MXPA03008925A - Fotosintetizadores y metodo para la produccion de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a la medicina y a un fotosintetizador para detectar y curar tumores. El fotosintetizador de la invencion esta modalizado en la forma de una composicion que contiene cloro en la forma de sal y metales alcalinoterreos. 80-90 % del cloro e6, se usa 5-20 % de purpurina 5, siendo el resto purpurina 18, como cloro. El fotosintetizador es producido al extraer la biomasa de la espirulina con la ayuda de acetona. Despues de lo cual, la biomasa es expuesta a tratamiento acido, neutralizacion, hidrolisis, extraccion de feoforbida a, disolucion en acetona, adicion de una base fuerte, neutralizacion y re-precipitacion del cloro6.

Description

FOTOACTIVADOKES Y METODO PARA LA PRODUCCIÓN DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION invención concierne a la esfera de la medicina, particularmente a la esfera de terapia fotodinámica (PDT) con el uso de compuestos activos biológicamente. Los fotoactivadores o fotosensibilizadores (PS) son usados como agentes de diagnóstico en PDT y como marcadores fluorescentes en diagnósticos fotodinámicos (PDD) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La sal tetrasódica de mono-L-aspartil clorina es "Npe6" es conocida como PS (Patente EDA No. 4,977,177) : Este PS es activa en PDT. Sus desventajas son: la laboriosidad de producir, dinámicas de excreción y de acumulación tumoral demasiado altas, que reducen el tiempo de exposición efectiva sobre el tumor, y comparativamente baja extensión de acumulación en formación maligna (tumor) a causa de la alta idrofilia, que activa solamente uno de varios mecanismos posibles de destrucción de tumor en él proceso de PDT, es decir, solamente la afección de los vasos sanguíneos. La sal trisódica de lisil cloro P6 "LCP" es conocida como PS (Patente EUA No. 5,330,741): Este PS es activo en PDT. Sus desventajas son: la laboriosidad de producir y el hecho de que es una mezcla de dos monoamidas en las posiciones 13 y 15 en la proporción de 10:1, que puede conducir a biodistribución y excreción ambiguas. La sal sódica de feoforbida a se conoce como PS (Patente EUA No. 5,378,835) : Este PS se puede acumular en tumores malignos y es activo en PDT . Su desventaja es la tendencia a la oxidación (inestabilidad química) en almacenamiento como solución, ninguna solubilidad total en agua después de almacenamiento como un sólido, hidrofobia y, como una consecuencia, la lenta excreción afuera del organismo, que conduce a una fotosensibilidad prolongada del integumento de la piel. Los derivados de clorina ee se conocen también como PS (Patente EUA No. 5,002,962): en donde R = substituyente hidrocarburo hidrofóbico, saturado o insaturado, de cadena recta o ramificada, que consiste de 4 a 25 átomos de carbono. PS, en donde R es hexilo, es trópico a tumores malignos y es un agente efectivo para PDT. Sus desventajas son: la laboriosidad de la producción y purificación preparativa, mucha hidrofobia y, como consecuencia, poca acumulación en tumor y baja estabilidad de soluciones acuosas de las - formas medicinales en almacenamiento. Se conoce un método de producir PS, es decir, composición de clorinas con metales alcalinos, destinadas para la práctica médica. Este método consiste de lo siguiente: se extrae biomasa vegetal (floral) con una mezcla 2:1 a 8:1 de hidrocarburos que consisten de 6-12 átomos de carbono y alcohol que consiste de 2-10 átomos de carbono, la solución de clorofila resultante se evapora a la presión atmosférica, se añade alcohol que consiste de menos átomos de carbono que el alcohol de extracción, el hidrocarburo es separado completamente por destilación de la mezcla a la presión atmosférica, se añade lentamente (gradualmente) solución alcalina de alcohol a la solución alcohólica de clorofilas a . la temperatura de ebullición, pero a menos de 120 °C, hasta que el pH es 11.5 - 11.8, la mezcla se enfrió, se incubó por 4 horas, se filtró, se extrajo con hidrocarburo que consiste de 6 a 12 átomos de carbono, se separa la fase alcohólica que contiene complejos de magnesio de clorinas, se evapora el alcohol a la presión atmosférica, se añade ácido clorhídrico al residuo hasta que el pH es 3.5, la mezcla se incuba hasta el fin de la precipitación de clorina y se filtra, el precipitado se disuelve en metanol, se añade solución alcohólica alcalina hasta que el pH es 8.5, la solución de PS se filtra y se evapora al vacío (Patente EUA No. 3,102,891). Las desventajas de este método son: el uso de altas temperaturas mientras que se retiran los solventes del extracto, el uso de alcoholes, especialmente alcohol metílico, que conduce a la alomerización de E exociclo y a la formación de múltiples productos de oxidación diferentes de feofitinas y feoforbidas (K. Hyvarinen, J. Helaja, P. Kurchen, I. Kipelainen, P.H. Hynninen. Espectro H-l y C-13 NMR de los productos de la alomerización metanólica de 13 (2) - (R) -clorofila a. // Magnetic Resonance in C emistry -1996- V. 33. - N8, - p. 646 - 656), esto conduce a la mezcla compleja, cuya composición es indefinida y difícil de reproducir. Se conoce un método para producir PC, es decir, la sal sódica de clorina ee, que consiste de lo siguiente: se añade solución 1 N de NaOH a la solución de éter trimetílico de clorina e<j en tetrahidrofurano, se agita la mezcla por 2 días a la temperatura ambiente bajo nitrógeno, se añade agua a la mezcla, luego se extrae el solvente orgánico con cloruro de metileno, las trazas de éste se eliminan por burbujeo de nitrógeno a través de la solución de la sal de clorina eg (Patente EUA No. 5, 002, 962) . Las desventajas de este método son: baja disponibilidad de cantidades suficientes de éter trimetílico de clorina e6 inicial, larga duración de producción de la PS, debido a la inercia química del radical éster en la 13ava. posición del macrociclo de tetrapirrol y la inestabilidad de la forma medicinal de PS en almacenamiento en la forma de solución acuosa debido a la saponificación incompleta del grupo éster en la 13ava. posición del macrociclo.

Se conoce un método de producir PS, es decir, fotosensibilizador de "LCP" para terapia fotodinámica (sal trisódica de lisil-clorina ps) , que consiste de lo siguiente: La biomasa es tratada con acetona 2-3 vec.es a fin de extraer clorofila a, la biomasa es filtrada o centrifugada, el extracto es evaporado, tratado con ácido a fin de remover el ión magnesio afuera de la molécula de clorofila e hidrolizar el grupo éster fitilico, se añade alcohol metílico para la esterificación concurrente, la masa de reacción es tratada con agua, el derivado de feoforbida a es extraído con metileno cloroso, el extracto es neutralizado, lavado con agua, evaporado, cromatografiado sobre óxido de aluminio, la metilfeoforbida a separada por cristalización de la mezcla de metileno cloroso - metanol y el derivado de feoforbida a resultante se hace reaccionar con una base inorgánica fuerte en la presencia de oxigeno en piridina - éter dietilico - n-propanol, la masa de reacción se trata con agua, la fase acuosa es acidificada hasta pH 4, se extrae la "clorina inestable" con metileno cloroso, se evapora el extracto, la "clorina inestable" es redisuelta en tetrahidrofurano, se evapora la solución, este procedimiento se repite hasta absorción a 700 nm se detiene para aumentar, la purpurina 18 resultante es disuelta en tetrahidrofurano, es esterificada con diazometano, el éster metílico de la purpurina 18 es mezclado con solución acuosa de Usina en metileno cloroso en la presencia de piridina, se agita la mezcla por 12 horas a temperatura ambiente, Los solventes son removidos al alto vacio, luego el producto crudo resultante es purificado por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC) , se remueven los solventes por liofilización, el PS es disuelto en regulador de fosfato a fin de obtener la solución inyectable para PDT, se añade solución de NaOH 0.1 N, se ajusta el pH al valor fisiológico de pH 7.35 con HCl 0.1 N y la solución se filtra a través de filtro microporoso (Patente EÜA No. 5,330,741) . Las desventajas de este método son: baja reproductibilidad, laboriosidad (el uso de alto vacío, cristalización, cromatografía de columna y HPLC, larga duración de la reacción con lisina) , el uso de reactivos inflamables y muy tóxicos (diazometano, piridina, metanol, tetrahidrofurano, éter dietílico) . Estas desventajas hacen el método inadecuado para la industria farmacéutica. Además, el producto objetivo soluble en agua resultante es estable solamente por 24 horas a 4 °C en la obscuridad, en la forma de solución acuosa, y en la forma de substancia sólida es estable solamente 4 meses a 4 °C en la obscuridad, mientras que de acuerdo con los requerimientos de la farmacopea, debería de ser estable no menos de seis meses (Leach M. W., Higgins R. J. Bogan J. E., Lee S. -J., Autry S., Smith K. M. Effectiveness of a Lysilchlorin p6/Chlorin p6 mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cáncer Research 1992, V. 52, 1235 - 1239) . Además, en cuanto a la composición química, este PS representa la mezcla de monoamxdas en las 13ava. y 15ava. posiciones en la proporción aproximada de 10: 1 que puede conducir a su distribución y excreción biológica ambigua afuera del organismo.

SUMARIO DE IA INVENCION El objetivo de esta invención es obtener PS que esté caracterizado por aislamiento y purificación preparativa fácil, hidrofobia- hidrofilia equilibrada y, como una consecuencia, por la velocidad óptima de acumulación y excreción tumoral afuera del tumor y del organismo completo, y también por la alta estabilidad en almacenamiento de las soluciones acuosas de las formas medicinales . Este objetivo se logra al producir PS que comprenda clorina en la forma de sal con metal alcalino, la clorina que esté compuesta de clorina e6 (13-carboxi-17-[2-carboximetil]- 15- carboximetil- 17, 18- trans- dihidro- 3-vinil- 8- etil- 2, 7, 12, 18- tetrametilporfirina) en un 80 - 90 % de purpurina 5 (13- carboxi- 17 [2 carboxietil]- 15- formil- 17, 18- trans- dihidro- 3- vinil 8- etil- 2, 7, 12, 18- tetrametilporfirina) (H) en un 5 - 20 %, y purpurina 18 - clorina p6 (13-carboxi- 17- [2- carboxietil]- 15- carboxi- 17, 18- trans-dihidro- 3- vinil- 8- etil- 2, 7, 12, 18-tetrametilporfirina) el resto,- de modo que los componentes mencionados de la composición formen la composición, sodio y potasio pueden usarse como metales alcalinos. También el objetivo de esta invención es lograr alta reproductibilidad del método de producir PS, la estabilidad química, simplicidad de las formas medicinales de PS no menos de 1 año, así como también lograr la totalidad de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de PS que proporcionan la efectividad de la PS en PDT, y también evitar el uso de reactivos tóxicos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención es ilustrada en las figuras: La figura 1, concierne al método y muestra la formación de purpurina 5 que depende de la temperatura en incubación por 30 dias . La figura 2 muestra la dependencia del contenido de purpurina 5 sobre el tiempo de incubación a la temperatura de 70 °C. La figura 3 muestra la dependencia del contenido de purpurina 5 sobre el tiempo de incubación a la temperatura de 100 °C. La figura 4 ilustra las farmacocinéticas de la substancia, "Extracto liquido de clorinas", usada como la forma medicinal "Radac lorin, solución al 0.5 % para inyecciones"' ("Photoclorin", Fotoclorina) en ratones con tumores en introducción intravenosa en la dosis de 20 mg/kg . La figura 5a muestra la presencia de un metabolito de clorina e (fórmula I) , es decir purpurina 5 (fórmula II) , en sangrer y las curvas marcadas como "1" , se toman para PS en regulador de borato 0.01 M con pH de 9.18, y las curvas marcadas como w2", se toman para PS en sangre. La figura 5b confírmale metabolismo de la clorina es (fórmula I) en purpurina 5 (fórmula (II) en hígado. La figura 6 muestra el espectro de PMR de la substancia "Extracto liquido de clorinas", obtenida en el Ej emplo 2. La figura 7 muestra el espectro de masa de la substancia "Extracto liquido de clorinas" obtenida del Ejemplo 2. La figura 8 muestra el espectro de absorción visible de la substancia "Extracto liquido de clorinas", obtenida en el Ejemplo 2, el espectro es tomado en etanol, la concentración de la substancia es 5 mg/ml. La figura 9 muestra el espectro de PMR de la clorina e6. La figura 10 muestra el espectro de masa de la clorina e6. La figura 11 muestra el espectro de absorción visible de la clorina e¡j, el espectro es tomado en etanol, la concentración de la clorina e6 es de 15 mg/ml (banda de Sore - 5 mg/ml) . La figura 12 muestra el espectro de PMR de purpurina . La figura 13 muestra el espectro de masa de purpurina . La figura 14 muestra el espectro visible de absorción de purpurina 5, el espectro es tomado en etanol, la concentración de purpurina 5 es de 15 mg/ml (banda de Sore - 5 mg/ml) .

La figura 15 muestra el espectro de P R del éster dimetilico de purpurina 5. La figura 16 muestra el espectro de masa del éster dimetilico de purpurina 5. La figura 17 muestra el espectro visible de absorción del éster dimetilico de purpurina 5, el espectro es tomado en etanol el DME de purpurina 5 es 15 mg/ml (banda de Sore - 5 mg/ml) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La esencia del método sugerido de producir PS es la siguiente: se trata biomasa de espirulina con acetona hasta que la clorofila a es extraída completamente, la biomasa es separada por filtración o centrifugada, el extracto se trata con ácido a fin de sacar el ión magnesio de la molécula de clorofila, el extracto es neutralizado y se precipita la feofitina a que es separada por filtración, luego la feofitina a es hidrolizada en la mezcla de ácido clorhídrico - acetona- hexano, 6 - 16 mi de acetona, 0.6 -6 mi de hexano y 5 - 10 mi de ácido clorhídrico concentrado que es usado por cada gramo de feofitina a cruda, se calienta la mezcla hasta 40 - 60 °C y se agita por 20 minutos - 1 hora, luego se añade hexano (6 - 16 mi) y la fase orgánica se laya con la mezcla de acetona y ácido clorhídrico (2- 10: 1), la fase acuosa se lava con hexano, luego la fase acuosa que contiene feoforbida a es neutralizada con solución acuosa en exceso de citrato de sodio (tri-, di-, o mono- substituido, la feoforbida a precipitada se separa por filtración, se lava con agua, se separa de la mezcla acetona - agua por recristalización, se seca con aire hasta que su peso se vuelve constante, luego la feoforbida a se disuelve en acetona, se añade una base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa de 0.05 -1.00 % de concentración, se agita a 30 - 60 °C por 5 - 30 min, se añade un volumen extra de base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa de 1 - 50 % de concentración, la mezcla se calienta a 40 - 60 °C por 20 - 90 min, se neutraliza con ácido clorhídrico diluido, la clorina e6 que precipita se separa por centrifugación, se lava con agua destilada hasta que desaparece la reacción ácida, se obtiene 55 - 80 % de clorina es, luego se separa la clorina &e de la acetona por recristalización a fin de separar los tetrapirroles lineales, la clorina es se separa por filtración y se lava con agua destilada, la clorina e6 se calienta en un depósito sellado a las temperaturas de 40 -100 °C por 1 hora - 30 dias, entonces es enfriada y se añade la solución de base fuerte hasta pH 7.5 - 8.5, luego la solución se ajusta con agua apirógena por inyección para hacer las concentraciones de fotoactivador de 6.5 - 7.5 % en masa. Además, en el método de producir PS después de la etapa de adición de base fuerte hasta pH de 7.5 - 8.5, la mezcla puede ser filtrada en gel para elaborar hasta el porcentaje de 80 - 90 % de clorina es, purpurina 5 - hasta 5 - 20 % y purpurina 18- el resto, luego se añade solución diluida de ácido clorhídrico hasta precipitar el fotoactivador, la solución se ajusta con agua apirógena por inyección para elaborar las concentraciones de 6.5 - 7.5 % en masa de fotoactivador, así se obtiene el "Extracto líquido de clorinas". Además, en el método de producir PS después de la etapa de la filtración en gel puede añadirse solución de ácido clorhídrico diluido a la solución de fotoactivador hasta que precipita el fotoactivador, luego el filtrado se separa por filtración o por centrifugación, los aditivos aprobados por la RF State Pharmacopeia se añaden hasta pH de 7.5 - 8.5, se añade agua apirógena por inyección para hacer la concentración de fotoactivador de 0.1 - 1 % en masa luego se separan las bacterias por filtración. También en el método de producir PS después de la etapa de filtración en gel puede añadirse ácido clorhídrico diluido a la mezcla hasta precipitar el fotoactivador, este precipitado es separado por filtración o por centrifugación, se ajusta con agua apirógena por inyección para hacer la concentración de fotoactivador de 6.5 - 7.5 % en masa, el "Extracto líquido de clorinas" es dispersado en substrato gel de conformidad con la siguiente proporción: 0.1 - 12 % en masa del "Extracto liquido de clorinas", 5 -20 % en masa de dimetilsulfoxida, el resto es agua, los aditivos aprobados por RF State Pharmacopeia y el substrato gel . Además, en el método de producir PS después de la etapa de filtración en gel puede añadirse ácido clorhídrico diluido a la mezcla hasta precipitar el fotoactivador, este precipitado se separa por filtración o por centrifugación, se ajusta con agua apirógena por inyecciones para hacer la concentración de fotoactivador de 6.5 - 7.5 % en masa, y el "Extracto líquido de clorinas" es disuelto en dimetilsulfoxida de acuerdo con la siguiente proporción: 0.5 - 12% en masa de "Extracto líquido de clorinas" y el resto es dimetilsulfoxida. Este método se realiza con el uso de equipo piloto de laboratorio químico estándar: se trata la biomasa en recipientes de aluminio de 10 - 50 litros equipados con agitador mecánico, la biomasa se filtra a través de filtros Nucht de 5- 20 litros con bomba de vacío y trampa fría de nitrógeno líquido, la biomasa es centrifugada en la centrifuga de piso fria con 4 celdas de 1 litro y velocidad de rotación de 6000 rpm, el extracto es acidificado en botellas de vidrio de 20 litros, la feofitina a precipitada se filtra a través de filtros Nucht de 20 litros con bomba de vacío y trampa fría de nitrógeno liquido, la feofitina a es hidrolizada en matraces de fondo redondo de tres cuellos calentados de 0.1 a 0.5 litros equipados con agitador, condensador de retroflu o y agujero de alimentación con tapón, las soluciones son lavadas en embudos de separación de 2 litros, son neutralizadas en vasos de precipitados para productos químicos, químicos de 2 - 5 litros, la feoforbida a es filtrada a través de filtros Nucht con bomba de vacío de aceite y trampa fría de nitrógeno líquido, es recristalizada en matraces para productos químicos, de fondo plano de 0.25 - 1 litros, la feoforbida a es disuelta en acetona y se hizo reaccionar con una base inorgánica fuerte en matraces de cuello redondo de tres cuellos calentados de 0.5 - 2 litros equipados con agitador, condensador de retroflujo y agujero de alimentación con tapón, el precipitado de clorina e6 es separado en la centrífuga de piso fría con celdas de 4 x 0.5 litros y velocidad de rotación de 6,000 rpm, la clorina e6 es recristalizada en matraces de fondo plano para productos químicos de 0.25 - 0.5 , 2 - 5 litros, la clorina e6 se filtra a través de filtros Nucht de 1 - 2 litros con bomba de vacío de aceite y trampa fría de nitrógeno líquido, la clorina e6 se calienta en matraces para productos químicos de fondo redondo de 0.05 - 0.1 litros de vidrio resistente al calor, se hace reaccionar con solución de base fuerte y se ajusta en vasos de precipitados para productos químicos de 0.1 - 1 litro con el uso de un pH-metro y espectrofotometro estándares, la mezcla es filtrada en gel sobre una columna de 50 - 10 mm de diámetro y 100-150 mm de altura, las bacterias son separadas por filtración a través de filtro microporoso estándar de 0.22 µ?t?. de tipo Millipore, el '"Extracto líquido de clorinas" es dispersado en substrato en gel con el uso de un homogeneizador de bolas o de cuchillas, además se usaron matraces cónicos de 0.01 - 10 litros con tapones, cilindros de 0.005 - 2 litros, vasos de precipitados de 0.05 - 2 litros, botellas de 20 litros, balanza con intervalo de 1 -1000 gramos y agitadores magnéticos para preparar muestras y soluciones; Se usaron matraces de fondo redondo de 5 litros con termómetro y condensador de agua de flujo directo para la regeneración de acetona y hexano; se usó un evaporador rotatorio de vacío para remoción rápida de solventes a baja temperatura. De conformidad con el método de producir PS la solución de ácido clorhídrico concentrado es considerada como solución acuosa saturada de cloruro de hidrógeno a la temperatura de 20 °C que contiene comúnmente 36 - 37 % en masa de cloruro de hidrógeno. En la etapa de conversión de la feofitina a a feoforbida a el intervalo de volúmenes de hexano y acetona (6 - 16 mi de acetona y 0.6 - 6 mi de hexano) se explica por el hecho de que si se usan volúmenes inferiores de solventes la disolución de la feofitina a no es completa y si los volúmenes son superiores la solución no seria suficientemente concentrada para la hidrólisis rápida. El intervalo de volúmenes de ácido clorhídrico (5 - 10 mi) se explica por el hecho de que si el volumen es inferior el rendimiento de feoforbida a disminuye y si el volumen es superior la selectividad de la reacción disminuye debido a la formación de pirofeoforbida a sub-producto . El intervalo de temperatura de 40 - 60 °C se explica por el hecho de que si la temperatura es inferior el rendimiento de feoforbida a disminuye y si la temperatura es superior la selectividad de la reacción disminuye debido a la formación de pirofeoforbida a sub-producto. El intervalo de tiempo de 20 min - 1 hora se explica por el hecho de que si este período es más corto el rendimiento de feoforbida a disminuye y si este período es más largo la selectividad de la reacción disminuye debido a la formación de pirofeoforbida a sub-producto. El volumen de hexano añadido (6 - 16 mi) se explica por helécho de que si este volumen es inferior la separación de uno de los productos de la reacción, fitol, desde la mezcla de reacción no es efectiva, y el uso de volumen de hexano mayor no es razonable .

En la etapa de purificación de feoforbida a, la fase orgánica es lavada con la mezcla de acetona y ácido clorhídrico concentrado en la proporción de 2:1 a 10:1. Si esta proporción es inferior que 2:1 se forma un precipitado de mezcla en forma de hojuelas, que es difícil de separar desde la fase acuosa que contiene la feoforbida a objetivo. Si esta proporción es mayor que 10:1 la fase acuosa se vuelve sobresaturada con acetona y las mezclas entran desde la fase de hexano, contaminando la feoforbida a objetivo. En la etapa de conversión de feofitina a a clorina e6 la concentración de la capa de la base fuerte está en el intervalo de 0.05. 1.00 %, su límite inferior mínimo que es necesario para la reacción apertura del anillo ciclopentanona de feoforbida a (anillo E) , y si la concentración de' la base es superior que 1 % tiene lugar la reacción de alomerización (oxidación) del anillo E, que conduce a '"clorina inestable" en vez de la clorina e ob etivo, y conduce luego a purpurina 18, y adicionalmente - a clorina p6. Entonces, de conformidad con el método, se añade un volumen extra de base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa de 1 - 50 % de concentración. Si esta concentración es inferior a 1 % tiene lugar la saponificación incompleta del grupo éster en la posición treceava o quinceava. Si la concentración de la base es superior a 50 % el macrociclo tetrapirrol de PS se abre en algunos casos. Entonces la masa de reacción se agita a 30 - 60 °C por - 30 minutos, la temperatura inferior facilita el proceso de alomerización del anillo E, y la temperatura más alta facilita la descomposición de la clorina e6 a clorina e4.

Cuando se añade una cantidad extra de base inorgánica fuerte el intervalo de temperatura es 40 - 60 °C y el intervalo de tiempo es 20 - 90 minutos. Si el tiempo y la temperatura son inferiores que las establecidas, el éster metílico en la posición 152 no tiene tiempo de idrolizar, si el tiempo y la temperatura son mayores se incrementa el rendimiento en el sub-producto clorina e^. Cuando la clorina ee se convierte en ""Extracto liquido de clorinas", tiene lugar el proceso de oxidación y el proceso termolítico de deshidratación y descarboxilación de PS subsecuente,, con el grupo metileno oxidado en la posición ' a purpurina 5: Cuando la clorina es se convierte en el "Extracto liquido de clorinas", el uso de la temperatura inferior a 40 °C, requiere tiempo de reacción prolongado, esto es tecnológicamente irracional . El uso de la temperatura más alta que 100 °C da como resultado la aceleración de la descomposición de la substancia. La duración del proceso inferior a 1 hora requiere del uso de temperaturas superiores a 100 °C, o da como resultado que la substancia tenga una actividad biológica baja. La duración del proceso superior a 30 días está acompañada por cambios irreversibles (descomposición) de la substancia . La temperatura óptima de proceso es de 45 - 70 °C (figura 1) La duración óptima de proceso es de 2 - 9 dias a 70 °C (figura 2) o 1 - 48 horas a 100 °C (figura 3), lo que da como resultado 5 - 20 % de purpurina 5 en la mezcla. La substancia que contiene 5-20 % de purpurina 5 y 80-95 % de clorina ee en la composición de agente activo (PS) es adecuada para producir formas medicinales inyectables acuosolubles . Si la substancia contiene menos de 5 % de purpurina 5 tiene una baja actividad biológica. Si la substancia contiene más de 20 % de purpurina 5 su solubilidad en agua empeora, lo que afecta desfavorablemente la estabilidad de las formas medicinales en almacenamiento y empeora la capacidad de filtración a través de filtros micro porosos . La última propiedad es necesaria para la esterilización de las formas medicinales, como formas medicinales de tetrapirroles no pueden ser esterilizadas térmicamente o por radiaciones UV a causa de la alta probabilidad de cambios químicos indeseables. Son necesarios contenidos de clorina e6 en la substancia para conservar la purpurina 5 en estado acuosoluble . El intervalo de pH resulta del hecho de que su valor inferior - pH 7.5 — es el limite inferior dé solubilidad de clorinas en solución acuosa que da como resultado concentraciones adecuadas para utilización farmacéutica, sin añadir solubilizantes . El limite superior - pH 8.5 - es el limite de tolerancia biológica de iones hidróxido, [OH-].

El intervalo de concentraciones de clorina es de 6.5 -7.5 % resulta del uso de métodos tecnológicos de centrifugación o filtración en la etapa de separar el precipitado de clorina e6, estos métodos dan el producto en este intervalo de concentraciones. El PS se ilustra en el Ejemplo 1, ejemplos de realización del método se dan en los Ejemplos 2, 3, casos especiales de realización del método se ilustran en los Ejemplos 4 - 9. Con respecto a la química, PS comprende tres tetrapirroles cíclicos de la naturaleza de clorina (con el anillo D hidrogenado) - clorina es (Fórmula I) , purpurina 5 (Fórmula II, Ejemplo 10) y purpurina 18, que se convierten gradualmente a clorina pe en medio alcalino (en almacenamiento) (Fórmula III) . Con respecto a la fisicoquímica, PS posee la habilidad de absorber la luz en espectro visible, dando como resultado la fotoactivación y la relajación subsecuente del estado excitado con transferencia de energía a oxígeno molecular y substrato orgánico disuelto en tejidos. Esta transferencia conduce a procesos oxidantes y radicales libres en tejidos biológicos y su daño y la destrucción subsecuente (necrosis) . La banda de excitación más preferible para PDT es la banda de longitud de onda larga (Tabla 1) ya que la potencia luminosa que penetra en los tejidos biológicos se incrementa junto con el incremento en la longitud de onda. Así, PS es capaz de dañar objetos biológicos en profundidades de hasta 10 mm después de excitación por medio de la luz con longitudes de onda de 654- 670 nm. Con respecto a productos farmacéuticos, PS es la substancia "Extracto líquido de clorinas" (los extractos son considerados como líquidos si la concentración del ¦ agente efectivo es inferior a 20 %) . La substancia dada es considerada como extracto debido a la necesidad de su extracción desde una biomasa con el uso de solventes orgánicos . Tabla 1 Posiciones de máxima absorción y de extinción molecular de valores de absorción para una banda de onda larga de "Extracto liquido de clorinas en diferentes medios . (a) (regulador de borato 0.01 M, pH de 9.18) íb) (regulador de borato 0.01 M con albúmina de suero humano al 1 %, pH de 7.2) íc)etanol El compuesto de fórmula II posee la habilidad de acumularse selectivamente en neoplasmas malignos y focos infectados pero es débilmente soluble en agua, y el compuesto de fórmula I, paralelamente con la actividad fotodinámica expresada, es un agente solubilizante para compuestos de fórmula II. Con respecto a la farmacología (figura 4, Ejemplo 11) la unicidad de los parámetros farmacocinéticos se logra por el hecho de que en un organismo PS de fórmula (I) se convierte lentamente en PS de fórmula (II), este proceso conserva la concentración del último a un nivel constante desde el momento de introducción en el organismo hasta el momento de excreción afuera de un tumor, durante un intervalo de tiempo suficiente para la realización efectiva de PDT. Después de que la composición de PS sugerida es introducida en el organismo de ratones con tumor entra al torrente sanguíneo, y debido a la circulación sanguínea principalmente, la concentración alta y estable del compuesto de fórmula I - 0.27 - 0.32 uM, suficiente para la terapia fotodinámica (PDT) efectiva en el intervalo de 0.5 - 4 horas, se logra en las primeras 3 horas post introducción en el área de un tumor. En este período se logra mucho contraste debido a la presencia de 5 - 20 % del compuesto de fórmula (II) en una composición, este compuesto posee la habilidad de acumularse en un tumor con mucho contraste, El máximo de acumulación cae en el momento de 3 horas post introducción del fotoactivador (PS) en un organismo de animales (el índice de contraste es 14.5 para piel y 2.9 para músculos) . En este tiempo el compuesto de fórmula (I) se convierte en el compuesto de fórmula (II) en el organismo, proporcionando concentración de fotoactivador (PS) muy estable en el área de un tumor en el intervalo de 3 - 5 horas después de inyección, esta concentración disminuye gradualmente, permaneciendo terapéuticamente suficiente hasta 18 horas después de inyección. Entonces el compuesto de fórmula (II) se disocia en el organismo a productos no tóxicos que son excretados a través de un higado. La transformación de la clorina eg de fórmula (I) en purpurina 5 de fórmula (II) se prueba por medio del espectro de fluorescencia de muestras de órganos y tejidos de animales experimentales (figura 5) . Cuando se añade la forma medicinal de "solución inyectable de Radachlorin al 0.5 %" ("Photochlorin") a sangre homogénea [Fig. 5a, (I)] en la concentración de 10 µ? con el análisis espectrofo ométrico subsecuente, se observa el cambio del espectro de fluorescencia en la forma de 1.2 veces de ampliación y la desviación máxima de la intensidad de fluorescencia en una región espectral de onda-larga por 8 nm. Cuando se añade ""Photochlorin" en una concentración más pequeña (C = 1 µ ) solamente se observa la desviación de un espectro sin amplitud, que muestra el efecto de la dosis en la formación del metabolito [Fig. 5a, (2)]. La figura 5a, (3) muestra el resultado de sangre homogénea, recibida 3 horas después de la introducción de "Photochlorin" en ratones. El parámetro expresado mayormente en la presente es 1.5 veces de amplitud de un espectro en la desviación máxima de una banda en una región espectral de una onda larga por 4 nm, esto indica está presente que una mezcla de "Photochlorin" y metabolito en la muestra de sangre analizada. Cuando se añade ""Photochlorin" en la concentración de 10 µ? a µ? tubo de ensayo con homogeneizado hepático [Fig. 5b, (1)], el cambio de características espectrales se expresa primero que todo en la desviación de la intensidad máxima de fluorescencia en una región espectral de onda larga por 9 mm. No se observa la amplitud de un espectro. Se observa la imagen similar cuando se añade "Photochlorin" en concentración más pequeña C = uM [Fig. 5b, (2)]. Cuando se analiza el tejido homogéneo de hígado obtenido 3 horas después de la introducción de la preparación en animales la imagen espectrofotométrica de una muestra es similar a las dos previas [Fig. 5b, (3)]. Así, los datos recibidos muestran la presencia del metabolito de "Photochlorin" en homogeneizados de hígado. Se observó la acumulación de purpurina 5 en tumores de animales experimentales óptima para el efecto fotodinámico de acuerdo con la selectividad, en el intervalo de tiempo de 3 - 18 horas después de introducción intravenosa o intraperitoneal. En casos en donde sea necesario facilitar también la substancia de clorinas que circula en un flujo sanguíneo, el tiempo óptimo de irradiación es 0.5 - 4 horas después de introducción intravenosa. Generalmente, para liberar la terapia fotodinámica (PDT) con "Extracto líquido de clorinas", el intervalo entre la introducción de una preparación y la irradiación es de 0.5 - 18 horas. Se estima in vitro e in vivo, la actividad biológica de la forma medicinal "solución inyectable al 0.5 % de Radachlorin" ("Photochlorin", que contiene 0.5 % de substancia de "Extracto líquido de clorinas". Se probó el equilibrio del PS de acuerdo con la anfifilicidad por medio de experimentos estándares in vitro (Kessel D. Biochemistry. 1977. V. 16. p. 3443 - 3449) (Tabla 2, Ejemplo 12) . El coeficiente de distribución de PS en 1-octanol/ regulador de fosfato, pH 7.4 (Cd) es 1.40. LO que significa que el PS reclamado es" igualmente bien soluble tanto en fase acuosa como en fase lipídica y prueba la lipofilia del PS, la cual permite a este compuesto ser redistribuido desde agua en complejos con proteínas y lipoproteínas de transporte, para penetrar rápidamente en células y acumularse en membranas y microsomas intracelulares citoplásmicas, o para penetrar en células por difusión a través de una membrana plasmática de estas células. Después de irradiación láser, el compuesto depositado de una manera tal, involucra oxigeno en singletes adentro de una célula y las mata. La actividad antitumoral del PS hacia diferentes tipos de células cancerosas es probada por medio de los resultados obtenidos en el experimento in vitro en el cual se usaron 3 lineas de células de tumor cultivadas: PC12 de feocromocitomas de rata, RGGN1 de neurinoma del ganglio de Gasser De rata y 27 de hepatoma de rata (Hep27), (Tabla 2, Ejemplo 13) . Se usaron los siguientes métodos para el estudio de la citofototoxicidad dependiente de la dosis (después de irradiación láser) y actividad biológica en la ""obscuridad" del PS: 1, La prueba de MTT que permite definir precisamente el número de células vivientes . después de su tratamiento con el PS y de irradiación láser a fin de calcular los índices citotóxico y citofototóxico del PS. Las mismas pruebas permiten estimar la actividad citotóxica dependiente de la dosis y la actividad biológica en la "obscuridad" del PS (Andrei V. Reshetnichov, Gelii V. Ponomarev, Andrei V. Ivanov, Olga Yu. Abakunova, Tatiana A. Tsvetkova, Artashes V. Karmenyan, Aleksei G. Rebeko, Rudolf Ph.Baum. Novel drug form of chlorin e6 ¡ I In Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX - T. J. Dougherty, ed., Yol. 3909, 124 - 129 (2000)) . 2. La determinación del número de células después de tinción de la monocapa celular con cristal violeta al final del experimento. Este método es menos laborioso y costoso que la prueba de MTT y también permite calcular índices citotóxicos y citofototóxicos del PS (A. E. Medvedev y colaboradores, Biomed. Science, 1990, v. 1., p. 261), pero es menos precisa ya que la tinción con cristal violeta también mata las células. 3. Se estimaron comparativamente los efectos genotóxicos y genofototóxicos del PS por medio del grado de inhibición de la síntesis de DAN en células. Se evaluó la síntesis de DNA por medio del nivel de incorporación de 14C timidina en DNA, usando métodos radiométricos estándares (0. Yu. Abakumova, y colaboradores, J. Neural. Transm. Suppl. 3, 1998, V. 52, p. 87) . Las tres líneas celulares estudiadas fueron muy sensibles al efecto de la irradiación láser después del tratamiento con el PS (datos de la prueba de MTT) . De conformidad con la susceptibilidad a la irradiación láser, las líneas celulares variaron como sigue: RGGN1 > PC12 > Hep27. Los efectos del PS prolongado en concentración de 5 µ? sobre células en sobrevivencia en la obscuridad fue de 96.5 - 86.2 % para PC-12, 103.7 . 93.0 % para RGGN1 y 109.7 -87.9 % para Hep27 (prueba MTT - violeta en cristales, correspondientemente) . Bajo las mismas condiciones la síntesis de DNA en células PC-12 permaneció prácticamente sin afectar y se redujo en 21.2 y 22.2 % en células Hep27 y RGGN1 correspondientemente. El incremento observable en el número de células RGGN1 y Hep27 bajo el efecto de 5 µ? de PS sobre células en obscuridad en la mayoría probablemente relacionada con la inducción de la actividad proliferativa celular por medio del PS . En general, la actividad citotóxica es más típica para el PS en ausencia de irradiación que la inducción de la actividad proliferativa .

Se observó muerte celular después de irradiación láser de células tratadas con PS. Se detectó la actividad citofototóxxca dependiente de la dosis de la preparación y permitió calcular la EC50, es decir determinar la concentración de PS a la cual mueren el 50 % de las células. Estos datos se dan en la Tabla 2. Se observará que el PS con EC50 inferior a 20 uM se considera que es eficiente para la supresión del crecimiento tumoral. La síntesis de DNA en células PC-12 es disminuida fuertemente (96.5 % de disminución en comparación con el control solamente irradiado) en la determinación de genofototoxicidad después de tratar las células con 5 uM de PS y de irradiación láser. Se observó el estímulo de la síntesis de DNA después de la irradiación láser a baja concentración de PS en células Hep27 y RGGNl, esta síntesis es reducida considerablemente en la presencia de 5 uM de RC. Se explicó el estímulo observable de la síntesis de DNA, por el hecho de que las células gliales y las de hígado transformadas que sobrevivieron a bajas concentraciones de PS poseen alta capacidad para sintetizar DNA y regenerar la población. Así, el PS es una preparación muy citofototóxica para diferentes tipos de células tumorales. En altas concentraciones (> 5 µ?) es un inhibidor moderado del crecimiento tumoral aún sin irradiación. Debido a la alta genofototoxicidad, el PS puede ser considerado como un fuerte inhibidor del crecimiento tumoral en irradiación. Se estudiaron las propiedades tóxicas de PS en experimentos in vitro (Ejemplo 14) . La LD50 promedio es 210.53 ± 22.2 mg/kg del coeficiente de peso que es considerado, y la dosis que causa la muerte de 10 % de los animales experimentales (LDj.0) es 169.87 mg/kg. Estos experimentos permiten considerar el PS como una "substancia poco tóxica". Se estudió la biodistribución de PS en experimentos in vivo (Ejemplo 11) . Se observaron los siguientes mecanismos de distribución de compuestos, cuando se introdujo el PS intraperitonealmente a ratones con embriocarcinoma T36 inoculado en el músculo de las patas posteriores. Después de inyección el PS entra en la sangre, y luego es redistribuido en órganos y tejidos de un animal (Tabla 3) .

Como puede verse en la Tabla 3 se logra la acumulación máxima en tumor (0.70 µ?) en 5 horas después de inyección intraperitoneal en una dosis en una dosis de 40 mg/kg y se conserva por un periodo prolongado (18-24 horas) . La concentración tumoral 18 horas después de inyección es 0.48 µ?, que es 1.5 veces inferior que en acumulación absoluta máxima a alta selectividad de acumulación. La proporción de tumor/ tejido muscular es 32, y la proporción tumor/ piel es 44. La acumulación máxima en tumor (0.32 µ?) se logró en 0.5 horas después de inyección intravenosa en una dosis de 20 mg/kg y se conservó también por un período prolongado (hasta 5 horas) . El contraste máximo de acumulación en inyección intravenosa se logró en 3 horas y este valor fue 3 para tumor/ tejido muscular y 4 para tumor/piel. El 98 % del PS se excretó afuera del organismo en un día.

Tabla 2 Coeficiente de lipofilia y actividad in vltro de la "solución inyectable al 0.5 %, Radachlorin" ("Photochlorin") . Pruebas, lineas Citotoxicidad (toxicidad Fotocito- (Cd) celulares en la ""obscuridad") , % toxicidad, en control a 5 M EC5D, µ?111 Prueba de MTT, 96.5 1.8 PC12 Prueba de MTT, 103.7 1.8 RGGN1 Prueba de MTT, 109.7 3.9 Hep27 Prueba con el 86.2 1.5 cristal violeta, PC-12 Prueba con el 93.0 1.8 1.4 cristal violeta, RGGN1 Prueba con · el 87.9 4.7 cristal violeta, Hep27 Genotoxicidad, 104.7 3.5(;¡1 PC-12 Genotoxicidad. 77.8 132.2m RGGN1 Genotoxicidad, 78.8 100.7(2) Hep27 excepto para genofototoxicidad (2,% en control a 5 µ? Los resultados de la estimación de la efectividad de la preparación en PDT de cáncer en experimentos in vivo sobre ratones (Ejemplo 15) permitieron establecer que la "solución inyectable al 0.5 %, Radachlorin" ("Photochlorin") y el "gel al 0.05 %, Radachlorin" poseen la actividad fotodinémica expresada. La substancia medicinal "Extracto liquido de clorinas" que incluye las sales sódicas de clorinas (o sales de clorinas y otras bases inorgánicas fuertes) es usada para producir formas medicinales en aditivos suplementarios diferentes aprobados por la RF State Pharmacopeia: carbonato de calcio, sacarosa, glucosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidonas, poliglucanos, metilglucamina, solución isotónica, dimetilsulfoxida, substratos en emulsión con agua y gel etc. (Ejemplos 4- 9) . Se tiliza para uso externo preparaciones basadas en aceite, ' geles, linimentos, ungüentos, estas formas contienen los substratos aprobados por RF State Pharmacopeia, 5 - 20 % de dimetilsulfoxida y 0.5 - 12 % de la substancia "Extracto liquido de clorinas", o 0.8 - 14 % de substancia "Extracto liquido de clorinas" y 86- 99.2 % de dimetilsulfoxida (Ejemplos 8,9) . El intervalo de concentraciones de dimetilsulfoxida en combinación con substratos se explica por el hecho de que la penetración de la substancia en tejidos es baja a concentración inferior a 5 %, y porque reduce la efectividad de PDT. Si la concentración de dimetilsulfoxida es superior a 20 %, las formas medicinales en otras bases pierden su estabilidad en almacenamiento. El intervalo de concentraciones de la substancia se explica por el hecho de que si esta concentración es inferior a 0.5 %, la concentración de la substancia en tejido es insuficiente para la PDT efectiva. Si la concentración de la substancia es superior a 12 %, el tejido pierde transparencia por la radiación luminosa, toda la luz es absorbida en la capa superior del tejido, lo que da como resultado una quemada a baja efectividad del procedimiento de PDT.

Tabla 3 Los parámetros farmacocinéticos principales La exposición de substancia sobre piel antes de irradiación es 0.5 - 24 horas en- uso externo. La substancia no tiene tiempo de penetrar en un tejido en profundidad necesaria en tiempo inferior a 0.5 horas. Si el intervalo de tiempo es más de 24 horas se observa la calda del valor de acumulación absoluta de la preparación, debido a su redistribución y excreción. Además, la exposición por periodo prolongado de las formas medicinales externas sobre una piel son inconvenientes desde el punto de vista critico . La preparación es usada para introducción continua o por goteo intravenoso en la forma de soluciones al 0.1 - 1 % en cualquier medio aprobado por la RF State Pharmacopeia (agua apirógena para inyecciones, dimetilsulfoxida, solución salina, etc.). El uso de soluciones de la substancia con concentraciones inferiores a 0.1 % es irracional considerando los volúmenes de liquido introducido en un organismo. El uso de soluciones con concentración superior a 1 % es imposible debido ala baja filtrabilidad de las soluciones en la etapa de esterilización a través de filtros antibacterianos. El módulo de diodo láser semiconductor para terapia fotodinámica ML-662-SP diseñado por ZAO "MYLON" (Saint Petersburg) y 000 " SIGM PLUS" (Moscú) se usa para activación de la substancia PS "Extracto liquido de clorinas". Este módulo tiene los siguientes datos de salida (Certifícate of the Russian Ministry of Health, Reg. No. 29/10-679-96) : - potencia de 2.5-3 W en una fibra de 200 micrones con una abertura de 0.22. - diodos láser de alta intensidad de la corporación "Polaroid" (EUA) y coproducción de 000 "SIGM PLUS" con longitud de onda de irradiación máxima de 662 ± 3 nm. Módulos de una potencia inferior (con un número inferior de diodos) con longitud de onda de irradiación máxima de 662 + 3 nm pueden usarse para activación de la substancia PS, puede usarse también el láser en estado sólido con bombeo sobre una segunda armónica de granate itrio-aluminio YAG-Nd3+ con longitud dé onda de irradiación máxima de 670 nm. La magnitud de la energía alimentada varía desde 30 hasta 3000 J. A dosis luminosas inferiores a 30 J el procedimiento de PDT se vuelve excesivamente largo ya que la exploración debe de ser realizada en áreas pequeñas a fin de lograr el efecto óptimo. A dosis luminosas superiores a 3000 J y dimensiones de tumor que más frecuentemente tienen lugar en la práctica clínica, se observa el daño considerable de tejido saludable que conduce a prolongar el período de regeneración. La densidad superficial de energía alimentada varía desde 50 hasta 2500 J/cm2. No se observa efecto en superficie la dosis luminosa inferior a 50 J/cm2. En superficie dosis luminosas superiores a 2500 J/cm2, se observa considerable daño de tejido saludable que conduce a la prolongación del período de regeneración. El intervalo de longitudes de onda de radiación excitante está conectado a una característica técnica del láser usado (662 ± 3 nm) , la desviación de la máxima absorción de la preparación dependiente de la polaridad del medio (654 - 662 nm) y el contenido de purpurina 5 en la substancia (5- 20 %, amplitud de vida de una banda de absorción de longitud de onda larga a 663 - 670 nm) (Tabla 1) . Ejemplo 1. .Descripción .de las propiedades fisicoquímicas del PS El PS representa la masa negra densa, que adquiere una^ sombra verde en una capa fina, con un olor de alga. A fin de confirmar la autenticidad de las propiedades del PS, el "Extracto liquido de clorinas", 7.5 % es agitado vigorosamente, una porción del extracto (1 mg) se disuelve en 10 mi de alcohol etílico médico "o el más rectificado purificado, 95 %, la densidad óptica es medida a 662 nm (D) . El valor es 0.23. La extinción molecular s (M-l cm-1) se calcula de conformidad con la fórmula e = D * 597 / (0.004). El valor resultante podría situarse en el intervalo de 33300 - 35100. Después de substitución, e = 0.23 * 597 / (0.004) = 34328. Por consiguiente, el "Extracto líquido de clorinas" contiene 7.5 % de PS . La solución de PS en alcohol etílico tiene color verde amarillento. La solución adquiere coloración rojo rubí si los rayos luminosos de la lámpara azul médica DS 220 - 75 (especificaciones técnicas 16.535.376-79) pasan a través de la capa de solución en el lugar protegido de la luz .

Para la determinación cuantitativa el "Extracto liquido de clorinas" se agita vigorosamente, una porción del extracto (5 mg) se disuelve en 10 mi de alcohol etílico médico o el más purificado rectificado, 95 , y se mide la densidad óptica a 662 nm (D) . El valor es 2.15. El contenido de PS es calculado de conformidad con la fórmula : c, % = (D*597*10*100)/ (34230*5) . El valor resultante corresponderá al especificado. Después de substitución, c, % = (2.15*597*10*100) / (34230*5) = 7.5 % (corresponde al especificado) . Para el análisis adicional se añade ácido clorhídrico diluido a 100 mg de "Extracto líquido de clorinas" hasta que precipita el PS, el precipitado se saca por filtración, se seca al vacío sobre pentóxido fosforoso por 12 horas y se toman el espectro de absorción y el espectro de masa, PMR-, el intervalo de longitud de onda de 360 - 720 nm. El espectro PMR del PS (Figura 6) : (en DMS0-D6, solución concentrada): 9.64, 9.55, 9.52, 9.39, 8.90, 8.79 (s, meso-H de clorina es y purpurina 5), 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, CH=C¾ de clorina es y purpurina 5), 6.84 (s, ?-meso-CHO de purpurina 5), 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, CH=C¾), 5.43 (2s, y-meso-CHz-COOH) , 4.60 (m, 7-H) , 4.45 (m, 8-H) , 3.80, 3.56 (qx2, 4-CH2CH3) , 3.75, 3.64, 3.51, 3.46, 3.29, 3.23 (c, C¾ nuclear de clorina e6 y purpurina 5), 2.38, 2.32 (2m, 7-CH2C¾C00H) , 2.71, 2.20 (2m, 7-CHzCH2COOH) , 1.76 (d, 8-CH3) , 1.72 (t, 4-CH2-CH3) , - 1.63,-1.91 (2s, 2NH) ppm. El espectro de masa de PS (figura 7) : es decir, M+ (%), 596 (16.0), 566 (9.4), 508 (100.0), 494 (7.3), 447 (9.4), 435 (50.6), 421 (12.8), 405(6.9), 254 (7.4). El espectro de absorción visible de PS : y (e) (etanol), 386 (22310), 406 (113040), 506 (14870), 536 (8925), 608 (7437), 662 (34220). De conformidad con el espectro de PMR la substancia contiene 80 % de clorina e6, 15 % de purpurina 5 y 5 % de purpurina 18 (señales menores a 9.25, 9.10, 8.71, 7.84, 3.55, 3.32, 3.04 ppm), esto corresponde a una composición que es patentada. De conformidad con el espectro de masa hay picos de 596 iones moleculares de clorina e6 y 566 de purpurina 5. En el espectro de absorción hay una banda de 662 nm con el valor de absorción que está bien emparejado con la extinción molecular del estándar de PS (34230) . Por consiguiente la muestra estudiada es ^Extracto liquido de clorinas", 7.5 %. Ej emplo 2. Producir PS como "Extracto liquido de clorinas", 6.5 %. Se trata la biomasa de espirulina (2 kg) con acetona (3 x 2 L) hasta que se extrae completamente la clorofila, la biomasa se saca por filtración, el extracto se trata con ácido clorhídrico (30 mi) a fin de sacar el ión magnesio de la molécula de clorofila, el extracto se neutraliza y precipita feofitina a (8 g) y se separa por filtración, luego la feofitina a se hidroliza en la mezcla de ácido clorhídrico - acetona - hexano, para este propósito se disuelve la feofitina a en la mezcla de 50 mi de acetona, 5 mi de hexano y 40 mi de ácido clorhidrico (37 %) , la mezcla se calienta hasta 40 °C y se agita por 1 hora, luego se añade hexano (50 mi) y la fase orgánica se lava con la mezcla de acetona y ácido clorhidrico (2:1, 3 x 50 mi), la fase acuosa se lava con hexano (5 x 40 mi) , luego la fase acuosa que contiene feoforbida a se neutraliza con exceso de solución acuosa de citrato de sodio (tri-, di- o mono-substituido) , la feoforbida a se separa por filtración se lava con agua (3 x 50 mi) , se separa por recristalización de la mezcla acetona - agua, se seca con agua hasta que su masa se vuelve constante (el rendimiento de feoforbida a es 4.2 g, 7.1 mM, 77 %) , luego la feoforbida a (2.7 g, 4.56 mM) se disuelve en acetona (100 mi) , se añade base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa (0.05 %, 25 mi), se agitó a 60 °C por 5 minutos, se añade volumen extra de base inorgánica en la forma de solución acuosa (20 %, 25 mi) , la mezcla se calienta a 40 °C por 90 minutos, se neutraliza con ácido clorhidrico diluido (2 %, aproximadamente 250 mi) , se separa el precipitado de clorina e6 por centrifugación, se lava con agua destilada (5 x 10 mi) hasta que desaparece la reacción ácida, se obtiene 1.85 g (2.96 mM, 65 %) de clorina es, luego la clorina e6 se separa por recristalización de la acetona a fin de separar los tetrapirroles lineales, la clorina e$ se separa por filtración y se lava tres veces con agua destilada, la clorina ee se calienta en depósito sellado a la temperatura de 40 °C por 30 días, luego se enfria y se añade solución acuosa de hidróxido de sodio al 1 % hasta pH de 7.5, el PS resultante contiene 15 % de purpurina 5, 80 % de clorina e<j y 5 % de purpurina 18 (clorina p6) , entonces la solución de PS se ajusta con agua destilada hasta hacer que la concentración del fotoactivador sea de 6.5 %, dando 14.2 g (50 %) de PS en la forma de 6.5 % de "Extracto liquido de clorinas" . El espectro de PMR del "Extracto liquido de clorinas" resultante (Figura 6) : (en DMS0-Ü6, solución concentrada) : 9.64, 9.55, 9.52, 9.39, 8.90, 8.79 (s, meso-H de clorina e6 y purpurina 5), 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, CH=CH2 de clorina ee y purpurina 5), 6.84 (s, ?-meso-CHO de purpurina 5), 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, CH=C¾) , 5.43 (2s, ?-meso-CH2C00H), 4.60 (m, 7^), 4.45 (m, d^?) , 3.80, 3.56 (qx2, 4-CH2CH3) , 3.75, 3.64, 3.51, 3.46, 3.29, 3.23 (s, CH3 nuclear de clorina e6 y purpurina 5), 2.38, 2.32 (2m, 7-CH2C¾COOH) , 2.71, 2.20 (2m, 7-CH2C¾COOH) , 1.76 (d, 8-CH3) , 1.72 (t, 4-CH2CH3) , -1.63, -1.91 (2s, 2NR) ppm.

La substancia contiene 80 % de clorina e6, 15 % de purpurina 5 y 5 % de purpurina 18 (clorina pe) (señales a 9.25, 9.10, 8.71, 7.84, 3.55, 3.32, 3.04 ppm) . El espectro de masa de substancia resultante (Figura 7) : es decir, (%), 596 (16.0), 566 (9.4), 508 (100.0), 494 (7.3), 447 (9.4), 435 (50.6), 421 (12.8), 405 (6.9), 254 (7.4) . El espectro de absorción visible (figura 8) : ? (e) (etanol), 386 (22320), 406 (113110), 506 (14880), 536 (8930), 608 (7440), 662 (34230). Ej emplo 3. Producir PS como "Extracto liquido de clorinas", 7.5 %. Se trató la biomasa de espirulina (2 kg) con acetona (3 x 2 1) hasta que la clorofila a se extrajo completamente, la biomasa se separó por centrifugación, el extracto se trató con ácido clorhídrico (30 mi) a fin de sacar el ión magnesio de la molécula de clorofila, el extracto se neutralizó y la feofitina a precipitada (8 g) se separó por filtración, luego se hidrolizó la feofitina a en la mezcla de ácido clorhídrico - acetona - hexano, para este propósito la feofitina a se disolvió en la mezcla de 100 mi de acetona, 50 mi de hexano y 80 mi de ácido clorhídrico (37 %) , la mezcla se calentó hasta 60 °C y se agitó por 20 minutos, luego se añadió hexano (100 mi) y la fase orgánica se lavó con la mezcla de acetona y ácido clorhídrico concentrado (5 : 1, 3 x 50 mi) , la fase acuosa se lavó con hexano (s x 40 mi) , luego la fase acuosa que contenía feoforbida a se neutralizó con exceso solución acuosa de citrato de sodio (tri-, di- o mono-substituido) , el precipitado de feoforbida a se separó por filtración, se lavó con agua (3 x 50 mi) , se separó por recristalización desde la mezcla acetona - agua, se secó con aire hasta peso constante (el producto fue de 3.8 g, 6.4 mM, 67 %) , luego la feoforbida a (2.7 g, 4.56 mM) se disolvió en acetona (100 mi) , se añadió la base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa (1 %, 25 mi) , se agitó a 30 °C por 30 minutos, se añadió volumen extra de base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa (20 %, 25 mi) , la mezcla se calentó a 60 °C por 20 minutos, se neutralizó con ácido clorhídrico diluido (2 %, aproximadamente 250 mi) , el precipitado de clorina e6 se separó por centrifugación, se lavó con agua destilada (5 x 10 mi) hasta que desapareció la reacción acida, 1.67 g (2.67 mM, 55 %) se obtuvo la clorina es, luego la clorina e& se separó por recristalización desde acetona, a fin de separar los tetrapirroles lineales, la clorina e6 se separó por filtración y se lavó tres veces con agua destilada, la clorina es se calentó en depósito sellado a la temperatura de 100 °C por 1 hora, luego se enfrió y se añadió solución al 1 % de hidróxido de potasio hasta pH de 8.5, el PS resultante contiene 2 % de purpurina 5, 82 % de clorina y 16 % de purpurina 18 (clorina pe) , entonces la solución de PS se ajustó con agua destilada para hacer la concentración del fotosensibilizador a 7.5 %, dando 11.1 g (50 %) de PS en la forma de pasta al 7.5 %. El espectro de la substancia resultante es similar al dado en el Ejemplo 2 y representa una superposición de espectro de clorina es /Figura 9 - 11) y purpurina 5 (Figura 12 - 14) . Ej emplo 4. Un caso especial de producir PS - producir "Extracto liquido de clorinas", 7.5 %. PS que contenia 2 % de purpurina 5, 82 % de clorina e6 y 16 % de purpurina 18 (clorina pe) en la forma de pasta al 7.5 % descrito en el Ejemplo previo es filtrado sobre3 gel en columna de Sephadex GIO de 50 mm de diámetro y 100 mm de altura con el uso de solución de hidróxido de potasio al 1 % como un eluyente, hasta que el contenido de clorina es se convirtió en 90 %, purpurina 5 - 5 % y purpurina 18 - 5 % . Se añadió solución de ácido clorhídrico diluido hasta que precipitó el PS, el PS se ajustó con agua apirógena inyectable para hacer que la concentración del fotoactivador sea de 7.5 %masa, dando 6.8 g de "Extracto líquido de clorinas", 7.5 %. Un espectro de electrones del producto - ver la Figura 8. Ejemplo 5. Un caso especial de producir PS - producir la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.1 % para inyección" . Después de la filtración sobre gel, se añadió solución de ácido clorhídrico diluido a la solución de PS descrito en el Ejemplo 4 hasta que precipitó el PS, este precipitado se separó por filtración, se añadió solución de hidróxido de sodio concentrado en agua apirógena para inyección hasta pH 7.5 y se añadió agua apirógena hasta hacer la concentración de PS 0.1 %, luego se separaron las bacterias por filtración de la solución a través del filtro microporoso "Millipore" antibacteriano con poros de 0.22 una. El producto fue 500 mi de la solución. Un espectro d electrones del producto - ver la Figura 8. Ej emplo 6. Un caso especial de producir PS - producir la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyección" ("Photochlorin") . Después de la filtración sobre gel, se añadió solución diluida de ácido clorhídrico a la solución de PS descrita en el Ejemplo 4 hasta que precipita el PS, este precipitado se separó por filtración, se añadió solución concentrada de hidróxido de potasio hasta pH de 7, luego la solución se ajustó con N-metil-D-glucamina hasta pH de 8.5 bajo el control del pH-metro, se añadió agua apirógena para inyección para hacer la concentración del fotoactivador, 0.5 %masa, luego se separaron las bacterias por filtración de la solución a través de filtro microporoso ""Millipore" antibacteriano con poros de 0.22 µ?a. El producto es 100 mi de la solución. Un espectro de electrones del producto- ver la Figura 8. Ej emplo 7. Un caso especial de producir PS — producir la forma medicinal, "Radachlorin, solución al 1 % para inyecciones" . Después de filtración sobre gel se añadió solución diluida de ácido clorhídrico a la solución de PS descrita en el ejemplo 4 hasta que el PS precipitó, este precipitado se separó por filtración, se añadió solución concentrada de hidróxido de sodio hasta pH de 8.5, luego se añadió agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración del fotoactivador 1 % en masa, luego las bacterias se separaron por filtración de la solución a través del filtro microporosoo "Millipore" antibacteriano con poros de 0.22 um. El producto es 50 mi de la solución. Un espectro de electrones del producto - ver la Figura 8. Ej emplo 8. Un caso especial de producir PS - producir las formas medicinales de "Radachlorin, gel". Después de filtración sobre gel se añadió solución de ácido clorhídrico diluido a la solución de PS descrita en el ejemplo 4 hasta que el PS precipitó, este precipitado es separado por centrifugación, se ajustó con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración del fotoactivador 6.5 %masa, luego se realizaron las siguientes variantes : Variante (a). Se añaden 0.3 g de Pemulen TR1 o Carbopol 2020 (BF Goodrich, UK) a 75 mi de agua y 5 g de dimetilsulfoxida a temperatura ambiente y se agita - 8 horas. Se añade solución acuosa alcalina hasta pH de 5. Se resuspende el gel suplementando el "extracto liquido de clorinas", 6.5 % y agua para hacer la concentración de clorina e6 0.05 % en el gel resultante, el gel se somete al vacio por 5 minutos a 10 - 50 mm de Hg. El producto es 100 g de gel. Variante (b) . Se añaden 0.5 g de dimetilsulfoxida y "extracto liquido de clorinas", 6.5 % a 70 mi de agua para hacer la concentración de clorina ee de 0.05 % en el gel resultante, luego se añaden 15 g de Aculyn 33A (ISP, USA) . La substancia se agita hasta homogeneidad y se añade solución alcalina acuosa hasta pH 5. El gel se somete al vacio por 5 minutos a 10 - 50 mm de Hg. El producto es 100 g de gel . Después de la filtración del gel se añade ácido clorhídrico diluido a la solución de PS descrita en el Ejemplo 4 hasta que el PS precipita, este precipitado es separado por centrifugación, es ajustado con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración del fotoactivador de 7.5 ¾masa, luego se realizaron las siguientes variantes: Variante (c) . Se añaden 0.7 g de Pemulen TR1 o Carbopol 2020 (BF Goodrich, ÜK) a 60 mi de agua y 20 g de dimetilsulfoxida a temperatura ambiente y se agita por -8 horas. Se añade solución acuosa de trietanolamina hasta pH de 8.5. El gel es resuspendido suplementando el "Extracto liquido de clorinas", 7.5 % y agua para hacer la concentración de clorina e« de 1 1 en el gel resultante, el gel es sometido al vacio por 5 minutos a 10 - 50 MI de Hg. El producto es 100 g del gel. Variante (d) . Se añaden 20 g de dimetilsulfoxida y "Extracto liquido de clorinas", 7.5 % a 55 mi de agua para hacer la concentración de clorina ee de 1 % en el gel resultante, luego se añaden 15 g de Aculyn 33A (ISP, USA) . La substancia se agita hasta homogeneidad y se añade solución acuosa de trietilamina hasta pH de 8.5. El gel se somete al vacio por 5 minutos a 10 - 50 mm de Hg. El producto es 100 g del gel. Ejemplo 9. Un c aso especial de producir PS - producir las formas medicinales "solución de Radachlorin, dimetilsulfoxida para uso externo". Variante (a) . Después de filtración sobre gel en el Ejemplo 4 se añade solución de ácido clorhídrico diluido a la mezcla hasta que el PS precipita, este precipitado se separa por filtración, se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración de PS de 7.5 %masa, y se añaden 14 g del "Extracto liquido de clorinas" resultante a 86 g de dimetilsulfoxida a temperatura ambiente para hacer la concentración de clorina e<j de 1 % en la solución resultante, y se agita hasta homogeneidad. El producto es 100 g de la solución. Variante (b) . Después de filtración sobre gel en el Ejemplo 4, se añade solución diluida de ácido clorhídrico a la mezcla hasta que precipita el PS, este filtrado se separa por filtración, se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración de PS de 7.5 %masa, y se añade 0.8 g del "Extracto liquido de clorinas" a 99.2 g de dimetilsulfoxida a temperatura ambiente para hacer la concentración de clorina ee de 0.05 %, en la solución resultante, y se agita hasta homogeneidad. El producto es 100 g de solución. Ejemplo 10. Para la identificación de purpurina 5, la mezcla de reacción del Ejemplo 2 es filtrada sobre gel sobre una columna Sephadex G10 con el uso de solución al 1 % de N-metil-D-glucamina como un eluyente para dar 3 fracciones, la primera y la segunda fracciones contienen purpurina 5. Estas fracciones son neutralizadas, se separan por filtración un precipitado, se disuelve en mezcla de cloroformo - metanol 1 : 1 y se esterifica con diazometano. La mezcla se lava con agua, se separa una fase orgánica, se seca con sulfato de magnesio anhidro, se concentra por evaporación al vacio y se somete a cromatografía sobre gel de sílice Merck, Kieselgel, 0.04 - 0.063, se colecta la última fracción (menos móvil) . Si es necesario, el éster dimetílico de purpurina 5 resultante (10.1 % calculado en la masa de reacción seca tomada para esterificación) se somete repetidamente a cromatografía. El espectro de PMR (Figura 15) : (DMSO-D6, solución concentrada) : 9.64, 9.46, 8.82 (s, meso-H) , 8.06 (2 d, CH=CH2) , 6.82 (s, ?-meso-CHO) , 6.34, 6.31, 6.19,6.16 (2d, -CH=CH2) , 4.54 (m, 7-H) , 4.46 (m, 8-H) , 3.61 (q, 4-CH2CH3) , 4.20, 3.81, 3.57, 3.53, 3.47 (5s, -COOCH3 y -CH3 nuclear), 2.38, 2.35 (2m, 7 -CH2CH2COOH) , 2.68, 1.85, (2m, 7-CH2CH2C00H) , 1.73 (d, 8-CH3) , 1.70 (t, 4-CH2CH3) ppm. Espectro de masa (Figura 16) : es decir M+ (%) , 594 (8.6) , 566(100.0), 505(5.1), 491 (9.8), 475 (8.2), 463 (1.7) , 447 (1.4), 433 (1.7), 403 (2.0), 262 (5.0) . Espectro de absorción visible (Figura 17) : ? (e) (cloroformo), 408 (117200), 501 (11380), 542 (9830), 617 (6720), 668 (35200). Se disuelve el éster dimetílico de purpurina 5 en acetona y se añade ácido clorhídrico concentrado (37 %) en la proporción de 1:2. La mezcla se agita por 2 horas a 25 °C, se neutraliza, se separa por filtración la purpurina 5, se lava con agua, se disuelve en solución al 10 % de N- metil-D-glucamina y se filtra sobre gel sobre una columna Sephadex G10 con el uso de solución al 1 % de N-metil-D- glucamina como un eluyente, se colecta la segunda fracción, se neutraliza, se separa por filtración un precipitado, se lava con agua, se seca sobre pentóxido de fósforo hasta peso constante para dar purpurina 5 5.2 % calculado en la masa de reacción seca tomada para esterificación) . Espectro de PMR (Figura 12) : (DMSO-D6í solución concentrada) : 9.55, 9.39, 8.79 (s, meso-H) , 8.09, 8.04, 7.97, 7.92 (2d, -CH=C¾) , 6.84 (s, ?-meso-CHO) , 6.37, 6.32, 6.13, 6.10 (2d, -CH=CH2), 4.60 (m, 7-H) , 4.45 (m, 8-H) , 3.55 (q, 4-CH2C¾) , 3.75, 3.46, 3.23 (s, -CH3 nuclear), 2.38, 2.32 (2m, 7 -CH2CH2COOH) , 2.71, 2.20 (2m, 7-CH2CH2COOH) , 1.76 (d, 8-CH3) . 1.72 (t, 4-CH2C¾) ppm. Espectro de masa (Figura 13) : es decir, M+ (%) , 566 (8.2), 494 (100.0), 447 (9.1), 435 (49.6), 421 (12.7), 405 (6.6) , 254 (7.1) . Espectro de absorción visible (figura 14) : ? (e) (etanol), 408 (116900), 501 (11320), 540 (9790), 615 (6710), 665 (35090). Ejemplo 11. Estudio de farmacocinéticas y de metabolismo de las substancias ^Extracto liquido de clorinas" y la forma medicinal "Radachlorin, solución para inyecciones al 0.5 % (Photochlorin") . 769.2 mg/kg de la substancia "Extracto liquido de clorinas" al 6.5 % del Ejemplo 2 (50 mg/kg, calculado para la substancia de clorinas anhidra) se introdujeron intraperitonealemnte a ratones de la línea Balb/c. Los ratones fueron sacrificados 3 horas después de inyección (cada grupo consistió de 3 ratones) . Los materiales de hígado, riñon, bazo, pulmones, intestino delgado, tumor, tejidos circundantes, así como también de sangre, orina heces de intestino grueso que pesaron 100 mg cada uno fueron homogeneizados completamente en homogeneizadores de vidrio que se suplementaron con 4 mi de solución salina. Para examen de los fluidos biológicos (sangre, orina) se tomaron 0.1 mi de cada fluido con disolución subsecuente en 4 mi de solución salina. Los homogeneizados resultantes se estudiaron en un espectrofluorímetro "Perkin-Elmer" (modelo MPF-44A) . El estudio de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones (""Photochlorin") se llevó a cabo de una manera similar en los homogeneizados de órganos y tejidos de ratones a quienes fue introducida la preparación intraperitonealmente en la dosis de 50 mg/kg, los animales fueron sacrificados 3 horas después de inyección. En ambos casos hay una desviación de la máxima intensidad de fluorescencia en tejidos de hígado, intestino delgado, bazo y riñon a 670 nm ( en 10 - 12 nm en comparación con la solución 0.01 M de regulador de borato, pH 9.2, y en 5 - 6 nm en comparación con la solución 0.01 M de borato, pH 9.2, con 1 % de albúmina de suero humano), que indica el metabolismo de ,vRadachlorin, solución para inyecciones al 0.5 %" C"Photochlorin") (Figura 5) . En espectro de fluorescencia este fenómeno se observó diferentemente, que una amplitud de espectro simple y la desviación al intervalo de longitud de onda larga debido al efecto de hidrofobia del medio (por ejemplo, después de una interacción hidrofóbica con proteinas, lipoproteinas) . Se observa desviación de la máxima intensidad sin o con una pequeña amplitud de una banda que es típica de la formación de un nuevo compuesto. El espectro de fluorescencia de purpurina 5 en solución reguladora de borato 0.01 M, pH de 9.2, con 1 % de albúmina de suero humano se caracterizan por la presencia de la banda de 670 nm. En sangre , parénquima pulmonar, asi como también en piel y tumor se observa la amplitud de espectro 1.4 - 1.5 veces a longitud de onda de 669 nm, lo que indica la presencia de "Radachlorin solución al 0.5 % para inyecciones" (""Photochlorin") (su complejo con proteinas) y una mezcla de metabolitos en el homogeneizado . Si se añade directamente ""Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photochlorin") a los tubos con homogeneizado de tejidos de animales intactos en concentraciones de 0.5 - 1.0 µ? se detectó en sangre, intestino delgado, higado, bazo y pulmón un metabolito de "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photochlorins") (una desviación a intervalo de longitud de onda sin amplitud de un espectro) , y solamente en homogeneizado de piel se observó un leve incremento de 1.15 veces en la amplitud media del espectro, lo que indica la presencia de "Photochlorin" - mezcla de metabolitos en una muestra. Si la concentración de "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" (""Photochlorin") en homogeneizados de órganos es incrementada a 5 - 10 µ?, la presencia de mezcla clorina e& - purpurina 5 es registrada prácticamente en todas las muestras (una desviación de espectro a intervalo de longitud de onda larga en incrementos de 1.15- 1.05 veces en la amplitud media del espectro) . Asi, es posible considerar que la formación de un metabolito en adición de "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photochlorin") a homogeneizados depende de la concentración de la preparación y de la actividad de las enzimas de un tejido homogeneizado. Estos experimentos demuestran claramente la conversión de clorina es en purpurina 5 bajo las condiciones in vivo y ex vivo. Esta conversión es similar a la conversión de clorina e6 en purpurina 5 en calentamiento .

Ejemplo 12. N-octanol/regulador de fosfato, pH de 7.4, coeficiente de distribución. Se sometieron a vórtice por 20 segundos, 300 mi de n-octanol y 300 mi de regulador de fosfato, pH 7.4 y se centrifugaron por 10 minutos a 10000 rpm para dividir. Alícuotas de PS de 0.1 mi con concentraciones de 5 mg/ml se disolvieron en la solución reguladora preparada (2 mi) y n-octanol (8 mi), se determinó la absorción máxima a 406 nm.

Se obtienen los valores de D°c y Dbc , donde o es n-octanol, b es regulador de fosfato, c es control. La distribución de equilibrio de n-octanol/regulador de fosfato se logra al someter a vórtice 2 mi de regulador de fosfato y 8 mi de n-octanol con 0.1 mi de PS por 20 segundos a 20 °C con subsecuente centrifugación por 10 minutos a 10000 rpm. La densidad óptica de cada fase se mide a 406 nm, dando los valores de D° y Db, donde o es n-octanol, b es regulador de fosfato. Cd, es calculada de conformidad con la fórmula: Cd = donde Vo - el volumen de octanol tomado para la determinación de la distribución de equilibrio (8 mi), V°c - el volumen de octanol, saturado con agua, tomado para la determinación control de absorción de alícuota (8 mi), V*5 - el volumen del regulador tomado para la determinación de la distribución de equilibrio (2 mi) , Vbc - el volumen del regulador, saturada con octanol, tomada para la determinación de la absorción de alícuota (2 mi) . El experimento se lleva a cabo por tres veces y los valores obtenidos de Cd se promedian. El valor resultantes es 1.4 ± 0.3. E emplo 13. Determinación de fototoxicidad in vitro (actividad biológica) y citotoxicidad (toxicidad celular) de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photocnlorin") . Para estos trabajos se usaron el wFlow Lab" laminar (UK) , la incubadora por C02 wFlow Lab" (UK) , el "Bio-Tek Instruments" de multiescaneo (USA) , medios y sueros "PanEco" (Rusia) . Para un experimento, células de una línea son pasadas en dos placas de 48 células: una para irradiación láser y una para el experimento "en la obscuridad". Al día siguiente de la preparación se añade a las células en estado de confluencia y las placas se termoestabilizadas en papel negro. Se estudian las concentraciones de la preparación de 0.1, 0.5, 2.0 y 5.0 µ?. 3 ñoras después de adición de la preparación, las células son irradiadas con láser, siendo la dosis de irradiación de exposición de 50 J/cm2, y 39 horas después la prueba de MTT se lleva a cabo así como también la incubación con 14C-timidina para estimación de la síntesis de DNA (se prueba también la charola en "la obscuridad") . En todos los casos la parte superior de la placa se usa para la prueba de MTT, y la parte inferior se usa para medir la síntesis de DNA y el número de células después de tinción con cristal violeta. Los datos representados en la Tabla 2 son las medias de 4 experimentos paralelos. Ejemplo 14. Estudio In vivo de propiedades tóxicas de la substancia ""Extracto liquido de clorinas" y de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photoc lorin") . Se estudia la toxicidad de inyecciones intravenosas de PS en ratones blancos de laboratorio que pesaron 19 - 21 g (criadero de la Russian Academy of Medical Science, Krukovo) . Los animales se conservaron bajo . condiciones de vivero estándares y son alimentados de conformidad con el Ministry of Health of the USSR. Orden No. 1179 de 10.10.83 "acerca de la aprobación de especificaciones de consumos de forraje para animales de laboratorio en instituciones de protección de la salud". La toxicidad se determina de acuerdo con la muerte del animal, el cálculo posterior de la dosis letal media - LD50. El cálculo se lleva a cabo de acuerdo con métodos estadísticos recomendados por la State Pharmacopeia, edición XI (1,3). Con base en la LD50 la preparación estudiada es mencionada en la clase específica de toxicidad de acuerdo con Hodge y Sterner. Las reacciones de intoxicación se registran también durante el experimento . Se usan 12 ratones (6 machos y 6 hembras) para cada dosis probada de PS. Las dosis siguientes se usan para la determinación de la LD50 de PS: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 mg/kg. La solución con 5 mg/kg de concentración de PS es introducida a los ratones intravenosamente, se varia la dosis por el volumen de PS introducido. El valor de LD50 resultante es 210.53 + 22.2 mg/kg, el valor de LD50 es 169.87 mg/kg. Ejemplo 15. Actividad biológica in vivo con el uso de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" (""Photochlorin") . Se estudió la actividad fotodinámica de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photochlorin") sobre ratones de la linea Balb/c con embriocarcinoma T36 inoculado en el músculo de la pierna posterior. El peso de los ratones es 20- 21 g. El procedimiento de irradiación se realizó con el diodo láser ML-662-SP 2 semanas después de inoculación de un tumor. Se depiló la piel en el área de irradiación Antes Del procedimiento . La preparación se introdujo intraperitonealmente en una dosis de 40 mg/kg, que corresponde a una dosis terapéutica suficiente. Para llevar a cabo el procedimiento de irradiación los ratones se eterizaron. El peso de tumores en los grupos control y experimentales en el momento del experimento varia desde 0.9 hasta 1 g. La irradiación se llevó a cabo 5- 6 horas después de la inyección de PS. Cada animal, excepto para control, es irradiado una vez, luego es observado durante un mes después del procedimiento, · se registró el área de necrosis de tumor y el estado Fisiológico general. La densidad promedio de la dosis de exposición de irradiación es 150 o 300 J/cm2. Se observó el mejor resultado en la forma de necrosis completa , formación de costra en 1 semana después de PDT y esta costra se cae en 1.5 meses después de PDT en el grupo que obtuvo la dosis luminosa de 300 J/cm2. Ej emplo 16. Tratamiento de un cáncer de piel de células básales con el uso de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % para inyecciones" ("Photochlprin") . Se diagnosticó el cáncer de piel de células básales en exámenes citológicos de una raspadura. La preparación es introducida gota a gota intravenosamente para hacer la concentración de 0.7 mg/kg de peso del paciente después d e dilución en 100 mi de solución salina de NaCl al 0.9 % estéril. En 2 - 3 horas se lleva a cabo la irradiación sin anestesia de un tumor con el diodo láser ML-662-SP con longitud de onda de 662 nm con la dosis superficial de 50 J/cm2. No se registraron reacciones colaterales indeseables durante la inyección de la preparación y la irradiación láser. En dos horas después de irradiación se formó un foco marrón obscuro con área rojiza circundante de 1 - 2 cm en el lugar del tumor. Al final del primer día se formó una necrosis en el lugar del tumor en la forma de una costra marrón obscuro seca (costra negra gangrenosa) . En 2 - 3 semanas tiene lugar el rechazo de costra, y 2 semanas después, tiene lugar la epitelialisación completa del defecto de piel en el lugar del basalioma formador, con buen efecto cosmético.

Ejemplo 17. Tratamiento de un cáncer de piel de células básales con el uso de la forma medicinal "Radachlorin, gel al 0.5 %". Se diagnosticó cáncer de piel de células básales en examen citológico de una raspadura. El gel se aplica sobre un tumor en capa fina, si es posible no se toca la parte de piel saludable. La irradiación se lleva a cabo 20 - 40 minutos después de aplicar el gel. El procedimiento de irradiación sé realiza con el diodo láser ML-662-SP ("Mylon-Sigm Plus", Rusia) con longitud de onda de 662 nm. La densidad de la dosis de exposición de irradiación es 2500 J/cm2. en dos horas después de irradiación se forma un foco marrón obscuro con zonas rojizas circundantes de 1 - 2 cm, en el lugar del tumor. En 1 semana se forma una necrosis en el lugar del tumor en la forma de una costra marrón obscuro seca (costra negra gangrenosa) . En 2 semanas tiene lugar el rechazo de la costra, y 2 semanas más tarde tiene lugar la epitelialización del defecto de piel en el lugar del basalioma formador, con buen efecto cosmético. Ejemplo 18. Remoción de un tatuaje con el uso de la forma medicinal "Radachlorin, solución al 0.5 % en dimetilsulfoxida para uso externo". Se aplica la solución en la servilleta y ésta es puesta sobre el tatuaje, cubierto con papel negro o lámina delgada de aluminio y fijada por 30 minutos. El exceso de la solución se remueve desde una superficie con algodón humedecido con alcohol. El procedimiento de irradiación se realiza con el diodo láser ML-662-SP ( Mylon-Sigm Plus", Rusia) con longitud de onda de 662 nm, se lleva a cabo la irradiación a lo largo de las lineas patrón trazadas procurando evitar el tejido circundante. La densidad de la dosis de exposición de irradiación es 120 J/cm2. en una hora después de irradiación, se observó piel rojiza y esponjamiento en el lugar del tatuaje. Al final del segundo dia se formó una "imagen" marrón obscuro con zona rojiza circundante de 1 mm. En dos semanas se forma una necrosis en el lugar del tatuaje en la forma de una costra marrón obscura seca 2 semanas después tiene lugar la descamación de la costra junto con el tatuaje. En dosis luminosas más pequeñas el procedimiento va sin necrosis por decoloración de la tinción, pero hay una necesidad de dosis repetidas en este caso. Un tejido rosa blando se forma en el lugar del tatuaje en 6 semanas como un resultado de la PDT, este tejido difiere ligeramente de la piel circundante, se observa el buen efecto cosmético.

Claims (8)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :
2. REIVINDICACIONES : 1. Un fotoactivador caracterizado porque comprende clorina como sal con metal alcalino, caracterizado porque la clorina está compuesta de clorina ee (13-carboxi-17~[2-carboxietilj-lS-carboximetil-l?, 18-trans- dihidro-3-vinil-8- etil- 2, 7, 12, 18- tetrametilporfirina) en un 80 - 90 %, purpurina 5 (13- carboxi- 17- [2-carboxietil]- 15- foritiil- 17, 18- trans- dihidro- 3- vinil-8- etil- 2, 7, 12, 18- tetrametilporfirina) en un 5 - 20 %, y purpurina 18 - clorina p6 (13-carboxi- 17- [2- carboxietil]- 15- carboxi- 17, 18- trans-dihidro- 3- vinil- 8- etil- 2 , 7, 12, 18-tetrametilporfirina) en el resto, de modo que los componentes mencionados forman la composición. 2. Un fotoactivador de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa el sodio como metal alcalino .
3. 3. Un fotoactivador de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa el potasio como metal alcalino.
4. 4. Un método para producir un fotoactivador caracterizado porque se trata biomasa de espirulina con acetona hasta que se extrae completamente la clorofila a, la biomasa se separa por filtración o se centrifuga, el extracto se trata con ácido a fin de remover el ión magnesio de la molécula de clorofila e hidrolizar el grupo éster fitílico, y el derivado de feoforbida a resultantes se hacen reaccionar con una base inorgánica fuerte, I caracterizada porque después de tratar el extracto con ácido para remover el ión magnesio de la molécula de clorofila, el extracto es neutralizado y se separa por filtración la feofitina a precipitada, luego la feofitina a es hidrolizada en la mezcla de ácido clorhídrico- acetona-hexano, 6 - 16 mi de acetona, 0.6 - 6 mi de hexano y 5 - 10 mi de ácido clorhídrico concentrado se usan por cada gramo de feofitina a cruda, la mezcla se calienta hasta 40 - 60 °C y se agita por 20 minutos - 1 hora, luego se añade hexano (6 - 16 mi) y la fase orgánica se lava con la mezcla de acetona y ácido clorhídrico (2 - 10 : 1) , la fase acuosa se lava con hexano, luego la fase acuosa que contiene feoforbida a es neutralizada con exceso de solución acuosa de citrato de sodio (tri-, di- o mono-substituido) , la feoforbida a precipitada se separa por filtración, se lava con agua, se separa por recristalización desde la mezcla acetona - agua, se seca con aire hasta peso constante, luego la feoforbida a es disuelta en acetona, se añade la base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa de 0.05 - 1.00 % de concentración, se agita a 30 - 60 °C por 5 - 30 minutos, se añade volumen extra de base inorgánica fuerte en la forma de solución acuosa de 1 — 50 % de concentración, la mezcla se calienta a 40 - 60 °C por 20 — 90 min, se neutraliza con ácido clorhídrico diluido, el precipitado de clorina &e se separa por centrifugación, se lava con agua destilada hasta que desaparece la reacción acida, se obtiene 55 - 80 % de clorina ee, luego la clorina ee se separa por recristalización desde acetona a fin de separar tatrapirroles lineales, la clorina es se separa por filtración y se lava con agua destilada, la clorina ee se calienta en depósito sellado a las temperaturas de 40 - 100 °C por 1 hora - 30 días, luego se enfría y se añade solución de base fuerte hasta pH de 7.5 - 8.5, luego la solución se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración de fotoactivador de 6.5 - 7.5 % en masa.
5. 5. Un método para producir un fotoactivador de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque después de adición de la solución de base fuerte hasta pH de 7.5 - 8.5 la mezcla es filtrada sobre gel para hacer el porcentaje de clorina eg hasta 80 — 90 %, de purpurina 5 -hasta 5 - 20 % y de purpurina 18 - el resto, luego se añade solución diluida de ácido clorhídrico hasta que precipita el fotoactivador, la solución se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración del fotoactivador de 6.5 - 7.5 % en masa, asi se obtiene el Extracto liquido de clorinas".
6. 6. Un método para producir un fotoactivador de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque después de la etapa de filtración sobre gel se añade solución diluida de ácido clorhídrico a la solución de fotoactivador hasta que el fotoactivador precipita, luego el precipitado se separa por filtración o por centrifugación, se añaden los aditivos aprobados por la RF State Pharmacopeia hasta pH de 7.5 - 8.5, se añade agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración de fotoactivador de 0.1 - 1 % en masa, luego se separan las bacterias por filtración.
7. 7. Un método para producir un fotoactivador, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque después de la etapa de filtración sobre gel se añade solución diluida de ácido clorhídrico a la mezcla hasta que precipita el fotoactivador, este precipitado se separa por filtración o por centrifugación, se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración del fotoactivador de 6.5 — 7.5 % en masa, el "Extracto líquido de clorinas" es dispersado en substrato en gel de conformidad con la siguiente proporción: 0.5 - 12 % en masa del "Extracto líquido de clorinas", 5 - 20 % en masa de dimetilsulfoxida, el resto es agua, los aditivos aceptables farmacológicamente y el substrato en gel.
8. 8. Un método para producir un fotoactivador de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque después de la etapa de filtración sobre gel se añade solución diluida de ácido clorhídrico a la mezcla hasta que el fotoactivador precipita, este precipitado se separa por filtración o por centrifugación, se ajusta con agua apirógena para inyecciones para hacer la concentración de fotoactivador de 6.5 - 7.5% en masa, y el "Extracto líquido de clorinas" resultante se disuelve en dimetilsulfoxida de conformidad con la siguiente proporción: 0.5 - 12 % en masa del "Extracto líquido de clorinas" y el resto es dimetilsulfoxida.