CN1046335A - 核糖体失活蛋白质及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从苦瓜属(Momordica),Bryonia.和Asparagus种植物提取的可用于制备免疫毒素的新的核糖体失活蛋白质。
Description
本发明涉及可用于制备免疫毒素的核糖体失活蛋白质以及它们的疏基衍生物。
由植物得到的核糖体失活蛋白质(RIPs)(Cancer Surveys 1,489,1982;J.Natural Products.48,446,1985,FEBS Letters.195,1,1986)使得真核生物核糖体的60s核糖体亚单位催化失活。它们可以是单链蛋白质(RIPS 1型)或双链蛋白质(RIPS 2型)、其中的一条链具有酶活性而另一条具有半乳糖特异性植物血凝素的性质。RIPs 1型较为常见,它存在于许多并且有可能是几乎所有植物的若干部分中,包括种子、根、叶和植物乳汁中,有时以多于一种的形式,可能为异构体形式存在。RIPs具有一个独特的N-糖苷酶活性,并且断裂28s rRNA中腺嘌呤4324的N-糖苷键,造成一种损伤,使得RNA可以在由α-sarcin诱导产生的断裂的邻近位点被苯胺裂解。这就使得核糖体不能与延伸因子1或2结合,因而阻碍了蛋白质的合成。尽管它们有许多结构上的相似之处,以及相同的酶活性,但是对于源于不同生物体的核糖体(源于植物、原生动物、昆虫及后生动物),RIPs具有不同的作用。
由于RIPs已用作为“免疫毒素”的成分,所以对它的兴趣愈来愈增加,“免疫毒素”是由连到抗体上去的毒性分子部分组成的杂化分子。免疫毒素将有希望用于消除有害细胞、肿瘤细胞、免疫活性细胞及寄生细胞。这些细胞被认为是可能的靶细胞(Cancer Immunol.Immunother 27,95,1988)。
对RIPs另外的兴趣是来自于它们的抗病毒活性,所有被试验的RIPs都能抑制植物和动物病毒的感染。实际上,首先发现的RIP 1型即商陆植物抗病毒蛋白质(PAP)最初纯化为一种抗病毒蛋白质。RIPs的这种性质归因于它更容易穿透到病毒感染的细胞中,因而使这些细胞的核糖体失活,并且阻碍了病毒的繁殖。可是最近发现,一种1型RIP,Trichosanthin,它通过一个显然与对核糖体作用无关的机制,来抑制人类免疫缺陷病毒的复制。
有用的是,得到一些用于制备免疫毒素的RIP、得到对一些RIPs具有抗性的细胞起活性作用的共轭物,并且防止因用药后的免疫反应造成的中和作用以及在共轭作用过程中一些RIPs失活所引起的问题。
现已发现可以从植物木鳖(Momordica Cochinchinensis)Bryonia Dioica e Asparagus Officinalis中得到的新的核糖体失活蛋白质。所述植物在先前已被研究过,没有认识到它们里面存在有本发明的蛋白质,这种蛋白质的特征是比从同一植物种中提取的已知的类似蛋白质具有显著更高的活性。例如从木鳖(一种产于印度的葫芦科植物)中提取的蛋白质与已知从一些苦瓜属(Momordica Genus)(苦瓜(Momordia Charantia))中提取的已知Momordine相比显示出人意料的不同特性。类似的是,从Asparagus officinalis L.(Biochem.J.216,617,1983)得到的三种糖蛋白是已知的,而从该同种植物中提取的本发明物质是具有不同生物和物理化学性质的蛋白质,本发明蛋白质的活性在于主要是在无细胞体系中有效地抑制蛋白质的合成:尽管对于大多数哺乳动物的细胞毒性很小,但是它们可以通过(用合适的化学试剂)-共轭到合适的载体(“Haptomers”)例如单克隆抗体上,而转化成为高度细胞毒性剂。如果所述载体对肿瘤细胞是抗原特异的,则可以使用所述新的RIPS进行肿瘤细胞的选择性破坏。
还发现本发明的蛋白质能够在用各种病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV1)忽性传染的培养细胞中抑制病毒的复制。
本发明还涉及所述RIPs的引入了疏基的衍生物,这种衍生物由式Ⅰ表示。所述衍生物与起始RIPs相比具有相同的或略低的抑制活性,因此,由于它们都是起始RIPs释放到细胞中的免疫毒素与抑制剂的合成中间体,所以对于制备抗体毒素结合物是有用的。
(其中Tox表示有关的RIP;Y、R和X的含义见下文)
按照常规方法使用双功能试剂得到式Ⅰ的衍生物,这些双功能试剂有例如3,3′-二硫代双丙亚胺酸二甲酯或下面所述的试剂:
N-琥珀酰亚胺基(succinimidy1)-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)
Y:
X:0.5-3(优选0.7-2,最好0.7-1.5)
2)-亚胺基硫烷(Iminothiolane)(Traut′s试剂):
X:0.5-2(优选0.5-1,最好0.7)
3)S-乙酰基-疏基-琥珀酐(SAMSA):
X:0.2-3(优选0.4-1;最好0.7-1)
本发明的RIPS将以下列名称表示:
木鳘因momorcochin(从木鳖种子中得到);bryodine-L泻根因(从Brionia dioica叶中得到);天门冬因1(asparin 1)和天门冬因2(asparin2)(从天门冬属Arparagus Officinalis种子中得到)。木鳖因和泻根因-L是糖蛋白,而天门冬因1和2是蛋白质。
通过常规的从植物中提取蛋白质的方法可以得到本发明的蛋白质,其特征在下文中被描述。本发明蛋白质因此可以通过包括以下各步的方法获得:
a)研磨和萃取种子或叶;
b)将提取物离心或过滤;
c)将步骤b的下清液在交联葡糖上进行色谱或进行透析;
d)按照合适的顺序进行离子交换色谱和/或凝胶过滤;
e)通过透析、冻干、色谱、沉淀或其它常规方法进行最终的纯化。
按照已知方法,借助于前面列举的试剂可以将所获得的蛋白质进行修饰。所得衍生物可以用于制备免疫毒素。用于治疗,例如用于治疗肿瘤,这时可以通过非肠道途经采用合适的药物剂型,以1至100mg剂量范围给药。
下面的实施例进一步阐述本发明。
实施例1
制备粗提取物
将种子在适当的研磨器中湿磨并萃取;将叶和根切成小片,并在萃取前过滤离心,回收汁液并萃取残余物。用0.14M氯化钠/5mM磷酸钠缓冲液PH7.4-7.5,在4-10℃下搅拌12小时进行提取。通过离心使提取物澄清;将按上述方法获得的叶和根的汁加至澄清的混合物中,然后再通过高g离心使其澄清。最终的澄清溶液(“粗提取物”)进行下一阶段的处理。用乙酸将提取物的PH值调至4.2-4.8,例如4.5;放置后形成沉淀,将其离心除去。将澄清的上清液(“酸提取物”)装在S-SepharoseR柱上柱用10mM的乙酸钠缓冲液PH4.5平衡,用同样的缓冲液洗涤并随后用5mM、PH7.5的磷酸钠洗至洗脱液为中性后,用1M氯化钠/磷酸钠缓冲液洗脱该柱。
用硫酸铵使澄清的洗脱液饱和;放置后,离心收集沉淀物。
将固体溶于5mM、PH7.0的磷酸盐缓冲液中;通过离心使溶液澄清,并将其分离成单一的RIPS(“S-Sepharose渗滤”):或者,所说的最后的提取物的制备也可以通过在4℃、在50-500体积的5mMPH6.5的磷酸盐缓冲液(至少全部更换两次)中透析至少24小时,离心除去每次透析过程中形成的沉淀,并将澄清的提取物进行分离。在“粗提取物”、“酸提取物”、“S-Sephazose渗滤液”这些步骤中,都要对每个RIP进行下文中所述的总蛋白质含量、比活度及总活度的测定。
实施例2
木鳖因(momorcochin)的分离与性质
A)提取与分离
按照实施例1中所描述的方法对1.2kg木鳖,一种产于印度的葫芦科种植物的种子进行提取。将最终溶液“S-Sepharose渗滤液”在Sephadex G-50R上进行色谱层析(“Sephadex G-50洗脱液”),然后装在用5mM、PH7.0的磷酸钠缓冲液平衡过的并配备有流动盒和280nm吸收探测器的CM-Sepharose Fast FlowR柱上。用平衡缓冲液洗柱直至该渗滤液在280nm不再有任何吸收为止。在20℃,用在相同缓冲液中的0至300mM线性梯度的Nacc洗脱渗滤速度为1.2升/小时,总体积为20升,收集450ml的组分,测定每一组分在260nm处的吸收及电导(ms:cm)并测定每一组分的抑制特异蛋白及全蛋白合成的活性,这些活性在下面的生物学特性中将描述。对洗脱液特性与已知木鳖丁(Momordin)(由Momordica Charantia获得:J、Chromatogr、408,235,1987)之间的比较证实了这两种物质的不一致性(木鳖丁:约从12至17升的洗脱组分,木鳖因:从6至7.5升的组分)。将含有木鳖因的组分合并并在水中透析至完全没有盐。将最终的溶液冻干,对比残余物(“木鳖因”)进行物理化学及其生物学特性分析。
B)物理化学性质
a)提取液的蛋白质含量:结果是根据以下方法得出的:
-Lowry的方法(J.Biol Chem 193,265,1956),(标准:-牛血清白蛋白)
-Kalb与Bernlhor的方法(Anal Biochem 82,362,1977)
-利用该提纯蛋白质在280nm的吸收进行分光光度测定(摩尔消光系数为0.8)。
b)相对分子量(rm):
根据下述方法测定:
-采用下述标记(括号中是相对的rm)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nature 227,680,1970):细胞色素C(12300)、肌红蛋白(17200)、碳酸酐酶(30000)卵白蛋白(45000)、牛血清白蛋白(66250)、卵转铁蛋白(76000-78000);
-通过用含有0.3m Nacl的20mM、PH7.5的磷酸钠缓冲液平衡过的Sephacry S-200R(95×1.6cm柱)进行凝胶过滤,在20℃洗脱速度为8ml/小时;标定(括号中为相对的rm):葡聚糖蓝(2×106)、牛血清白蛋白(66250)、卵白蛋白(45000)、胰凝乳蛋白酶原A(25000)、核糖核酸酶A(13700)。
C)按照Biochem、J.240,659,1986测定等电点、氨基酸的组成、氨基糖和中性糖的组成。
通过对中间提取物(实施例1中描述的)、对本实施例的中间提取物以及最终的冻干产品“木鳖因”使用上述方法,得出如下结果:不同纯化阶段的蛋白质(每千克起始种子的克/升)
-“粗提取物”-52.26
-“酸提取物”-36.00
-“S-Sepharose渗滤液”-19.48
-“Sephadex G-50洗脱液”-2.55
-“木鳖因”-0.74
即以木鳖因相对于首次提取的总蛋白质的产率约1%(重量),而相对于所提取的种子只有0.07%(重量)的产率。
最终产品的分子量:
凝胶过滤:31000
电泳:30700
电泳分析还显示存在着一个单一的化学物质。等电点>9(木鳖丁:8.60-Biochem.J.207,505,1982)
在280mm(A280)的消光值:0.7
氨基酸组成(mols/mole蛋白质)
(水解24,48和72小时的平均值;假定rm=30700下计算出的比率;误差<1%;IUPAC符号,括号内是木鳖丁的相应值-Biochem.J.207,505,1982;aa:氨基酸):
与木鳖丁组份的比较表明从相同苦瓜属的两个种中提取的这两种RIPS的组份不同。
中性糖的总含量:2.82%
(木鳖丁-上面所引用的Biochem、J、207-含量为1.74%的)。
糖组成(Mols/Mol RIP):
(假定rM=30700下所计算的比率,IUPAC符号;括号内是木鳖丁的相应值-上面所引用的Biochem J.207)
糖 : Mols/Mol RIP
Fuc : 1.42(0.90)
Glc : 0.98(0.80)
Man : 2.16(1.30)
Xyl : 0.98(0.50)
Glc-NH2: abs.(2.00)
在此例中,木鳖因与木鳖丁之间的意外区别是很明显的,
C)生物学性质
C.1.-对蛋白质合成的抑制活性:通过下述方法测定:
C.1.1-兔网状细胞溶解产物(Biochem.J.240,659,1986)。通过这种方法测定在有网状细胞成分(阳性线粒体部分)存在的情况下,RIPS抑制蛋白质合成的能力。
该方法是基于在有合适的辅助因子及天然氨基酸,其中的一个氨基酸用3H或14C标记混合物存在下,用所述亚细胞制剂进行体外诱导合成,在所获得的蛋白质中结合的放射活性的量随时间的关系可以估价该系统中蛋白质合成的速度以及诸如RIPS这类不同试剂对它的影响。
向含有100mM乙酸铵、2mM乙酸镁、1mMAT、0.2mMGTP、15mM磷肌酸、0.5mM中性氨基酸(除亮氨酸以外)的10mM、PH7.4的Tris/Hcl缓冲溶液中加入3μg肌酸激酶、89nCi的L-(14C)-亮氨酸和25μl兔网状细胞溶解产物(按照J.Biol.Chem.237,760,1982的方法制备),最终体积为62.5μl。在28℃保温5分钟后加入1ml 0.1MKOH中止反应。可以按照Biochem.J 174,491,1978中描述的方法测定所结合的放射活性。在相同的实验条件下,在保温之前加入梯量的RIP。这些结果以IC50(50%合成被抑制的浓度)或以单位和比活度(单位/毫克)表示。一个抑制单位(或活度单位)-能抑制50%蛋白质合成所需的RIP的量(以毫克表示),调正反应体积为1ml。
C.1.2-聚尿苷酸酯(Poly-u)-用兔或布氏锥虫网状细胞的核糖体进行苯丙氨酸的控制聚合(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.47.1588,1961)。此方法可以估价RIPs对聚苯丙氨酸合成的抑制活性,聚苯丙氨酸的合成是由从t-RNA酯化的苯丙氨酸起始,合成由仅仅由尿嘧啶核苷酸组成的合成多核苷酸Poly-U控制的。
此方法与前一种是相似的,只是用一种简化的多核苷酸代替兔网状细胞m RNAs控制复合蛋白质的合成,这种简化的蛋白质可以在有纯核糖体存在的情况下转译一个均聚物-聚苯丙氨酸的合成。
在最终体积为250μl、含120mM乙酸镁、2m MGTP的80mM、PH7.4的Tris/Hcl缓冲液中加入200μg Poly-U25Pmol14C-苯丙氨酰-t-RNA、20Pmol兔网状细胞核糖体或布氏锥虫核糖体(J.Protozool.35,384,1988)以及250μg(作为蛋白质)的按Biochem.J.176,265,1978中的“PH5的上清液”。在30℃保温30分钟后,测定(已引用的Biochem J.240)三氯乙酸不溶物的放射活性(即被聚合了的,被标记的苯丙氨酸的量)。然后在梯量RIPs存在下再进行该实验。通过线性回归分析计算IC50。
C.1、3-人细胞培养:在补充非必需氨基酸抗菌素及10%牛胎血清的RPMI 1640培养基中以单层培养物形式保持Hela、TG细胞(人输卵管癌)、JAR细胞(人绒膜癌)、人纤维细胞以及NB100细胞(人成神经细胞瘤细胞系)此方法可以通过比较毒素存在与不存在条件下的蛋白质合成来估价在不同的完整细胞系统中RIPs的细胞毒素的作用。
此方法包括在无牛胎血清的RPMI 1640培养基中、在存在不同量的RIPs条件下培养不同的细胞。18小时后,通过在RPMI 1640培养基中培养细胞1-5小时测定蛋白质合成活性,在培养基中不含血清和亮氨酸,而在每毫升培养基中加入0.1-1μCi的L-(14C)-亮氨酸。根据J.Biol、Chem 257,7495,1982的方法测定结合于细胞中的放射性。通过线性回归分析计算ID50(抑制50%蛋白质合成的剂量)。
C.2-对动物的毒性
对体重为27-32g的瑞士雌小鼠(Fed ad Libitum)以剂量范围是5.6-23.7mg/kg体重的6种不同的剂量给药,每种剂量6只动物,通过腹膜途径对纯RIPs的毒性进行评估:在48小时后通过线性回归分析计算LD50、对主要器官进行尸体剖验。
通过对实施例1、本实施例中的中间提取物以及对最终冷冻干燥产品(“木鳖因”)应用所述方法,得到下面结果:
组分网状细胞溶解产物时蛋白质合成的抑制活性(C.1.1):
组分 比活度 提取总活度※产率※※
(单位/mg×10-3)(单位×10-6
-“粗提取物” 16.8 877.2 (100)
-“酸提取物” 29.1 1049.6 119.6
-“S-Sepharose 27.5 536.6 61.2
渗滤液”
-“Sephadex 149.2 379.1 43.2
G-50洗脱液”
-“木鳖因” 285.7 211.9 24.0
※:指1.2kg起始种子
※※:指“粗提取物”假设为100。
必须指出木鳖因的比活度(211.9单位/mg×10-3)比木鳖丁的比活度(在J.Chromatogr.408,235,1987中报导为1.0526×10-3单位/mg)高约201倍。
在无细胞体系中蛋白质合成的IC50
方法 酶体系 IC50(nM)
C.1.1 网状细胞溶解产物 0.12
C.1.2 网状细胞的纯化核糖体 1.0
C.1.2 布氏锥虫的纯化核糖体 3,330
将用网状细胞溶解产物得到的木鳖丁(FEBS-Letters 195,1,1986)的IC50(0.06nM)与木鳖因的IC50相比较证明了这两种RIPs进一步的不同。
在Integer细胞中蛋白质合成的IC50(C.1.3)
(表中的值是两个不同测定的平均值;括号中是木鳖丁的ID50值;其中的符号同C.1.3中):
细胞 ID50(nM)
Hela 2,870(32,000)
TG 2,040
Jar 3,330
NB 320
人纤维细胞 109
动物毒性(C.2):LD50:24.5mg/kg体重。木鳖丁的LD50值为4.30mg/kg体重(上面引用的FEBS Letter)。
D)化学修饰
D.1-用SPDP:使用Biochem.J.240,659,1986中描述的方法。根据Biochem.J.173,727,1978中描述的方法测定引入的2-吡啶基疏基基团。将待疏基化的木鳖因溶解于PH9.0硼酸盐缓冲液中,浓度为10mg/ml。SPDP与木鳖因的摩尔比率、引入基团的数目以及IC50值列于表D.4中。
D.2-用2-亚胺基硫烷(Iminothiolane):使用Biochemistry 24,1517,1985中描述的方法。根据Arch、Biochem、Biophys 82,70,1959的方法测定引出疏基基团的数目。木鳖因是溶于50mM、PH9.0硼酸盐缓冲液中的1.5mM溶液。通过Sephadex G25进行凝胶过滤,纯化最终产品。2-亚胺基疏烷与木鳖因的摩尔比率和ID50值列于表D.4中。
D.3-用SAMSA:根据J.Am.Chem.Soc.81,3802,1959。根据Enzymology 25,457n1972的方法测定加入羟胺后引入疏基基团的数目。木鳖因是溶于125mM、PH7磷酸盐缓冲液的溶液。
D.4-测定改性RIPs的IC50
计算用网状细胞溶解产物(方法C.1.1)时这种改性产物的IC50值(以nM表示)。每个值是三个测定的平均值。
试剂 摩尔比 引入基团的 IC50
试剂/RIP(※) 数目 (nM)
无 0.12
SPDP 1.5∶1 1.13 0.12
SPDP 2.0∶1 1.44 0.20
2-亚胺基 1.25mM 0.73 0.10
硫烷
SAMSA 28∶1 0.70 0.10
(※):在上面所述实验条件下。
实施例3
泻根因-L(bryodine-L)的分离与性质
A)提取与分离
根据实施例1的方法提取12.5kg新鲜的Bryoniadioica-一种葫芦科种植物的叶,直到获得“S-Sepharose渗滤液”;按照实施例2的方法处理所述溶液,用Sephacryl-SrooR(“Sephacryl-SzooR洗脱液”)代替Sephadex G-50R;在如对木鳖因所述的条件下,在CM-Sepharose Fast FlowR上进行色谱后,混合活性组分(“CM-Sepharose洗脱液”),在水中彻底地透析,装入用10mM、PH8.0的Tris/HCl缓冲液平衡过的Blue SepharoseR柱上用0-200mM在相同缓冲液中的Nacl对色谱柱进行梯度洗脱,监测组分在280nm的吸收及传导率(ms/cm)。
混合从6.8-7.6升的组分并在水中彻底地透析,然后冷冻干燥(Bryodine-L)。
B)物理化学性质
所使用的方法是在实施例2的B中a、b、c段所公开的方法。
不同纯化步骤的蛋白质(g/12.kg叶)。
-“粗提取物” 293.75
-“S-Sepharose渗滤液” 1.74
-“Sephacryl-Sroo洗脱液” 0.41
-“CM-Sepharose洗脱液” 0.035
-“泻根因-L” 0.021
最终产品的分子量:
通过凝胶过滤: 27300
通过电泳 28800
电泳进一步表明冷冻干燥物是一个单一物质。
等电点:>9.5
在280nm的消光系数(A280):0.8
氨基酸组成(Mol/Mol(蛋白质)
(在24、48、72小时水解的平均值;假设rM=28800时所计算的比率,误差<1%;IUPAC符号;括号内容是Bryodine的相应值-Biochem.J.240,659,1986;aa:氨基酸)。
数据之间的比较表明这两种RIPs不同的组成。下面的数据进一步表明了这种显著的区别。对于泻根因(被引用过的Biochem.J.240)总含量为6.33%。
糖组成(mols/mol RIP):
(假设rM=28800时计算得的比率;IUPAC符号;括号内是泻根因的相应值-引用了的Biochem.J.240):
糖 mols/mol RIP
Fuc: 1.52(3.47)
Glc: 0.43(1.55)
Man: 2.52(6.27)
Xyl: 0.63(0.93)
C)生物性质
根据实施例1中C.1.1、C.1.2、C.1.3项所描述的方法测定生物性质,根据C.2的方法估价毒性。用兔网状细胞溶解产物时蛋白质合成的抑制活性(C.1.1):
比活度 提取总活度*
(单位/ (单位×
组分 mg×10-3) 10-6) 产率**
-“粗提取物” 0.6 170.0 (100)
-“S-Sepharose
渗滤液” 81.4 141.0 83.2
-“Sephacryl-
S200洗脱液” 123.0 50.0 29.7
-“CM-Sepharose
洗脱液” 251.9 8.7 5.1
-“泻根因-L” 362.3 6.7 3.9
*:指12.5kg鲜叶,
**:指“粗提取物”假设为100。
应当指出,叶中的泻根因-L的比活度(362.3单位/mg×10-3)分别比CM0.097M和CM0.112M组分的比活度高2.8倍和1.6倍,比在所引用的Biochem.J.240中所描述的泻根因(根中的CM0.100M组分)高2.56倍。无细胞体系中蛋白质合成的IC50
方法 酶体系 IC50(nM)
C.1.1 兔网状细胞溶解产物 0.09
C.1.2 网状细胞的纯化核糖体 1.3
C.1.2 布氏锥虫的纯化核糖体 3,330
在此例中无法与Biochem.J.240中所描述的数据比较,因为无论是在被结合的d.p.m或者ID50数据(与IC50的含义相同)都是用不同的核糖体制剂(源于小麦胚或源于Bryoniadioica)估价的
在完整的细胞体系中蛋白质合成的IC50(C.1.3):(这些值是两个不同测定的平均值)
细胞 TD50(nM)
HeLa 3,330
TG 770
Jar 3,330
NB 50
人体纤维细胞 800
动物毒性(C.2):LD50:10mg/kg体重
泻根因(被引用的Biochem.J.240):14.5mg/kg。
D)化学修饰
采用实施例2中D.1、D.2、D.3的方法进行化学修饰。测定修饰泻根因-L的IC50:
根据实施例2的方法C.1.1测定IC50、IC50以nM表示。每个值是三次测定的平均值。
摩尔比 IC50
试剂 试剂/RIP(*) 引入基团的数目 (nM)
无 0.10
SPDP 1.5∶1 1.03 0.11
SPDP 2.0∶1 1.32 0.12
2-亚胺基硫烷 1.25mM 0.70 0.09
SAMSA 28∶1 0.75 0.11
实施例4
天门冬因(asparin)1和2的分离与性质
A)提取与分离
按照实施例3的方法提取1kg Asparagus Officinalis种子,将CM-Sepharose提取液分成两种组分(“CM-峰1∶1.8至2.4升之间的组分;“CM-峰2∶3.3至3.8升之间的组分)。然后将这两种组分分别在两个Red-Sepharose柱上纯化,柱子用pH8.0的Tris/HCl缓冲液平衡,用0-300mM溶于相同缓冲液中的Nacl梯度洗脱。
将“CM-峰1”的纯化组分(“天门冬1”)冷冻干燥,而“CM-峰2”的纯化组分(“天门冬2”)首先通过Sepharyl S-200R柱上洗脱。
B)物理化学性质
使用实施例2中B项的a,b,c段所描述的方法。
不同纯化步骤的蛋白质(g/1kg种子):
-“粗提取物”-23.23
-“酸提取物”-13.58
-“S-Sepharose渗滤液”-7.55
-“Sephacryl S-200洗脱液”-2.04
-“CM-峰1”-0.159
-“CM-峰2”-0.229
-“asparin 1”(天门冬因1)-0.054
-“asparin 2”(天门冬因2)-0.049
最终产品的分子量:
天门冬因1:
通过凝胶过滤:29700
通过电泳:30500
天门冬因2:
通过凝胶过滤:28100
通过电泳:29800
电泳结果还表明这两种组分都是单一物质。
等电点:-天门冬因1∶8.7
-天门冬因2∶9.2
在280nm的消光系数(A280)∶1.0(两种都是)
氨基酸组成:(mol/mol蛋白质)
天门冬因1:
(在24、48、72小时水解的平均值:假设rM∶30500时计算得的比率;误差<1%;IUPAC符号;aa:氨基酸):
氨基酸 mol/mol 氨基酸 mol/mol 氨基酸 mll/mol
/pr. /pr. /pr.
Lys:15.3 Glx:24.3 Met:4.1
His:3.4 Pro:14.9 Ile:11.4
Arq:14.4 Gly:15.0 Leu:26.3
Asx:26.5 Ala:19.5 Tyr:9.8
Thr:13.9 半胱氨酸:3.3 Phe:6.3
Ser:11.0 Val:16.7 Trp:abs.
天门冬因2:
(在24、48、72小时水解的平均值;假设rM=29800时计算比率;误差<1%;IUPAC符号;aa:氨基酸)
氨基酸 mol/mol 氨基酸 mol/mol 氨基酸 mol/mol
/pr. /pr. /pr.
Lys:14.9 Glx:23.2 Met:1.1
His:2.9 Pro:15.4 Ile:11.5
Arg:14.8 Gly:15.2 Leu:26.6
Asx:27.2 Ala:18.8 Tyr:9.8
Thr:14.2 半胱氨酸:1.3 Phe:6.3
Ser:11.3 Val:16.9 Trp:abs.
中性糖的总含量:0%
对于三种糖蛋白(被引用的Biochem.J.216)其中含量为1.42%、1.20%、1.32%,其组成为:
糖 糖蛋白
峰 1 峰 2 峰 3
(mol/mol蛋白质)
岩藻糖 痕迹量 0 0
半乳糖 0.3 痕迹量 0.3
葡萄糖 2.1 2.1 2.1
甘露糖 0.4 0.3 0.3
c)生物性质
根据实施例2中C.1.1、C.1.2和C.1.3项的方法测定生物活性,根据C.2的方法测定毒性。用兔网状细胞溶解产物时蛋白质合成的抑制活性(C.1.1):
比活度 提取脂的总
组分 (单位/毫克 活性(单位
×10-3) ×10-6)*产率**
-“粗提取物” 7.9 183.5 (100)
-“酸提取物” 16.3 221.0 120
-“S-Sepharose
渗透物” 35.3 266.5 145
-“Sephacryl-S
200提洗液” 69.4 141.8 77
-“CM-峰1” 89.9 15.7 8.5
-“CM-峰2” 218,0 49.9 27.2
-“天门冬1” 112.4 6.1 3.3
-“天门冬2” 224.2 10.9 5.9
*:指1kg种子
**:指“粗提取物”,假定为100。
无细胞体系中蛋白质合成的IC50
天门冬因1:
方法 酶体系 IC50(nM)
C.1.1 兔网状细胞溶解产物 0.27
C.1.2 网状细胞的纯化核糖体 8.8
C.1.2 布氏锥虫的纯化核糖体 >3,330
天门冬因2:
方法 酶体系 IC50(nM)
C.1.1 兔网状细胞溶解产物 0.15
C.1.2 网状细胞的纯化核糖体 6.9
C.1.2 布氏锥虫的纯化核糖体 >3,330
在完整的细胞中蛋白质合成的IC50(C.1.3):(这些值是两次不同测定的平均值)
天门冬因1:
细胞 ID50(nM)
HeLa 3,330
TG 610
Jar 3,330
NB 180
人体纤维细胞 3,330
天门冬因2:
细胞 ID50(nM)
HeLa 3,330
TG 210
Jar 3,330
NB 180
人体纤维细胞 2,020
动物毒性(C.2):LD50∶20mg/kg体重(两者相同):
D)化学修饰
根据实施例2中D.1、D.2、D.3项的方法进行化学改性。测定修饰的天门冬因1和2的IC50值。
修饰的天门冬1和2的TC50的测定
根据实施例2中C.1.1的方法测定IC50,IC50以nM表示。每个值是三次测定的平均值。
天门冬因1:
试剂/RIP 引入基团 IC50
试剂 摩尔比 的数目 (nM)
NOne 0.27
SPDP 1.5∶1 1.03 0.41
SPDP 2.0∶1 1.32 0.67
2-亚胺基硫烷 1.25mM 0.70 0.28
SAMSA 28∶1 0.75 0.26
天门冬因2:
试剂 试剂/RIP 引入基团 IC50
摩尔比 的数目 (nM)
NOne 0.15
SPDP 1.5∶1 1.03 0.19
SPDP 2.0∶1 1.32 0.40
2-亚胺基硫烷 1.25mM 0.70 0.26
SAMSA 28∶1 0.75 0.21
实施例5
抗HIV活性
抑制HIV1在lymphoblastoid培养细胞中复制的活性。
将在标准条件下培养的VB细胞与已知浓度的HIV1病毒在37℃保温约60分钟。通过洗涤除去未结合到细胞中的多余病毒,然后在各个逐渐增加浓度(10-8和10-6M之间)的Bryodine或天门冬因1或天门冬因2或木鳖因下培养此细胞(大约1×105细胞/毫升)。
利用常规免疫测定法,通过分析病毒抗原P24的表达,测定培养物中HIV1的存在。
如通常一样,在最大病毒产生的周期里评估抗HIV1活性。
根据P24相对于对照的百分含量估价对复制的抑制。
所得结果表明泻根因、天门冬因1、天门冬因2和木鳖因在不削弱细胞的大分子合成的浓度下,能够抑制病毒的复制,抑制值为70-80%。
在被传染的单核细胞巨噬细胞中对HIV1的抑制
根据标准Ficoll梯度方法,从健康志愿者的外周血液中分离单核细胞/巨噬细胞。
如上所述将此细胞在HIV1感染后进行培养。
一旦根据Growe S.,Mills J.e Mc Grath M.1987 AIDS Res.Hum.Retrov.3 135-145的方法测出感染量,用浓度为10-8至10-6M的本发明RIPs处理该细胞,并且培养4天。通过荧光分析法测定P24抗原的表达,以及用相对于对照的百分数表示的抑制值。结果表明,本发明的RIPs在这些实验浓度下能抑制病毒的复制,其抑制值为70-80%。
Claims (5)
1、一种由木鳖植物种子制备名为木鳖因的核糖体夫活蛋白质的方法,该蛋白质具有下述特征:
--通过凝胶过滤的分子量: 31,000
--通过电泳的分子量: 30,700
--等电点: >9
--在280nM的消光系数: 0.7
--rM=30,700的氨基酸组成
mol/mol mol/mol mol/mol
氨基酸/Pr· 氨基酸/Pr·氨基酸/Pr·
Lys:15.1 Glx:21.7 Met:3.3
His:2.7 Pro:8.8 Ile:12.3
Arg:8.1 Gly:11.3 Leu:26.6
Asx:27.7 Ala:23.6 Tyr:11.4
Thr:18.4 半胱氨酸:abs. Phe:10.8
Ser:19.2 Val:18.7 Trp:abs.
--中性糖的总含量: 2.82%
--rM=30,700的糖组成 (mols/mol RIP)
糖 mols/mol RIP
Fuc: 1.42
Glc: 0.98
Man: 2.16
Xyl: 0.98
Glc-NH2: abs.
该方法包括:
a)磨碎并提取种子;
b)将提取物离心;
c)在交联葡聚糖上进行色谱;
d)离子交换色谱;
e)透析并冷冻干燥。
2、一种由Bryoria dioica叶制备名为泻根因-L的核糖体失活蛋白质的方法,该蛋白质具有下述特征:
-通过凝胶过滤的分子量:27,300
-通过电泳的分子量:28,800
-等电点:>9.5
-在280nm的消光系数 0.8
-rM=28,800的氨基酸组成
mol/mol mol/mol mol/mol
氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr.
Lys:10.8 Glx:18.9 Met:2.2
His:1.0 Pro:7.2 Ile:15.4
Arg:11.0 Gly:11.4 Leu:24.5
Asx:25.5 Ala:24.1 Tyr:11.7
Thr:17.4 半胱氨酸:abs. Phe:7.4
Ser:24.4 Val:14.4 Trp:abs.
-中性糖的总含量:2.72%
-rM=28.800的糖组成(mol/mol RIP)
Sugar mols/mol RIP
Fuc: 1.52
Glc: 0.43
Man: 2.52
Xyl: 0.63
该方法包括:
a)磨碎并提取叶;
b)将提取物离心;
c)在交联葡聚糖上进行色谱;
d)离子交换色谱;
e)透析并冷冻干燥。
3、一种由Asparagus officinalis种子制备名为天门冬因1的核糖体失活蛋白质的方法,该蛋白质具有下述特征:
-通过凝胶过滤的分子量: 29,700
-通过电泳的分子量: 30,500
-等电点: >8.7
-在280nm处的消光系数: 1.0
-rM=30,500的氨基酸组成:
mol/mol mol/mol mol/mol
氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr.
Lys: 15.3 Glx: 24.3 Met: 4.1
His: 3.4 Pro: 14.9 Ile: 11.4
Arg: 14.4 Gly: 15.0 Leu: 26.3
Asx: 26.5 Ala: 19.5 Tyr: 9.8
Thr: 13.9 半胱氨酸: 3.3 Phe: 6.3
Ser: 11.0 Val: 16.7 Trp: abs.
该方法包括:
a)磨碎并提取种子;
b)将提取物离心;
c)在交联葡聚糖上进行色谱;
d)离子交换色谱;
e)在Sephacryl S-200R上进行色谱。
4、一种由Asparagus officinalis种子制备名为天门冬因2的核糖体失活蛋白质的方法,该蛋白质具有下述特征:
-通过凝胶过滤的分子量: 28,100
-通过电泳的分子量: 29,800
-等电点: >9.2
-在280nm处的消光系数: 1.0
-rM=29,800的氨基酸组成。
mol/mol mol/mol mol/mol
氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr. 氨基酸 /pr.
Lys: 14.9 Glx: 23.2 Met: 1.1
His: 2.9 Pro: 15.4 Ile: 11.5
Arg: 14.8 Gly: 15.2 Leu: 26.6
Asx: 27.2 Ala: 18.8 Tyr: 9.8
Thr: 14.2 半胱氨酸: 1.3 Phe: 6.3
Ser: 11.3 Val: 16.9 Trp: abs.
该方法包括:
a)磨碎并提取种子;
b)将提取物离心;
c)在交联葡聚糖上进行色谱;
d)离心交换色谱;
e)在Sephaczyl S-200R上进行色谱。
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