RU2234508C2 - Палладий-замещенные производные бактериохлорофилла и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к палладийзамещенным производным бактериохлорофилла формулы I, I' или I"

где А представляет собой ОН, OR₁, -O-(CH₂)_n-Y, -S-(CH₂)_n-Y, -NH-(CH₂)_n-Y, -O-(СН₂)₂-ОН, -NH-(CH₂)₂-NH-BOC или -N(CH₂-CH=CH₂)₂, где R₁ представляет собой Na⁺, K⁺, (Са²⁺)_0,5, (Mg²⁺)_0,5, Li⁺, NH $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{4}}$ , ⁺NH₃-C(CH₂OH)₃,⁺NH₃-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH, ⁺NH₂(СН₃)-СН₂-(СНОН)₄-СН₂OH или ⁺N(C_n'H_2n'+1)₄; R₂ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I', и R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₄ для соединения формулы I, где R₄ представляет C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил; R₃ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I', и R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси для соединения формулы I; n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, Y представляет собой -NR'₁NR'₂ или -⁺NR'₁R'₂R'₃X^-, где R'₁, R'₂ и R'₃ каждый независимо от другого представляет собой -СН₃ или -С₂Н₅; Х представляет собой F, Cl, Br или I, n' равно 1, 2, 3 или 4, и где * обозначает асимметричный атом углерода и --- обозначает одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь фармацевтической композиции, обладающей способностью детектирования или лечения опухолей, содержащей, по меньшей мере, одно соединение формулы I, I' или I", трем способам получения соединения формулы I. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 табл., 11 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к палладийзамещенным производным бактериохлорофилла, способам их получения, промежуточным соединениям для их получения и к фармацевтическим композициям, включающим их, а также к их применению в области in vivo фотодинамической терапии и диагностики и in vitro фотодинамического уничтожения вирусов и микроорганизмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И АББРЕВИАТУРЫ

ВСHl=бактериохлорофилл а (Мg-содержащий 7,8,17,18-тетрагидропорфирин, имеющий фитильную или геранилгеранильную группу в положении 17³, группу СООСН₃ в положении 13², атом Н в положении 13², ацетильную группу в положении 3 и этильную группу в положении 8).

BChlide=бактериохлорофиллид а (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из ВСhlа).

BPhe=бактериофеофитин а (ВСhl, в котором центральный атом Мg замещен на два атома Н).

BPheid=бактериофеофорбид а (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из BPhe).

Pd-BPheid=Pd-бактериофеофорбид (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из BPhe, имеющая центральный атом Pd, группу СООСН₃ в положении 13², атом Н в положении 13², ацетильную группу в положении 3 и этильную группу в положении 8).

Во всем описании для производных бактериохлорофилла используют нумерацию IUPAC. По этой номенклатуре природные бактериохлорофиллы имеют два сложных эфира карбоновых кислот в положениях 13² и 17², однако они являются этерифицированными по положениям 13³ и 17³.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует повышенный интерес к применению фотосенсибилизаторов для лечения рака. В соответствии с данной методикой, известной как фотодинамическая терапия (PDT), фотосенсибилизаторы помещают, например, в область опухоли, и в процессе фотосенсибилизации in situ продуцируются соединения, которые вызывают интоксикацию злокачественных клеток.

Фотодинамическая терапия, использующая порфирины и родственные соединения, к настоящему времени имеет довольно продолжительную историю, ранние работы в 1940-х годах показали, что в облученной опухолевой ткани можно вызвать флюоресценцию порфирина. Оказалось, что порфирины накапливаются в данных тканях и являются способными к абсорбции света in situ, обеспечивая способ детектирования опухоли путем определения локализации флюоресценции. Препаратом, широко использующимся на ранних стадиях фотодинамической обработки как с целью детекции, так и с целью лечения, является неочищенное производное гематопорфирина, также называемое гематопорфириновое производное, HpD или производное Lipson, полученное по способу, описанному Lipson с соавторами в J. Natl. Cancer Inst. (1961) 26:(1-8). С данным препаратом была проделана большая работа, и Dougherty и соавторы описали применение данного производного в лечении злокачественных образований (Cancer Res. (1978) 38:2628-2635; J. Natl. Cancer Inst (1979) 62:231-237).

Dougherty и соавторы получили более эффективную форму гематопорфиринового производного, которая включает фрагмент HpD, имеющий аггрегативный вес >10 кДа. Данная форма лекарственного препарата, применимая в фотодинамической терапии, представляет собой заявленный объект патента США 4649151, является коммерчески доступной и проходит клинические испытания.

Установлено, что основные принципы применения светопоглощающих соединений, особенно относящихся к порфиринам, состоят в лечении опухолей при системном введении. Характерная способность данных препаратов разрушать опухоль в противоположность нормальной ткани является результатом эффекта самонаведения данных препаратов на нежелательные клетки. (См., например, Dougherty, T.J. et al., "Cancer: Principles and Practice of Oncology" (1982), V.T. de Vita, Jr., et al., eds. pp 1836-1844). Были сделаны попытки улучшить эффект самонаведения путем образования конъюгатов гематопорфиринового производного с антителами. (См., например, Mew, D., et al., J. Immunol (1983) 130:1473-1477). Механизм умерщвления клеток этими лекарственными препаратами, по-видимому, включает образование синглетного кислорода при облучении (Weishaupt, K.R., et al., Cancer Research (1976) pp. 2326-2329).

Применение гематопорфиринового производного или его активных компонентов при лечении кожных заболеваний с помощью местного введения также было описано в патенте США 4753958. Кроме того, данные лекарственные препараты использовали для стерилизации биологических образцов, содержащих инфекционные организмы, такие как бактерии и вирусы (Matthews, J.L., et al., Transfusion (1988):81-83). Для этой цели также использовали различные другие фотосенсибилизирующие соединения, как изложено, например, в патенте США. №4727027.

В основном способы применения радиационных сенсибилизаторов с разными структурами для избирательного повреждения функционирования биологических субстратов как in vivo, так и in vitro, известны в данной области. Соединения, использующиеся в данных методиках, должны иметь разное сродство к целевым биологическим субстратам, подлежащим повреждению или разрушению, и должны быть способны к абсорбции света так, чтобы облученный лекарственный препарат активировался таким образом, чтобы оказывать повреждающий эффект на находящиеся по соседству композиции и вещества.

Так как всегда желательно оптимизировать проведение лечения и диагностики, проводят поиск различных форм порфириновых лекарственных препаратов, традиционно использующихся в лечении и диагностике. Полагают, что существует множество основных классов фотосенсибилизаторов, включая фталоцианины, соединения, относящиеся к псораленам, и мультициклические соединения, имеющие в общем случае резонансные системы. Наиболее близкими к соединениям, раскрытым в данном документе, являются различные феофорбидные производные, применение которых в фотодинамической терапии было описано в заявке ЕРО 220686, Nihon Metaphysics Company; этилендиаминовые производные, предназначенные для данной цели, описаны в заявке Японии J85/000981, Таmа Seikayaku, К.К., и в заявке Японии J88/004805, которая направлена на 10-гидроксифеофорбид-а. Кроме того, Beems, Е.М., et al., in Photochemistry and Photobiology (1987) 46:639-643 раскрывают применение в качестве фотосенсибилизаторов двух производных бактериохлорофилла-а -бактериохлорофиллин-а (также известный как бактериофеофорбид-а, который утратил остаток фитилового спирта, присутствующего в бактериохлорофилле-а), и бактериохлорин-а (который утратил и фитильную группу и ион Mg). Авторы направили свои усилия на данные производные, так как они имеют преимущества, состоящие в увеличении растворимости в воде по сравнению с бактериохлорофиллом-а.

ЕР 584552 и W0 97/19081, обе от Yeda Research and Development Co. Ltd., описывают производные хлорофилла и бактериохлорофилла и их применение в качестве агентов PDT, а также металлированные бактериохлорофиллы и их получение путем трансметаллирования соответствующих Cd-BChl производных соответственно.

Остается проблема поиска подходящих фотосенсибилизаторов, применимых в фотодинамической терапии и диагностике, оптимальных для конкретных мишеней и конкретной среды. Таким образом, данное изобретение предоставляет дополнительные группы фотосенсибилизирующих соединений, которые являются частью набора вариантов, предназначенных для применения в конкретных терапевтических и диагностических ситуациях.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время обнаружено в соответствии с данным изобретением, что соединения формул I, I' или I", приведенных ниже, где А, как определено ниже, представляет заместитель, способный обеспечить эффективный перенос в плазме и проникновение через клеточную мембрану, применяются в качестве агентов PDT и обладают преимуществами, состоящими в увеличении растворимости, стабильности и/или эффективности по сравнению с известными соединениями. Данное изобретение таким образом касается соединений формулы I, I' или I"

где А представляет собой ОН, OR₁,

-O-(CH₂)_n-Y,

-S-(CH₂)_n-Y,

-NH-(CH₂)_n-Y,

-O-(CH₂)₂-NH₂,

-O-(CH₂)₂-OH,

-NH-(CH₂)_n-⁺N о, X^-,

-NH-(CH₂)₂-NH=BOC или

-N-(CH₂-CH=CH₂)₂

где

r₁ представляет собой Na⁺, К⁺, (Ca²⁺)_0,5, (Мg²⁺)_0,5, Li⁺, NH₄ $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{+}}$

 ⁺NН₃-С(CН₂ОH)₃, ⁺NН₃-СН₂-(СНОН)₄-CH₂OH,

 ⁺NH₂(CH₃)-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH или

 ⁺N(C_n,H_2n'+1)₄;

R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₄, где R₄ представляет собой C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил;

R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси;

n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6,

Y представляет собой -NR'₁R'₂ или -NR'₁R'₂R'₃,X^-, где R'₁, R'₂ и

R'₃ независимо друг от друга представляют собой -СН₃ или -С₂Н₅;

Х представляет собой F, Cl, Вr или I, n' равно 1, 2, 3 или 4,

и где * обозначает ассимметричный атом углерода, и -представляет одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь.

Кроме того, настоящее изобретение касается способов получения вышеуказанных новых соединений.

Таким образом, в одном из аспектов в данном документе описывается способ инициирования повреждения или разрушения целевого биологического субстрата, данный способ включает обработку целевого субстрата количеством соединения формулы I, I' или I", эффективным для фотосенсибилизации упомянутого субстрата, с последующим облучением упомянутого целевого субстрата в интервале длин волн, поглощаемых соединением формулы I, I' или I", в течение времени, эффективного для повреждения или разрушения субстрата.

В другом аспекте данное изобретение таким образом направлено на фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере соединение формулы I, I' или I" в качестве активного агента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Данные композиции применяются для in vivo фотодинамической терапии и диагностики опухолей и для умерщвления клеток, вирусов и бактерий, паразитов и грибков, в образцах и в живых тканях, с помощью хорошо известных фотодинамических методик.

Кроме того, данное изобретение касается применения соединений формулы I, I' или I" для получения фармацевтической композиции, применимой в фотодинамической терапии.

Данное изобретение также касается применения соединений данного изобретения для получения композиций, применимых в диагностике и для ех vivo умерщвления бактерий, паразитов, вирусов и грибков.

Данное изобретение также касается хлорангидрида и ангидрида кислот формул II и III, соответственно приведенных ниже, как промежуточных соединений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигуре 1 показан спектр оптического поглощения Pd-BPheid в смеси ацетон и метанол/К-фосфатный буфер.

На фигурах 2 и 3 показаны соответственно масс-спектры Pd-BPheid низкого и высокого разрешения, полученные методом бомбардировки быстрыми атомами (FAB-MS).

На фигуре 4 показаны зависимые от времени морфологические изменения клеток А431 с Pd-BPheid или BChl-SerOMe после PDT (на фигурах Bchl-Ser обозначает BChl-SerOMe, серилметиловый эфир BChl).

На фигуре 5 показана фототоксичность Pd-BPheid и BChl-SerOMe, анализированная на клетках ECV-304.

На фигуре 6 показана фототоксичность Pd-BPheid и этилового эфира Pd-BPheid на культивированных клетках мышиной меланомы M2R. (А) пигменты растворяют в 95% этаноле и дополнительно разбавляют до указанных концентраций в культуральной среде+10% сыворотки до 1% этанола. (В) пигменты растворяют непосредственно в культуральной среде+10% сыворотки.

На фигуре 7 показана фототоксичность Pd-BPheid на культивированных клетках мышиной меланомы M2R и клетках карциномы ободочной кишки человека Н29.

На фигуре 8 показана PDT мышиной меланомы M2R с использованием Pd-BPheid (2/5 мг/кг), растворенного в Cremophor и разбавленного солевым раствором.

На фигуре 9 показана PDT мышиной меланомы M2R с использованием Pd-BPheid (2,5 мг/кг), растворенного в солевом растворе и разбавленного Cremophor.

Фигура 10 иллюстрирует излечение первичных глиомных опухолей С6 после PDT с использованием Pd-BPheid или Pd-BPheid-SerOMe (на фигуре Pd-Bchl-Ser).

На фигуре 11 показано появление метастаз глиомы С6 у голых мышей CD1 после операции (ампутации) или после PDT с использованием Pd-BPheid или Pd-BPheid-SerOMe (на фигуре Pd-Bchl-Ser).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В предпочтительном воплощении соединения данного изобретения имеют следующую формулу с оптической конфигурацией, указанную ниже:

где А является таким, как определено выше. Если пунктирные линии, представляющие в вышеприведенной структуре связь между С7 и С8 и С17 и С18, являются насыщенными одинарными связями, то атомы углерода с номерами 7, 8, 17 и 18 являются асимметричными. Если R₂ или R₃ представляет собой Н, то С13² является асимметричным атомом углерода.

В присутствии кислорода или на воздухе при воздействии света может происходить окисление вышеупомянутых связей С₇-С₈ и С₁₇-С₁₈, что приводит к образованию соединений с двойными связями в указанных положениях С₇-С₈ и С₁₇-С₁₈.

Соединения формулы I' и I" настоящего изобретения являются окисленными формами соединений формулы I и могут быть получены по способу, описанному в Chlorophyll, by Scheer H. (ed.), CRC Press, 1991, pp. 147-209.

В предпочтительном воплощении данного изобретения соединения представляют собой такие соединения, в которых А представляет OR₁.

В наиболее предпочтительном воплощении соединение данного изобретения представляет собой Pd-BPheid (также обозначаемый иногда в данном документе Pd-BChl-COOH), соединение формулы I, где А представляет ОН, имеющее следующую структуру:

Один из способов получения соединений формулы I, где А представляет ОН, включает по меньшей мере стадии:

a) объединенные деметаллирование и гидролиз соединения M-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, геранилгеранил (gg) или SerOMe (серил-O-метиловый сложный эфир), а М представляет собой металл, выбранный из Мg, Cd или Zn;

b) включение Pd с помощью Pd реагента в соединение, полученное на стадии (а), с получением Pd-BPheid, и, при желании,

c) последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В одном предпочтительном воплощении способ направлен на получение Pd-BPheid, бактериохлорофилл a (Bchia) подвергают деметаллированию и гидролизу на стадии (а) и полученный бактериофеофорбид (BPheid) взаимодействует с Pd реагентом на стадии (b) с получением целевого Pd-BPheid.

Другой способ получения соединения формулы I включает по меньшей мере стадии:

a) трансметаллирование BChlide-17³-Z с получением соответствующего Pd-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, gg или SerOMe

b) гидролиз полученного соединения и

c) необязательно последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В одном предпочтительном воплощении способ направлен на получение Pd-BPheid, бактериохлорофилл a (BchLa) подвергают трансметаллированию на стадии (а) для замены природного центрального атома Мg на Pd, и полученный Pd-BPheid-l7³-Z, где Z представляет собой фитил, подвергают гидролизу на стадии (b) с получением целевого Pd-BPheid.

Другой способ получения соединения формулы I включает по меньшей мере стадии:

а) ферментативный гидролиз BChlide-17³-Z, где Z представляет собой фитил или геранилгеранил, с получением BChlide;

b) кислое деметаллирование упомянутого BChlide, полученного на стадии (а);

c) введение Pd с помощью Pd реагента в деметаллированный BPheid, полученный на стадии (b); и

d) необязательно последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В вышеуказанных способах получения соединений формулы I Pd реагент может представлять собой любое подходящее реакционноспособное соединение, доставляющее Pd в таких структурах, как, например, ацетат Pd и хлорид Pd.

Введение Pd в вышеуказанных процедурах может быть достигнуто с помощью двухстадийной методики с использованием аскорбата Na или аскорбиновой кислоты, или с помощью одностадийной методики с использованием 6-О-пальмитоил-L-аскорбиновой кислоты.

Соединения данного изобретения, в которых А отличается от ОН и OR₁, могут быть получены путем взаимодействия Pd-BPheid (Pd-BChl-COOH) с соответствующим соединением А-Н.

Соединения формул II и III, приведенных выше, являются промежуточными соединениями для соединений формулы I данного изобретения. Хлорангидриды формулы II, Pd-BPheid-COCl могут быть получены с помощью любого агента, подходящего для получения хлорангидридов, такого как, например, SOCl₂.

Ангидриды кислоты формулы III могут быть получены путем дегидратации соединений формул I, I', I" с помощью уксусного ангидрида.

Соединения формул I, I' или I" могут быть получены путем взаимодействия данных промежуточных соединений II и III с соответствующим соединением АН.

Далее данное изобретение включает фармацевтически приемлемые соли свободных кислот формул I, I' и I". Данные соли могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как взаимодействие свободной кислоты или ее соли с неорганическими или органическими реагентами, такими как, не ограничиваясь ими, NaOH, КОН, подходящие соли кальция или магния, LiOH, NH₄OH, гидроксид тетраалкиламмония, например гидроксид тетраэтиламмония, или N-метилглюкамин, глюкамин и триэтаноламин.

Соединения данного изобретения предназначены для применения в фотодинамической терапии и диагностике, что касается целевых биологических субстратов. Под целевым биологическим субстратом подразумеваются любые клетки, вирусы или ткани, которые являются нежелательными для их окружения, к которому применяют терапию или другое корректирующее воздействие, такое как стерилизация, или местоположение которых желательно узнать в их окружении, диагностику которого осуществляют.

В соответствии с настоящим изобретением, лекарственный препарат вводят субъекту и позволяют достичь оптимальной концентрации в целевом субстрате. Затем целевой субстрат облучают при длине волны, соответствующей спектру поглощения введенного соединения. Действие данного соединения может быть усилено путем сопутствующего повышения температуры целевого субстрата.

Для применения в способе данного изобретения получают композицию, в которую входят соединения данного изобретения, с использованием традиционных эксципиентов, подходящих для подразумевающегося применения. Для системного введения в основном применяют забуференные водные композиции с достаточным количеством нетоксичного детергента для солюбилизации активного соединения. Так как соединения данного изобретения в основном не очень хорошо растворяются в воде, может применяться солюбилизирующее количество такого детергента. Подходящие нетоксичные детергенты включают, не ограничиваясь ими, Tween-80, различные желчные соли, такие как глихолат натрия, различные аналоги желчных солей, такие как фузидаты. В альтернативных композициях используют липосомальные носители. Раствор забуферивают при желательном рН, используя традиционные буферы, такие как раствор Хэнка, раствор Рингера или фосфатный буфер. Могут быть также включены другие компоненты, которые не препятствуют функционированию лекарственного препарата, такие как стабилизирующие количества белков, например сывороточного альбумина, или липопротеины низкой или высокой плотности (LDL и HDL соответственно). Композиции, предназначенные для системного введения, могут быть введены путем инъекции, такой как внутривенная (в.в.), интраперитонеальная (и.п.), внутримышечная или подкожная (п.к.) инъекция, или могут быть введены с помощью трансмембранного или трансдермального метода. Композиции, подходящие для трансдермального или трансмембранного введения, включают спреи и свечи, содержащие вещества, способствующие проникновению, которыми зачастую могут являться детергенты, описанные выше.

Композиция, предназначенная для местного локального введения, также может содержать вещество, способствующее проникновению, она может существовать в виде мази, бальзама, линимента, крема или масла. Подходящие композиции как для системного, так и для локализованного местного введения можно обнаружить в Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition,. Mack Publishing Co., Easton, PA.

При применении ex vivo для обработки, например, крови или плазмы для переливания, или препаратов кровяных продуктов, нет необходимости в использовании специальных композиций, причем соединения данного изобретения растворяют в подходящем совместимом растворителе и смешивают с биологической жидкостью в подходящих концентрациях, порядок которых обычно составляет 1-100 мкг/мл, до облучения.

При фотодинамических терапевтических и диагностических применениях подходящие интервалы дозировок варьируют в зависимости от способа применения и выбора соединения, а также от природы состояния, подлежащего лечению или диагностике. Однако в основном порядок подходящих доз составляет от 0/01 до 50 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,1 до 10 мг/кг. При местном применении обычно применяют общее количество, порядок которого составляет 5-100 мг.

Общие процедуры фотодинамической обработки ex vivo аналогичны приведенным Matthews, J. L., et al., Transfusion (supra).

Короче говоря, при системном введении дают пройти подходящему периоду времени после введения, обычно составляющему от нескольких минут до двух дней, для того, чтобы достичь оптимальной концентрации соединений данного изобретения в целевом биологическом субстрате. В основном данный субстрат является опухолевой сосудистой сетью, клетками опухоли или любым другим опухолевым компонентом, и локализацию соединения можно отслеживать путем измерения оптического поглощения целевой ткани по сравнению с базовым уровнем. После проведения оптимизации целевой биологический субстрат облучают подходящим участком спектра, в интервале 740-800 нм или 500-600 нм, или 700-900 нм, с мощностью 5-750 мВт/см², и с общей энергией 100-1000 Дж/см².

При местном применении локализация является немедленной, и соответствующее облучение может быть предоставлено позднее. При обработке биологических жидкостей ех vivo облучение применяют после достижения оптимального связывания/поглощения целевой тканью. Порядок плотности потока облучения составляет 1-10 Дж/см². Так как не требуется проникновение через ткань, можно применять более низкую общую энергию.

Композиции данного изобретения включают по меньшей мере одно соединение формулы I, I' или I", как определено выше, с физиологически приемлемым носителем. Данные композиции могут находиться в виде раствора, липидной эмульсии или геля, или в виде липосом или наночастиц. Подходящий носитель выбирают так, чтобы получить оптимальную концентрацию соединения данного изобретения в целевом субстрате. Примеры таких носителей представляют собой, не ограничиваясь ими, "Tween 80", полиэтиленгликоль, например PEG 400, "Cremophor EL", пропиленгликоль, этанол, базиликовое масло, желчные соли и аналоги желчных солей, и их смеси. Липосомальные композиции могут быть получены, например, на основе димиристоилфосфатидилхолина или фосфатидилглицерина. Носитель может также включать дипальмитоилфосфатидилхолин.

При применении наночастиц они могут находиться в виде PEG-покрытых наночастиц поли(молочной кислоты). Для липидных эмульсий обычно используют липопротеины низкой плотности и триглицериды.

В композиции данного изобретения соединение(я) данного изобретения присутствует(ют) в количестве, составляющем от 0,01 до 20%, предпочтительно от 0,05 до 5% по массе от общей массы композиции.

Далее данное изобретение будет иллюстрироваться с помощью следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение Pd-BPheid

Pd-BPheid получают из ВСhlа с помощью следующего 3-стадийного способа.

(а) Выделение бактериохлорофилла а (ВСhlа)

ВСhlа экстрагируют из лиофилизированной бактерии Rhodovolum. sulfidophilum следующим образом:

Лиофилизированные клетки (100 г) измельчают в порошок, промывают 5 раз общим количеством ацетона 1250 мл для частичной промывки от каротиноидов, смесь фильтруют и BChla, экстрагируют из твердого вещества абсолютным метанолом (~1200 мл, 4-5 фильтраций). После фильтрации темный сине-зеленый раствор частично упаривают в вакууме, концентрированный раствор (~500 мл) экстрагируют 2-3 раза петролейным эфиром (т.пл. 80-100°С, ~1300 мл) для дальнейшего устранения каротиноидов, и фазу петролейного эфира экстрагируют дважды метанолом (~550 мл). Данную фазу затем отбрасывают, объединенную метанольную фазу упаривают в вакууме, сине-зеленый осадок перерастворяют в смеси метанол-ацетон (1:3, об/об) и загружают на колонку с DEAE-сефарозой (3 × 10 см), уравновешенную смесью метанол-ацетон (1:3, об/об). BChla элюируют смесью метанол-ацетон (1:3, об/об), затем метанол-ацетоновую смесь упаривают и сухой ВСhlа, перерастворяют в точном объеме (для получения спектра поглощения) простого эфира и фильтруют через вату для того, чтобы избавиться от растворенного вещества колонки. После последнего упаривания твердый пигмент хранят в атмосфере аргона в темноте при -20°С. Выход на стадии экстракции: приблизительно 700 мг ВСhlа на 100 г лиофилизированных клеток.

Колонку с DEAE-сефарозой готовят по описанной ранее методике (Omata and Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a. Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., vol. 24, pp. 1093-1100). Короче говоря, DEAE-сефарозу промывают дистиллированной водой и затем превращают в ацетатную форму путем суспендирования в 1 М натрий-ацетатном буфере (рН 7). Взвесь промывают 3 раза ацетоном, затем суспендируют в смеси метанол-ацетон (1:3, об/об) и хранят при 5°С.

(b) Получение бактериофеофорбида (BPheid)

Неочищенный экстракт ВСhlа, полученный на стадии (а) (приблизительно 100 мг Bchia, содержащего некоторое количество остаточных каротиноидов), растворяют в 80% водном растворе трифторуксусной кислоты (приблизительно 15 мл), через который барботируют азот в течение 10 мин. Раствор перемешивают 2 ч при температуре окружающей среды. Затем реакционную смесь выливают в воду (250 мл) и экстрагируют хлороформом. Экстракт дважды промывают водой и сушат над безводным Na₂SO₄. После упаривания растворителя остаток хроматографируют на оксиде кремния (колонка 3 см × 15 см, Kieselgel 60, Merck и элюируют раствором метанола в хлороформе при ступенчатом градиенте: 2, 5, 10, 15%. Сначала вымывают каротиноиды и небольшое количество бактериофеофитина, затем элюируют алло-бактериофеофитин и каротиноиды. При 10% метанола в хлороформе начинают собирать продукт, контролируя с помощью ТСХ (Kieselgel, хлороформ-метанол, 9:1). Продукт (60 мг) упаривают и остаток, взятый в хлороформе, фильтруют через мембрану UltraPore для удаления остатков оксида кремния, который в противном случае может вызвать окисление.

(с) Введение палладия в бактериофеофорбид (BPheid)

BPheid (100 мг), полученный на стадии (b), и ацетат Pd (80 мг) растворяют в дихлорметане (~10 мл) и добавляют к суспензии 200 мг аскорбата натрия в 50 мл метанола. Реакционную смесь перемешивают в закрытой колбе при комнатной температуре, каждые 15-20 мин берут образцы из реакционной смеси и регистрируют их оптическое поглощение. Приблизительно через 4 ч максимум поглощения BPheid при 357 нм заменяется на поглощение Pd-BPheid при 330 и 390 нм.

Реакционную смесь переносят в раствор хлороформ/вода (200 мл; 50:50 об/об) и встряхивают в разделительной воронке. Органическую фазу собирают, промывают водой, сушат над безводным хлоридом натрия и упаривают. Сухое вещество добавляют к 80 мг ацетата Pd и указанные выше стадии повторяют до тех пор, пока остаточное поглощение при 357 нм полностью не исчезнет, и соотношение между поглощением при 765 нм (пик перехода в инфракрасную область) и максимальным поглощением при 330 нм не достигнет значения ~2,4 (в хлороформе).

Сухую реакционную смесь солюбилизируют в минимальном объеме смеси хлороформ:ацетон 2:1 и загружают на колонку с СМ-сефарозой (150 мм × 25 мм), которую предварительно уравновешивают ацетоном. Колонку вначале промывают ацетоном и первую элюированную фракцию отбрасывают. Затем колонку промывают смесью ацетон:метанол 9:1. Две полосы становятся заметными и вымываются - первая является основным продуктом, а вторая является алломеризованным побочным продуктом (отбрасывают). Продукт концентрируют почти досуха и переносят в систему хлороформ : вода 50:50 в разделительной воронке. Смесь тщательно встряхивают и органическую фазу отделяют, сушат над безводным сульфатом натрия (или хлоридом натрия) и упаривают досуха.

Пример 2. Получение Pd-BPheid

(а) Выделение ВСhlа

Данную стадию способа проводят,как описано в приведенном выше примере 1(а).

(b) Получение Pd-BPheid

6-О-пальмитоил-L-аскорбиновую кислоту (246 мг, 593 мкмоль) растворяют в МеОН (84 мл) и через раствор пропускают N₂. BPheid (92 мг, 151 мкмоль) и Pd(CH₃COO)₂ (83 мг, 370 мкмоль) растворяют в СНСl₃ (34 мл, дегазированный с помощью N₂) и добавляют к метанольному раствору. Смесь держат в инертной атмосфере при перемешивании и развитие реакции отслеживают, записывая спектры поглощения небольших порций реакционной смеси каждые несколько минут. Через ~30 мин реакция завершается и растворители упаривают.

(с) Очистка Pd-BPheid

Неочищенный Pd-BPheid растворяют в СНСl₃ и загружают на колонку, содержащую 15 г 0,4%-Silica-Asc. Небольшой объем СНСl₃ (~30 мл) пропускают через колонку и затем пигмент элюируют, используя МеОН:СНСl₃ (1:99, ~250 мл). Чистоту фракций определяют с помощью ТСХ и оптической абсорбционной спектроскопии. Масс-спектроскопию и ЯМР детекцию проводят на контрольных образцах. Выход: 82,5 мг чистого Pd-BPheid (76%).

Для получения 0,4%-Silica-Asc. аскорбиновую кислоту (240 мг) растворяют в 240 мл смеси EtOH: СНСl₃:МеОН (60:60:120). Добавляют силикагель 60 (60 г, Merck, кат. номер 107734, меш 70-230, взвесевую смесь перемешивают в течение 10 мин и затем фильтруют под вакуумом. Silica-Asc желтоватого цвета в конце высушивают в течение ~1 ч при ~50°С. Данный 0,4%-Silica-Asc является готовым к применению как силикагель регулярной структуры; его природа является менее полярной и он обладает некоторыми антиоксидантными свойствами.

Пример 3. Получение Pd-BPheid

(a) Выделение Bchla

Данную стадию проводят, как описано в приведенном выше примере 1(а).

(b) Получение хлорофиллазы (Chlase)

Хлорофиллазу (Chlase) получают из хлоропластов листьев Melia azedarach L.,. Chine tree leafs. Свежие листья (50 г) измельчают в течение 2 мин в смесителе, содержащем 350 мл ацетона, охлажденного до -20°С. Гомогенат фильтруют через четыре слоя марли, фильтрат собирают и оставляют на ночь при 4°С для дальнейшей преципитации. Ацетон удаляют путем фильтрации и оставшийся порошок промывают несколько раз холодным ацетоном для удаления следов Chlase и каротиноидов, пока фильтрат не обесцветится. Chlase ацетоновый порошок в конце сушат в лиофилизаторе и далее хранят при -20°С. В данных условиях ферментативный препарат является стабильным в течение 1 года без значительной потери активности. Выход: получают 20 г Chlase на 1 кг листьев.

(с) Синтез и очистка бактериохлорофиллида (BChlide)

Аскорбиновую кислоту (70 мг, Merck) растворяют в воде (9 мл), рН раствора доводят до 7,7 с помощью 10 М водного раствора КОН и добавляют 1 мл 0,5 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,7) для поддержания рН в течение реакции. Добавляют тритон Х-100 (приблизительно 80 мкл) до достижения конечной концентрации детергента 0,8% (об/об). Chlase ацетоновый порошок (200 мг) гомогенизируют в 6 мл данного раствора, используя гомогенизатор Polytron. Оставшийся раствор используют для промывания инструмента и затем объединяют с гомогенатом. Раствор фермента обрабатывают ультразвуком с 20 мг твердого ВСhlа, насыщенного аргоном, и инкубируют в темноте в течение 6 ч при 37°С при перемешивании.

Для очистки реакционное вещество непосредственно замораживают (~20°С) через 6 ч после начала реакции и затем лиофилизируют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, обрабатывают ультразвуком, после чего раствор наносят на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную ацетоном. Колонку промывают ацетоном для элюирования непрореагировавшего вещества и затем 5% и 7% метанолом в ацетоне (об/об) для элюирования бактериохлорофиллида (BChlide) и бактериофеофорбида (BPheid). Продукт элюируют 25% метанолом в ацетоне. Растворитель упаривают и твердый пигмент хранят в атмосфере аргона при -20°С в темноте. Выход реакции: 30-55%. СМ-сефарозу для хроматографии получают путем промывания СМ-сефарозы вначале водой, затем 3 раза ацетоном перед наполнением колонки и уравновешиванием в ацетоне. Хроматографическое вещество можно использовать повторно после тщательного промывания 2 М водным раствором NaCl до обесцвечивания, промывания водой и ресуспендирования в ацетоне.

(d) Введение палладия в бактериофеофорбид (BPheid)

Процедура является такой же, как в примере 1(с), описанном выше. ВЭЖХ сухого вещества показывает, что основной продукт присутствует в виде двух эпимеров, которые являются химически идентичными (88% от всей смеси), и остаточных алломеров. Имеется также незначительное загрязнение (0,5%) исходным веществом, BPheid.

Пример 4. Характеристика соединения Pd-BPheid

(а) Спектры поглощения

Спектры поглощения Pd-BPheid получали с помощью спектрофотометра UVICON (длина прохождения луча 1 см) с использованием детектора РМ, нормализованного по отношению к базовой линии. Чувствительность составляет 0,05.

Спектр поглощения Pd-BPheid в ацетоне и смеси метанол/К-фосфатный буфер приведены в таблице 1 и на фигуре 1.

Спектр поглощения Pd-BPheid в плазме сдвинут в красную область до 763 нм.

При детектировании в режиме pie обнаруживают следующие пики в соответствии с фигурой 1: при 758 нм - 1,2502; при 537 нм - 0,3239; при 384 нм - 0,5351; и при 329 нм - 0,7766.

(b) Детектирование Pd-BPheid методом ВЭЖХ

Для характеристики профиля примесей и количества палладий-BPheid был разработан метод обращен-нофазовой ВЭЖХ.

Твердая фаза - C₈ Intersil 5 мкм 250 × 4,6 нм

Жидкая фаза - метанол: 20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,59 (70%/30%}

Скорость потока - 1 мл/мин

Объем инжектирования - 100 мкл

Детектирование - 1-Spectroflow 783, дейтериевая лампа: 385 нм; 2-Spectroflow 757, вольфрамовая лампа: 753 нм

Как показано в таблице 2, при ВЭЖХ анализе продукта Pd-BPheid, полученного по способу примера 3, обнаруживают 7 пиков. Основной пик составляет от 64 до 70% от общего количества продуктов.

Растворы Pd-BPheid, которые хранят в ацетоне при -20°С, являются стабильными по меньшей мере в течение 2 месяцев. Если базовый раствор держат при комнатной температуре в течение 18 часов, то изменения в профиле ВЭЖХ не наблюдаются, это говорит о том, что Pd-BPheid является стабильным соединением.

(с) Характеристика Pd-BPheid методом ЯМР

После стадии очистки Pd-BPheid, полученного по способу примера 3, основной пик составляет приблизительно 90%. Данную очистку проводят с помощью препаративной ВЭЖХ С8. Очищенное соединение используют для характеристики продукта методом ЯМР и масс-спектрометрии.

Проводят анализ Pd-BPheid методом ЯМР, химические сдвиги перечислены в таблице 3:

-¹H ЯМР и ¹³С ЯМР

-2D^lH ЯМР (COSY и NOESY)

-2D¹H-¹³C ЯМР (HMQC и НМВС: обратное детектирование).

(d) Характеристика Pd-BPheid методом масс-спектрометрии

В результате анализа Pd-BPheid методом масс-спектрометрии получают спектры, изображенные на фигурах 2 и 3. Данный анализ проводят методом бомбардировки быстрыми атомами (FAB) при низком и высоком разрешениях. Используют спектрометр "ZabSpec TOF Micromass"; способ ионизации: LSIMS с использованием Сs⁺, положительный, ускорение - 8 кВ; температура источника: 40°С; используемый растворитель: mNBA (мета-нитробензиловый спирт); ввод: латеральный.

Результаты: тип иона: М⁺; формула: С₃₅Н₃₆N₄О₆ ¹⁰⁶Pd; теория: 714,1670 Z:1 m/z теоретический 714,1670, m/z обнаруженный 714,1689.

Данные результаты подтверждают данные анализа ЯМР: m/е = 714, подтверждается введение металла палладия.

Химическая структура, анализированная методом ЯМР и масс-спектрометрии, представляет собой палладиевое производное свободной кислотной формы BChl - Pd-BPheid.

Пример 5. Биологическая активность Pd-BPheid на мышиных клетках L1210 и на человеческих клетках НТ29

(i) Клеточные линии

Клеточную линию мышиного лейкоза (L1210) поддерживают в суспензионной культуре с использованием среды Фишера, дополненной 10% лошадиной сыворотки, 1 мМ глутамином, 1 мМ меркаптоэтанолом и гентамицином. Опухоль RIF (индуцированная облучением фибросаркома) поддерживают по методу, описанному Twentyman et al. (1980, "А new mouse tumor model system (RIF-1) for comparision of end-point studies", J. Natl. Cancer Inst., 64, 595-604). Культуры выращивают в среде Weymouth, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и гентамицин.

Клетки аденокарциномы ободочной кишки человека НТ29 культивируют в RPMI 1640 без фенолового красного и с 10% FCS. Клетки субкультивируют путем рассеяния с использованием 0,25% трипсина в 0,02% ЭДТА и снова помещают в плашки с расщеплением 1:5.

(ii) Фототоксичность in vitro

Для исследований фототоксичности, включающих клетки L1210 и RIF, свет обеспечивается посредством 600-ваттового кварцево-галогенового источника, фильтруется через 10 см воды и 850 нм вырезающий фильтр для удаления ИК-области. Ширину полосы спектра дополнительно ограничивают областью до 660±5 нм с помощью интерференционного фильтра (Oriel). Суспензию клеток (L1210) или клетки, прилипшие к покровным стеклам диаметром 24 мм, инкубируют в культуральной среде (содержащей 20 мМ HEPES рН 7 вместо NаНСО₃ для усиления забуферивающей способности) в течение 15 мин в присутствии точно определенных уровней сенсибилизаторов. Затем клетки отмывают от сенсибилизатора и переносят в свежую среду. Облучение проводят при 10°С. После этого для некоторых исследований клетки метят флюоресцентными зондами и оценивают участки фотоповреждений. В других исследованиях клетки после этого инкубируют в течение 60 мин при 37°С в свежей среде для обеспечения протекания апоптоза. Анализ жизнеспособности проводят, используя 96-луночные планшеты и 72-часовой анализ МТТ с четверными повторами.

Для модели НТ29 клетки инкубируют в течение 1 ч с различными концентрациями Pd-BPheid и облучают с помощью галогеновой лампы или титаново-сапфирового лазера при 300 мВт/см² и 10 и 25 Дж/см².

(iii) Жизнеспособность клеток

Выживание клеток оценивают с помощью реакции МТТ, проводимой через 3 дня после помещения 1000-50000 клеток в 96-луночные планшеты. Интенсивность цвета сравнивают со стандартной кривой, содержащей различные количества контрольных клеток. Поглощение при х нм определяют с помощью аппарата для прочтения планшет BioRad. Клеткам L1210 дают расти в свежей среде в течение следующих 3 дней и количество клеток подобным образом оценивают с помощью анализа МТТ.

(iv) Связывание с липопротеинами:

Определяют связывание Pd-BPheid с белками и липопротеинами контрольной плазмы человека. Инкубируют 250 мкл образца плазмы, содержащей 3 мкМ соединения, в течение 30 мин при 37°С. Затем липопротеиновые и белковые компоненты отделяют с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Градиенты фракционируют, фракции разбавляют в 3 мл 10 мМ детергента тритон Х-100 и определяют флюоресценцию при 750-800 нм с возбуждением при 400 нм.

Результаты:

(v) Эффект фототоксичности Pd-BPheid на клетки L1210

Клетки мышиного лейкоза L1210 инкубируют с 1 мкМ Pd-BPheid в течение 30 мин при 37°С, что приводит к 50% гибели клеток, с использованием дозы света 75 мДж/см² при 760±5 нм. Для достижения такой же степени гибели клеток линии RIF требуется доза света 215 мДж/см².

(vi) Эффект фототоксичности Pd-BPheid на клетки НТ29

Если клетки НТ29 инкубируют с Pd-BPheid без света, то степень выживания варьирует между 100 и 79%. Степень выживания клеток уменьшается при увеличении концентрации Pd-BPheid и при увеличении дозы доставляемой энергии. Доза Pd-BPheid фотосенсибилизатора, вызывающая 50% гибель (называемая также LD₅₀), составляет 48 мкМ при мощности облучения 25 Дж/см². Длина волны возбуждения, индуцирующая наиболее значительную фототоксичность, составляет 773 нм.

(vii) Участки фотоповреждений

Для клеток мышиного лейкоза L1210 Pd-BPheid является высокоспецифичным митохондриальным фотосенсибилизатором, не вызывающим детектируемых фотоповреждений плазматической мембраны или лизосом. Такой результат связан с быстрой инициацией апоптоза.

(viii) Связывание с липопротеинами плазмы

Проводимые исследования показали, что Pd-BPheid связывается с HDL>LDL>>>альбуминовыми фракциями человеческой сыворотки, что рассматривается как одна из детерминант селективности PDT.

Пример 6. Композиции, содержащие Pd-BPheid: растворимость и стабильность Pd-BPheid в растворителях, использующихся для экспериментов на животных

Готовят растворы Pd-BPheid в разных композициях с получением концентраций от 0,05 до 2%.

(а) Композицию на основе кремофора готовят следующим образом: 40 мг Pd-BPheid растворяют в 2 мл кремофора EL в сухой пробирке или путем медленного вращения сосуда до тех пор, пока раствор полностью не освободится от частиц, или с помощью коротких импульсов зонда, генерирующего ультразвук. Пробирку охлаждают так, чтобы температура не повышалась выше 30°С. После солюбилизации лекарственного препарата добавляют 0,6 мл пропиленгликоля и снова перемешивают либо путем медленного вращения, либо с помощью ультразвукового зонда. Затем добавляют изотонический раствор NaCl порциями по 0,1 мл до получения общего объема 4 мл. Смесь должна оставаться прозрачной после каждого добавления, образования осадка не должно происходить. Композиции в течение кратких промежутков времени обрабатывают с помощью ультразвукового зонда после каждого добавления 0,9% NaCl, следя, чтобы температура была ниже 25-30°С. Концентрацию лекарственного препарата оценивают путем измерения поглощения при 757 нм после разбавления в этаноле.

Если в экспериментальных исследованиях используют 20 мг/кг Pd-BPheid, это значение переводят в 0,4 мг на 20-граммовую мышь. Так как в хвостовую вену может быть введено не более чем 0,1 мл кремофора, концентрация лекарственного препарата должна составлять 4 мг/мл.

(b) Модифицированную композицию на основе кремофора готовят следующим образом: 5 мг Pd-BPheid смешивают с 0,4 мл кремофора EL. После растворения добавляют 0,12 мл пропиленгликоля. После чего небольшими порциями добавляют изотонический физиологический раствор (1,48 мл) и перемешивают после каждого добавления. Конечный раствор является совершенно прозрачным и свободным от частиц. Для облегчения растворения лекарственного средства используют ультразвуковой зонд, поддерживая растворы при температуре ниже 25°С путем охлаждения по необходимости в бане со льдом.

Определение концентрации Pd-BPheid в кремофоровом растворе проводят путем разбавления в метаноле. Спектр поглощения записывают при 740-780 нм. Значение величины пика сравнивают с результатами, полученными с известными концентрациями Pd-BPheid.

(c) Дополнительные композиции получают, используя Tween 80 и этанол для солюбилизации Pd-BPheid (1 мг Pd-BPheid/мл раствора).

Пример 7. Исследования токсичности in vivo - эффект Pd-BPheid на моделях мышиных опухолей

Для оценки фототоксичности Pd-BPheid проводят два ряда экспериментов, включающих модели мышиных опухолей.

(а) Фотодинамическую реактивность Pd-BPheid вначале оценивают на двух моделях мышиных опухолей: ВА - аденокарцинома молочной железы и фибросаркома, индуцированная облучением (RIF-1).

Параметры фотодинамической терапии: в PDT эксперименты входят мыши с опухолями 5-7 мм в диаметре. Оценивают три дозы лекарственного препарата Pd-BPheid (1, 5 и 10 мг/кг) и две дозы света (100 и 300 Дж/см²). Композицию, содержащую Pd-BPheid, растворенный в кремофоре, вводят путем инъекции в хвостовую вену. Световое воздействие при PDT начинают оказывать или через 15 мин, или через 1 или 4 ч после инъекции. Трех мышей обрабатывают в каждом режиме обработки, если только начальные результаты не демонстрируют летальной токсичности или отсутствия реактивности. В качестве источника света для PDT используют титаново-сапфировый лазер, настроенный на 757 нм. Генерированный лазером свет доставляется к опухоли с помощью кварцевых волокон. Используют свет с плотностью мощности 75 мВт/см². Размер опухоли измеряют 3 дня в неделю после обработок PDT и определяют процент излечения опухолей (определяемого как отсутствие возобновления опухоли в течение 40 дней после лечения).

Ответ PDT in vivo: в таблицах 4 и 5 предоставляются суммарные результаты обработок PDT для мышей С3Н, которым трансплантировали либо карциному молочной железы ВА, либо фибросаркому RIF-1. В каждой таблице приведены следующие параметры: 1) доза лекарственного препарата для внутривенного введения, выраженная в мг/кг; 2) параметры лазерной обработки, включая общую дозу света (Дж/см²), длину волны (757 нм), мощность дозы света (мВт/см²) и временной интервал (между обработками каждой группы); 3) токсичность (четыре мыши умерли вскоре после эксперимента); 4) возобновление роста опухоли (выражают в числе дней между обработкой PDT и возобновлением роста опухоли) и 5) число мышей (и процент) с излечением опухолей, индуцированным Pd-BPheid PDT.

Как показано в данном документе, обнаружено, что PDT, опосредованная Pd-BPheid, индуцирует как классический, так и эффективный противоопухолевый ответ на двух моделях мышиной опухоли. PDT-опосредованная опухолевая реактивность непосредственно коррелирует с дозой лекарственного препарата, дозой света и интервалом времени между введением лекарственного препарата и световой обработкой. Конкретно более высокие дозы лекарственного препарата и/или более высокие дозы света продуцируют усиленные ответы. Обнаружено, что карцинома молочной железы ВА в большей степени отвечает на PDT, опосредованную Pd-BPheid, чем фибросаркома RIF-1 на сравнимые обработки PDT. Pd-BPheid-опосредованная PDT является эффективной, если световую обработку начинают в пределах 1 ч после введения препарата, и не является эффективной, если используют 4-часовой интервал между введением препарата и обработкой светом.

(b) Во втором ряду экспериментов фототоксичность Pd-BPheid оценивали на модели мышиной опухоли, полученной в результате трансплантации аденокарциномы ободочной кишки человека НТ29.

Животные и опухолевые модели: ткань твердой опухоли (диаметром 2 см), удаленной от донорной мыши сразу после смерти, механически размельчают в 1 мл 0,9% физиологического раствора и раствор (0,1 мл) вводят п.к. в одну заднюю ногу каждой мыши.

Мышей включают в эксперимент, если диаметр опухоли составляет 8-10 мм. Опухоли трансплантируют п.к. 8-недельным швейцарским голым мышам за 10 дней до эксперимента.

Исследования фототоксичности: 0,15 мл Pd-BPheid вводят в.в. в дозе 15 мг/кг. Мышей анестезируют тиопенталом 40 мг/кг непосредственно перед облучением. Через 30 мин, 1 ч, 4 ч или 24 ч после инъекции мышей облучают с помощью титаново-сапфирового лазера при 300 мВт/см², измеряют средний диаметр для установки времени облучения, чтобы получить 200 или 300 Дж/см². Контрольных мышей, которым не вводили Pd-BPheid, облучают в тех же условиях. Замедление роста опухоли, индуцированное PDT, анализируют по эквивалентности тестам, используемым в экспериментальной радиотерапии. Для исследований in vivo и для каждого отдельного эксперимента все результаты представляют собой среднее значение от 2 или 3 отдельных экспериментов, и для каждого отдельного эксперимента используют 2 мышей для каждого набора экспериментальных условий.

В исследованиях опухолевого роста результаты выражают как вариации опухолевого индекса с отнесением (=1) к соответствующему опухолевому индексу необработанных клеток. Опухолевый индекс рассчитывается следующим образом: опухолевый индекс = (самый большой диаметр опухоли + перпендикулярно противоположный диаметр) /2.

Исследования температурных изменений: для того чтобы гарантировать, что термический эффект не является избыточным, измеряют изменения температуры для галогеновой лампы и облучения титаново-сапфировым лазером с помощью непоглощающей микротермопары, внедренной в оксид алюминия.

Результаты данного эксперимента приведены далее:

(i) облучение длиной волны 763 нм при 200 Дж/см²:

Уменьшение роста опухоли (по сравнению с контролем) наблюдают для условий 30 мин и 4 ч после инъекции. Уменьшение опухолевого индекса наблюдают до 7 дней для условий 1 ч и 24 ч после инъекции.

(ii) облучение длиной волны 763 нм при 300 Дж/см²:

Уменьшение роста опухоли (по сравнению с контролем) наблюдают для условий 30 мин и 24 ч после инъекции. Уменьшение опухолевого индекса наблюдают до 7 дней для условий 1 ч и 4 ч после инъекции.

(iii) Облучение при 300 Дж/см² через 1 ч после инъекции:

Уменьшение роста опухоли (по сравнению с контролем) наблюдают для условия 773 нм до 5 дней и для условий 753 нм и 763 нм до 12 дней. Максимальное уменьшение роста опухоли наблюдают при 763 нм.

(iv) Облучение при 300 Дж/см² через 24 ч после инъекции:

Уменьшение роста опухоли (по сравнению с контролем) наблюдают для условия 753 нм до 4 дней и для условий 763 нм и 773 нм до 12 дней. Максимальное уменьшение роста опухоли наблюдают при 773 нм.

В процессе воздействия галогеновой лампы или титаново-сапфирового облучения на мышь чрезмерных изменений температуры не наблюдают.

Итак, в результате данного исследования обнаружено, что, оптимальная длина волны облучения составляет 773 нм. Промежуток времени между инъекцией и облучением (интервал) оказывает влияние на ответ опухоли. Показано, что при 764 нм интервал, равный 1 ч, является наиболее эффективным. При использовании длины волны 773 нм наиболее эффективный интервал составляет 24 ч.

Пример 8. Морфологическая оценка человеческих эпителиальных карциноидных клеток А431 после PDT на основе Pd-BPheid и BChl-Ser

Данный эксперимент проводят для исследования времязависимых морфологических изменений, имеющих место после PDT, с использованием Pd-BPheid или BChl-SerOMe в человеческих эпителиальных карциноидных клетках А431.

(i) Материалы:

Pd-BPheid получают по способу приведенного выше примера 1, а серинметиловый эфир BChl-SerOMe получают по способу, описанному в ЕР 584552.

(ii) Источник света:

Галогеновая лампа (Osram, Germany, 100 Вт) с водным фильтром 4,5 см и отсекающим фильтром >650 нм. Клетки облучают в течение 10 мин, 15 мВт/см², общий поток энергии 9 Дж/см². Для облучения культуральные планшеты помещают на стеклянный стол для обеспечения доступа света со стороны дна.

(iii) Исследование фототоксичности:

Клетки А431 (5 × 10⁴ клеток) высевают в чашки диаметром 3 см с повторами и культивируют до 75% слияния в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM) + F12 (1:1), забуференный с помощью HEPES (25 мМ, рН 7,4), фетальная телячья сыворотка (FCS) с пенициллином (0,06 мг/мл) и стрептомицином (0, 1 мг/мл). К клеткам добавляют Pd-BPheid или BChl-Ser в соответствующей LD₉₀ концентрации (0,1 и 1 мкМ соответственно). После 4-часового периода клетки промывают культуральной средой и облучают указанным выше источником света. Исследование методом фазово-контрастной микроскопии проводили в разные моменты времени после облучения (через 0, 0,5, 4 и 24 ч после PDT), используя световой микроскоп Zeiss Axiovert-35 (увеличение х320), оборудованный камерой Contax 35 мм SLR. Во второй чашке каждого повтора жизнеспособность клеток оценивали через 24 ч после PDT, используя анализ жизнеспособности с нейтральным красным (Zhang SZ., 1990, Cell Biol. Toxicol. 6(2): 219-234).

(iv) Результаты:

Оба сенсибилизатора вызывают значительные изменения в клеточной морфологии. Pd-BPheid вызывает быстрое изменение в структуре клеточной мембраны (30 мин), клетки быстро сжимаются и образуются фиброзные связи, связывающие клеточную мембрану с точками первоначальных очагов адгезии (фиброзный фенотип). Через 4 ч 90% клеток теряют большую часть внутреннего объема и значительная часть клеток отделяется от чашки, через 24 ч никаких дополнительных изменений не наблюдается (фиг.4, правая колонка). Bchl-Ser демонстрирует другую модель времязависимых морфологических изменений, которые могут наблюдаться только после 4 ч. Пузырения в мембране наблюдают в виде темных пузырьков, отделяющихся от клеточной мембраны. В течение 24 ч значительного уменьшения объема не наблюдается и после этого периода большинство клеток остаются присоединенными к чашке, но выглядят впалыми (пузырящийся фенотип, фиг.4, левая колонка). Через 24 ч после обработки светом проводят анализ жизнеспособности с использованием нейтрального красного, который подтверждает 90±7% гибели клеток в обеих экспериментальных группах. На фиг.4 фиброзный фенотип представлен в правой колонке и пузырящийся фенотип представлен в левой колонке. Сплошные белые стрелки показывают образование волокон или пузырьков.

Пример 9. Фотоцитотоксичность Pd-BPheid и BChl-SerOMe на клеточной линии карциномы мочевого пузыря человека ECV304

Данный эксперимент проводят для оценки фотоцитотоксичных эффектов фотосенсибилизаторов Pd-BPheid и BChl-SerOMe на клетки карциномы мочевого пузыря человека ECV304.

(i) Материалы: как в примере 8(i).

(ii) Источник света: как в примере 8(ii).

(iii) Исследование фототоксичности:

Клетки ECV304 (2×10⁴ клеток на лунку) культивируют в среде М-199, 10% FCS с пенициллином (0,06 мг/мл) и стрептомицином (0,1 мг/мл) в 96-луночном планшете до слияния (~2×10⁵ клеток на лунку). После инкубации с увеличивающимися концентрациями Pd-BPheid или BChl-SerOMe в течение 4 ч клетки промывают свежей культуральной средой и облучают, как описано выше в разд. 1. Через 24 ч после облучения оценивают жизнеспособность клеток с помощью нейтрального красного. Используют следующие контроль: световой контроль: облученные клетки, не обработанные сенсибилизатором; темновой контроль: необлученные клетки, обработанные сенсибилизатором в темноте. Необработанный контроль: необработанные сенсибилизатором и необлученные клетки используют для вычисления 100% выживания (Rosenbach-Belkin V. et al., 1996, Photochem. Photobiol. 64(1):174-181).

(iv) Результаты:

И Pd-BPheid и BChl-SerOMe проявляют дозо- и светозависимую цитотоксичность на клетках ECV304 (фиг.5). Соответствующие значения LDso составляют 19 и 1000 нм. Морфологические изменения после PDT согласуются с наблюдениями, сделанными для клеток А431 (данные не показаны).

Пример 10. PDT с использованием Pd-BPheid и этилового эфира Pd-BPheid на клетках мышиной меланомы M2R

Целью данного эксперимента является тестирование эффекта Pd-BPheid и этилового эфира Pd-BPheid на клетки M₂R.

(i) Материалы:

Pd-BPheid получают по способу примера 1, приведенного выше, а этиловый эфир Pd-бактериофеофорбида а (этиловый эфир Pd-BPheid) получают, как описано в WO 97/19081.

(ii) Источник света:

Как в примере 8 (ii), приведенном выше, но клетки облучают в течение 10 мин, 12 мВт/см², общий поток энергии 7 Дж/см².

(iii) Исследование фототоксичности:

Клетки M₂R культивируют в виде монослоев в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) + F12 (1:1), забуференный HEPES (25 мМ, рН 7,4). Включают фетальную бычью сыворотку (FBS) (10%), глутамин (2 мМ), пенициллин (0,06 мг/мл) и стрептомицин (0,1 мг/мл) и клетки выращивают при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 8% CO₂. Для анализа фототоксичности клетки (1×10⁴ клеток/лунку) культивируют в 96-луночных планшетах в течение 24 ч до достижения плотности приблизительно 2×10⁴ клеток/лунку. Пигменты растворяют непосредственно в культуральной среде или в 95% этаноле с последующим разбавлением в культуральной среде до получения конечной концентрации этанола 1%. Добавляют разбавленные ферменты и клетки инкубируют в темноте в течение 4 ч при 37°С. Перед облучением клетки промывают один раз и заменяют культуральную среду на свежую. Затем планшеты облучают со стороны дна в течение 10 мин при комнатной температуре и помещают в культуральный инкубатор при 37°С в темноте. Жизнеспособность клеток определяют спустя 24 ч. Используют следующие контрольные системы: темновой контроль - необработанные клетки, которые держат в темноте; световой контроль - не обработанные сенсибилизатором клетки, которые подвергают облучению; темновая токсичность - клетки обрабатывают пигментом, но держат в темноте. Жизнеспособные клетки определяют по включению [³H]-тимидина, как описано ранее (WO 97/19081).

(iv) Результаты:

Как можно видеть из фигуры 6А, при растворении пигментов в 95% этаноле LD₅₀ для Pd-BPheid составляет 0,03 мкМ, тогда как для этилового эфира Pd-BPheid LD₅₀ составляет 0,07 мкМ. При растворении пигментов непосредственно в культуральной среде, содержащей 10% сыворотки, только Pd-BPheid обладает полной активностью, тогда как этиловый эфир Pd-BPheid является совсем не активным при концентрациях вплоть до 1 мкМ, самой высокой тестируемой концентрации (фиг.6В).

Пример 11. PDT с применением Pd-BPheid на клетках мышиной меланомы M2R и клетках карциномы ободочной кишки человека НТ29

Целью этих экспериментов является определение фототоксичного воздействия Pd-BPheid на две клеточные линии: мышиной меланомы M2R и карциномы ободочной кишки человека НТ29.

(i) Материалы:

Pd-BPheid получают по способу примера 1, приведенного выше.

(ii) Источник света:

Источником света является ксенон-фторная лампа LS3-PDT (Bio-Spec, Russia) с 10 см водным фильтром и световым интервалом 720-850 нм. Клетки облучают в течение 10 мин/ при 12 мВт/см², общей энергии 7 Дж/см².

(iii) Исследование фототоксичности:

Анализ проводят по методике, описанной выше (пример 10), со следующими изменениями: Pd-BPheid растворяют непосредственно в среде, содержащей 10% сыворотки, и затем добавляют к клеткам. Жизнеспособность клеток M₂R определяют по включению [³H]-тимидина, а человеческих клеток НТ29 - с помощью анализа МТТ (Merlin JL et al., 1992 Eur. J. Cancer 28A: 1452-1458).

(iv) Результаты:

Как можно видеть из фигуры 7, клетки ободочной кишки человека НТ29 демонстрируют более низкую чувствительность к данному пигменту (LD₅₀=0,5 мкМ), тогда как клетки M2R являются приблизительно в 10 раз более чувствительными (LD₅₀=0,03 мкМ).

Пример 12. PDT мышиных меланомных опухолей M2R с использованием Pd-BPheid in vivo

Целью данного эксперимента является изучение PDT мышиных меланомных опухолей M2R у голых мышей CDl с применением 2,5 мг/кг Pd-BPheid.

(i) Материалы:

Pd-BPheid получают по способу примера 1, приведенного выше.

(ii) Мыши: Голые мыши CD1 (25-30 г)

(iii) Анестезия: и.п.(интраперитонеальная) инъекция 50 мкл кетамин/румпон (об/об = 85/15).

(iv) Имплантация опухоли:

Мышам имплантируют на спину 10⁶ клеток M2R и опухолям дают расти до размера, подлежащего обработке (7-8 мм) в течение 2-3 недель.

(v) Источник света:

Галогеновая фотооптическая лампа 64643 Osram 150 Вт (D. К. Keller et al. 1999, Int. J. Hyperthennia 15, 467-474), оборудованная спектральным окном λ=650-900 нм, 300 мВт/см². Облучение проводили в течение 30 мин.

(vi) Метод PDT:

Анестезированным животным вводят в.в. пигмент и опухоль сразу облучают. В конце обработки мышь помещают обратно в клетку. Фотографии опухолей делают до обработки и после нее через определенные промежутки времени.

Эксперимент 1:

Получение сенсибилизатора:

Два мг Pd-BPheid растворяют в 0,25 мл кремофора EL, затем обрабатывают ультразвуком в течение 20 мин. Добавляют 0,075 мл 1,2-пропиленгликоля и озвучивание продолжают еще 15 мин. Затем добавляют 0,9 мл 0,15 мМ NaCl и обрабатывают ультразвуком 5 мин. Образец центрифугируют 12 мин при 13000 об/мин (Eppendorf). Конечная концентрация Pd-BPheid, рассчитанная на основе спектра в хлороформе, составляет 0,5 мг/мл.

PDT опухоли: 2,5 мг/кг Pd-BPheid вводят в. в. голым мышам CDl, несушим меланомную опухоль M2R. Опухоль облучают 30 мин при 300 мВт/см². Температура опухолевой области мышиной кожи составляет 37,7-38°С. Опухолевый ответ регистрируют через 1 и 4 дня после обработки. Результаты приведены на фиг.8.

Эксперимент 2:

Получение сенсибилизатора:

Два мг Pd-BPheid растворяют в 0,1 мл метанола, 0,1 мл 0,1М KH₂PO₄, рН = 8,0 и 0,9 мл PBS и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин. Метанол упаривают аргоном и добавляют 20% кремофор EL:1,2-пропиленгликоль (3:1), после чего обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин. Образец центрифугируют 8 мин при 13000 об/мин, конечная концентрация Pd-BPheid, рассчитанная на основе спектра в хлороформе, составляет 0,5 мг/мл.

PDT опухоли: 2,5 мг/кг Pd-BPheid (120 мкл) вводят в. в. голым мышам CD1, несуoим меланомную опухоль M2R. Опухолевую ткань облучают 30 мин при 300 мВт/см². Температура опухолевой области мышиной кожи составляет 37,7-38°С. Опухолевый ответ регистрируют через 1 и 4 дня после обработки. Результаты приведены на фиг.9.

Результаты: Как показано на фигурах 8 и 9, PDT меланомных опухолей M2R с применением 2,5 мг/кг Pd-BPheid, как описано выше, вызывает тяжелый воспалительный ответ с некрозом опухоли в течение 24 ч.

Пример 13. PDT с применением Pd-BPheid уменьшает скорость образования метастаз глиомы С6 у мышей: преимущество по сравнению с хирургическим вмешательством

Данные эксперименты проводят для сравнения терапевтического потенциала PDT с применением Pd-BPheid и BChl-SerOMe и вероятности распространения метастаз после PDT с применением Pd-BPheid и BChl-SerOMe.

(i) Материалы:

5 мг/кг Pd-BPheid (полученного по способу примера 1) или Pd-BPheid-SerOMe в 20% кремофоре EL.

(ii) Источник света:

Источником света является ксенон-фторная лампа LS3-PDT (Bio-Spec, Russia), с 10 см водным фильтром и световым интервалом 720-850 нм.

(iii) Мыши: Голые мыши CDl.

(iv) Опухоли: Мышам имплантируют в ступню задней ноги 10⁶ клеток глиомы С6. Опухоли обрабатывают при достижении ими 7-8 мм в длину.

(v) Анестезия: 50 мкл веталар/румпон (об/об=85/15).

(vi) Анальгезия:

Оксикодон (12 мг/л) добавляют в питьевую воду, содержащую 5% сахарозы, при проведении лечения (ампутация или PDT) в течение одной недели.

(vii) Протокол:

Трем группам (10 мышей в каждой) вводили в. в. 5 мг/кг сенсибилизатора (Pd-BPhe или 'Pd-BPheid-SerOMe), сразу облучали при 200 мВт/см² в течение 30 мин и животным давали возможность прийти в себя в клетке. Группы 1 и 2. Животные, которые получали PDT с применением Pd-BPheid и BChl-SerOMe, соответственно. Опухолевый ответ и образование метастаз в паху регистрировали через 4 недели. Группа 3: животные, которым ампутировали ногу до лодыжки (в паре с группой 1), образование метастаз в паху регистрировали через 4 недели. Параметры ответа на PDT выражают как процент животных с некрозом и исчезновением опухоли от общего числа обработанных животных. Метастазы проявляются через появление опухолей в паху или в другом месте. Рассматриваемые конечные точки в пределах 4 недель: спонтанная гибель, достижение опухолью диаметра 2 см, метастазы, по появлению первой из них.

(viii) Результаты:

Результаты выравнивания (исчезновения) опухоли показаны на фигуре 10. В то время как на 11 день ответ на Pd-BPheid был сильнее, чем на Pd-BPheid-SerOMe (100 и 80% выравнивания опухоли соответственно), позже, на 28 день, процент ответа был одинаковым, примерно 60%. Ухудшение выравнивания опухоли в течение длительного периода происходит из-за некоторого возобновления роста опухоли у некоторых из обработанных животных, возможно, в результате несоответствия области освещения и опухолевого участка. Результаты появления метастаз показаны на фигуре 11. Хирургическое лечение путем ампутации ноги приводит к значительно более высокому проценту метастазирования по сравнению с PDT (до 78%). Кроме того, метастазы после ампутации появляются гораздо раньше. Частота метастаз после PDT с применением Pd-BPheid является самой низкой (до 23%). Данный результат подобен результату, полученному при применении Pd-BPheid-SerOMe, основным преимуществом Pd-BPheid является замедление появления метастаз. PDT с применением Pd-BPheid или Pd-BPheid-SerOMe является целебной для глиомных опухолей С6. Образование метастаз после PDT является существенно более низким, чем после хирургического лечения.

Пример 14. Получение диметиламинометилового эфира Pd-BPheid [Соединение формулы I, где А означает -O-(CH₂)_n-Y, Y представляет -NR'₁R'₂, каждый R'₁ и R'₂ означает метил, и n равно 1].

Указанное в заголовке соединение получают каталитической этерификацией Pd-BPheid согласно способу, описанному в патенте заявителя ЕР 0584552. Так, высушенный Pd-BPheid (3 мг), дициклогексилкарбодиимид (DCC; 50-60 мг), 4-диметиламинопиридин (DMAP; 1,2-1,4 мг) и диметиламинометанол (5-15-кратный избыток) растворяют в 1 мл сухого дихлорметана, герметизируют в атмосфере Аr и перемешивают в темноте при комнатной температуре в течение 36 часов. Продукт выделяют на препаративной пластинке из силикагеля и очищают на колонке из сефарозы. Выход 20-25%.

Пример 15. Получение диметиламиноэтилового эфира Pd-BPheid [Соединение формулы I, где А означает -О-(CH₂)_n-Y, Y представляет -NR'₁R'₂, каждый R'₁ и R'₂ означает метил, и n равно 2].

Это соединение получают, как описано в примере 14, но используют в качестве реагента для этерификации диметиламиноэтанола (5-15-кратный избыток). Выход 30%.

Пример 16. Получение хлорида триметиламмонийметилового эфира Pd-BPheid [Соединение формулы I, где A -O-(CH₂)_n-Y, Y представляет -⁺NR'₁R'₂R'₃,Х^-, где R'₁, R'₂ и R'₃ каждый означает метил, Х^- означает Сl^- и n равно 1].

Это соединение получают, как описано в примере 14, но используют в качестве реагента для этерификации хлорид триметиламмонийметанола (5-15-кратный избыток). Выход 28%.

Пример 17. Получение хлорида триметиламмонийэтилового эфира Pd-BPheid [Соединение формулы I, где A -O-(CH₂)_n-Y, Y представляет -⁺NR'₁R'₂R'₃,Х^-, где R'₁, R'₂ и R'₃, каждый, означает метил, Х^- означает Сl^- и n равно 2].

Это соединение получают, как описано в примере 14, но используют в качестве реагента для этерификации хлорид триметиламмонийэтанола (5-15-кратный избыток). Выход 23%.

Пример 18. Получение диметиламинометиламида Pd-BPheid [Соединение формулы I, где А означает -NH- (CH₂)_n-Y, Y представляет -NR'₁R'₂, каждый, R'₁ и R'₂ означает метил, и n равно 1].

Указанное в заголовке соединение получают каталитическим амидированием Pd-BPheid согласно способу, описанному в патенте заявителя ЕР 0584552. Сначала осуществляют активацию Pd-Bpheid N-гидроксисукцинимидом (NHS). Так, высушенный Pd-Bpheid (3 мг), сухой N-гидроксисукцинимид (NHS; 11,5 мг) и DCC (5 мг) растворяют в сухом тетрагидрофуране (ТГФ; 2 мл), герметизируют в атмосфере Аr, перемешивают в темноте при комнатной температуре в течение 48 ч, а затем выдерживают дополнительно 40 ч в темноте при 5°С. После завершения реакции растворитель упаривают под N₂ и полученный NHS-Pd-Bpheid повторно растворяют в ацетоне и очищают элюированием на колонке с СМ-сефарозой (выход 50-80%). На следующей стадии NHS-Pd-Bpheid (2 мг), растворенный в небольшом объеме ацетонитрила, добавляют к перемешиваемому раствору N,N-диметиламинометиламина (0,2 мг) в воде и обрабатывают ультразвуком в течение короткого промежутка времени. Реакционную смесь герметизируют в атмосфере Аr и перемешивают в темноте при комнатной температуре в течение 50 ч. Продукт выделяют и очищают на колонке с сефарозой. Выход 40%.

В соответствии с той же самой методикой получают следующие соединения: диметиламиноэтиламид Pd-Bpheid (выход 30%), диэтиламинометиламид Pd-Bpheid (выход 20%), диэтиламиноэтиламид Pd-Bpheid (выход 33%).

Пример 19. Синтез металлических солей Pd-Bpheid [Соединения формулы I, где А означает -OR₁ и R₁ означает Na⁺, К⁺, Li⁺,, NH $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{4}}$ , (Ca²⁺)_0,5 или (Мg²⁺)_0,5]

Для получения калиевой соли, Pd-Bpheid (2 мг) растворяют в 100 мкл этанола, добавляют 100 мкл 0,1 М калиевого фосфатного буфера с рН 8, и смесь подвергают обработке ультразвуком в течение 10 мин. Затем добавляют 900 мкг солевого раствора, забуференного фосфатом (PBS; рН 7,4), и смесь опять обрабатывают ультразвуком (10 мин). Этанол выпаривают из смеси при пониженном давлении, остаток центрифугируют (10000g, 5 мин) для удаления непрореагировавшего материала, и калиевую соль Pd-Bpheid получают в растворе (примерно 1,5 мг/мл) и затем очищают (выход 40%).

С использованием той же самой методики получают натриевую, аммониевую, литиевую, магниевую и кальциевую соли Pd-Bpheid, но применяя соответственно 0,1 М натриевый буфер, рН 8,0, буфер хлористого аммония рН 8,5, или литиевый, магниевый или кальциевый фосфатный буфер рН 8,0.

Пример 20. Синтез N-метилглюкозаммониевой соли Pd-Bpheid и других гидроксилированных аммониевых солей Pd-Bpheid [Соединение формулы I, где А означает -OR₁ и R₁ означает ⁺NH₂(СН₃) -СН₂-(СНОН)₄-СН₂OН]

Смесь Pd-Bpheid (10 мг) и N-метилглюкозамина (10 мг) в 5 мл DMF нагревают при 100°С в течение 15 мин. После охлаждения добавляют порцию диэтилового эфира (8 мл) и смесь выдерживают при 0-5°С. Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают холодным (0-5°С) диэтиловым эфиром (2×5 мл), получая 9 мг (71%) продукта.

Синтез Pd-Bpheid-TRIS (R₁ означает ⁺NН₃-С (СН₂OН)₃), N-глюкозаммония Pd-Bpheid (R₁ означает ⁺NH₃-CH₂- (СНОН)₄-СН₂OН) и тетраалкиламмония Pd-Bpheid (R₁ означает ⁺N(C_n'H_2n'+1)₄) осуществляют, как описано выше, используя основание TRISMA (трис[гидроксиметил]аминометан), N-глюкозамин или тетраметиламмонийбромид соответственно.

Пример 21. Синтез 13¹, 13²-димeтиллoвoгo эфира 17³-диметиламинометиламида Pd-бактериопурпурина-7 и 13¹, 13²-диэтилового эфира 17³-димeтилaминoмeтилaмидa Pd-бактериопурпурина-7 [Соединение формулы I', где А представляет -NH-(CH₂)_n-Y, Y означает -NR'₁NR'₂, где R'₁ и R'₂, каждый, означает метил и n равно 1, R₂ и R₃, каждый означает метил или этил].

Синтез указанного в заголовке соединения основан на синтезе триметилового эфира пурпурина-7, описанного Kenner et al. (Kenner G.W., McCombic S.W. and Smith R.M (1973), Pyrroles and Related Compounds. Part XXIV. Separation and Oxidative Degradation of Chlorophyll Derivatives, J.C.S. Perkin I: 2517-2523). Для щелочного гидролиза изоциклического кольца к соединению вышеуказанного примера 18 (14 мг) в пиридине (0,5 мл) добавляют диэтиловый эфир (20 мл) и 25% КОН в н-пропаноле (1 мл). Раствор перемешивают в течение 30 мин при пробулькивании через него воздуха. Реакционную смесь экстрагируют водой (2 × 10 мл). Водный слой охлаждают до 4°С, осторожно нейтрализуют 8% НСl (2 мл) и экстрагируют хлористым метиленом (2 × 10 мл). Экстракт промывают водой (20 мл) и сразу же обрабатывают избытком эфирного диазометана для этерификации. Продукт очищают на колонке с диоксидом кремния смесью хлороформ : н-гексан (7:3), получая указанное в заголовке соединение (7 мг, 46%).

13¹, 13²-диэтиловый эфир 17³-диметиламинометиламида Pd-бактериопурпурина-7 синтезируют, как описано выше, используя эфирный диазоэтан для этерификации (выход 50%).

Пример 22. Синтез Pd-бактериопурпурина-18 [Соединение формулы I", где А представляет ОН]

Синтез Pd-бактериопурпурина-18 основан на синтезе бактериопурпурина-18, описанном Mironov et al. (Mironov A.F., Kozyrev A.N. and Brandis A.S. (1993) Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives. Proc. SPIE 1922: 204-208). Для гидролиза изоциклического кольца к Pd-Bpheid (14 мг) в пиридине (0,5 мл) добавляют пропан-2-ол (15 мл) и водный 30% КОН (3 мл). Раствор перемешивают в течение 1 ч при пробулькивании через него воздуха. Затем реакционную смесь охлаждают до 4°С, осторожно подкисляют 16% НСl до рН 1,5-2 и перемешивают при комнатной температуре еще 0,5 часа. Затем реакционную смесь нейтрализуют водным 30% КОН и экстрагируют хлористым метиленом (2 x 10 мл). Экстракт промывают водой (20 мл) и упаривают. Продукт очищают на колонке с диоксидом кремния смесью хлороформ ацетон (8:2), получая Pd-бактериопурпурина-18 (9 мг, 67%).

Пример 23. Получение Bchla из различных бактерий

Природный Bchla этерифицируют по положению 17 или фитилом, или геранил-геранилом в зависимости от вида применяемых бактерий. Bchla, полученный в вышеуказанном примере 1 из лиофилизированной пурпурной бактерии Rhodovulum Sulfidophilum, представляет собой фитиловый эфир Bchla. Согласно той же самой методике, фитиловый эфир Bchia получают из лиофилизированной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides (выход экстракции: примерно 600 мг фитилового эфира Bchla на 100 г лиофилизированных клеток) и из Rhodobacter capsulatus (выход экстракции: примерно 700 мг фитилового эфира Bchla на 100 г лиофилизированных клеток).

Согласно той же самой методике, геранил-гераниловый эфир Bchla получают из Rhodospirillum rubrum (выход экстракции:примерно 700 мг геранилгеранилового эфира Bchia на 100 г лиофилизированных клеток).

Claims (21)

1. Соединение формулы I, I' или I"

где А представляет собой ОН, OR₁, -O-(CH₂)_n-Y, -S-(CH₂)_n-Y, -NH-(CH₂)_n-Y, -O-(CH₂)₂-OH, -NH-(CH₂)₂-NH-BOC или -N(CH₂-CH=CH₂)₂, где r₁ представляет собой Nа⁺, K⁺, (Са²⁺)_0,5, (Mg²⁺)_0,5, Li⁺, NH $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{4}}$ , ⁺NН₃-С(СН₂OН)₃, ⁺NH₃-СН₂-(СНОН)₄-СН₂OН, ⁺NH₂(CH₃)-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH или ⁺N(C_n'H_2n'+l)₄;

R₂ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I' и R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₄ для соединения формулы I, где R₄ представляет C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил;

R₃ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I' и R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси для соединения формулы I;

n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6,

Y представляет собой -NR'₁NR'₂ или -⁺NR'₁R'₂R'₃X^-, где R'₁, R'₂ и R'₃ каждый независимо от другого представляет собой -СН₃ или -С₂Н₅;

Х представляет собой F, Cl, Вr или I;

n' равно 1, 2, 3 или 4;

и где * обозначает асимметричный атом углерода и --- обозначает одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь.

2. Соединение по п.1, формула и оптическая конфигурация которого являются такими, как указано ниже:

где А представляет собой ОН или OR₁, a R₁ такой, как определен в п.1.

3. Соединение по п.2, где А представляет собой ОН, обозначенный в данном документе как Pd-бактериофеофорбид a (Pd-BPheid).

4. Соединение формулы I, I' или I", как определено в любом из пп.1-3, в качестве лекарственного препарата.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью детектирования или лечения опухолей, содержащая, по меньшей мере, одно соединение формулы I, I' или I", как определено в любом из пп.1-3, и физиологически приемлемый носитель.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанная композиция находится в виде раствора, липидной эмульсии или геля, или в виде липосом или наночастиц.

7. Фармацевтическая композиция по п.5 или 6, где соединение(я) присутствует(ют) в количестве 0,01 - 20% по массе от общей массы композиции.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.5-7, содержащая соединение Pd-Bpheid и физиологически приемлемый носитель.

9. Способ получения соединения формулы I по п.1, где А представляет собой ОН, включающий стадии a) совместного деметаллирования и гидролиза соединения M-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, геранилгеранил или серилметиловый эфир (SerOMe), a M является металлом, выбранным из Mg,Cd и Zn; b) введение Pd с помощью Pd реагента в соединение, полученное на стадии (а).

10. Способ по п.9 для получения Pd-BPheid, где на стадии (а) деметаллируют и гидролизуют бактериохлорофилл a (Bchla), и на стадии (b) полученный бактериофеофорбид a (BPheid) подвергают взаимодействию с палладиевым реагентом с получением целевого Pd-BPheid.

11. Способ получения соединения формулы I по п.1, где А представляет собой ОН, включающий стадии a) трансметаллирования BChlide-17³-Z с получением соответствующего Pd-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, геранилгеранил или SerOMe; b) гидролиза соединения, полученного на стадии (а).

12. Способ по п.11 для получения Pd-BPheid, где на стадии (а) бактериохлорофилл а (Bchla) трансметаллируют для замены природного центрального атома Mg на Pd и на стадии (b) полученный Pd-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, гидролизуют с получением целевого Pd-BPheid.

13. Способ получения соединения формулы I по п.1, где А представляет собой ОН, включающий стадии a) ферментативного гидролиза BChlide-17³-Z, где Z представляет собой фитил или геранилгеранил с получением Bchlide, b) кислотного деметаллирования Bchlide, полученного на стадии (а); c) введения Pd с помощью Pd реагента в деметаллированное соединение стадии (b).

14. Способ по п.13 для получения Pd-BPheid, где на стадии (а) бактериохлорофилл a (Bchla) подвергают ферментативному гидролизу, на стадии (b) - деметаллированию и взаимодействию с Pd реагентом на стадии (с) с получением целевого Pd-BPheid.

15. Способ по любому из пп.9-14, дополнительно включающий стадию взаимодействия полученного соединения Pd-BPheid с соединением 5а, соответствующим соединению А-Н, с получением соединения формулы I, где А отличен от ОН.

16. Способ по любому из пп.9-14, где Pd реагентом является ацетат Pd или хлорид Pd.

17. Способ по п.16, где введение Pd проводят с помощью двухстадийной методики с использованием аскорбата Na или аскорбиновой кислоты, или с помощью одностадийной методики с использованием 6-О-пальмитоил-L-аскорбиновой кислоты.

18. Соединение по п.1, используемое для получения фармацевтических композиций, применимых в фотодинамической терапии (PDT) опухолей.

19. Соединение по п.1, используемое для получения композиций, применимых при детектировании опухолей.

20. Соединение по п.1, используемое для получения фармацевтических композиций, применимых для ex vivo уничтожения бактерий, вирусов, паразитов и грибков.

21. Соединение по любому из пп.18 -20, представляющее собой Pd-BPheid.

Images