는, 재생 기간의 장기화를 초래하는, 건강한 조직의 상당한 손상이 관찰된다.
공급되는 에너지의 표면 밀도는 50부터 2500 J/㎠ 까지 변한다. 50 J/㎠ 미만의 표면 광 조사에서는 효과가 관찰되지 않는다. 2500 J/㎠ 보다 큰 표면 광 조사의 경우에는, 재생 기간의 장기화를 초래하는, 건강한 조직의 상당한 손상이 관찰된다.
여기(exciting) 조사의 파장 범위는 사용되는 레이저 (662 ±3 nm)의 기술적 특성, 매질의 극성(polarity)에 의존하는 제제(preparation) 흡수 최대값의 전이 (654-662 nm) 및 물질 중의 퍼퓨린 5의 함량 (5-20%, 663-670 nm에서의 장파장 흡수 밴드의 반 넓이(half-width)와 관련이 있다(표 1).
실시예 1. PS의 물리화학적 특성의 설명
PS는 얇은 층 형태의 녹색조(green shade)와 조류(algae)의 향을 갖는 밀도가 큰 흑색 덩어리(mass)이다.
PS 특성의 확실성을 확인하기 위하여 "클로린의 액체 추출물" 7.5%를 충분히 교반하고, 상기 추출물의 일부(1 mg)을 의약용 또는 가장 잘 정제 정류된(purified rectified) 에틸 알콜 (95%) 10 ml에 용해시키고, 662 nm에서 광학 밀도(optical density)를 측정한다 (D). 그 값은 0.23이다. 분자 소멸 값 ε(M-1cm-1)을 식 ε= D*597/(0.004)에 따라 계산한다. 그 결과 값은 33300-35100 범위 내에 들어가야 한다. 치환 후에 ε= 0.23*597/(0.004) = 34328이다. 따라서 "클로린의 액체 추출물"은 7.5%의 PS를 함유한다.
PS 에틸 알콜 용액은 황록색을 갖는다. 빛이 차단된 장소에서 상기 용액 층에 의료용 청색 램프 MDS 220-75 (기술 제원 16.535.376-79)의 광선을 통과시키는 경우 상기 용액은 루비색(ruby-red)이 된다.
정량을 위하여 "클로린의 액체 추출물"을 충분히 교반하고, 상기 추출물의일부(5 mg)를 의약용 또는 가장 잘 정제 정류된(purified rectified) 에틸 알콜 (95%) 10 ml에 용해시키고, 662 nm에서 광학 밀도(optical density)를 측정한다 (D). 그 값은 2.15이다. PS 함량은 식 c(%)= (D*596*10*100)/34230*5)에 따라 계산된다. 그 결과 값은 기술된 값(specified)에 해당하여야 한다. 치환 후에 c(%)= (2.15*596*10*100)/34230*5) = 7.5% 이다(기술된 값에 해당).
추가적인 분석을 위하여, PS가 침전될 때까지 "클로린의 액체 추출물" 100 mg에 묽은 염산 용액을 가하고, 침전물을 여과하고, 오산화인을 넣고 진공 하에서 12 시간 동안 건조하여, PMR, 질량 스펙트럼 및 흡수 스펙트럼을 360-720 nm의 파장 영역에서 측정한다.
PS PMR 스펙트럼 (도 6): (DMSO-D6 진한 용액): 9.64, 9.55, 9.52, 9.39, 8.90, 8.79 (s, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 메조-H), 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 CH=CH2), 6.84 (s, 퍼퓨린 5의 γ-메조-CHO), 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, CH=CH 2), 5.43 (2s, γ-메조-CH 2COOH), 4.60 (m, 7-H), 4.45 (m, 8-H), 3.80, 3.56 (qx2, 4-CH 2CH3), 3.75, 3.64, 3.51, 3.46, 3.29, 3.23 (c, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 핵 CH 3), 2.38, 2.32 (2m, 7-CH 2CH2COOH), 2.71, 2.20 (2m, 7-CH2CH 2COOH), 1.76 (d, 8-CH 3), 1.72 (t, 4-CH2CH 3), 1.63, 1.91 (2s, 2NH) ppm.
PS 질량 스펙트럼 (도 7): e.i., M+(%) 596(16.0), 566(9.4), 508(100.0), 494(7.3), 447(9.4), 435(50.6), 421(12.8), 405(6.9), 254(7.4).
PS 가시광선 흡수 스펙트럼: λ(ε)(에탄올) 386(22310), 406(113040), 506(14870), 536(8925), 608(7437), 662(34220).
PMR 스펙트럼에 의하면, 상기 물질은 80%의 클로린 e6, 15%의 퍼퓨린 5 및 5%의 퍼퓨린 18 (9.25, 9.10, 8.71, 7.84, 3.55, 3.32, 3.04 ppm에서의 작은 시그널)을 함유하며, 이것은 특허청구된 조성물에 해당한다. 질량 스펙트럼에 의하면, 클로린 e6의 분자 이온(molecular ions) 596과 퍼퓨린 5 분자 이온 566의 피크가 존재한다. 흡수 스펙트럼에는 PS 에탈론(etalon)(34230)의 분자 소멸(molecular extinction)에 잘 맞는 흡수값인 662 nm의 밴드가 존재한다.
따라서 연구된 시료는 "클로린의 액체 추출물", 7.5% 이다.
실시예 2."클로린의 액체 추출물", 6.5% 인 PS의 제조
스피룰리나바이오매스 (2 kg)를 클로로필 a가 완전히 추출될 때까지 아세톤 (3 x 2 L)로 처리하고, 바이오매스를 여과하고, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 추출물을 염산 (30 ml)으로 처리하고, 추출물을 중화하고, 침전된 페오피틴 α(8 g)를 여과한다. 그 다음, 페오피틴 α를 염산-아세톤-헥산 혼합물 내에서 가수분해하는데, 이를 위해 페오피틴 α를 50 ml의 아세톤, 5 ml의 헥산 및 40 ml의 염산 (37%)로 이루어진 혼합물에 용해시키고, 이 혼합물을 40℃ 로 가열하면서 1 시간 동안 교반한 다음, 헥산 (50 ml)을 가하고, 유기층을 아세톤과 염산의 혼합물 (2 : 1, 3 x 50 ml)로 세정하고, 수층을 헥산 (5 x 40 ml)으로 세정한다. 그 다음, 페오포비드 α를 함유하는 수층을 과량의 소듐 시트레이트 (트리-, 디- 또는 모노 치환된) 수용액으로 중화하고, 침전된 페오포비드 α를 여과하고, 물로 세정 (3 x 50 ml)하고, 아세톤 - 물 혼합물로 재결정하고, 무게가 일정하게 될 때까지 공기 중에서 건조한다 (페오포비드 α의 수율은 4.2 g, 7.1 mM, 77% 이다). 그 다음, 페오포비드 α(2.7 g, 4.56 mM)를 아세톤 (100 ml)에 용해시키고, 무기 강염기 수용액 (0.05%, 25 ml)을 가하고, 60℃에서 5 분 동안 교반하고, 무기 강염기 수용액 (20%, 25 ml)을 추가로 가한다. 그 다음, 혼합물을 40℃에서 90 분 동안 가열하고, 묽은 염산 (2%, 약 250 ml)으로 중화하고, 클로린 e6침전을 원심 분리하여 분리하고, 산 반응이 사라질 때까지 증류수 (5 x 10 ml)로 세정하여, 1.85 g(2.96 mM, 65%)의 클로린 e6을 얻는다. 그 다음, 클로린 e6을 선형 테트라피롤을 분리하기 위하여 아세톤으로 재결정하여 여과하고, 증류수로 3 회 세정하고, 클로린 e6을 밀봉 저장기에 넣고 40℃의 온도에서 30일 동안 가열한 다음, 냉각시키고, pH 7.5가 될 때까지 1% 수산화나트륨 용액을 가한다. 여기서 얻어진 PS는 15%의 퍼퓨린 5, 80%의 클로린 e6및 5%의 퍼퓨린 18 (클로린 p6)를 함유한다. 그 다음, PS 용액을 증류수로 조절하여 감광제 농도를 6.5%로 만들어서, 6.5% "클로린의 액체 추출물" 형태의 PS 14.2 g (50%)을 얻는다.
여기서 얻어진 "클로린의 액체 추출물"의 PMR 스펙트럼 (도 6): (DMSO-D6 진한 용액): 9.64, 9.55, 9.52, 9.39, 8.90, 8.79 (s, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 메조-H), 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 CH=CH2), 6.84 (s, 퍼퓨린 5의 γ-메조-CHO), 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, CH=CH 2), 5.43 (2s, γ-메조-CH 2COOH), 4.60 (m, 7-H), 4.45 (m, 8-H), 3.80, 3.56 (qx2, 4-CH 2CH3), 3.75, 3.64, 3.51, 3.46, 3.29, 3.23 (c, 클로린 e6및 퍼퓨린 5의 핵 CH 3), 2.38, 2.32 (2m, 7-CH 2CH2COOH), 2.71, 2.20 (2m, 7-CH2CH 2COOH), 1.76 (d, 8-CH 3), 1.72 (t, 4-CH2CH 3), 1.63, 1.91 (2s, 2NH) ppm.
상기 물질은 80%의 클로린 e6, 15%의 퍼퓨린 5 및 5%의 퍼퓨린 18 (클로린 p6) (9.25, 9.10, 8.71, 7.84, 3.55, 3.32, 3.04 ppm에서의 시그널)을 함유한다.
얻어진 물질의 질량 스펙트럼 (도 7): e.i., M+(%) 596(16.0), 566(9.4), 508(100.0), 494(7.3), 447(9.4), 435(50.6), 421(12.8), 405(6.9), 254(7.4).
가시광선 흡수 스펙트럼 (도 8): λ(ε)(에탄올) 386(22320), 406(113110), 506(14880), 536(8930), 608(7440), 662(34230).
실시예 3."클로린의 액체 추출물", 7.5% 상태의 PS의 제조
스피룰리나바이오매스 (2 kg)를 클로로필 a가 완전히 추출될 때까지 아세톤 (3 x 2 L)로 처리하고, 바이오매스를 원심 분리하고, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 추출물을 염산 (30 ml)으로 처리하고, 추출물을 중화하고, 침전된 페오피틴 α(8 g)를 여과한다. 그 다음, 페오피틴 α를 염산-아세톤-헥산 혼합물 내에서 가수분해하는데, 이를 위해 페오피틴 α를 100 ml의 아세톤,50 ml의 헥산 및 80 ml의 염산 (37%)로 이루어진 혼합물에 용해시키고, 이 혼합물을 60℃ 로 가열하면서 20 분 동안 교반한 다음, 헥산 (100 ml)을 가하고, 유기층을 아세톤과 염산의 혼합물 (5 : 1, 3 x 50 ml)로 세정하고, 수층을 헥산 (5 x 40 ml)으로 세정한다. 그 다음, 페오포비드 α를 함유하는 수층을 과량의 소듐 시트레이트 (트리-, 디- 또는 모노 치환된) 수용액으로 중화하고, 침전된 페오포비드 α를 여과하고, 물로 세정 (3 x 50 ml)하고, 아세톤 - 물 혼합물로 재결정하고, 무게가 일정하게 될 때까지 공기 중에서 건조한다 (수율은 3.8 g, 6.4 mM, 67% 이다). 그 다음, 페오포비드 α(2.7 g, 4.56 mM)를 아세톤 (100 ml)에 용해시키고, 무기 강염기 수용액 (1%, 25 ml)을 가하고, 30℃에서 30 분 동안 교반하고, 무기 강염기 수용액 (20%, 25 ml)을 추가로 가한다. 그 다음, 혼합물을 60℃에서 20 분 동안 가열하고, 묽은 염산 (2%, 약 250 ml)으로 중화하고, 클로린 e6침전을 원심 분리하여 분리하고, 산 반응이 사라질 때까지 증류수 (5 x 10 ml)로 세정하여, 1.67 g(2.67 mM, 55%)의 클로린 e6을 얻는다. 그 다음, 클로린 e6을 선형 테트라피롤을 분리하기 위하여 아세톤으로 재결정하여 여과하고, 증류수로 3 회 세정하고, 클로린 e6을 밀봉 저장기에 넣고 100℃의 온도에서 1 시간 동안 가열한 다음, 냉각시키고, pH 8.5가 될 때까지 1% 수산화칼륨 용액을 가한다. 여기서 얻어진 PS는 2%의 퍼퓨린 5, 82%의 클로린 e6및 16%의 퍼퓨린 18 (클로린 p6)를 함유한다. 그 다음, PS 용액을 증류수로 조절하여 감광제 농도를 7.5%로 만들어서, 7.5% 페이스트 형태의 PS 11.1 g (50%)을 얻는다.
여기서 얻어진 물질의 스펙트럼은 실시예 2에서 얻은 것과 유사하며, 클로린 e6의 스펙트럼 (도 9 - 11)과 퍼퓨린 5의 스펙트럼 (도 12 - 14)의 중첩을 나타낸다.
실시예 4.PS 제조의 특정예(special case) - "클로린의 액체 추출물", 7.5%의 제조
2%의 퍼퓨린 5, 82%의 클로린 e6및 16%의 퍼퓨린 18 (클로린 p6)를 함유하는, 앞의 실시예에 기술된 7.5% 페이스트 형태의 PS를, 직경이 50 mm이고 높이가 100 mm인 Sephadex G10 칼럼 상에서 1% 수산화칼륨 용액을 용리액으로 사용하여, 클로린 e6의 함량이 90%, 퍼퓨린 5의 함량이 5%, 퍼퓨린 18의 함량이 5%로 될 때까지 젤 여과한다. 묽은 염산 용액을 PS가 침전될 때까지 가하고, PS를 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제 농도를 7.5 중량%로 만들어서, 6.8 g의 "클로린의 액체 추출물",7.5% 를 얻는다. 생성물의 전자 스펙트럼은 도 8을 참조하라.
실시예 5.PS 제조의 특정예 - "Radachlorin, 주사용 0.1% 용액" 의약 제형의 제조
젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 실시예 4에 기술된 PS의 용액에 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 진한 수산화나트륨의 주사용 아피로젠 수용액을 pH 7.5가 될 때까지 가하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 PS의 농도를 0.1%로 만든 다음, 0.22 μm 크기의 기공을 갖는 항균 "Millipore" 미세 기공 필터를 통과시켜 박테리아를 용액으로부터 여과하여 제거한다. 여기서 500 ml의 용액이얻어진다. 생성물의 전자 스펙트럼은 도 8을 참조하라.
실시예 6.PS 제조의 특정예 - "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액" 의약 제형의 제조
젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 실시예 4에 기술된 PS의 용액에 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 진한(concentrated) 수산화칼륨 용액을 pH 7이 될 때까지 가한 다음, pH 미터에 의한 제어 하에 N-메틸-D-글루카민을 사용하여 pH 8.5로 조절하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제의 농도를 0.5 중량%로 만든 다음, 0.22 μm 크기의 기공을 갖는 항균 "Millipore" 미세 기공 필터를 통과시켜 박테리아를 용액으로부터 여과하여 제거한다. 여기서 100 ml의 용액이 얻어진다. 생성물의 전자 스펙트럼은 도 8을 참조하라.
실시예 7.PS 제조의 특정예 - "Radachlorin, 주사용 1% 용액" 의약 제형의 제조
젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 실시예 4에 기술된 PS의 용액에 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 진한 수산화나트륨 용액을 pH 8.5가 될 때까지 가한 다음, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제의 농도를 1 중량%로 만든 다음, 0.22 μm 크기의 기공을 갖는 항균 "Millipore" 미세 기공 필터를 통과시켜 박테리아를 용액으로부터 여과하여 제거한다. 여기서 50 ml의 용액이 얻어진다. 생성물의 전자 스펙트럼은 도 8을 참조하라.
실시예 8.PS 제조의 특정예 - "Radachlorin, 젤" 의약 제형의 제조
젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 실시예 4에 기술된 PS의 용액에 PS가 침전될때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제의 농도를 6.5 중량%로 만든 다음, 다음과 같이 변형하여 실시한다.
변형 (a). 0.3 g의 Pemulen TR1 또는 Carbopol 2020 (BF Goodrich, 영국)을 실온에서 75 ml의 물과 5 g의 디메틸설폭사이드에 가하고, 1/4-8 시간 동안 교반한다. 알칼리 수용액을 pH 5가 될 때까지 가한다. 젤을 보충적인(supplementing) "클로린의 액체 추출물", 6.5% 및 물에 다시 부유시켜, 얻어지는 젤 내의 클로린 e6의 농도를 0.05%로 만들고, 젤을 5 분 동안 10-50 mmHg 에서 진공화한다. 100 g의 젤을 얻는다.
변형 (b). 5 g의 디메틸설폭사이드와 "클로린의 액체 추출물", 6.5%를 70 ml의 물에 가하여 얻어지는 젤 내의 클로린 e6의 농도를 0.05%로 만든 다음, 15 g의 Aculin 33A (ISP, 미국)를 가한다. 이 물질을 교반하여 균질화하고, 알칼리 수용액을 pH 5가 될 때까지 가한다. 젤을 5 분 동안 10-50 mmHg 에서 진공화한다. 100 g의 젤을 얻는다.
젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 실시예 4에 기술된 PS의 용액에 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 감광제의 농도를 7.5 중량%로 만든 다음, 다음과 같이 변형하여 실시한다.
변형 (c). 0.7 g의 Pemulen TR1 또는 Carbopol 2020 (BF Goodrich, 영국)을 실온에서 60 ml의 물과 20 g의 디메틸설폭사이드에 가하고, 1/4-8 시간 동안 교반한다. 트리에탄올아민 수용액을 pH 8.5가 될 때까지 가한다. 젤을보충적인(supplementing) "클로린의 액체 추출물", 7.5% 및 물에 다시 부유시켜, 얻어지는 젤 내의 클로린 e6의 농도를 1%로 만들고, 젤을 5 분 동안 10-50 mmHg 에서 진공화한다. 100 g의 젤을 얻는다.
변형 (d). 20 g의 디메틸설폭사이드와 "클로린의 액체 추출물", 7.5%를 55 ml의 물에 가하여 얻어지는 젤 내의 클로린 e6의 농도를 1%로 만든 다음, 15 g의 Aculin 33A (ISP, 미국)를 가한다. 이 물질을 교반하여 균질화하고, 트리에탄올아민 수용액을 pH 8.5가 될 때까지 가한다. 젤을 5 분 동안 10-50 mmHg 에서 진공화한다. 100 g의 젤을 얻는다.
실시예 9.PS 제조의 특정예 - "Radachlorin, 외용(external use) 디메틸설폭사이드 용액" 의약 제형의 제조
변형 (a). 실시예 4에서의 젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 PS의 농도를 7.5 중량%로 만든 다음, 얻어진 "클로린의 액체 추출물" 14 g을 실온에서 86 g의 디메틸설폭사이드에 가하여, 얻어지는 용액 중의 클로린 e6의 농도를 1%로 만들고, 교반하여 균질화한다. 100 g의 용액을 얻는다.
변형 (b). 실시예 4에서의 젤 여과 후에 묽은 염산 용액을 PS가 침전될 때까지 가하고, 생성된 침전을 여과하고, 주사용 아피로젠 수로 조절하여 PS의 농도를 7.5 중량%로 만든 다음, 얻어진 "클로린의 액체 추출물" 0.8 g을 실온에서 99.2 g의 디메틸설폭사이드에 가하여, 얻어지는 용액 중의 클로린 e6의 농도를 0.05%로 만들고, 교반하여 균질화한다. 100 g의 용액을 얻는다.
실시예 10
퍼퓨린 5를 확인하기 위하여 실시예 2의 반응 혼합물을 1% N-메틸-D-클루카민(N-methyl-D-glucamine) 용액을 용리액으로 사용하여 Sephadex G10 칼럼 상에서 젤 여과하여, 3 개의 분획(fractions)을 얻는데, 그 중 제 1 및 제 2 분획이 퍼퓨린 5를 함유한다. 이들 분획을 중화하고, 침전을 여과한 다음 클로로포름-메탄올 1:1 혼합물에 용해시키고, 디아조메탄으로 에스테르화한다. 혼합물을 물로 세정하고, 유기 층을 분리하여 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 진공 하에서 증발시켜 농축하고, Merck, Kieselgel, 0.04-0.063 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고, 최종(유동성이 가장 적은) 분획을 모은다. 필요한 경우, 얻어진 퍼퓨린 5 디메틸 에스테르 (에스테르화된 건조 반응 매스를 기준으로 계산하여 10.1%)를 반복적으로 크로마토그래피한다.
PMR 스펙트럼 (도 15): (DMSO-D6 진한 용액): 9.64, 9.46, 8.82 (s, 메조-H), 6.82 (s, γ-메조-CHO), 6.34, 6.31, 6.19, 6.16 (2d, -CH=CH 2), 4.54 (m, 7-H), 4.46 (m, 8-H), 3.61 (q, 4-CH 2CH3), 4.20, 3.81, 3.57, 3.53, 3.47 (5s, -COOCH 3및 핵 CH 3), 2.38, 2.35 (2m, 7-CH 2CH2COOH), 2.68, 1.85 (2m, 7-CH2CH 2COOH), 1.73 (d, 8-CH 3), 1.70 (t, 4-CH2CH 3) ppm.
질량 스펙트럼 (도 16): e.i., M+(%) 594(8.6), 566(100.0), 505(5.1),491(9.8), 475(8.2), 463(1.7), 447(1.4), 433(1.7), 403(2.0), 262(5.0).
가시광선 흡수 스펙트럼 (도 17): λ(ε)(클로로포름) 408(117200), 501(11380), 542(9830), 617(6720), 668(35200).
퍼퓨린 5 디메틸 에스테르를 아세톤에 용해시키고, 진한 염산 (37%)을 1:2의 비율로 첨가한다. 이 혼합물을 25℃에서 2 시간 동안 교반하고, 중화한 다음, 퍼퓨린 5를 여과하고, 물로 세정하고, 10% N-메틸-D-글루카민 용액에 용해시킨 다음, 1% N-메틸-D-글루카민 용액을 용리액으로 사용하여 Sephadex G10 칼럼 상에서 젤 여과하고, 제 2 분획을 모아서 중화하고, 침전을 여과한 다음, 물로 세정하고, 오산화인을 넣고 무게가 일정하게 될 때까지 건조시켜, 퍼퓨린 5 (에스테르화된 건조 반응 매스를 기준으로 계산하여 5.2%)를 얻는다.
PMR 스펙트럼 (도 12): (DMSO-D6 진한 용액): 9.55, 9.39, 8.79 (s, 메조-H), 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, -CH=CH2), 6.84 (s, γ-메조-CHO), 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, -CH=CH 2), 4.60 (m, 7-H), 4.45 (m, 8-H), 3.55 (q, 4-CH 2CH3), 3.75, 3.46, 3.23 (s, 핵 CH 3), 2.38, 2.32 (2m, 7-CH 2CH2COOH), 2.71, 2.20 (2m, 7-CH2CH 2COOH), 1.76 (d, 8-CH 3), 1.72 (t, 4-CH2CH 3) ppm.
질량 스펙트럼 (도 13): e.i., M+(%) 566(8.2), 494(100.0), 447(9.1), 435(49.6), 421(12.7), 405(6.6), 254(7.1).
가시광선 흡수 스펙트럼 (도 14): λ(ε)(에탄올) 408(116900), 501(11320),540(9790), 615(6710), 665(35090).
실시예 11."클로린의 액체 추출물" 물질 및 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"(Photochlorin") 의약 제형의 약물 동력학 및 대사 연구
실시예 2에서 얻은 6.5% "클로린의 액체 추출물" 물질 769.2 mg/kg (무수 클로린 물질을 기준으로 계산하여 50 mg/kg)을 Balb/c 라인 마우스의 복강 내에 주입하였다. 주사한 후 3 시간이 되었을 때 마우스를 희생시켰다(각 군은 3 마리의 마우스로 구성되었다). 혈액, 오줌, 대장으로부터의 대변(faeces)은 물론, 간, 신장, 비장, 폐, 소장, 종양, 주변 근율 조직 물질(materials)을 각각 100 g 씩 취하여 유리 균질화기(glass homogenizer) 내에서 충분히 균질화하고, 4 ml의 식염수 용액(saline solution)을 보충하였다. 생리적 유체(혈액, 오줌)을 검사하기 위하여, 각 유체 0.1 ml를 취하여 4 ml의 식염수 용액에 용해시켰다. 얻어진 균질물을 "Perkin-Elmer" 형광 분광계(spectrofluorimeter, MPF-44A 모델)로 연구하였다.
"Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형에 대한 연구를, 제제를 50 mg/kg의 투여량으로 마우스의 복강 내에 주사하고 3 시간 후에 동물을 희생시켰을 때의 마우스의 장기 및 조직 균질물에 대한 것과 유사한 방법으로 실시하였다.
양 쪽 모두의 경우에 간, 소장, 비장 및 신장 조직에서의 형광 세기 최대값이 670 nm로 전이 (0.01M 보레이트 완충 용액 pH 9.2에 비하여 10-12 nm이고, 1% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.01M 보레이트 완충 용액 pH 9.2에 비하여 5-6 nm)되었고, 이는 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")이 대사된 것을 나타내는 것이다(도 5).
형광 스펙트럼에서의 이러한 현상은 매질의 소수성 효과에 기인하는 단순한 스펙트럼의 넓어짐 및 장파장 영역으로의 전이 (예를 들면, 단백질, 지방 단백질과의 소수성 상호 작용 이후의)와는 다른 것으로 보인다. 세기 최대값의 전이는 새로운 화합물 생성의 경우에 전형적인 약간의 밴드의 넓어짐이 없이 또는 이와 함께 관찰된다. 1% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.01M 보레이트 완충 용액 pH 9.2 내의 퍼퓨린 5의 형광 스펙트럼은 670 nm 밴드가 존재하는 것이 특징이다.
피부 및 종양에서는 물론, 혈액, 폐 연조직(parenchyma)에 있어서, 669 nm의 파장에서 1.4-1.5 배의 스펙트럼 넓어짐이 관찰되며, 이는 균질물 내에 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")(그 단백질 복합체) 및 대사산물의 혼합물이 존재한다는 것을 나타내는 것이다.
"Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")을 직접 완전한 동물 조직(intact animal tissues)의 균질물이 담긴 시험관(tubes)에 0.5-1.0 μM 농도로 첨가한 경우, "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin")의 대사산물이 혈액, 소장, 간, 비장 및 폐에서 관찰되며 (스펙트럼의 넓어짐이 없이 장파장 영역으로 전이), 단지 피부 균질물의 경우에만 스펙트럼 반 넓이(half-width)가 1.15 배 증가하는 것이 관찰되는데, 이는 시료 내에 "Photochlorin" 대사산물의 혼합물이 존재한다는 것을 나타내는 것이다.
장기의 균질물 내의 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 농도를 5-10 μM 로 증가시킨 경우, 모든 시료에 있어서 실질적으로 클로린 e6및 퍼퓨린 5 혼합물의 존재가 기록된다 (스펙트럼 반 넓이가 1.15-1.05 배 증가된 상태에서 장파장으로의 스펙트럼의 전이).
따라서 균질물에 첨가되는 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 에서 대사산물의 생성은 제제의 농도 및 균질화된 조직의 효소 활성에 의존하는 것으로 생각될 수 있다.
이들 실험은 클로린 e6가 생체 내 및 생체 외 조건에서 퍼퓨린 5로 전환된다는 것을 명확하게 보여준다. 이러한 전환은 가열 시에 클로린 e6가 퍼퓨린 5로 전환되는 것과 유사하다.
실시예 12.n-옥탄올/포스페이트 완충 용액 pH 7.4 분배 계수
300 ml의 n-옥탄올 및 300 ml의 포스페이트 완충 용액 pH 7.4를 20초 동안 와류(vortexed)시키고, 분리를 위하여 10000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한다. 제조된 완충 용액 (2 ml)와 n-옥탄올 (8 ml)에, PS 농도가 5 mg/ml인 PS 분액(aliquot) 0.1 ml를 용해시키고, 406 nm에서의 흡수 최대값을 측정한다.
D o c 및D b c 값이 얻어지는데, 여기서 o는 n-옥탄올, b는 포스페이트 완충 용액이고, c는 제어군(control)이다. 0.1 ml의 PS를 함유하는 2 ml의 포스페이트 완충 용액과 8 ml의 n-옥탄올을 20℃에서 20초 동안 와류시키고, 이어서 10000 rpm을 10 분 동안 원심 분리하여, n-옥탄올/포스페이트 완충 용액 평형 분배가 이루어지도록 한다. 각 상의 광학 밀도를 406 nm에서 측정하여D o 및D b 값을 얻는데, 여기서 o는 n-옥탄올이고, b는 포스페이트 완충 용액이다.
C d 는 아래의 식에 따라 계산되며,
식 중,V o 는 평형 분배를 결정하기 위하여 취한 옥탄올의 부피 (8 ml)이고,V o c 는 분액 흡수(aliquot absorption)의 제어 측정(control determination)을 위해 취한, 물로 포화된 옥탄올의 부피 (8 ml)이고,V b 는 평형 분배를 결정하기 위하여 취한 완충 옹액의 부피 (2 ml)이고,V b c 는 분액 흡수(aliquot absorption)의 제어 측정을 위해 취한, 옥탄올로 포화된 완충 용액의 부피 (2 ml)이다. 실험을 3 회에 걸쳐 실시하여, 얻어지는C d 값을 평균한다.
결과 값은 1.4 ±0.3이다.
실시예 13."Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형의 광독성(phototoxicity) (생물학적 활성) 및 세포 독성(cytotoxicity) (세포에 대한 독성)의 결정
이를 위하여, 라미나(laminar) "Flow Lab"(영국), CO2-배양기(incubator)"Flow Lab"(영국), 다중 스캔(multiscan) "Bio-Tek Instruments"(미국), 배지(mediums) 및 혈청 "PanEco"(러시아)가 사용된다.
하나의 실험에 있어서, 하나의 셀 라인을 두 개의 48-셀 플레이트로 옮기는데, 그 하나는 레이저 조사를 위한 것이고, 다른 하나는 "암흑(dark)" 실험을 위한 것이다. 그 다음 날에, 제제를 융합 상태(confluent state)의 세포에 가하고, 플레이트를 흑지(black paper)에 싸서 항온 상태로 만든다. 농도가 0.1, 0.5, 2.0 및 5.0 μM인 제제에 대하여 연구한다. 제제를 첨가한 후 3 시간이 되었을 때, 세포에 50 J/㎠의 노출 조사선량(radiation dose)으로 레이저를 조사하고, 39 시간 후에, MTT-테스트를 실시하고, DNA 합성을 평가하기 위하여14C-티미딘으로의 배양 또한 실시한다("암흑" 트레이 역시 시험한다). 모든 경우에, 플레이트의 위 부분(upper part)는 MTT-테스트에, 아래 부분(lower part)은 DNA 합성 및 크리스탈바이올렛(crystal violet)으로 염색(staining)한 후의 세포 수를 측정하는 데에 사용된다.
표 2에 나타낸 데이터는 4 회의 평행 실험(parallel experiments)의 평균값이다.
실시예 14."클로린의 액체 추출물" 물질 및 "Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형의 생체 내 독성 연구
독성을 19-21 g의 체중을 갖는 실험실용 백색 마우스 (Krukovo의 Russian Academy of Medical Sciences에서 사육된)에 PS를 정맥 주사하여 연구한다. 이 동물을 표준 사육장 조건으로 유지하면서 1983년 10월 10일자의 소비에트 연방 공화국 보건부(Ministry of Health of the USSR) 명령 제1179호 "About the approval of specifications of forage expenditures for laboratory animals in health protection institutions"에 따라 부양한다. 독성을 동물의 사망에 의하여 결정하고, 평균 치사량 - LD50- 을 계산한다. 상기 계산은 주 약전(State Pharmacopoeia), 11판(1.3)에서 추천된 통계법에 따른다. LD50에 기초하여, 연구된 제제는 Hodge와 Sterner에 의한 특정 분류의 독성(specific class of toxicity)에 따라 언급된다. 중독 반응 또한 실험 중에 기록된다.
12 마리의 마우스 (6 마리의 수컷과 6 마리의 암컷)를 시험하려는 각 PS 투여량에 대하여 사용한다. PS의 LD50을 결정하기 위하여, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 mg/kg의 투여량이 사용된다. PS 농도가 5 mg/ml인 용액을 마우스에 정맥 주사로 주입하고, 주입되는 PS의 부피를 변화시켜 투여량을 변화시킨다.
얻어진 LD50값은 210.53 ±22.2 mg/kg이고, LD10값은 169.87 mg/kg이다.
실시예 15."Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형을 사용하는 생체 내 생물학적 활성 연구
"Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형의 광 역학 활성을, 뒤 다리 근육에 접종된 T36 배아 암종을 갖는 Balb/c 라인의 마우스에 대하여 연구한다. 마우스의 체중은 20-21 g이다. 조사 절차(irradiation procedure)를종양 접종 후 2 주가 되었을 때 다이오드 레이저 ML-662-SP로 실시한다. 조사 절차에 앞서 조사 영역 피부의 털을 깎는다.
치료에 충분한 양에 해당하는 40 mg/kg의 투여량으로 제제를 복강 내 주입한다. 조사 절차를 실시하기 위하여, 마우스를 에테르로 마취한다. 제어군과 실험군에서의 종양의 무게는 실험을 실시하는 순간에 0.9에서 최대 1 g까지 변한다. PS를 주사한 후 5-6 시간이 되었을 때 조사를 실시한다. 제어군을 제외한 모든 동물에 한 차례 조사한 다음, 상기 절차 후 1 개월 동안 관찰하고, 종양 괴사 영역 및 일반적인 생리적 상태를 기록한다.
노출 조사선량의 평균 밀도는 150 또는 300 J/㎠ 이다.
완전한 형태의 종양 괴사에 있어서 가장 좋은 결과는, 300 J/㎠ 의 광 투여를 받은 군에서, PDT 실시 후 1 주일이 되었을 때 딱지(crust)가 형성되고, PDT 후 1.5 개월이 되었을 때 상기 딱지가 떨어지는 것이 관찰된 것이다.
실시예 16."Radachlorin, 주사용 0.5% 용액"("Photochlorin") 의약 제형을 사용하는 기저 세포 피부암(basal cell skin cancer)의 치료
기저 세포 피부암이 찰과상(scrape)의 세포학적 검사(cytologic examination)에서 진단된다. 0.9% 멸균 NaCl 식염수 용액 100 ml에 희석한 후에 제제를 정맥 내에 점적(dropwise) 주사하여, 환자의 체중을 기준으로 0.7 mg/kg 의 농도가 되게 한다. 2-3 시간 후에 662 nm 파장을 갖는 다이오드 레이저 ML-662-SP를 이용하여 표면 조사선량 50 J/㎠ 으로 마취(anaesthesia)하지 않고 종양에 조사한다. 제제 및 레이저 조사 과정 중에 바람직하지 않은 부작용은 기록되지 않는다.조사 후 2 시간이 되었을 때 1-2 cm 의 주변 적색 영역을 갖는 어두운 갈색 병소(focus)가 종양 영역에 형성된다. 첫째 날의 종결 시점에서, 종양 영역에서 어두운 갈색의 건조된 딱지(건조가피)의 형태로 괴사(necrosis)가 형성된다. 2-3주가 되었을 때 딱지가 떨어지고, 2주 후에는 우수한 미용 효과와 함께 이전의 기저세포 암 영역 내의 피부 결함의 완전한 상피화(epithelisation)가 일어난다.
실시예 17."Radachlorin, 0.05% 젤" 의약 제형을 사용하는 기저 세포 피부암(basal cell skin cancer)의 치료
기저 세포 피부암이 찰과상의 세포학적 검사에서 진단된다. 젤을 종양 위에, 가능한 한 피부의 건강한 부분에 닿지 않도록, 얇은 층 형태로 도포한다. 젤을 도포한 후 20-40 분이 되었을 때 조사를 실시한다. 조사 절차는 662 nm 파장을 갖는 다이오드 레이저 ML-662-SP ("Mylon-Sigm Plus", 러시아)로 실시된다. 노출 조사선량의 밀도는 2500 J/㎠ 이다. 조사 후 2 시간이 되었을 때 1-2 cm 의 주변 적색 영역을 갖는 어두운 갈색 병소가 종양 영역에 형성된다. 1 주일이 되었을 때 종양 영역에서 어두운 갈색의 건조된 딱지 (건조가피)의 형태로 괴사가 형성된다. 2 주가 되었을 때 딱지가 떨어지고, 2 주 후에는 우수한 미용 효과와 함께 이전의 기저세포 암 영역 내의 피부 결함의 완전한 상피화(epithelisation)가 일어난다.
실시예 18."Radachlorin, 외용 0.5% 디메틸설폭사이드 용액" 의약 제형을 사용하는 문신(tattoo)의 제거
용액을 냅킨에 도포하고, 냅킨을 문신 위에 놓은 다음, 흑지 또는 얇은 알루미늄박으로 덮고, 30 분 동안 고정시킨다. 알콜로 적신 면솜으로 표면으로부터 과량의 용액을 제거한다. 조사 절차를 662 nm 파장을 갖는 다이오드 레이저 ML-662-SP ("Mylon-Sigm Plus", 러시아)로 실시하는데, 이 때 주변의 조직에 영향을 주는 것을 피하기 위하여 패턴 라인을 따라 조사를 실시한다. 노출 조사선량의 밀도는 120 J/㎠ 이다. 조사 후 1 시간이 되었을 때, 적색 피부(skin redness) 및 팽창이 문신 영역에서 관찰된다. 둘째 날의 마지막에, 1 mm 크기의 주변 적색 영역을 갖는 어두운 갈색의 "상(picture)"이 형성된다. 2 주 후에는 문신 영역에서 괴사가 어두운 갈색 딱지 형태로 형성된다. 2 주 후에는 딱지가 문신과 함께 벗겨진다. 보다 작은 광 조사선량에서는 착색 탈색(stain decolorisation)에 의한 괴사 없이 절차가 진행되지만, 이 경우에는 반복적인 작업이 필요하다. 6 주 후에는 PDT의 결과로서 문신 영역에 연한 핑크색 조직이 형성되는데, 이 조직은 주변 피부와 약간 다른 정도로서, 우수한 미용 효과가 관찰된다.
Claims (8)
- 클로린이 클로린 e6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시메틸-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린) 80-90%,퍼퓨린 5 (13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-포밀-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린) 5-20%, 및퍼퓨린 18 - 클로린 p6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린)이 나머지인 것으로 구성되어,상기 성분들이 조성물을 형성하는 것을 특징으로 하는, 알칼리 금속 염 상태의 클로린을 포함하는 감광제.
- 제 1 항에 있어서, 알칼리 금속으로서 소듐이 사용되는 것이 특징인 감광제.
- 제 1 항에 있어서, 알칼리 금속으로서 포타슘이 사용되는 것이 특징인 감광제.
- 스피룰리나바이오매스를 클로로필 α가 완전히 추출될 때까지 아세톤으로 처리하고, 바이오매스를 여과하거나 또는 원심 분리하고, 추출물을 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 산으로 처리하고, 얻어지는 페오포비드 α유도체를 무기 강염기와 반응시키는 것에 의한 것으로서, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 상기 추출물을 산으로 처리한 후에, 그 추출물을 중화하고, 침전된 페오피틴 α를 여과한 다음, 페오피틴 α를 염산-아세톤-헥산 혼합물 내에서 조 페오피틴 α1 g 당 아세톤 6-16 ml, 헥산 0.6-6 ml 및 진한 염산5-10 ml을 사용하여 가수분해하고, 이 혼합물을 40-60℃로 가열하여 20 분 - 1 시간 동안 교반한 다음, 헥산 (6-16 ml)을 가하고, 유기 층을 아세톤과 염산의 혼합물 (2-10:1)로 세정하고, 수층을 헥산으로 세정한 다음, 페오포비드 α를 함유하는 수층을 과량의 소듐 시트레이트 (트리-, 디- 또는 모노 치환된) 수용액으로 중화하고, 침전된 페오포비드 α를 여과하고, 물로 세정하고, 아세톤 - 물 혼합물로 재결정하고, 무게가 일정하게 될 때까지 공기 중에서 건조한 다음, 페오포비드 α를 아세톤에 용해시키고, 0.05-1.00% 농도의 무기 강염기 수용액을 가하고, 30-60℃에서 5-30 분 동안 교반하고, 1-50% 농도의 무기 강염기 수용액을 추가로 가한 다음, 혼합물을 40-60℃에서 20-90 분 동안 가열하고, 묽은 염산으로 중화하고, 클로린 e6침전을 원심 분리하여 분리하고, 산 반응이 사라질 때까지 증류수로 세정하여, 55-80%의 클로린 e6을 얻은 다음, 클로린 e6을 선형 테트라피롤을 분리시키기 위하여 아세톤으로 재결정하여 여과하고, 증류수로 세정하고, 클로린 e6을 밀봉 저장기에 넣고 40-100℃의 온도에서 1 시간 - 30일 동안 가열한 다음, 냉각시키고, pH 7.5-8.5가 될 때까지 강염기 용액을 가한 다음, 얻어진 용액을 주사용 아피로젠 수로 조절하여, 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만드는 것을 특징으로 하는, 감광제의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, pH 7.5-8.5가 될 때까지 강염기 용액을 가한 후에 혼합물을 젤 여과하여 클로린 e6의 퍼센트를 80-90% 까지, 퍼퓨린 5를 5-20% 까지, 그 나머지가 퍼퓨린 18이 되도록 만든 다음, 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 가하고, 이 용액을 주사용 아피로젠 수로 조절하여, 감광제 농도를 6.5-7.5%로 만들어 "클로린의 액체 추출물"을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 5 항에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 감광제 용액에 가한 다음, 침전을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, pH 7.5-8.5가 될 때까지 러시아 연방국 약전에 의하여 공인된 첨가제를 가하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제 농도를 0.1-1 중량%로 만든 다음, 박테리아를 여과하여 제거하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 5 항에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 감광제 용액에 가한 다음, 침전을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만들고, 그 "클로린의 액체 추출물"을, "클로린의 액체 추출물"이 0.5-12 중량%이고, 디메틸설폭사이드가 5-20 중량%이고, 나머지가 물, 의약적으로 허용되는 첨가제 및 젤 기재인 비율에 따라 젤 기재 위에 분산시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 5 항에 있어서, 젤 여과 단계 이후에 감광제가 침전될 때까지 묽은 염산 용액을 감광제 용액에 가한 다음, 침전을 여과하거나 또는 원심 분리하여 분리하고, 주사용 아피로젠 수를 가하여 감광제 농도를 6.5-7.5 중량%로 만들고, 여기서얻어진 "클로린의 액체 추출물"을, "클로린의 액체 추출물"이 0.5-12 중량%이고 나머지가 디메틸설폭사이드인 비율에 따라 디메틸설폭사이드에 용해시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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