JPH04504252A

JPH04504252A - リボソーム不活性化タンパク質及びその誘導体

Info

Publication number: JPH04504252A
Application number: JP2504924A
Authority: JP
Inventors: スティルペ，フィオレンツォ; バルビエリ，ルイギ; グロモ，ギアンニ
Original assignee: イタルファルマコ　エス．ピー．エイ
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-26
Publication date: 1992-07-30
Also published as: PL286574A1; CN1046335A; ES2055203T3; EP0465495A1; WO1990012034A1; DE69001701T2; SG52793G; ZA902484B; EP0390040B1; PH27547A; PL286575A1; EP0390040A1; NZ233106A; CA2050592A1; IL93924A0; DE69001701D1; AU5333490A; IT8919964A0; ATE89830T1; IT1229216B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム不活性化タンパクｌびその誘導体本発明は免疫毒素の製造に有用なリボソー・ム不活性化タンパク質及びそのスルフヒドリル化誘導体に関する。

植物由来のリポソーム不活性化タンパク質（ＲＩＩ”類）　（Ｃａｎｃ＋・）・５ｕｒｖｅｙｓ　Ｌ　４８９．１９Ｂ２；　Ｊ、　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　４Ｂ＋　４４６．１９８５゜Ｆ［ｉＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ月４．１．１９８６）は、真核生物リポソームの６ＯＳリポソーム　ザブユニッ［・を触媒的に不活性化する。これらのサブユニッ１−は一本鎖タンパク質（ＲＩＩ′１１型）または二本鎖タンパク質（ＲＩＰ　２型）のいずれかであり、−木の鎖は酵素活性を、他方はガラク［・−ス特異的１／クチンの性質を有している。ＲＸＰｌ型は頻度がより高く、種子、根及び葉及び乳液を含む、多数の恐らくはすべての植物の複数部位？１．二、時と１〜′Ｔ、複数の形態、恐らくはイソ型として存在する。Ｒ１１）類は特、異なＮ−グリコシダーゼ活性を有して、２８Ｓ　ｒＲＮＡのアデニン″″のＮ−グリコシド結合を開裂させて、α−ザルシン（Ｓ訂ｃｉｎ）に依って誘発された開裂の隣接部位に、アニリンに依るＲＮＡ開裂を起こさ（する変異を導入する。これに依ってリポソームの延長因子１または２−・の結合を不可能として、結果とし７てタンパク質合成を阻害する。

その構造に多数の類似点及び同一酵素活性があるにも拘らず、ＲＩＰ類は種々異なった生物（植物、ブ■］ｌ・シア、昆虫及びその他の後生ｖｊ物）から得られたりボヅーム乙、二異なった作用を示す。

ＲＩＰ類に対する関心は、これが抗体に結合した毒性部分を構成する雑種タイである゛免疫毒素′の成分とし２て使用されて来たので増大＋、て来た。免疫毒素が、標的の可能性ありと考えられる有害細胞、新生物、免疫能細胞及び寄生細胞を排除するに有用である事が望ま１ノい（Ｃａｎｃｅｒ　ＩＭｍ＋、＋ｎｏ１．　Ｉｉｍｕｎｏｔｌｉｅｒ、　２ユ。

９５、１９８８）。

１？ＩＰ類に対する関心は更にその抗ウィルス活性に由来する。

試験したすべてのＲＩＰ頬は植物及び動物ウィルスの感染力を阻害ｊまた。実際に、最初に確認されたＲＩＰ　ｌ型は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（Ｐ／ＩＰ）であり、最初に抗ウイルスクニ／バク質として卑☆製された。このＲＩＰ類の性質は、ウィルスに感染１−７だ細胞に容易に侵入して、その結果リボソーノ、の不活性化を起こさ（ｔで、ウィルスの増殖を阻止する為とされていた６しかしながら、最近ＲＩＰ　ｌ型であるトリコザンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎ−ｔｈｉ＋ｖ）が、リポソームへの作用と請求外見１：別個の機構（ご依って、ヒト免疫不全ウィルスの複製を阻害する車が見出された（６ｏ）。

免疫毒素の羽Ｈに数種のＲＩＰ類が入手可能で、若干のＲＩＰ類に抵抗性の細胞に対ｊ〜て活性の抱合体を所有し、また投与後に免疫反応に依って中和される事、並びに抱合の過程で若干のＲＩＰ類の不活性化する事から生じる問題を迂回する等は有用である。。

丘９−１９目−ｉ−り卯９扛１ｎｃ−リ−（−ｖ９−リ−１ｊ−５−・β肢何− Ｕ）１垣り、及びバー朗−（那閃ｐＱ−ｉｃｉ−ｎｑｊｉｓから得られる新規リポソーム不活性化タンパク質が見出され）、＝、上記植物Ｌ４既ら一研究されてはいるが、同種植物から抽出された既知の類似タンパク質より、著し２く高慶の活性１、；依って特徴づＵられる、本発明のクンバク質の存在シラ。認められていなかった０例えば、インド原産のウリ科植物のＭｏ＋ｍｏｒｄ　１ｃａｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓから抽出されたタンパク質は、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ属（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ　）から抽出された既知のモモルディン（ｍｏｍｏｒｄｉｎｅ）とは驚くべき事に異なった特徴を示す、同様に、３種類の糖タンパク質がハ以圧旺匹」１■０１出匡り、より得られているが（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２１５１．６１７．１９８３）　、同種植物から抽出された本発明の物質は、異なった生物学的及び物理化学的特徴を有するタンパク質である０本発明のタンパク質の活性は、大部分の哺乳類細胞に対しては毒性が低いが、主として無細胞系に於いては強力なタンパク質合成阻害をなし、適当な化学物質と共に適当な担体じハプトマー（ｈａｐｔｏｍｅｒ類）”）、例えばモノクローナル抗体との抱合に依って強力な毒性物質に変換される。

もし前記担体が腫瘍細胞に抗原特異的であれば、前記の新規ＲＩＰ類は後者の選択的破壊に使用出来る。

本発明のタンパク質が、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ　１）を含む数種のウィルスに重度に怒染させた培養細胞中に於けるウィルス複製を阻害出来る事を見出した。

本発明はまた式Ｉで示される、前記ＲＩＰ類にスルフヒドリル基が導入された誘導体にも関する。前記誘導体類は出発物質であるＲＩＰ　類と同等ないしやや低い阻害活性を有しており、従ってこれらは共に免疫毒素及び阻害剤の合成中間体であり、後者は細胞中に放出されるので、抗体−毒素抱合体の形成に有用である。

（１）　を有する）。

式Ｉで示される誘導体は、例えばｄｉｍｅｔｈｙｌ　３．３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅまたは以下に示す試剤の様な、二価性試剤を使用して常法で得られる。

１）　Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−１）Ｖｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐＮ−５ｕｃｃｉｎｉ　（ＳＲＤＰ）２）　２−１ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　（トラウド（Ｔｒａｕｔ）試剤）：に好ましくは０．７）３）　Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（ＳＡＭＳＡ）：も好ましくは０．７〜１）本発明のＲＩＰ類は以下の名称で示される：モモルコチン（ｍｏｍｏｒｃｏｃｈｉｎ）（Ｍｏｏ＋ｏｒｄｉｃａ　ｃｏｃｈｉｎｅｎｓｉｓの種子より）；ブリオダインーＬ　（ｂｒｙｏｄｉｎｅ−Ｌ）　（Ｂｒ　ｏｎｉａ　ｄｉｏｉｃａの葉より）；アスパリン１　（ａｓｐａｒｉｎ　１）及びアスパリン２　（ａｓｐａｒｉｎ２）（ハ匹」ふ１Ｊ工国匡吐旦の種子より）、モモルコチン及びブリオダインーしは糖タンパク質であり、アスバリン１及びアスパリン２はタンパク質である。

以下に示す特徴を有する本発明タンパク質は、植物からタンパク質を抽出する常法で得られる。本発明のタンパク質は従って以下の方法の組合せで得られる：ａ〕種子または葉の磨砕及び抽出；ｂ）抽出物の遠心分離または濾過；Ｃ）架橋結合デキストランを用いるクロマトグラフィーまたはｂ）工程の上清の透析；ｄ）イオン交換クロマトグラフィー及び／または適当な順序のゲル濾過；ｅ）透析、凍結乾燥、クロマトグラフィー、沈澱またはその他の常法に依る最終精製。

この様にして得られたタンパク質は、先に挙げた試剤に依って、公知の方法で修飾される。得られた誘導体は、次いで治療に使用可能の免疫毒素の製造に使用される、例えば、腫瘍の治療には、適当な製剤を用いて１〜ｌｏＯｍｇの用量範囲で非経口的に投与される。

以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明する。

１直燃−上粗亘上生夏製盈種子は湿式で適当な磨砕器を用いて磨砕し、抽出した一葉及び根は細切し、抽出前に濾過遠心分離し、搾汁を採取し、残渣を抽出した。抽出はｐＨ７，４〜７．５の５ｎＭリン酸緩衝液中の０．１４Ｍ塩化ナトリウムでかき混ぜながら１２時間、温度４〜１０°Ｃで行った。

上記の様にして得た葉及び根の搾汁は遠心分離して澄明とし、これを合して、再度高速遠心分離して澄明とした。最終澄明液（”粗抽出液”）は、以下の和処理に付した。抽出液は酢酸を加えてｐ）Ｉ　４．２〜４．８、例えばｐＨ４，５、とし；放置後、生成した沈澱は遠心分離して除いた。澄明な上清じ酸性抽出液” ）はＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ”カラムに付して、ｐＨ４，５の１０　ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡とした。カラムを同一の緩衝液、次いでｐｕ　７．５の５　ｍＭリン酸ナトリウムで流出液が中性となる迄洗浄した後、カラムをリン酸緩衝液中の１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。

澄明な溶出液を硫酸アンモニウムで飽和した後に放置し、沈澱物は遠心分離で採取した。

固形物はｐＨ７，０の５　ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ、得られた溶液は遠心分離して澄明とし、単−ＲＩＰ　（”Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出液”）の分離段階に付した。別法として、前記最終抽出液は、粗抽出物を少なくとも２４時間、４°Ｃで５０〜５００倍容量のｐ）！　６．５の５　ｉＭリン酸緩衝液に対して、少なくとも２回全溶液を交換して透析して得る事も出来る。透析中に形成した各沈澱物は遠心分離で除き、澄明抽出液は次いで単離操作に付した。”粗抽出物 ”、”酸性抽出物”、”Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出液”の各段階中に、以下に記載する各ＲＩＰに就いて総タンパク質含有量、比及び総活性を測定する。

１施１モモルコチンの　び　゛Ａ）皿Ｒ反グ皇風インド原産のウリ科植物のＭｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓの種子１．２　ｋｇを実施例１に記載の方法で抽出した。最終溶液である”Ｓ −５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出液２は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０”カラムを用いてクロマトグラフィーに付しく’５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０溶出液”）、次いでｐ）１７．０の５１１ＩＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡とし、フローセル及び波長２８０　ｎｍの検出器を取り付けたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ”に付した。カラムは浸出液がもはや２ＢＯｒ＋ｓ＋の吸収を示さなくなる迄、平衡緩衝液で洗浄した。カラムは、同一緩衝液中で、０〜３００　ｍＭ濃度勾配の塩化ナトリウム溶液を用い、溶出速度１．２Ｌ／時間、２０°Ｃ１で総容量２０　Ｌと成るまで各４５０　ｍ１分画を採取しながら溶出した。各分画は２６０　ｒ＋＋＋＋の吸収と伝導率測定（＋ｅＳ：ｃ＋ｓ）で検定した。各分画は、また以下に示す生物学的特徴で示される特異的及び総タンパク質合成阻害活性も測定した。

溶出パターンを既知のモモルディン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）　（Ｍｏｎｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａより抽出、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　４０８．２３５．１９８７）と比較して、両物質に一致はなかった（モモルディン：溶出分画１２〜約１７しいモモルコチン（ｗ＋ｏｍｏｒｃｏｃｈｉｎ）　：溶出分画６〜７．５Ｌ）。モモルコチンを含有する分画を集めて、水に対して完全に塩分を除くまで透析した。最終溶液は凍結乾燥して、残留分（″モモルコチン”）は物理化学的性質及び生物学的特徴を分ａ〕抽出液のタンパク質含有量：結果は以下の方法に依って得たニー　Ｌｏｗｒｙ法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９３．２６５．１９５１）　（標準：ウシ血清アルブミン）、 −Ｋａｌｂ及びＢｅｒｎｌｈｏｒ法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、井、　３６２．１９７７）、−スペクトル測定、モル吸収係数０．８の精製タンパク質の２８０ｎｏ＋の吸収を使用）ｂ）相対的分子量（ｒＭ）　：以下に依って測定したニーポリアクリルアミド　ゲル上で以下の標準物質（括弧内は相対的ｒＭ）を使用した電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ　２ｇ１．６８０．１９７０）で測定：チトクロームＣ（１２３００）、ミオグロビン（１７２００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３００００）、卵白アルブミン（４５０００）　、ウシ血清アルブミン（６６２５０）　、オボトランスフエリン（７６０００〜７８０００）　；−５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００”　（９５ｘ　１．６　ｃｍカラム）を使用し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７，５の２０　ｔａＭ　リン酸ナトリウム緩衝液で平衡とし、２０℃の流出速度８ｍｌ／時間のゲル濾過；校正（括弧内は相対的ｒＭ）　：デキストラン　ブルー（ｄｅｘｔｒａｎｂｌｕｅ）（２ｘ　１０ ”）　、ウシ血清アルブミン（６６２５０）　、卵白アルブミン（４５０００）　、キモトリプシノーゲンＡ　（２５０００）、リボヌクレアーゼＡ　（１３７００）。

Ｃ）等電点、アミノ酸組成、アミノ糖及び中性糖組成は、Ｂｉｏ−ｃｈｅｔａ、　Ｊ、、２４０．６５９．１９８６に依って測定。

前記方法を（実施例１に示す）中間抽出物から本実施例及び最終凍結乾燥製品” モモルコチン”に通用して、以下の結果を得た：々の　１　に　しる　ンバク　のＡｋｎｌ工Ｌニーし粗抽出物−−−−−−−−−−−−−−−５２，２６−″酸性抽出物”−− −−−−−−−−−−−３６，００”Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出物−−−−− −１９，４８−”５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０溶出液−−−−−２，５５−”モモルコチンー−−−−−−−−−−−０，７４即ち最初に抽出した総タンパク質に対するモモルコチンは約１重量％の収率で、種子抽出物に対して０．０７重量％である。

の　ニゲル濾過に依る：　３１０００電気泳動に依る：　３０７００電気泳動は単一化学物質の存在も示す。

蔓！立＞　９　（モモルディン：　８．６０−Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　’ＩＪ）３−、５０５゜２８０　ｎ＋ｗの　Ａ２８０：０．７ヱ４　（ｃｍｏ　ｌ　ｓ　／ｌａｏ　ｌ　ｅタンパク質））２４．４８及び７２時間加水分解物の平均値；　ｒＭ　＝　３０７００と推定して算出した比率；誤差くｌχ；国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の記号を使用、括弧内の値はモモルディンに対して見出された４ｉｉ　−Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２０７．５０５．１９Ｂ２　；ａａ　二アミノ酸を示す）＝Ｌｙｓ：　１５．１（１１，４）　Ｇｌｘ：　２１．７（２４，８）　Ｍｅｔ：　３．３（７，０）Ｈｉｓ：　２．７（４，７）　Ｐｒｏ：　８．８（９，０）　Ｉｌｅ：　１２．３（１３，８）Ａｒｇ：　８．１（１２，６）　Ｇｌｙ：　１１．３（１５，８）　Ｌｅｕ：　２６．６（２１，２）Ａｓｘ：　２７．７（２７，６）　Ａｌａ：　２３．６（２４，６）　Ｔｙｒ：　１１．４（１３，４）Ｔｈｒ：　１８．４　（１６，２）　半Ｃｙｓ：　ａｓｓ　（２，２）　Ｐｈｅ：　１０．８　（８，４）Ｓｅｒ：　１９．２（１６，８）　Ｖａｌ：　１８．７（１３，７）　Ｔｒｐ：　ａｂｓ、　（１，０）モモルディンの組成との比較は、間溝のＭｏｍｏｒｄｉｃａの２種から抽出した２種のＲＩＰが異なる組成である事を示した。

−５１１！−１１１１ニー１１（１１−にｌｅニニｔ：にニー１１１１にｍ二二２．８２ス；（モモルディンーＢｉｏｃｈｅ＋ｓ、　Ｊ、　２０７、上記−は含有量１．７４％で組成比はｒＭ・３０７００と推定して算出、国際純正及び応用化学連合（１ｔｌＰＡＣ）の記号を使用；括弧内はモモルディンの対応値−Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｊ、２０７．上記）：Ｉｉ　ｍｏｌｓ／ｍｏｌ　ＲＩＰＦｕｃ　：　１．４２　（０，９０）Ｇｌｃ　：　０．９８　（０，８０）Ｍａｎ　２．１６　（１，３０）ｘｙｉ　・　０．９８　（０，５０）Ｇｌｃ−ＮＨｔ　：　ａｂｓ、（２，００）この場合、モモルコチンとモモルディンとの間には予想外の差も明かであった。

Ｃ）生立ヱ五豊徽Ｃ，１−タンパク質合成の阻害活性は以下に依って実施した：Ｃ，１，１−ウサギ網状赤血球溶解産物（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２４０．６５９゜１９８６）　、本方法に依り、ＲＩＰ類の網状赤血球構成成分（ミトコンドリア以降の分画）の存在下のタンパク質合成阻害能力を測定した。

本方法は、いずれか一方が３Ｈまたは１４ｃで標識された適当な補助因子及び天然アミノ酸混合物の存在下に、前記細胞レベル以下の調製品に依る”試験管内” 合成の誘導を基礎としている。

得られたタンパク質に取り込まれた放射活性の量は、時間の関数で、本システムに於けるタンパク質合成速度の測定及び、例えばＲＩＰ類に依存する異なった試剤の作用の測定を可能とする。

酢酸アンモニウム１０ｈＭ　、酢酸マグネシウム２＋ｓＭ、ＡＴ　１　ａ＋Ｍ、ＧＴＰ　Ｏ，２ｍＭ、クレアチン　リン酸１５　ｍＭ、（ロイシンを除く）天然アミノ酸０．５　ｍＭを含有する、ｐｉ（７，４のトリス塩酸緩衝液１０　ｍＭを、タレアチンキナーゼ３μｓ、Ｌ−（”　Ｃ）−ロイシン８９ｎＣｉ及び（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２３７．７６０．１９８２に従って調製した）ウサギ網状赤血球溶解産物２５μｌと混合して、最終容量を６２．５μｍとした。

２８℃で５分間培養後、反応は０．１Ｍ水酸化カリウム１ｍｌを添加して終了させた。取り込まれた放射活性の測定は、Ｂｉｏｃｈｅ−、Ｊ、　１７４．４９１．１９７８に記載の方法で行った。測定可能量のＲＩＰ類を、同一実験条件で培養前に添加した。結果はＸＣＳ。

（５０％合成阻害濃度）または単位及び比活性（単位／ｍｇ）で現した。阻害単位（または活性単位）、即ちＲＩＰ量（ｍｇ）は、反応容量を１ａ＋１に調整した際の、タンパク質合成を５０％阻害するに必要な量である。

Ｃ，１，２−ポリウリジル化（ｐｏｌｙ−Ｕ）−ウサギまたはｋＤｌ巨阻駐ｂｒｕｃｅｉの綱状赤血球からのリポソームのフェニルアラニンとの定方向重合（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　４７．１５８８．１９６１）。

本方法は、合成ポリヌクレオチドポリ−Ｕに依って方向づけられたウラシルヌクレオチドのみで構成され、ｔ−ＲＮＡエステル化フェニルアラニンから始まる、ポリフェニルアラニン合成へのＲＩＰ類の阻害活性の評価を可能とする。

本方法は既知の方法に類似しているが、複合タンパク質の合成に向けられたウサギ網状赤血球−ＲＮＡ類の代わりに、精製リポソームの存在下にホモポリマーであるポリフェニルアラニンの合成の翻訳に用いられる単純化されたポリヌクレオチドを使用する。

リス塩酸緩衝液８０　ｆｆ１Ｍを、ポリ−Ｕ２００μｇ、′４Ｃ−フェニルアラニルーｔ−ＲＮＡ　２５　ｐｍｏｌ、ウサギ網状赤血球リポソームまたは江ｕａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉリポソーム（Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、　３５．３８４．］、９８８）の２０　ｐｍｏｌ　、”ｐＨ５の上滑”　（タンパク質として）２５０μｇに、最終容量２５０　ｕ　ｌと成る様に、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７６、２６５．１９７８に従って添加した。３０°Ｃで３０分間培養後、トリクロロ酢酸不溶性放射活性（即ち重合化標識フェニルアラニン）を測定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、２４０、引用済み）。実験は測定可能量のｌ？ＩＰ［の存在下に反復実施した。ＩＣ５゜は線形回帰分析に依って算出した。

Ｃ，１，３−ヒト細胞培養：　ＨｅＬａ　ＴＧ細胞（ヒト卵管癌）　、ＪＡＲ細胞（ヒト絨毛膜癌）、ヒト繊維芽細胞、及びＮＢ１００細胞（ヒト神経芽細胞腫系統）は、非必須アミノ酸、抗生物質及び１０％ウシ胎仔血清を補給したＲＰＭＩ　１６４０培地中で単層培養して維持した。

本方法は、各種完全細胞系に於けるＲＩＰ　類の細胞毒性作用の評価を、毒素の存在または不存在下で、タンパク質合成を比較する事で可能とする。

本方法はウシ胎仔血清無添加のＲＰＭＩ　１６４０培地中で、種々の量の＋ｎｐ　ｍの存在下に、種々の細胞を培養する事から成っている。１８時間後、タンパク質合成活性を、血清及びロイシン無添加で、Ｌ−（”Ｃ）−ロイシンの０．１〜１　ｉｔ　Ｃｉ／＋１を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地中で１〜５時間培養する事で測定した。細胞に取り込まれた放射活性は、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７．７４９５．１９８２の方法に依って測定した。■Ｄ、。（タンパク質合成の５０χ阻害用量）は線形回帰分析に依って算出した。

Ｃ，２−勤Ｊ１≧於旦ｊ−１１ＲＩＰ類の純品の毒性は体重２７〜３２　ｇで、飼料を自由に摂取させたスイス雌マウスに於て、用量５．６〜２３．７　ｍｇ／ｋｇ体重を、６種の用量で各６匹を用いて腹腔内投与に依って評価した。ＬＤ、。は４８時間後に線形回帰分析で算出した。剖検は主要臓器に就いて実施した。

前記方法を実施例１の中間抽出物、本実施例の産物及び最終凍結乾燥産物（”モモルコチン″）に適用して、以下の結果を＝”粗抽出物”　１６．８　Ｂ７７．２　（１００）−２酸性抽出物”　２９．１　１，０４９．６　１１９．６−　 ”Ｓ−３Ｂｐｈａｒｏｓｅ浸出物”　２７．５　５３６．６　６１．２−’５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０溶出液”１４９．２　３７９．１　４３．２−”モモルコチン”　２Ｂ５．７　２２１．９　’２４．０本　：出発種子１．２　ｋｇに基づく。

牢本：　”粗抽出物”を１００と推定して参照。

モモルコチン（ｍｏａ＋ｏｒｃｏｃｈｉｎ）の比活性２１１．９単位／Ｉｇ　Ｘ　１０−’は、（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　４０８．２３５．１９８７に１．０５２６　ｘ　１０−３単位／ｌ１ｇと報告された）モモルディン（＠ｏｗｏｒｄｉｎ）の約２０１倍である。

短　二に　しる　ンパク　ム　のＩＣＣ，１，１ｖ４状赤血球溶解産物　０．１２Ｃ，１，２１ｉｉ状赤血球より精製したリポソーム　１．ＯＣ，１，２Ｔ、ｂｒｕｃｅｉより精製したリポソーム　３，３３０゜網状赤血球溶解産物（０，０６ｎＭ）より得たモモルデイン（ＦＢＢＳ−Ｌｅｔｔｅｒｓ　Ｊｊ３Ｊ、　１．１９８６）のｘｃｓｏを、モモルコチンの値と比較すると、２種のＲＩＰの間にはさらに分化が明かである。

台　に・しる　ンパク　人　のＩＣ（Ｃ，１，３）　：（平均値は２回の異なった測定の平均値であり、括弧内の１０５゜はモモルディンを示し、記号はＣ，１，３に記載した）。

細胞　ｔＯＳ。（ｎＭ）ＨｅＬａ　２，８７０　（３２，０００）ＴＧ　２，０４０Ｊａｒ　３．３３ＯＮＢ　３２０ヒト繊維芽細胞　１０９に　しる　Ｃ０２：　ｔ、ｏｓ。：　２４．５　Ｂ／ｋｇ体重。モモルデインのＬＤｓｏは４．３０　＋ｎｇ／ｋｇ体重である（ＦＥＢＳ−Ｌｅｔｔｅｒ、上記）。

Ｄ）北ｊす壇虻腹０．１−４Ｊ！ｌに就いて：　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　Ｊ、　）段、　６５９　（１９８６）に記載の方法を使用した。導入した２−ｐＶｒｉｄｙｌｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ基の測定は、Ｂｉ。

ｃｈｅ＋ｓ、　Ｊ、ＪＪ、３．７２７（１９７８）の方法に依った。スルフヒドリル化するモモルコチンはｐＨ９，０のホウ酸緩衝液に濃度ＩＱａ＋ｇ／＋＋＋１　となる様に溶解した。５ＰＤＰのモモルコチンに対するモル比、導入された基の数、及び■ＣＳ。はり、４の表に記載した。

Ｄ、２　２４ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅに−°いて：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４．１５１７（１９８５）に記載の方法を使用した。導入したスルフヒドリル基の数はＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２．７０（１９５９）の方法に従って測定した。モモルコチンはｐ）ｌ　９．０の５０　ｍＭホウ酸緩衝液中に１．５　ｍＭ溶液とした。最終生産物の精製には５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５に依るゲル濾過を要した。２−　ｌｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅとモモルコチンのモル比及びＩＣ，。

はり、４の表に記載した。

０．３−　ＳＡＭＳＡに就いて：　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　、Ｉｌｌ、　３８０２　（１９５９）記載の方法に従った。導入したスルフヒドリル基の数は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２５．４５７ｎ　（１９７２）に従って、ヒドロキシルアミンの添加後に測定した。モモルコチンは、ｐＨ７のリン酸緩衝液１２５　ｍＭ溶液とした。

０．４−シたＲＩＰ　のＩＣの゛修飾した生産物のＩＣ５゜値は網内赤血球溶解産物で測定しく方法Ｃ，１，１，）　、ｎＭで現した。各値は３回の測定の平均値である。

反応試剤　試剤／ＲＩＰモル比（＊）導入した基の数　ｒｃｓ。（ｎＭ）なし　０．１２ＳＰＤＰ　１．５　：　１　１．１３　０．１２ＳＰＤＰ　２．０　：　１　１．４４　０．２０２−ｆｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　１．２５１１Ｍ　Ｏ，７３０，１０Ｓ１０５Ａ　２８　：　１　０．７０　０．１０１に勇−１ブ１オ゛イン−Ｌ　ｂｒ　ｏｄｉｎｅ−Ｌ　の　び　゛の”Ａ）ｆｆ−１１ウリ科植物敗ｎ紅しム娃組の新鮮葉１２．５　ｋｇを実施例１の°Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出物″を得る過程まで同様に抽出し、得られた溶液は実施例２と同様に、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０”の代わりに５ｅｐｈａｃｒｙｌ−５２００ ”を使用して、”５ｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ　２００溶出液１を得、モモルコチンに就いて実施した方法で、ＣＭ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏ−クロマトグラフィー処理の後に、活性分画（″ＣＭ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液”）を一括し、水に対して充分透析し、ｐＨ８，０の１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液で平衡とした旧ｕｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＩｌカラムに流入させ、カラムは同一緩衝液中の塩化ナトリウムＯ〜２００　ｍＭ濃度勾配で、２８０ｎｍの吸収及び分画の伝導率（ｍｓ／ｃａｅ）を監視しながら溶出した。

６．８〜７．６Ｌの分画を一括して水に対して充分透析し、次いで凍結乾燥してプリオダインーＬ（ｂｒｙｏｄｉｎｅ−Ｌ）を得た。

幻」阪理土１顎壇１故使用した方法は実施例２０Ｂ、第ａ、　ｂ、　ｃ項に記載した方法である。

ｌ　に、番る　ンパク　２．５ｋ　当　Ｌｏ−”粗抽出物−−−−−−−−−− −−−−−−−−−２９３，７５−″Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出物”−−−− −−−−−−−−−−−−−−−１，７４−”５ｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ　２００溶出液”−−−−−−−−−−−−−−−０，４１−”ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液’−−−−−−−−−−−−−−−−−−０，０３５−”プリオダインーＬ　（Ｂｒｙｏｄｉｎｅ−Ｌ）　”−−−−−−−−０，０２１のノ　ニゲル濾過法に依る　：　２７３００電気泳動に依る　：　２８８００電気泳動は更に凍結乾燥物が単一物質である事を示した。

等電点：　＞９．５２８０　ｎｒａの吸光度（Ａ２８０）　：ｏ、ａアミノ酸組成（ｍｏｌｓ／＋ｏｌタンパク質）（２４，４８，７２時間の加水分解の平均値；ｒＭ・２８８００と推定した比率を算出、誤差〈１χ；国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の記号を使用；括弧内はプリオダインに就いて見出された対応する値である一Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０．６５９　（１９８６）　；ａａミ二アミノを示す）。

ａａ　ｍｏｌ／ｍｏｌ／タンパク’ｆ（ａａ　ｍｏｌ／ｍｏｌ／タンパク質　ａａ　ｍｏｌ／ｓｏｌ／タンパク質Ｌｙｓ：　１０．８（８，６）　Ｇｌｘ：　１８．９（１７，７）　Ｍｅｔ：　２．２（１，６）Ｈｉｓ：　１．０（１，９）　Ｐｒｏ：　７．２（６，７）　ｌｉｅ：　１５．４（１５，１）Ａｒｇ：　１１．０（１１，８）　ＧＩＶ：　１１．４（１１，４）　Ｌｅｕ：　２４．５（２８，３）Ａｓｘ：　２５．５　（２２，５）　Ａｌａ：　２４．１　（２２，４）　Ｔｙｒ：　１１．７　（１４，２）Ｔｈｒ：　１７．４　（１５，１）　半Ｃｙｓ：ａｂｓ、　（０，２４）　Ｐｈｅ：　７．４　（８，３）Ｓｅｒ：　２４．４　（３０，２）　Ｖａｔ：　１４．４　（１５，６）　Ｔｒｐ：　ａｂｓ、（２，０）データの比較は２種のＲＩＰの組成の差を示す。この差は以下のデータから一層顕著である。

生立■■■會ｕ　：　２．７２χ プリオダイン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、２４０、引用済み）の総合有量は６．３３％組成比はｒＭ・２８８００と推定して算出、国際純正及び応用化学連合（ＩｔｌＰＡＣ）の記号を使用；括弧内はプリオダインの対応値−Ｂｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｊ、　２４０、引用済ミ）：塘　＋ｍｏｌｓ／ｍｏｌ　ＲＩＰＦｕｃ　：　１．５２　（３，４７）Ｇｌｃ　：　０．４３　（１，５５）Ｍａｎ　２．５２　（６，２７）ｘｙ＋　−０，６３（０，９３）Ｃ）注主ｆｆｌ教生物学的特徴は実施例１　ノＣ，１，１，、Ｃ，１，２、Ｃ，１，３項に記載の方法で検定したが、毒性はＣ１２，に従って評価した。

−”粗抽出物”　０．６　１７０．０　（１００）−”Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出物”　８１．４　１４１．０　Ｂ３．２’５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００溶出液”１２３．０　５０．６　２９．７−　”ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｉ出液”　２５１．９　Ｂ、７　５．１−”プリオダイン−Ｌ″　３６２．３　６．７　３．９傘　：新鮮葉１２．５　ｋｇに基づく。

傘＊り粗抽出物”を１００と推定して参照した。

ブリオダイン−Ｌの比活性（３６２，３単位／ｙａｇ　１Ｏ−３）は、葉の鉗０．０９７　Ｍ及びＣＭ　０．１１２　Ｍ分画の値の、それぞれ２．８及び１．６倍と高く、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　祖に報告されたブリオダイン（根からのＣＭ　０．１００　Ｍ分画）の２．５６倍高かった。

紐　＼に　しる　ンパク　人　のＩＣ方法　酵素系　ＩＣ，。（ｎＭ）Ｃ，１，１ウサギ網状赤血球溶解産物　０．０９Ｃ，１，２１ｉｉ状赤血球より精製したリポソーム　１．３Ｃ，１，２Ｔ、ｂｒｕｃｅｉより精製したリポソーム　３，３３０゜この場合、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０に記載したデータは、報告が導入されたｄ、ｐ、ｍ、またはＩＤＳ。（ＩＣ１゜と同一意味）が（コムギ胚または紅■ｎｉａ…ｏｉｃａからの）異なったリポソーム生成物に就いて評価されている為に、比較出来なかった。

☆　二に　番る　ンパク　ム　のＩＣ（Ｃ，１，３：（値は２回の異なった測定の平均値である）。

細胞　ＩＤＳ。（ｎＭ）ＨｅＬａ　３．３３０ＴＧ　７７０Ｊａｒ　３．３３ＯＮＢ　５０ヒト繊維芽細胞　８００に　番る　ｑ　：　ＬＤ５゜＝　１０　ｍｇ／ｋｇ体重。ブリオダイン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０、引用済み）　＝　１４．５　ｍｇ／ｋｇ。

Ｄ）北］１壇１腹化学的修飾は、実施例２の０．１、Ｄ、２．０．３の方法を使用して行った。

したプ１オ′イン−ＬのＩＣの′ ＩＣｓ。値は実施例２のＣ，１，１の方法で測定し、ｎＭで現した。各値は３回の測定の平均値である。

反応試剤　試剤／ＲＩＰモル比（本）導入した基の数　ＩＣＳ。（ｎＭ）ＳＰＤＰ　１．５　：　１　１．０３　０．１１ＳＰＤＰ　２．０　：　１　１．３２　０．ｌ２２−ｌｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　１．２５　ｍＭ　Ｏ，７００，０９ＳＡＭＳＡ　２８　：　１　０．７５　０．０９（＊）二上記に報告した実験条件。

災に阻−土アスバ１ン　ａＳａｒｉｎ　びアスバ１ン２の　び夏麓所Ａ）皿Ｒ及び里腹船律ｙ１１脛」江１江頂す上０−の種子１ｋｇを、実施例３の方法に依って抽出し、ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ抽出物を２つに分画した（″Ｃトビーク１’　：　１．８〜２．４Ｌの分画、及びＣトビーク２”：３．３〜３．８Ｌの分画）。

２つの分画は次いで別個にｐＨ８，０のトリス塩酸緩衝液で平衡としたＲｅｄ− Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ”のカラム２本を使用して精製し、同一緩衝液中Ｏ〜３００　ｍＭの濃度勾配を有する塩化ナトリウムで溶出した。

’ＣＭＣビーク１”（″アスバリン１”）の精製分画は凍結乾燥したが、一方″ ＣＭ−ピーク２１（”アスパリン２″）は、先ず５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ ”カラムを用いて溶出した。

Ｂ」１１し１昨性激使用した方法は実施例２のＢ、第ａ、　ｂ、　ｃ項に記載した方法である。

１　に　番る　ンバ　ｋ　Ｌ。

−”粗抽出物”−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２３，２３−”酸性抽出物“−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１３，５８−”Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出物−−−−−−−−−−−−−−−−− −７，５５−’５ｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ　２００溶出液”−−−−−−−−−− −−−−２，０４−”ＣＭ−ピーク１”−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−０，１５９−”ＣＭ−ピーク　２”−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−０，２２９−”アスパリン１”−一一一−−−−−−〜− −−−−−−−−−−−０，０５４−”アスバリン２’−−−−−−−−−−− −−−−−一〜−−−−−０，０４９ゲル濾過法に依る　：　２９７００電気泳動に依る　：　３０５００アスバリン２ニゲル濾過法に依る　：　２８１００電気泳動に依る　：　２９８００電気泳動は２つの分画が単一物質である事を示す。

隻！立：アスパリンｌ　：　８．７アスパリン２　：　９．２ｎｓの　Ａｌｕ：１．０　（双方とも）ヱ３　：　（ｍｏｌ／ｍｏｌタンパク質）アスパリン１：（２４，４８，７２時間の加水分解の平均値；ｒＭ・３０５００と推定して算出した比率、誤差〈１ｚ；国際純正及び応用化学連合（Ｉ［ＩＰＡＣ）の記号を使用；ａａミ二アミノを示す）。

Ｌｙｓ：　１５．３　Ｇｌｘ：　２４．３　Ｎｅｔ：　４．１）１ｉｓ：　３．４　Ｐｒｏ：　１４．９　ｌｉｅ：　１１．４Ａｒｇ：　１４．４　Ｇｌｙ：　１５．ＯＬｅｕ：　２６．３Ａｓｘ：　２６．５　Ａｌａ：　１９．５　Ｔｙｒ：　９．８Ｔｈｒ：　１３．９　半Ｃｙｓ：　３．３　Ｐｈｅ：　６．３Ｓｅｒ：　１１．ＯＶａｌ：　１６．７　Ｔｒｐ：　ａｂｓ。

（２４，４８，７２時間の加水分解の平均値；ｒＭ・２９８００と推定して算出した比率、誤差〈１χ；国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の記号を使用；ａａミ二アミノを示す）。

Ｌｙｓ：　１４．９　Ｇｌｘ：　２３．２　Ｍｅｔ＝　１．１ｉ（ｉｓ：　２．９　Ｐｒｏ：　１５．４　１１ｅ：　１１．５Ａｒｇ：　１４．８　Ｇｌｙ二　１５゜２　Ｌｅｕ：　２６．６Ａｓｘ：　２７．２　Ａｌａ：　１Ｂ、８　Ｔｙｒ：　９．８Ｔｈｒ：　１４．２　半Ｃｙｓ：　１．３　Ｐｈｅ：　６．３Ｓｅｒ：　１１．３　Ｖａｌ：　１６．９　Ｔｒｐ：　ａｂｓ。

記載した３種の糖タンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　２１６、引用済み）の含有量は、以下の組成でそれぞれ１．４２％、１．２０％、１．３２％である。

フコース　痕跡　ＯＯガラクトース　０，３　痕跡　０．３生物学的活性は実施例２のＣ，１，１，、Ｃ，１，２、Ｃ，１，３項に記載の方法で検定し、毒性はＣ，２に従って測定した。

ウサギ　２　°汐”　に　る　ンパ　ム　の　１＝”粗抽出物″　７．９　１８３．５　（１００）−”酸性抽出物’　１６．３　２２１．０　１２０’Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ浸出液”　３５．３　２６６．５　１４５−”５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００溶出液”　６９．４　１４１．８　７７＝”Ｃトピーク　１” 　８９゜９　１５．７　８．５−”ＣＭ−ピーク２″　２１８．０　４９゜９　２７．２−”アスバリンド　１１２．４　６．１　３．３＝”アスバリン２”　２２４．２　１０．９　５．９本　：種子１　ｋｇに基づく。

＊本：”粗抽出物７を１００と推定して参照した。

里鳳土丑刃　しる　ンバク　Ａ　のＩＣＣ，１，１ウサギ網状赤血球溶解産物　０．２７Ｃ，１，２ｍ状赤血球より精製したリポソーム　８．８Ｃ，１，２Ｔ、ｂｒｕｃｅｉより精製したリポソーム　＞３，３３０゜アスパリン２：方法　酵素系　ｒｃｓ。（ｎＭ）Ｃ，１，１ウサギ網状赤血球溶解産物　０．１５Ｃ，１，２ｆｍ状赤血球より精製したリポソーム　６．９Ｃ，１，２Ｔ、ｂｒｕｃｅｉより精製したリポソーム　＞３．３３０゜（平均値は２回の別個の測定の平均値である）。

細胞　ｒｏｓ。（ｎＭ）ＨｅＬａ　３．３３０ＴＧ　６１０Ｊａｒ　３．３３ＯＮＢ　１８０ヒト繊維芽細胞　３，３３０アスパリン２細胞　ＩＤ５ｏ　（ｎＭ）ＨｅＬａ　３．３３０ＴＧ　２１０Ｊａｒ　３．３３ＯＮＢ　１８０ヒト繊維芽細胞　２，０２０！　４６　（Ｃ，２）：ＬＤｓ。＝　２０　Ｂ／ｋｇ体重（双方とも）。

Ｄ）化ヱカ盗崖化学的修飾は、実施例２の０．１、Ｄ、２．０．３の方法を使用してしたアスバｌン１　びアスバ１ン２のＩＣのＩＣｓ。値、は実施例２のＣ，１，１の方法で測定し、ｎＭで現した。各値は３回の測定の平均値である。

アスパリン１：反応試剤　試剤／ＲＩＰモル比　導入した基の数　ＩＣ５゜（ｎＭ）ＳＰＤＰ　１．５　：　１　１．０３　０．４１ＳＰＤＰ　２．０　：　１　１．３２　０．６７２−１ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　１．２５　ｍＭ　Ｏ，７００，２８ＳＡＭＳＡ　２８　：　１　０．７５　０．２６反応試剤　試剤／ＲＩＰモル比　導入した基の数　ｒｃｓｏ（ｎＭ）ＳＰＤＰ　１．５　：　１　１．０３　０．１９ＳＰＤＰ　２．０　：　１　１．３２　０．４０２４ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　１．２５　ｍＭ　Ｏ，７００，２６ＳＡＭＳＡ　２８　：　１　０．７５　０．２１尖胤舅一旦ヱ」バ孟二１　ンパ　立　に　しる旧ｖ１の　＋１　：　。

標準方法で培養したνＢ細胞に、既知濃度の旧Ｖｌウィルスを約３７°Ｃで６０分間接種培養した。細胞に結合しなかった過剰のウィルスは、洗浄して除き、（約１　ｘ　１０’細胞／ｍｌ１度の）細胞は、ブリオダイン、アスバリン１、アスバリン２またはモモルコチンの種々（１０１〜１０−’　Ｍ）濃度段階の存在下に培養した。

培地中の旧ｖ１の存在は、市販の免疫検定試剤を用いてウィルス抗原ｐ２４の発現の分析で測定した。

抗旧Ｖｌ活性は通常通り最高ウィルス産生期間に評価した。

複製の阻害は対照群と比較したＰ２４含有率（％）として評価した。

得られた結果は、プリオダイン、アスバリン１、アスバリン２及びモモルコチンが、細胞の巨大分子合成を損なうことなく、（１０−”〜１０−’ｍｏｌルの）種々濃度でウィルスの複製が阻害可能であり、阻害率は７０〜８０％であった。

横坑　マクロフ　−ジ　に、しる旧Ｖｌの単球及びマクロファージ細胞は、健常志願者の末梢血からフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配を用いた標準法に従って分離した。

細胞は旧ｖ１感染後、上記の方法で培養した。

感染した量を一旦Ｃｒｏｗｅ　Ｓ−＋旧１１ｓ　Ｊ、及びＭｃＧｒａｔｈ　Ｍ、　（ＡＩＤＳＲｅｓ、　Ｈｕｍ、　Ｒｅｔｒｏｖ、３．１３５−１４５．１９８７）の方法で測定した後、細胞は本発明の濃度１０−ｓ〜１０４ＭのＲＩＰ類で処理して、４日間培養した。ｐ２４抗原の発現は細胞蛍光測定分析法で測定し、阻害値は対照群と比較した率（％）で現した。結果は本発明のＲＩＰ類が試験した濃度でウィルスの複製を、阻害率７０〜８０％で阻害する事を示した。

国際調査報告 ””””ｌ−”・　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００４８３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の特徴を有するリボソーム不活性化タンパク質：−ゲル濾過に依る分子量：３１，０００−電気泳動に依る分子量：３０，７００−等電点：＞９ −２８０ｎｍに於ける吸光度：０．７ −ｒＭ３０．７００に対するアミノ酸組成▲数式、化学式、表等があります▼ −中性糖の総含有量：２．８２％ −ｒＭ３０．７００に対する糖組成（ｍｏｌｓ／ｍｏｌ　ＲＩＰ）糖　　　　　　　　　ｍｏｌｓ／ｍｏｌＲＩＰ▲数式、化学式、表等があります▼
２．以下の特徴を有するリボソーム不活化タンパク質：−ゲル濾過に依る分子量：２７，３００−電気泳動に依る分子量：２８，８００−等電点：＞９．５ −２８０ｎｍに於ける吸光度：０．８ −ｒＭ２８，８００に対するアミノ酸組成▲数式、化学式、表等があります▼ −中性糖の総含有量：２．７２％ −ｒＭ２８，８００に対する糖組成（ｍｏｌｓ／ｍｏｌ　ＲＩＰ）糖　　　　　　　　ｍｏｌｓ／ｍｏｌｓ　ＲＩＰ▲数式、化学式、表等があります▼
３．以下の特徴を有するリボソーム不活化タンパク質：−ゲル濾過に依る分子量：２９，７００−電気泳動に依る分子量：３０，５００−等電点：＞８．７ −２８０ｎｍに於ける吸光度：１．０ −ｒＭ３０，５００に対するアミノ酸組成▲数式、化学式、表等があります▼
４．以下の特徴を有するリボソーム不活化タンパク質：−ゲル濾過に依る分子量：２８．１００−電気泳動に依る分子量　：２９，８００−等電点：＞９．２ −２８０ｎｍに於ける吸光度：１．０ −ｒＭ３０，５００に対するアミノ酸組成▲数式、化学式、表等があります▼
５．特許請求の範囲第１項ないし第４項記載の以下ので示されるタンパク質誘動体： ▲数式、化学式、表等があります▼ よりなる群から選ばれ、Ｒは水素原子、アセチル基、２−ピリジル基から選ばれ、Ｘは０．２から３よりなる。