CN1131939A - 氧化的类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯，及衍生的用作细胞分化诱导剂、细胞抑制剂和抗肿瘤试剂的馏分和化合物 - Google Patents

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Abstract

作为类胡萝卜素代表的β-胡萝卜素、蕃茄红素和角黄素，和至少，做为视黄酸类代表的视黄酸，经充分氧化后产生的物质，就氧化的β-胡萝卜素模型而言，具有用于抗细胞增殖、肿瘤、和致瘤病毒的无毒性活性试剂的性质，而且具有细胞分化促进剂的性质。

Description

氧化的类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭 多烯，及衍生的用作细胞分化诱导剂、 细胞抑制剂和抗肿瘤试剂的馏分和化合物
本发明的领域
本发明涉及氧化的类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯及其一些衍生物，该衍生物具有诱导细胞分化、抑制细胞、和抗肿瘤的性质，用作化学治疗和化学预防(Chemopreven-tive)试剂，更具体地，涉及通过对类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯的完全氧化及随后的处理而获得的衍生物。
发明背景
类胡萝卜素和视黄酸类是天然产物，其含有许多共轭多烯链。胡萝卜素类具有大量的碳-碳双键共轭系统，该共轭系统导致了其变化绚丽的色彩。许多类胡萝卜素和视黄酸类天然产物，具有生物活性。例如，类胡萝卜素族(最著名的，β-胡萝卜素、或维生素A原，是食物中的含量最丰富的类胡萝卜素之一)中的某些烃是视黄醇(维生素A的一种形式)的来源；类胡萝卜素可能通过使单氧灭活从而保护植物免受光敏氧化的损伤；流行病学的证据表明类胡萝卜素的引入与某些类型癌症的发生率负相关(Peto et al，Nature，1981，290，201-208)。已有人证明类胡萝卜素和视黄酸类能抑制一些试验诱导的动物肿瘤的发育(N.I.Krinsky.Actions ofCarotenoids in Biological Systems，Annu.Rev.Nutr.13，561-587(1993)；Matthews-Roth，Curr.Top.Nutr.Dis.〔NewProt.Roles Select.Nutr.〕，1989，22，17-38；Pure Appl.Chem.，1985，57，717-722)；进行了许多饮食干涉(interven-tion)研究以试图确定补充β-胡萝卜素作为无毒的能有效降低癌症死亡率的饮食抗致癌因子的效能，而且最近已开始检验β-胡萝卜素与降低冠状心脏病的发生率有关的可能性；近期的临床数据已证明用相关化合物(视黄酸类-视黄酸，视黄醇和视黄酰胺(retinamides))作为治疗和预防试剂在抗癌治疗中起作用(皮肤癌、头和颈癌、肺和膀胱癌，急性前髓细胞白血病、粘膜白斑病和脊髓发育不良综合症；D.L.Hill and C.J.Grubs，Retinoids and Cancer Prevention，Annu.Rev.Nutr.1992，12，161-181)；最后，β-胡萝卜素在组织内低氧压条件下具有抗氧化剂的性质(Burton and Ingold，β-Carotene：an unusual type of Lipid antioxidant，Science，1984，224，569-573)。
类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯能和分子氧(O2)发生反应，因此，其在食物贮存期间，即使在降低的温度下也可能会被氧化降解。因类胡萝卜素较大，含有更多的双键共轭系统，它们比视黄酸类更易于与氧起反应。然而，除作为β-胡萝卜素生物氧化的产物得到的维生素A外，类胡萝卜素、视黄酸类、和相关共轭多烯氧化降解的产物及其潜在的生理活性，极少受到注意。
Mordi等，β-胡萝卜素自动氧化的探索性研究，发表于Tetrahedron Letters，1991，32(33)，4203-4206，检验了β-胡萝卜素自我引发的自动氧化期间形成的产物。该论文得出结论：β-胡萝卜素自动氧化早期阶段的主要产物鉴定是环氧化物、β-紫香硐、β-apo-13-胡萝卜素酮，视黄醇，和相关羰基化合物；在最终的混合物中，短链羰基化合物占多数。
Mordi等的另一篇论文“Oxidative Degradation of β-carotene and β-Apo-8′-carotenal”发表于Tetrahedron Vol.49，No.4，pp.911-928，1993年1月22日，指出β-胡萝卜素与分子氧发生的自我引发的氧化产生环氧化合物、二氢呋喃、羰基化合物、二氧化碳、痕量的醇类，和其它一些化合物。该论文，由本发明的发明人之一共同署名创作，也提及了特别是在β-胡萝卜素氧化的后期，经常自溶液中沉淀出来的一些聚合/寡聚物。该论文没有公开该聚合/寡聚物的性质。
本专利申请源于我们的上述观点，即类胡萝卜素的生物活性并不是来源于类胡萝卜素本身，而是来源于它们在活体内氧化产生的一种或多种产物。视黄酸类由于其氧化力，虽然不如类胡萝卜素容易，也被包括在内。氧化的视黄酸类的生物活性明显不同于已知的视黄酸类本身的活性。
本发明概述
在导致本发明的研究的早期已发现：在至少某些底物与，以分子基准计，(比底物)大几倍的氧量反应的条件下(在此以后称之为充分氧化的方法)，β-胡萝卜素、角黄素或视黄酸与氧(O2)反应所得的混合物，在细胞培养中，能诱导癌衍生的和病毒转化的哺乳动物细胞以稍慢的方式增殖，该增殖方式对正常细胞是无毒的。而且，已证明几个经该处理的细胞系发生了细胞分化，也就是说，癌样细胞最终获得了正常细胞的许多特征。还发现由β-胡萝卜素充分氧化所得的混合物能以无毒的方式，抑制或阻碍小鼠体内肿瘤的生长。
建议在能有效得到含寡聚或聚合组分的条件下，用氧来氧化类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯。
类胡萝卜素、视黄酸类或共轭多烯，以固态或溶于有机溶剂，与氧进行该氧化反应。
基于下面描述的实验室的试验，相信由β-胡萝卜素、角黄素、蕃茄红素、视黄酸氧化所得的氧化的混合物(和其寡聚/聚合组分)和其部分氧化的混合物是有效的抗-增殖和抗-肿瘤试剂及分化诱导剂。
在该研究的早期没有确定该聚合成分的结构式。有证据表明由β-胡萝卜素、角黄素或视黄酸氧化所形成的聚合体具有聚过氧化物结构并含有酸性基团。
说到本发明的天然产物的问题。会察觉在自然状态下氧化期间聚合组分的形成可能会受到阻抑，因非分离的类胡萝卜素和视黄酸类受如维生素E的抗氧化剂的保护而免受氧化。然而，在有维生素E存在的溶液里氧化β-胡萝卜素所得的极性物质(分离时聚合形式存在)，在体外细胞培养试验中的活性与由非抑制氧化条件下所得的该聚合物的活性一样。
与类胡萝卜素和视黄酸类的分子量相比，本发明的混合物的许多聚合组分的分了量相对低些。为此，该物质被称为寡聚体和聚合物。为简便说明起见，用术语“聚合体”、或“聚合物”定义该物质。
在导致本发明的研究工作的第二期已证明：由上面定义的充分氧化所得的本发明的混合物可根据分子量对其进行分级分离。例如可通过溶剂沉淀或凝胶渗透色谱来进行该分级分离。如此所得的某些馏分还可根据其极性进一步分级分离(亚分级分离)。已发现如此所得的许多馏分和亚馏分，及其所含的某些化合物，表现出的抗肿瘤、细胞抑制和/或细胞分化活性，可与该研究工作第一期所定义的混合物的各自的活性相当或更高。
分离了一特别的化合物，2-甲基-6-氧化-2，4-庚二烯醛，并发现其表现出细胞抑制和抗肿瘤性质。该化合物可通过分级分离本发明的充分氧化的混合物(氧化的β-胡萝卜素)得到，或通过常规合成方法得到。作为反式-视黄酸的氧化所得产物，以前已有过该经合物的报道，Oyler等，“Characterization of autoxidation products of retinoic acid”，发表于Tetrahedron Vol.45，No.25，pp.7679-7694，1989。
附图的详细描述
附图中：
图1表示充分氧化的β-胡萝卜素的反相高压液相色谱(HPLC)的分离/分析；
图2图解描述充分氧化的β-胡萝卜素的凝胶渗透色谱分析结果；
图3表示充分氧化的β-胡萝卜素的氧化混合物的傅里叶红外变换(FTIR)光谱。
图4表示充分氧化的β-胡萝卜素的氧化混合物的质子核磁共振(NMR)光谱；
图5a表示充分氧化的β-胡萝卜素的氧化混合物的聚合组分的UV光谱(馏分1)；
图5b表示β-胡萝卜素的UV光谱；
图6a-6d图解描述聚合物混合物下列特定馏分的GPC分析结果：
6a-馏分1，
6b-馏分2，
6c-馏分3，和
6d-馏分4；
图7表示聚合物混合物的馏分1的FTIR光谱；
图8表示自固体β-胡萝卜素氧化所得的物质的FTIR光谱；
图9图解描述固体的β-胡萝卜素氧化所得的聚合物的GPC分析结果；
图10a-10f(照片)说明视黄酸和充分氧化的β-胡萝卜素对下列ES细胞系分化的作用效果：
图10a-ES细胞系，无诱导剂
图10b-视黄酸
图10c-充分氧化的β-胡萝卜素3μM
图10d-充分氧化的β-胡萝卜素7.5μM
图10e-充分氧化的β-胡萝卜素15μM
图10f-充分氧化的β-胡萝卜素30μM
图11图解说明充分氧化的β-胡萝卜素以10mg/kg剂量在0、2、4、7、9、11、14、16和18天注射对肿瘤生长的作用效果；
图12图解说明充分氧化的β-胡萝卜素以150mg/kg剂量在0、2、4、7、9、11、14、16和18天注射对肿瘤生长的作用效果；
图13a图解说明充分氧化的β-胡萝卜素对处死动物内肿瘤大小的作用效果及其对照(未经处理过的动物)，该处死的动物已用不同剂量的充分氧化的β-胡萝卜素处理过；
图13b图解说明充分氧化的β-胡萝卜素对处死动物内的肿瘤大小的作用效果及其对照(未经处理过的动物)，该处死的动物已用不同剂量的充分氧化的β-胡萝卜素处理过并且在该肿瘤周围产生了出血；
图14表示，作为比较，用作本发明目的的主要的起始化合物的结构式；
图15图解说明本发明主要馏分的分子量断裂；
图16图解说明该混合物溶剂介导的三个水平的分级分离。
图17表示将馏分SG1分离为馏分LSG和MSG的制备GPC的GPC色谱图；
图18a和18b图解说明馏分LSG的HPLC色谱图，分别在219和265nm处监测，并且表明了馏分LSG是怎样裂解成馏分F1和F2的；
图19a和19b图解说明馏分F1的HPLC色谱图，分别在219和265nm处监测，并且表明了馏分F1是怎样裂解成馏分F1.1和F1.2及F1.3的；
图20a和20b表示馏分F2的HPLC色谱图，分别在219nm和265nm处监测；
图21表示本发明认定馏分所指的特定化合物的分子式；
图22a表示本发明的某些馏分对结肠癌细胞系的细胞抑制作用效果；
图22b表示本发明的某些馏分对白血病细胞系的细胞抑制作用效果；
图23a图解说明β-Carox在活体外对DA-3细胞系IC50的苯丙氨酸氮芥的作用效果；
图24表示β-胡萝卜素和氧化和β-胡萝卜素在卵巢癌内的抗肿瘤性质；和
图25a和25b表示本发明不同馏分对小鼠DA3模型内的肿瘤生长的抑制效果。
本发明的详细描述
已确定β-胡萝卜素、视黄酸和相关化合物为潜在的抗癌试剂或被用作治疗不同类型癌症如肺癌和某些类型的白血病的预防和/或治疗试剂。由于与维生素A(视黄酸)(其本身是β-胡萝卜素的氧化产物)相关的作用模式，β-胡萝卜素的化学预防(Chemopreventive)作用也受到一些注意。已表明维生素A能引起某些类型癌细胞至少部分地发生转变，从其增殖的胚样状态变成与正常细胞相似的状态。然而，维生素A的严重的毒性极大限制了它的治疗应用。
还不清楚类胡萝卜素的作用机制。维生素A本身和能影响细胞生长和分化的相关视黄酸类的作用，看来由位于细胞核上的视黄酸类受体介导。
关于β-胡萝卜素和其它可能的类胡萝卜素，普遍认为其抗癌效果来源于完整分子的某些抗氧化性质，而并不是来源于它能形成维生素A的能力，但这一观点未被证实。
分离的β-胡萝卜素和其它的类胡萝卜素易于与空气中的氧反应，发生自发氧化。视黄酸类也能发生自发氧化。然而，开始认识到在视黄酸类里存在的少量的共轭烯键可降低其自发氧化的速率和程度。
自发氧化可引起类胡萝卜素和视黄酸类在活体内象细胞内助氧化剂样起作用，作为生物活性基和/或自由基-衍生的产物的来源发生反应。已认识到自由基和自由基氧化的产物，作为第二信使在活细胞的信号传递路径中起重要作用。实际上，虽然认识到自由基的产生是生命在需氧环境里的必然结果已很久了，但普遍认为这是对细胞有害的；最近，越来越认识到自由基，特别是氧自由基，在细胞维持、控制和发育中起重要作用。
我们发现类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯的充分氧化的产物及其结构类似物，具有非-维生素A的生物活性。通过在活体外对β-胡萝卜素、角黄素和视黄酸充分预氧化(Pre-oxidizing)，并且检测该氧化产物混合物的生物活性，我们已证实了我们的发现。认识到该充分氧化的产物，即本发明的根本，与维生素A之间的差别很重要；众所周知维生素A是β-胡萝卜素和其它产维生素A的类胡萝卜素在活体内氧化生成的产物。
在本研究工作的第二期，制定了充分氧化的β-胡萝卜素混合物，在此称之为β-Carox的分级分离纲要。根据分子量(MW)分布，该混合物用溶剂沉淀结合凝胶渗透(大小排阻)色谱的(GPC)，被分成三个馏分。生物鉴定表明大部分的生物活性残留于低分子量和中度分子量的馏分内。因此，注意力集中到了这两个馏分上，特别是低分子量馏分上。探究较为复杂的中度分子量馏分需要更长的时间。
进一步对该低分子量馏分进行分级分离，开始用溶剂沉淀，后来换用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离。分离点(point)可达某些馏分仅含一种或只含少数几种化合物。这些化合物中的一些化合物已被鉴定出来。一种化合物，不饱和的酮醛，已通过独立途径(合成)得到，并且发现其具有强的细胞抑制和抗肿瘤性质。该化合物以前从未被鉴定为由β-胡萝卜素形成，但作为RA自动氧化的产物，却曾被报道过。看来以前从未发现过该不饱和共轭酮醛类化合物的细胞抑制和抗肿瘤的性质。
已对许多β-Carox馏分做了细胞抑制和分化-诱导活性的测定。几个馏分的细胞抑制活性比β-Carox强。对几个人细胞系做了分化诱导试验。可见对IMR32成神经细胞瘤细胞系的效果最强。观察到的最引人注目的结果是当用不同的馏分处理时，一细胞系内的前体细胞可产生两种不同的表型(神经元和胶质细胞)。(具有如此性质的物质可用于大脑和脊髓损伤的神经再生治疗。)
β-Carox对作为异种移植片生长于裸鼠内的人卵巢癌细胞系的抗肿瘤活性已被证实。认为来源于人细胞系的裸鼠的异种移植片对人肿瘤的反映，比对来源于动物细胞系的动物肿瘤的反映更近。用第一个专利描述的活体内模式检验该β-Carox馏分的许多馏分，结果表明几个馏分具有强的活性。也值得注意的是在对动物没有明显毒性的浓度下，该活性仍可得到。
此时，本研究工作的第二期之后，我们已确证了不只一种化合物(来源于上面所定义的氧化的混合物)具有作为抗癌试剂的活性，而且含有不只一种化合物的馏分的活性比单一化合物的更高。
蕃茄红素(参见图14)，在西红柿里发现的类胡萝卜素，经充分氧化后也被发现具有细胞抑制活性。蕃茄红素缺少β-胡萝卜素中的两个环己基环。
为证实本发明，进行了活体内和活体外的生物学试验，对β-胡萝卜素、角黄素和视黄酸的氧化混合物的分析数据及合成方法叙述如下：试验研究的第一期化学
对β-胡萝卜素、角黄素和视黄酸的氧化描述如下：
实施例1：β-胡萝卜素的氧化
在黑暗中，30℃、纯氧、大气压下，20mM用氧和的β-胡萝卜素苯溶液在振荡浴中温浴。72小时后，当消耗6至8摩尔当量的氧时，蒸发溶剂得树脂似的黄色残余物。
溶剂作用：
β-胡萝卜素在四氯化碳中氧化产生的结果与其在苯中氧化所得的结果基本相同。维生素A形成的量：
在氧化混合物中既没有检测到视黄醇也未检测到视黄酸，而视黄醇和视黄酸是β-胡萝卜素在活体内酶氧化的产物。虽然已经确定视黄醛是氧化产物，视黄醛能被氧化成视黄酸；但生成的视黄醛的量太少，不是氧化的β-胡萝素混合物的生物活性的原因。而且，氧化混合物的生物活性基本上不同于维生素A的生物活性，不同之处将在下面描述。聚合物：氧化过程中有大量的聚合物质生成(参见下面)。与其它烯类化合物的氧化反应类似，高分子量的物质对应于由氧化的β-胡萝卜片段形成的聚合体。进行了不同浓度的β-胡萝卜素的试验来确定聚合反应对溶液里β-胡萝卜素浓度的依赖。用氧饱和的20mM、2mM和0.2mM的β-胡萝卜素苯溶液，在黑暗中于30℃、纯氧(760mmHg)下温育。在所有情况下，聚合成分均是主要产物。而且，在β-胡萝卜素氧化的早期形成聚合成分。
图1表示氧化混合物的反相高效液相色谱(HPLC)特征。
图2表示氧化混合物的GPC特征，表明了，任意单位的，该氧化混合物根据其组分分子量的组成。分子量分布的范围大致在大约600至8000道尔顿，大部分集中在大约900道尔顿(在4.9分钟出现的尖峰是假象，是由GPC柱的性质所引起的，该混合物中分子量在大约1400以上的所有组分被同时洗脱出来)。
图3是该氧化混合物的傅里叶变换红外线(FFIR)光谱。
图4是该氧化混合物的质子核磁共振(NMR)光谱。对β-Carox产物混合物的部分分级分离
通过连续溶剂沉淀(法)对所得的溶液中的不含β-胡萝卜素残留的充分氧化的混合物进行分级分离。通过凝胶渗透色谱(GPC)和元素分析对馏分进行特征分析。元素分析及酸和环氧化合物含量分析的结果示于表1：
表1  β-Carox的由连续溶剂沉淀获得
     的不同馏分的特征
馏分          1        2          3        4
重量％        37       17         14       32
可滴定酸
           4.3±0.3  4.3±0.2  6.1±0.3  6.2±0.1〔10-4mol/g〕
环氧化物
(碘量的)   9.5±1.0  9.9±0.8  8.2±0.3  5.9±0.4〔10-4mol/g〕
环氧化物
(Fe2+氧化)8.3±0.2  8.9±0.2  8.8±0.9  5.5±0.1〔10-4mol/g〕
元素分析：
C            58.5      58.2      61.2      65.3
H            7.2       7.0       7.6       8.7
O            34.2      34.3      31.2      26.0馏分由下述方法得到：将粗混合物(1.2g)溶于四氢呋喃(THF)(5ml)中，当将该溶液涡旋混合时，将己烷慢慢加入。将样品离心(3000rpm，3分钟)分离出油质残留物，用THF和己烷(5∶15)的混合物将其洗涤一次，并于真空干燥以产生馏分1。所剩的溶液与洗涤液体合在一起，蒸发，并将该残留物溶于THF(3ml)。用己烷(15ml)沉淀后，进行离心和洗涤(THF/己烷，3∶15)以得到馏分2。如前所述，将所剩溶液与洗涤液体混合，蒸发、并溶于苯中(3ml)。用己烷(15ml)沉淀后，进行洗涤(苯/己烷，3∶15)以得到馏分3。将上清物质标记为馏分4。
据各个馏分的重量和GPC脉迹估计，聚合物占β-Carox产物混合物的近90％的重量。所得的前三个馏分的氧的百分含量很好地反映出掺入到β-胡萝卜素中的6-8摩尔当量的氧及伴随该产物的生成时有30-35％净重的增加。β-胡萝卜素，原本由11个共轭双键组成，加入6-8分子的氧，说明大部分的共轭双键系统损失了，因大部分双键由于新的碳-氧键的形成被破坏了。因此，与母体β-胡萝卜素相比，该聚合物的紫外可见吸收光不谱表明其最大吸收在很短的波长处(约240nm，280nm有一肩峰)(相应于图5a和图5b)。
可溶于THF、甲醇、丙酮和乙腈的该聚合物在室温下是无限期稳定的，但在加热条件下部分降解，形成通过气体色谱可检到的挥发性产物。
该氧化混合物的特定馏分1-4的GPC分析(分别对应于图6a-6d)，与图2相比，证明馏分1和馏分2含有相对大量的高分子量的化合物，而馏分3和4，并且特别是馏分4，含有大量的低分子量的物质。在抗氧化剂存在下氧化β-胡萝卜素
在上面所述的条件但有0.01至0.1摩尔当量(基于β-胡萝卜素)的α-生育酚或者2，6-二-t-丁基-4甲氧基酚存在下，也进行了β-胡萝卜素(20mM)的氧化。该反应很慢(在大约6天里仅消耗1摩尔当量的氧)。氧的吸收曲线是线性的。该直线的斜率不依赖于抑制剂的类型及其浓度。在6天的时间里，β-胡萝卜素的消耗量不超过10％。在自由基引发剂存在下β-胡萝卜素的氧化
2，2′-偶氮-双(2-甲基丙腈)加速反应产物的形成。β-胡萝卜素的固态氧化：
得到了类似的聚合物，如FTIR和GPC分析所示，实际上其为唯一的产物；当纯化时，晶体胡萝卜素在固态被氧化。通过将晶体β-胡萝卜素放置在空气中于开口的透明的玻璃容器中最多至8周的时间里，而在白天并不排除光照，反应在此条件下进行。该反应比在溶液中进行的反应慢得多(40天比3天)。氧化固体的β-胡萝卜素所得的聚合体的FTIR光谱(图8)在位置和吸收峰的相对强度方面，与在溶液中、氧化所得的聚合体的馏分1的FTIR光谱很相似。GPC分析的结果与此相同(图9与图6a)。而且，β-胡萝卜素在固态氧化所得的物质，与在溶液中部分和充分氧化所得的物质显示了相似的抑制培养基中生长的癌和转化的细胞增殖的生物活性。
实施例2：角黄素的氧化
将角黄素在用于氧化β-胡萝卜素相同的条件下氧化。因此，20mM角黄素(Fluka)的苯溶液，用氧饱和，于黑暗中30℃在纯氧大气压下在振荡浴中温育。190小时后，当消耗了大约7摩尔当量的氧时，蒸发溶剂以生成树脂样的黄色残留物。虽然反应较慢，但与氧的反应很充分。氧化混合物的GPC分析(数据未列出)显示出与充分氧化的β-胡萝卜素很强的相似性，也就是说，该反应产物主要是聚合物。
实施例3：视黄酸的氧化
在用于氧化β-胡萝卜素和角黄素的条件下，视黄酸与氧的反应进行得很慢。反应在提高压力条件下进行加速。
视黄酸(Sigma)在玻璃试管中溶于苯(0.5ml，20mM)，并将其置于由INCONEL600构成的高压仪器中。该仪器调压至300磅/平方英寸，并将其在设置到42℃的温度控制的浴箱中放置3天。反应混合物的HPLC分析表明该反应不完全。除了温度调高至50℃外，在相同的条件下，反应再进行两天，此时总反应时间为5天。只剩下很少的视黄酸未被氧化(少于总产物的1％)。GPC分析(数据末列出)显示了高分子量产物的存在，及没有可检测的分子量比该柱的分离阻断点(Cut-off)(大约1400道尔顿)大的物质的存在，然而，所述的高分子量产物占总反应产物的部分与β-胡萝卜素和角黄素的比起来要小得多。
生物学
在活体外进行了生物学鉴定，测验了对不同培养细胞系的细胞抑制活性、分化诱导、和抗致瘤病毒活性。大部分的结果得自于β-Carox，也包括一些充分氧化的角黄素和视黄酸的结果。
通过测验β-Carox和充分氧化的角黄素对：
——小鼠的毒性；
——小鼠内肿瘤生长的抑制，包括肿瘤变化的组织病理学检查(肿瘤来源于移植的、化学诱导的大鼠乳癌细胞系)来进行活体内试验。活体外试验
为了确定本发明的混合物的生物学性质，在活体外进行了β-Carox对细胞抑制效果和诱导分化的试验。
在对一些细胞系的试验中，用视黄酸和/或β-胡萝卜素作为对照以便将它们的效果与氧化的β-胡萝卜素的区别开。还研究了氧化的β-胡萝卜素对细胞周期的影响。所有的有关β-Carox活性的浓度均以β-胡萝卜素的微摩尔当量表示。细胞模型：细胞系和特征
用各种细胞系测试β-Carox对增殖和/或分化的效果。细胞系或(建立于由转化的细胞系或是自得了癌症的病人的肿瘤中分离的。另外，还使用了两个鼠细胞系，该细胞系的细胞分化程序可明确地由适当的蛋白标记限定。对这两个系而言，已对由人乳头瘤病毒16型(HPV16)——一种与颈癌有关的病毒转染的匹配克隆做了特征分析，并已表明发生了转化。通过它们的对激素依赖和在软琼脂上形成克隆的能力，对转化的表型L6-HPV16(来源于L6细胞)和BALB/c/MK-HPV16(来源于BALB/c/MK细胞)进行了特征分析。
我们实验室用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)建立了该病毒蛋白质的表达模式。该病毒蛋白质从患有严重瘤形成的患者活体解剖得到。在活体解剖的材料中，表达模式与转化的L6克隆的表达模式类似，这证明用做测试目的的L6模型是恰当和有效的。
BALB/c/MK细胞系因当其暴露于高浓度Ca 2+时分化而令人感兴趣。当细胞暴露于低钙时，它们在少于72小时以内转变为其前分化状态。
对β-Carox的分化诱导性质在另两个模型中进行了进一步的研究，该模型使用小鼠胚干细胞(即准正常细胞系)和几个动物和人成神经细胞瘤细胞系(即癌细胞)。
胚胎干(ES)细胞是全能性的，即它们可生成有机体的任何的细胞谱系。在活体外，在一定条件下，它们同时分化成各种不同的混合类型。用已知的促进分化的物质处理使ES细胞趋于单一表型。例如，视黄酸促进培养细胞分化成神经元(数据未公开)，该细胞是在由National Research Council建立的条件下培养的。
鼠细胞模型
1a.L6大鼠初级成肌细胞(L6)。
1b.用人乳头瘤病毒16型转染的L6细胞(L6-HPV16)
2a.小鼠BALB/c/MK角质细胞(BALB/c/MK)。
2b.用人乳头瘤病毒16型转染的小鼠BALB/c/MK(BALB/c/MK-HPV16)。
3a.Mat B-WT：大鼠乳腺癌。
3b.Mat B-MLNr抗苯丙氨酸氮芥大鼠乳腺癌。
3c.Mat B-DOXr抗亚德里亚霉素的大鼠乳腺癌。
4.B16小鼠黑素瘤。
5.DA-3由DMBA诱导的小鼠乳癌。
6.FDCP-1小鼠髓样白血病。
Mat B NLNr和Mat B-DOXr两个细胞系对多种药物表现出抗性；Mat B-WT是野生型。它们是未完全分化的细胞，不表达雌激素或孕激素类受体。人细胞模型
7a.MCF7-WT人乳房癌。
7b.MCF7-ADRr抗亚德里亚霉素的人乳房癌。
该细胞中度分化并且对雌激素和孕激素类受体呈阳性。
8a.Uro9人膀胱上皮癌；完全分化。
8b.Uro10人膀胱上皮癌；分化很差。
9.L14人肺腺癌；中度分化(从患者的肿瘤中在the LadyDavis Institute of the Montrenl Jewish Hospital室内(in-house)分离)。
10.NB4人急性前髓细胞性白血病。细胞抑制效果
得自于Promega的MTT生活力/毒性的结果总结于表2(基于线粒体脱氢酶活性的代谢试验)。
在增加β-Carox浓度(2.5倍)时，对生活力进行了估测。与未经处理的对照相比，细胞群半数生长的剂量表述为IC50值。
    表2  充分的β-Carox的细胞抑制效果细胞系                 来源            IC50(μM)MatB-WT             大鼠乳腺癌          25.5Mat-MLNr                                21.0B16                 小鼠黑素瘤          12.4DA-3                  小鼠乳瘤          15.6FDCP-1             小鼠髓样白血病       7.5L6                大鼠胚胎成肌细胞      51.9L6-HPV16                                28.2MCF7-WT              人乳房癌           11.3MCF7-ADRr                               11.3Uro-9              人膀胱上皮癌         17.7Uro-10                                  19.8L14                  人肺腺癌           18.5NB4             人前髓细胞性白血病      4.8
将在低密度(104至105细胞/1-5ml)培养的指数生长期的细胞暴露于单一剂量的β-Carox的不同浓度达72小时或更长时间。由MTT试验确定细胞的生长。由存活曲线(细胞生长对β-Carox浓度的图)图解确定IC50值(由β-胡萝卜素当量表示)。表2中的每个值对应于至少两个独立实验的平均值。测试了不同批次的充分氧化的β-胡萝卜素，并且得到了一致的结果。注意NB4白血病细胞系的敏感性及对L6对照细胞缺乏活性。除NB4细胞对视黄酸有反应外，发现用作一些细胞系对照的视黄酸和β-胡萝卜素(均为3μM)，对细胞生长曲线无影响。
作为使用MTT试验的交叉检验，用Coulter计数器对细胞计数证实了L6和L6-HPV16细胞系的IC50结果，如表3所示。
表3    MTT试验测量和用Coulter计数器计数细胞
      所得的β-Carox的细胞抑制效果(IC50(μM)比较细胞系           MTT            Coulter计数器L6               51.9           39.0L6-HPV16         28.2           24.6
β-Carox的连续有机溶剂沉淀后所得的馏分对MCF7-WT细胞系进行了测试；发现两个馏分，1和3比原粗混合物更具有活性，如表4所示。
表4  馏分对MC7-WT细胞系的细胞抑制效果(μM)馏分      1      2      3      4      β-CaroxMCF7-WTIC50    11.8   17.3   13.1   26.2    22.8如表2脚注所述的那样处理细胞。
虽然似乎正常细胞被轻微地抑制了，但经较长时间的培养后，这种效果就渐渐地消失了，这表明β-Carox对正常细胞的影响并不剧烈。这样有可能对癌症患者进行反复治疗，而副作用有限。对细胞分化的影响对L6成肌细胞模型的形态观察：
在活体外培养的大鼠成肌细胞L6能够分化。在the Na-tional Research Council，用形态测量法，原位免疫荧光和流式细胞光度术分析对这些细胞的分化程序进行了5步特征分析。
所用的已知的肌细胞分化的标志(特征蛋白)是：纤连蛋白、α-肌动蛋白、N-CAM、波形蛋白及乙酰胆碱受体的表达。另外，证明在L6-HPV16细胞中，对前融合(prefusion)期特异的乙酰胆碱受体不表达。划分了5个时期，其顺序促进分化的表型描述如下：
1.细胞具有胚胎纤维细胞样表观。
2.细胞获得双极形态。
3.细胞开始定向。
4.细胞进入前融合期。
5.细胞表示syncitium和肌管的形成。
已经发现在前融合期，HPV16转染的细胞被转化和阻断。也就是，HPV16转染的细胞在4期被阻断。然而，在用β-carox处理下，观察到了细胞的较好定向及开始形成一些syncitium，相应地部分地进入分化的5期。
在含不同钙含量的培养基中培养，当培养基中不富含钙时(0.05mM)，β-carox对对照细胞和转染的细胞都更具有潜能。另外，还观察到了在钙和β-carox之间对上面所述的分化标志的表达存在拮抗作用。这促成了一些探索性实验，该实验针对于钙对经β-carox处理的细胞的作用效果。使用成肌细胞和角质细胞模型。
简言之，在L6肌细胞内，经由非特异性阳离子通道发生细胞内外源钙的流入(正如已由我们早期提出，并且在现存的文献相符)细胞内，钙水平由自内存中的钙释放控制。另外，在L6分化程序的前融合期表达的乙酰胆碱对肌浆钙通道进行受体调控。
角质细胞内，调控钙进入和自贮存释放的通道的本质还未被阐明。
通过两种技术进行了实验：电生理学及用Fura-2成像。初步的结果表明β-carox对钙通道起封闭剂或钙螯合剂的作用。此点通过其能部分克服所述多药抗性细胞系的多药抗性得到了证实。然而，似乎如维拉帕米(Verapamyl)这样的常规通道封闭剂，要比它有效。BALB/c/MK模型的分化标志的模式
BALB/c/MK角质细胞内，如Poll分类所定义的细胞角蛋白(cytokeratin)1，5，10是通过Western免疫印迹首次鉴定的。认为细胞角蛋白1和10与高度分化的细胞有关，而细胞角蛋白5与低度分化的还处于增殖阶段的细胞有关。
流式细胞光度术分析表明角蛋白在未经处理的HPV16转染细胞中比在未经处理的相应的对照细胞中总体表达得要少。角蛋白5
暴露于1.8mM的钙，3天内诱导不可逆分化，结果在对照细胞和转化细胞中，角蛋白5表达增除了6天的暴露足以诱导对照细胞的表达，而对转化的细胞来说则需9天外，暴露于β-carox得到类似的结果。
同时暴露于两种诱导剂，表达再增加，表明该两种化合物是拮抗剂。角蛋白1和10
暴露于增加的钙浓度(从0.05mM到1.8mM)观察到这两种角蛋白在对照细胞中表达大幅度增加，而转化的细胞未有任何反应。
作为对比，β-carox诱导两种标志在两个细胞系的表达。同对照相比，BALB-HPV16系一样，反应需要暴露较长的时间。
再次观察到钙处理的拮抗作用。这些结果似乎很重要，因为它们证明，至少在角质细胞中，β-carox促进HPV16转化细胞的分化而典型的细胞分化诱导剂却是无效的。
β-carox的分化诱导(通过形态学标准来估计)也已在NB4前髓细胞性白血病细胞中观察到了。ES和成神经细胞瘤细胞
在视黄酸诱导ES分化成神经元的相似条件下，该条件由the National Resarch Council建立，由免疫组织化学技术估计特定的标志，结果表明β-carox也能促进ES分化成神经元细胞，如图10所示。然而，视黄酸和β-carox对ES细胞的作用效果之间存在两个重要的差异。
1)视黄酸在0.1至1μM范围内(图10b)促进80％的ES细胞以剂量-非依赖的方式分化成两极表型，而β-carox在最适深度(7.5μMβ-胡萝卜素当量)下，大约90％的细胞产生类似于蒲肯野细胞的高度分枝表型的成体终末分化(图10d)；高度分枝的机制还尚未被完全阐明。
2)两种诱导剂的成体终末分化的动力学是不同的；β-carox比视黄酸更有效(分别为15小时与3天，在我们的实验条件下)。
β-carox促进成神经细胞瘤系Neuro2A，IMR32，SK-N-SH和SK-N-MC发生相似的高度的分化，而视黄酸仅能引起部分分化。
得自于ES和成神经细胞瘤模型的结果表示β-carox是强有力的分化促进剂并且看来它的作用机制与视黄酸的作用机制不同。抗致瘤病毒基因表达的活性
对β-carox可能具有抗致瘤病毒基因表达的活性的观察研究依赖于3个独立的试验。细胞病：一旦暴露于β-carox，病毒感染综合症，在转染的细胞L6-HPV16和BALB/c/MK-HPV16的细胞核周围的明显可见的强烈的液泡化，会急剧减少或消失。信使RNA从已经暴露于和还未暴露于β-carox的转染的细胞中抽提出来。通过RT-PCR分析了病毒基因产物表达模式的动力学。最初的结果表明，经β-carox处理的细胞病毒蛋白和myc致癌基因(与增殖有关的致癌基因)的表达模式与经视黄酸或β-胡萝卜素处理的那些细胞相比，是不同的。
用抗HPV16的致癌蛋白E6和E7共有片段的单克隆抗体，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹分析和流式细胞光度术来确定两种蛋白质的表达。转染的细胞暴露于β-carox9至12天后，观察到E6和E7蛋白表达的减少。未完全氧化的β-胡萝卜素、抗氧化剂-抑制的β-胡萝卜素氧化混合物、和充分氧化的角黄素及视黄酸的细胞抑制效应：
表5表明了含有聚合的氧化产物和未反应的β-胡萝卜素的未完全氧化的β-胡萝卜素、由α-生育酚(5摩尔％抑制的β-胡萝卜素氧化所得的氧化产物，完全氧化的角黄素和视黄酸(如上所述合成)对MC7-WT细胞系作用的相对效果。所有的样品都含有至少一些高分子量氧化物，而且均显示出相当高的细胞抑制活性。表5.  部分氧化的β-胡萝卜素、由β-胡萝卜素抑
  制氧化所得的产物，和充分氧化的角黄素和
  视黄酸对MC7-WT细胞系的细胞抑制活性
  样品                            IC50(μM)
大约25％的氧化的β-胡萝卜素           22
大约250％的氧化的β-胡萝卜素          21
100％                                 17
α-生育酚-抑制的β-胡萝卜素的氧化     11
氧化的角黄素                          9
氧化的视黄酸                          7对细胞进行如表2脚注所述的处理。β-carox的活体内毒性和抗肿瘤活性研究毒性估测：β-carox和充分氧化的角黄素
通过监测雌性BALB/c小鼠的体重及对该动物的普通体检来估测毒性。在1天、3天和5开腹膜内注射5mg/kg和10mg/kg的剂量(表6)。对照组仅接受溶剂(20％乙醇水溶液)。用50和100mg/kg的剂量在1，3，5，8和11天注射进行类似的研究。未观察到显然的毒性效果(数据未示出)。
即使施用100mg/kg的6倍剂量，β-carox对健康小鼠也是无毒的。应该强调的是即使用高至15mg/kg的重复剂量(9倍)(对患有肿瘤的小鼠)，也未观察到相反的效果。
类似地，充分氧化的角黄素在同样的剂量/注射模式规则下未显示明显的毒性迹象(数据未示出)。表6.充分氧化的β-胡萝卜素对小鼠体重的影响
天                 平均体重(g)
      对照           5mg/kg      10mg/kg
1     14.0           14.4        14.0
2     14.0           14.5        14.0
5     14.4           14.9        14.5
7     14.8           15.3        14.6
9     15.2           15.8        15.2
11    15.7           16.3        15.7
13    16.1           16.7        16.2
15    16.6           17.3        16.9
17    17.1           17.7        17.4
19    17.6           18.3        17.9
21    18.1           18.7        18.4
23    18.7           19.4        19.1
25    19.2           20.0        19.8抗肿瘤活性：肿瘤模型系统
使用了小鼠D1-DMBA-3(DA-3)乳腺癌模型。该细胞系来源于由7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的患有致免疫的非转移性的鼠乳腺癌的BALB/c小鼠。
每只雌性BALB/c小鼠皮下注身的一百万个DA-3细胞。当肿瘤可触诊时(直径0.5cm，1～2周)，将动物随机分成组并给其以5mg/kg至150mg/kg的剂量范围皮下注射β-carox。每隔2～3天测量肿瘤的生长。如Alaoui-Jamali等在J.Pharmaco1.Exp.Ther.1993，264(3)，1299中所描述的，通过测量肿瘤体积做为时间的函数来确定肿瘤生长的抑制进行评估。同样，对照组只接受溶剂(20％的乙醇水溶液)。
图11和图12图解描述β-carox对肿瘤生长的影响。图11对应于在0，2，4，7，9，11，14，16和18天注射10mg/kg的剂量。图12对应于以同样的方式注射150mg/kg的剂量。
为进行组织学检查，处死随机选取的几只动物，并对肿瘤解剖，将肿瘤于10％福尔马林常规盐水中固定。制备每个福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤的组织切片，并用苏木精-曙红将其染色。
结果表明β-carox对植入小鼠的癌细胞来源的肿瘤有生长抑制效果。图11和图12表明充分的β-carox即使以低至为10mg/kg的剂量重复施用也能有效阻止肿瘤的生长并使其稳定很长一段时间。
图13a和图13b表示已经被不同剂量的β-carox处理过的处死的动物体内的肿瘤和对照(未经处理的动物)之间的比较。一些动物在肿瘤周围发生了出血(图13b)。这些情况下，肿瘤的实际尺寸比用测径器测得的小些(误差来源于出血肿胀使表观肿瘤大小增大)。
对从经处理的动物内取出的肿瘤进行组织病理学检查发现：
—β-carox诱导已断定的组织学改变，反映在DA-3肿瘤中组织死亡。
—肿瘤组织表示出细胞/组织的许多分化特征。
—在所有的经处理的肿瘤中出现出血而且出血区严重的色素沉着和坏死有关。
—色素不是铁(用普鲁士蓝进行的铁染色是阴性的)，但可能是由出血症所致的血铁黄素。看来色素不可能是黑色素。色素沉着的真正的本质还有待于证实。
在正常的、非肿瘤组织中没有证据证明发生了类似的组织病理学变化。
多次腹膜内注射β-carox都能被很好地承受，即使是在高达150mg/kg的浓度下，因此看来β-carox的治疗指数是很高的，这说明β-carox比常规的抗癌药物具有潜在的很大的优势。
总结一下我们的一期研究，作为类胡萝卜素代表的β-胡萝卜素和角黄素，和至少作为视黄酸类代表的视黄酸可进行充分的氧化产生物质，至此β-carox模型证明了该物质作为无毒性的活性试剂抗不可控制的细胞增殖、肿瘤、和致瘤病毒、及作为细胞分化促进剂的有用性质。对β-carox的化学分析明显揭示其中没有任何形式的维生素A存在或仅以很少的量存在。而且，氧化的角黄素和视黄酸的生物学活性，(角黄素和视黄酸不能形成维生素A)，提示了不同于维生素A的生物活性物质的存在。虽然β-carox的细胞抑制和分化促进活性与维生素A本身的那些活性很相似，但总体上β-carox在宽范围的环境下其效果更强。还存在很重要的差异是β-carox是无毒的。研究的第二期化学番茄红素的氧化将番茄红素(参见图14)溶于苯，在与工作的第一期的β-胡萝卜素基本上相同的方式下与氧气进行充分氧化。以类似于β-carox的方式测试粗产物混合物的细胞抑制活性。β-carox的分级分离
分级分离分三相进行。该三相分离方案，3～4层次的分离描述如下：
               相1                               相2                        相3
Figure A9519075000371
用与第一期中所描述的相似的步骤合成β-carox。简言之，将β-胡萝卜素(30g)溶于苯(3.01；0.02M)，并将其于室温在氧气下搅拌4天。GPC层析证实有3种主要的组分存在，即低分子量馏分(＜300Da)、中等分子量馏分(300～1000Da)、大分子量馏分(＞1000Da)(图15)。
1级分离(相1～3)：将该溶液(3.0升)浓缩至大约200ml然后用约2升的己烷稀释。沉淀物，IG1，大约占总混合物的65％，含有大多数的大分子量的物质(＞1000Da)。含有可溶性馏分，即低分子量馏分(＜300Da)和中等分子量馏分(300～1000Da)，和实际上不含任何大分子量馏分(参见图16)的上清液，将其蒸干得到残余物，SG1。2级分离(相1)：馏分SG1(1.2g)在己烷(120ml)中于室温搅拌30分钟。不可溶的馏分，IG2，被过滤出来，其中含有大部分的中等分子量和一些低分子量物质(图15)蒸发含有可溶性馏分的上清液，产生SG2，其中含有大部分的低分子量和一些中等分子量的物质(图16)。2级分离(相2和相3)：将馏分SG1(10g)溶于四氢呋喃(10ml)，然后将该样品(250ml)相继注射上样到制备性梯度GPC层析柱(19×300mm，Waters styragel，颗粒大小15μm，孔径大小为10nm)，并四氢呋喃洗脱(4ml/min)，分离得到低分子量和中等分子量馏分，分别为LSG(40％)和MSG(55％)。完全分离成两个分子量馏分如图17所示。3级分离(相1)：将馏分SG2(688mg)上样到硅胶柱上，并用己烷/乙酸乙酯(95∶5)洗脱。合并洗脱出的馏分，并将溶剂脱去得到馏分SG3。3级分离(相2)-馏分LSG(600mg)与冰冷的戊烷(1ml)一起搅拌1分钟，然后弃去大部分的上清液。此步骤重复4次。过滤出不可溶的馏分，ILSG，将含可溶性组分的合并的上清液部分的溶剂蒸发掉，得到馏分SLSG。3级分离(相3)：将馏分LSG(4.4g)溶于乙腈(10ml)，然后将其(450ml，总共9.0ml)相继注射上样到制备性梯度HPLG仪，该仪装有3个Waters NovaPak HRC18(反相，颗粒大小6μm，孔径大小为6nm)的系列相连的PrepPak药筒(40×100mm)，用乙腈洗脱(40ml/min)。分别收集自4.8至6.4分钟和自6.4至12分钟的洗脱剂得到馏分F1(80％)和F2(20％)。在图18中，高效液相层析(HPLC)的分析图谱中间的圆点竖线表明LSG是怎样被分成成两个新馏分，F1和F2的。(图18中化合物的洗脱时间和其相应的分离时间与制备性HPLC中的那些不同，这是因为在分析性和制备性条件下，得到最佳分离各自所需的条件不同)。4级分离(相3)：将馏分F1(700mg)溶于腈(1.5ml)，将其(250μl，总共1.25ml)相继注射上样到装有与已经述及的柱子相同的柱子的制备性梯度HPLC仪上，然后用水∶乙腈∶甲醇的50∶45∶5的混合物以40ml/min的流速洗脱，分离得到3个馏分，F1.1(11％)、F1.2(13％)和F1.3(5％)。该馏分分别是在自2.0和6.6分、6.6至12.0分和12.0至23分收集洗脱剂得到的。图19中的圆点竖线表明分离是怎样进行以得到这3个馏分的。在第3和第4级分离的一些馏分化学组成的测定(图21给出了编号化合物的结构式)
馏分F1.1、F1.2和F1.3都仅含有很少的化合物，如图19所示。F1.2中的主要的成分为2-甲基-6-氧化-2，4-庚二酮醛(化合物1，在本文中各处均指酮醛)。Dihydroac-tinidiolide(化合物2)是F1.3的主要组分。已鉴定出馏分F2中含有化合物3～14。它们是β-环柠檬醛(3)、β-芷香酮(4)、β-芷香酮5，6-环氧化物(5)、4-氧代-β-芷香酮(6)、β芷香亚基乙醛(7)、β-芷香亚基乙醛5，6-环氧化物(8)、4-氧代-β-芷香基乙醛(9)、β-apo-13-胡萝卜素酮(10)、β-apo-13-胡萝卜素酮5，6-环氧化物(11)、4-氧代-β-apo-13-胡萝卜素酮(12)、视黄醛(13)和视黄醛5，6-环氧化物(14)。生物学在活体外通过测定细胞抑制活性、对分化的诱导、和对细胞周期的影响来进行生物鉴定。体内的检验则是通过测定对小鼠肿瘤生长的抑制来实现。活体外检验
对馏分的细胞抑制性质和诱导分化的能力进行了测试。所得结果与由β-carox所得的结果做了比较，后和为参考表明分级分离是否得出了具有高活性的馏分。(在一些用于测试的细胞系中，用视黄酸和/或β-胡萝卜素作对照以便将它们的效果和β-carox的效果区别开)。得到了许多馏分的不定的性质，所有的样品在相同的“重量”浓度下进行测验。对用β-胡萝卜的分子量(537Da)划分样品的重量所得假设体积克分子浓度比例进行了比较。
所用的细胞系：
HCT116                    人结肠癌
IMR32                     人成神经细胞瘤
NB4                       人急性前髓细胞性白血病
K562                      人慢性髓性白血病
BALB/c/MK                 小鼠角质细胞β-carox馏分的细胞抑制效果
用每个样品的6个浓度处理细胞(对HCT116和IMR32细胞系用2.5、7.5、15、22.5、30、45μM，NB4和K562细胞系用2.5、5、7.5、10、15、22.5μM处理)。3天后，细胞溶胞，与Hoechst染料33258一起温育，测定溶液中的荧光数据，并将其除以未经处理的细胞的相应值(在校正了背景荧光以后)来确定每个样品浓度的细胞抑制效果。图22a和22b分别图解描述了得自于HCT116人结肠癌细胞系和K562人白血病细胞系的结果。
很显然相对活性很大程度上依赖于所选择的细胞系。馏分MSG和ILSG特别好的地说明了这一点，MSG对HCT116细胞系有活性而对K562细胞系无活性，而馏分ILSG在两个细胞系中的活性很高(比β-carox的还高)。这些观察结果揭示可通过多种化合物的作用来得到细胞抑制效果。
表7总结了从四个细胞系所得的结果。通过将在每种样品浓度下的每个生长抑制值除以相应的β-carox的值把馏分相对于β-carox进行归类，并通过观察在6个样品浓度中的趋势进行定性测定。馏分的活性用“+”“0”和“-”表示，分别代表比β-carox活性高，与其相似和比其活性低。
最令人惊异的结果之一是酮醛图21中化合物1对细胞生长的强烈抑制，该酮醛已被鉴定为馏分F1.2的主要组分。可能令人吃惊的是在分级分离的较高水平(3和4)所得的相似馏分的活性明显减少，好馏分F1、F2、F1.2和F1.3，而由前面水平(1和2)分离所得的其较复杂的亲体馏分活性却增加。后者，相似馏分原则上富集了活性组分，从而导致了预期的高活性。在早期较为复杂的馏分中观察的高活性可能来源于其中存在不只一种的活性化合物和/或来源于两种或多种化合物的协同作用。表7.    馏分和表现出与β-carox有关的选择的
       化合物对几个细胞系的细胞抑制的效果阶段       馏分                    细胞系
                   HCT116  IMR32    K562    NB40         β-Carox      ○     ○       ○      ○1         SG1            ○      +        +       +
      IG1             +     ○       ○       +2         SG2             +      +        +       +
      IG2             +      +        +       +2         LSG             -     ○        +      ○
      MSG            ○     ○        -      ○3         SG3             +      +        +      ○3         F1              -     ○       ○      ○
      F2             ○     ○       ○       -4         F1.1            -     ○        +       +
      F1.2            -     ○        -      ○
      F1.3            -     ○       ○      ○
      酮醛            +      +        +       +
      β-Car          -     ○        -       -
      RA              -      +       ○      ○注：上面所示的数据是用所有的试验中β-carox值的平均值计算而来的。β-carox的值定义为“0”。RA＝全反式视黄酸。充分氧化的蕃茄红素的细胞抑制效果
用HCT116细胞系对充分氧化的蕃茄红素的活性和β-carox的做了比较。表8中的结果表明这种物质对该细胞系具有相似的效果。现在我们已经证明β-carox，角黄素和蕃茄红素缺乏在其它两个类胡萝卜素中存在的两个环己烷基环，看来在氧化产物中存在这个分子组分对细胞抑制活性并不是必须的。表8.  充分氧化的蕃茄红素和β-carox对HCT116
      细胞系的细胞抑制效果的比较剂量        β-carox        氧化的蕃茄红素[μM]0            100                1002.5          86                 1007.5          80                 8515           51                 5522.5         18                 4130           8                  1845           1                  11细胞分化
通过观察细胞系的形态学变化来进行馏分对细胞分化诱导效果的定性分析，通过用单克隆抗体和流式细胞光度术测量特征蛋白质标志的表达来对该效果进行定量分析。在表9中，活性馏分以“+”表示，高活性馏分以“++”表示。
馏分对IMR32人成神经细胞系有广泛的活性。
意想不到的是，三对馏分(SG1、IG1；SG2、IG2和LSG、MSG)表现空前的能力(就目前我们所认识到的而言)—能诱导同一前体细胞系分化成两个不同的表型。也就是说，IMR32细胞系可能会变成胶元细胞或神经元细胞，这依赖于馏分的选择。后期的相似的馏分(阶段4；表9)诱导神经元形成的能力消失了。这些观察结果进一步证明β-carox含有多种具有不同类型活性的活性化合物。
对NB4人白血病细胞系的分化诱导限于早期的化学复合体IG2和活性很强的MSG馏分。只有一种馏分，SG3，能使拟正常的L6大鼠成肌细胞的细胞系发生分化。
与拟—正常的L6细胞系相比，在转化的细胞系特别是IMR32内的高活性，对以无毒的方式用转化细胞的选择分化来控制癌细胞的生长提供了支持。
表9.β-carox馏分的分化诱导效果阶段     馏分            细胞系a
                 IMR32b NB4    L61        SG1         +(n)    ne     ne
     IG1         +(g)    ne     ne2        SG2         +(n)    ne     ne
     IG2         +(g)    ++     ne2        LSG         ++(n)   ne     ne
     MSG         ++(g)   ++     ne3        SG3         +(n)    ne     ++3        F1          ++(n)   ne     ne
     F2          ++(n)   ne     ne4        F1.1        ++(g)   ne     ne
     F1.2        ne      ne     ne
     F1.3        ne      ne     ne
     酮醛        ne      ne     ne
a：ne＝无效b：括号里的字母表示(g)向胶元表型分化(n)向神经元表型分化。
在研究的第一期提供了β-carox对小鼠Bald/c/MK角质细胞系的分化诱导效果的定性分析数据。现在表10和11提供支持定量分析的数据。表10.角蛋白1和10在Balb/c/MK角质细胞中的表达样品                      A      IA对照                     90.3   4.4Ca++(1.8mM)               96.5   13.8RA(3μM)                   94.5   15.4β-Carox(30μM)           96.5   7.9注：A栏是免疫阳性细胞的百分数，即表达所指的角蛋白。IA栏代表每细胞表达的强度(任意单位)。RA＝全反式视黄酸
 表11.一组角蛋白在Balb/c/MK角质细胞中的表达
样品                           A     IA
对照                          93.7   60.7Ca++(1.8mM)                       97.6   87.2RA(3μM)                          94.3   129.8β-Carox(30μM)                  96.2   82.1注：参见表10的脚注。
角蛋白1和10是高分子量蛋白质，它们随着分化程序的进行而表达增加。在活体外的细胞培养中，通过暴露于含高浓度钙的培养基中来典型地诱导分化。在低钙培养基中培养的细胞保留增殖能力。如表10中所描述的，视黄酸可代替Ca，促进角蛋白1和10表达。在诱导Balb/c/MK角质细胞分化方面，β-carox也能代替钙。与视黄酸相比，β-carox的效果明显较小，是由于反应滞后而并非它的潜能较低。表11表明用一组其它的角蛋白也已得到了相似的结果。β-carox或其馏分与反应式视黄酸结合对a)(鉴定β-carox的细胞靶位和b)结合治疗的效果。
给出β-carox和它的一些馏分的细胞分化诱导性质，这不仅对将所得的结果与那些已知的全反式视黄酸相比较是有益的，而且对确定当β-carox和视黄酸在一起使用时对细胞的作用效果也是有益的，视黄酸被认为能调控几种哺乳动物细胞的分化能力。表12列出了定性分析数据，描述了β-carox和视黄酸各种结合对NB4和IMR32细胞系的作用结果。
当等潜能(equipotent)浓逍度的β-carox和视黄酸结合时，其分化诱导效应消失，然而，当两者之一的浓度相对另一个增高时，分化诱导又恢复了。令人惊奇的是，当两种试剂的浓度一起增高时，观察到分化的显著增强。
许多分化标志在分化过程中瞬时表达。在NB4细胞系中，蛋白CD33早期分化有关，然后是蛋白质CD11b-中间标志，最后是蛋白质CD15-高度分化的标志。因此，增强的分化的特征将是CD33标志表达和强度的降低才CD15标志表达和强度的增加。表12.氧化的β-carox和视黄酸混合物的分化性质视黄酸        β-carox           分化L              -               是-              L               是L              L               否H              L               是L              H               是H              H               是
                            (增强)注：字母L和H分别表示低和高浓度。短横线表示不含所指的试剂。
或者用个体馏分补充或者用其与全反式视黄酸的各种不同的两者等量混合物补充，进行了全反式视黄酸、β-carox和其一些馏分对这些特异的分化标志在NB4细胞中的表达水平的作用效果的定量分析，数据列于表13。结果显示β-carox不如视黄酸有效(β-carox需要较长的时间来完全实现其效果)。用视黄酸和β-carox、或其一些馏分结合处理，结果抑制分化(拮抗效应)，这已在上面β-carox(表12)中注意到了；但只与馏分IG2或视黄酸结合处理，分化继续进行(协同效应)。
β-carox和其一些馏分能干扰和强化视黄酸的作用，这一发现提示，因为视黄通过操纵核受体超家族(包括视黄酸类、甲状腺激素、维生素D3和孤儿受体)和与之相互作用，所以β-carox及其一些馏分能特异地定位该受体家族并在核DNA转录水平影响细胞。
在上面所示的一定情况下分化增强，可预期视黄酸和β-carox或馏分IG2的适当的结合将比单独使用视黄酸治疗更有效。这样讲很恰当，因为尽管事实上视黄酸在治疗复活(resurgent)癌时，其在失效前能提供5～6个月的缓解，视黄酸能很快变成用于治疗急性前髓细胞性白血病(APL)。我们的结果支持这样的可能性，即两种试剂的结合，特别是上面所示的那些，将推动白血病细胞更完全地进入成体终未分化路径，它们转变为增殖状态被阻断的可能性增加了。
表13β-carox(G)或其馏分单独和与全反式视黄酸结合对选择的标志在NB4细胞系中表达的作用效果(5天后)
        CD33           CD11b         CD15
    A   B   IA  IB A   B   IA  IB A   B   IA  IBRA     87.1    1.6    71.9     2.6     73.1     9.7G      95.8    4.8    73.8     1.0     32.1     0.9SG1    96.9    5.2    77.3     0.8     30.0     0.3IG1    94.6    5.0    71.5     1.0     28.7     0.6SG2    95.3    4.6    72.1     1.2     29.4     1.0IG2    87.8    4.6    54.6  10.9 1.3  4.5 15.0 30.0 1.3  4.1SG3    64.2    1.7    29.1     2.0     19.2     0.3G+RA   39.8    1.6    11.6     2.1     23.6     1.5SG1    35.1 15.5 0.7 3.1 31.7      1.6      64.7      2.1+RASG2    45.4 21.4 1.0 7.1 59.8      1.0      75.1      5.5+RAIG2    71.6    1.1    80.2     1.9     83.7     11.0+RA注：结合处理是：1μM RA和7.5μM G(或其馏分)。A栏和B栏代表免疫阳性细胞占细胞群的百分比(即带有特别蛋白质分化标志的)。B栏值对应于根据由标志表达强度确定的分化的明显细胞群的出现。IA栏和IB栏对应于每细胞的分化标志表达的平均强度(任意单位)。
β-carox通过与上面提到的受体家族相互作用而在核DNA转录平水影响细胞的假设被用视黄酸和β-carox结合处理另一细胞系IMR32所得的结果进一步支持。如同NB4的情形，可观察到拮抗或协同效应(依赖于两种试剂的浓度)(参见表7a)。例如，当RA和β-carox单独使用时，神经微丝，NF(表示细胞分化成神经元的标志)的表达分别在1μM RA和5μMβ-carox时最多，当它们以这样的浓度合在一起使用时，彼此抵消掉其效果，而NF的表达与对照相似(拮抗作用)。然而，当RA的浓度增加到2.5μM及β-carox的浓度降至3μM时，NF的表达比它们任何一方单独使用时都高(协同作用)。神经胶质原纤维酸性蛋白质，GFAP(表示分化趋向胶质细胞的标志)的表达，该表达被两种试剂增强，也需经与复合体相互作用。例如，视黄酸本身在其浓度低至1μM时最有效；依赖于β-carox的浓度，β-carox的存在会使此最适浓度上升至10μM(参见表13a)。表13a.β-carox(G)单独地和与全反式视黄酸结合对选择的
   标志在IMR32细胞系中表达的作用效果(48小时后)RA  β-carox    NF             GFAP[μM][μM]    ％    强度    ％    强度0      0     96.0    4.3    65.0    1.71      0     96.4   14.2    94.4   18.42.5    0     97.2   11.9    90.5    6.15      0     95.5    8.4    87.5    5.210     0     92.0    7.9    83.1    4.00      3     90.6    7.7    91.5    5.20      5     98.7   53.0    87.0    5.20    7.5     96.1    8.6    94.2    8.70     10     95.8    8.5    88.1    4.51      5     94.1    6.4    98.2   22.41    7.5     94.7    7.5    87.4    5.61     10     98.2   17.6    89.7    6.22.5    3     98.3   70.0    87.7    5.62.5    5     94.7    7.2    97.9   21.72.5  7.5     98.7   22.2    92.7   10.42.5   10     93.0    6.1    97.6   20.45      3     97.5   17.0    79.1    3.45      5     94.7    7.1    90.3    4.85    7.5     95.3    9.1    96.8   18.45     10     96.7   15.0    97.4   18.510     3     93.4    6.6    89.6    5.310     5     94.5    7.7    89.5    7.010   7.5     90.6    7.7    93.3    7.910    10     95.1    7.0    97.0   15.9β-carox对细胞周期的影响
β-carox-处理细胞群在细胞周期(G1期(静止细胞)，S期(DNA合成阶段)，和G2期(染色体加倍)的分布表明S期细胞的积累。没有G1阻断。这种效果是由于细胞周期的延长。发现β-carox处理细胞完成细胞周期需36小时，而对照的细胞周期和视黄酸-处理的相应样品分别为22小时和18小时。用流式细胞光度术分析来自同步化群体的细胞的各自的细胞内DNA浓度以得到该数据、在48小时中每隔5小时抽样，使用了两种类型的细胞：悬浮生长的细胞(NB4白血病细胞)和粘附生长的细胞(L6成肌细胞)。其它生物学性质
β-carox对降低细胞谷光甘肽的水平和提高癌细胞系对常规化学治疗试剂的敏感性的作用效果
因癌细胞获得对治疗的抗性而常使用典型的抗癌药物无效。在多数情况下，这种现象与谷光甘肽(GSH)的水平增高有关，谷光甘肽通过与药物的活性组分相作用保护癌细胞，从而协助从细胞中清除该活性组分。表14给出的数据表明β-carox能基本上降低DA-3小鼠乳癌细胞系的GSH的水平，该细胞与用于评估抗肿瘤活性的动物模型细胞系相同。表14内的结果与buthionine sulfoximine(BSO)的相应的作用效果相比很相符；BSO是GSH生物合成的毒性较强的抑制剂，目前它被常用作抗癌试剂进行试验。表14.      β-carox对DA-3小鼠乳癌细胞
        系的谷光甘肽水平的影响β-carox[μM]      GSH[nmol/mg 蛋白质]
      0              30
      5              38
      10             6
      20             3
细胞GSH降低的效果的益处体现于由β-carox和苯丙氨酸氮芥—典型的抗癌试剂处理的DA-3细胞的存活性的变化。表15的数据表明当存在低浓度的β-carox时苯丙氨酸氮芥的IC50急剧下降。(这些结果图解描述于图23a和23b)。
这样的效果提示β-carox与常规的抗癌试剂，如苯丙氨酸氮芥共同给药，将提高癌细胞对抗癌药物的敏感性。这将对下列两种方式之一有所帮助：a)相同的剂量可在癌细胞中获得较高浓度的药物；b)较低的剂量也能获得治疗效果，从而减少由苯丙氨酸氮芥一般的高毒性所带来的不受欢迎的副作用。表15.  氧化的β-胡萝卜素对DA-3小鼠乳癌
    细胞系模型由MTT试验估测的苯
     丙氨酸氮芥的IC50的作用效果
β-Carox(μM)      IC50苯丙氨酸氮芥     (μM)
     0.0              100
     5.0              40
     7.5              44
     10.0             6.6
     20.0             6.8在活体内β-carox的毒性和抗肿瘤活性β-carox在其它动物模型中的抗肿瘤效果。裸鼠异种移植片
β-carox抗肿瘤活性的评估已扩展为包括对由植入裸鼠的人卵巢癌细胞A2780所生成的肿瘤的生长的作用效果的研究。图24表明β-carox的腹膜内给药显著的抑制该侵染性相当强的肿瘤的生长(与DA-3模型相比)。β-carox馏分和相关物质的抗肿瘤效果
使用了小鼠D1-DMBA-3(DA-3)乳腺癌模型。示于图25a和25b的结果表明至少有几个馏分(馏分SG、F1、F2)的潜能与β-carox的一样或者比β-carox更具有潜能(馏分F1.1、F1.2、F1.3；注意使用较低的浓度)。醛酮(化合物1，图8)的潜能令人惊奇。
表16表示在试验的第28天估测的相对于对照(即，仅接受载体的组)的肿瘤体积。与前面对β-carox所观察到的相反，可看到至少在馏分F1的情况下存在剂量—反应效应。表16.    β-carox和其馏分对DA-3模型
         活体内的抗肿瘤活性样品        剂量             相对肿瘤大小
     [mg/kg体重]           (28天)β-carox     25                0.36SG1           25                0.30LSG           25                0.49F1            5                 0.72
          10                0.49
          25                0.37F2            25                0.33F1.1          10                0.30F1.2          10                0.47F1.3          10                0.47酮醛          10                0.4420％  乙醇    N/A               (1.00)
对同一模型，用两个馏分F1和F2，改变其施给方式。表17的数据表明这两个馏分当口服给药(P.O)时至少与当腹膜内(I.P)给药同样有效。表17.  馏分F1和F2的口服给药和腹膜内给药对
DA-3模型活体内抗肿瘤活性的比较样品             相对肿瘤大小at 25 mg/kg体重        (21天)F2 p.o.                 0.50F2 i.p.                 0.48F1 p.o.                 0.34F1 i.p.                 0.4320％  乙醇              (1.00)

Claims (22)

1.类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物，用于细胞分化的无毒诱导剂、细胞抑制剂和抗肿瘤剂，该混合物通过类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯化合物与氧反应形成，其中氧的消耗量，按分子基准计，比类胡萝卜素、视黄酸类，或相关共轭多烯化合物消耗的量大几倍。
2.如权利要求1所定义的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物，通过在有机溶剂中氧化而获得。
3.如权利要求1所定义的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物，由固态氧化获得。
4.自视黄酸类或视黄酸衍生的权利要求1的混合物，其中氧化是在提高氧压条件下进行的。
5.如权利要求1所定义的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物，是在不含催化剂、氧化引发剂或抑制剂下获得的。
6.如权利要求1所定义的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物，用于抵抗在哺乳细胞内表达的病毒基因的增殖和分化—封闭效应。
7.由权利要求1的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物的聚合组分。
8.权利要求1的类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯衍生的氧化混合物的制备方法，该方法包括类胡萝卜素、视黄酸类或相关共轭多烯化合物在有机溶剂里或在固态与氧反应，其中氧的消耗量，按分子基准计，比类胡萝卜素、视黄酸类、或相关共轭多烯化合物消耗的量大几倍。
9.根据权利要求8的方法，其中与氧的反应是β-胡萝卜素、蕃茄红素、角黄素或视黄酸在有机溶剂中进行的。
10.根据权利要求8的方法，其中与氧的反应是与固体的β-胡萝卜素、角黄素或视黄酸反应进行的。
11.治疗动物或人的肿瘤的方法，包括对需药动物或人以有效量的权利要求1的混合物给药。
12.用作细胞分化诱导剂、细胞抑制剂和抗肿瘤试剂的物质，根据分子量通过对权利要求1的混合物分级分离而获得该物质。
13.权利要求12的物质，其中分级分离通过溶剂沉淀来实现。
14.权利要求12的物质，其中分级分离通过大小排阻色谱来实现。
15.根据权利要求12的物质，按照极性来进一步分级分离或分离。
16.权利要求12的物质，其分子量小于大约700Da。
17.权利要求12的物质，其分子量小于大约300Da。
18.治疗动物或人的肿瘤的方法，包括对需药动物或人以有效量的权利要求12的物质给药。
19.权利要求18的方法，其中有效量是指对所述动物或人每公斤体重大约10至150mg。
20.根据权利要求11的方法，其中该物质与通常的抗癌试剂结合给药。
21.权利要求8的方法，其中与氧的反应是与蕃茄红素进行的。
22.治疗动物或人的肿瘤的方法，包括对需药动物或人有效量的2-甲基-6-氧代-2，4-庚二烯醛给药。
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