CN1022113C - 新蛋白质和它的生产方法 - Google Patents
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Abstract
具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合能力的对类胰蛋白酶有抗性的修饰过的P31蛋白，是由乙型肝炎病毒表面抗原通过修饰使其至少一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感而制得。该蛋白能被用作预防乙型肝炎病毒感染的疫苗和诊断乙型肝炎病毒感染的抗原。
Description
本发明与对作为疫苗用的新蛋白质和它的生产方法有关。
乙型肝炎是一种病毒病害，它经常发生，特别是在非洲热带地区，东南亚地区和远东地区。在流行病学上，乙型肝炎被认为是引起慢性肝炎或肝硬变的原因，或甚至是引起原发肝癌的原因。
乙型肝炎的病原是乙型肝炎病毒（这里或以后都写作“HBV”）。它是DNA病毒的一种。发现以后被称为“戴恩颗粒”，以直径42毫微米的球形颗粒的形式存在。其外层有乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（这里或以后都写作“HBsAg”）。它包括adr、adw、ayr、ayw等亚型，它们彼此在抗原性上不同。adw和adr亚型常见于日本。
在患乙型肝炎病人的血液中，除了戴恩颗粒还能检测到比较小的颗粒和管状颗粒。已发现这些颗粒含有与戴恩颗粒中相同类型的乙型肝炎病毒表面抗原。从其他病毒中知道，对病毒表面抗原的抗体能预防所说病毒的感染。在HBV中，也许可以期望能以HBsAg为基础来产生抗乙型肝炎的疫苗，然而只有人和黑猩猩易被HBV感染。试图用它感染培养的细胞没有成功。所以HBsAg的来源受到感染肝炎病毒病人血液的限制。虽所得到的小的和其他病毒颗粒也许能满足作为制备诊断试剂材料的需要;但作为大规模疫苗生产仍是不够的。
在分子生物学中新近的发展，通过编码非细菌蛋白的DNA转化细菌，此问题已有解决可能。如果乙型肝炎病毒表面抗原的结构基因（这里和以后都写为“HBsAg基因”）能在细菌中表达作为应用这个基因操作技术的结晶，则大量生产没有感染乙型肝炎病毒危险的HBsAg将成为可能，并为乙型肝炎疫苗的实际应用开辟了一条途径。
在目前所知的四种亚型adw、adr、ayw和ayr中，主要在欧洲和美洲发现的ayw亚型的乙型肝炎病毒表面抗原基因的位置和碱基顺序已被确定[Galibert，F.等，Nature，281，646（1979）]charnay.P等，Nucleic Acids Res，7，335（1979）]而且在大肠杆菌中它以杂合蛋白表达已有报告[charnay，P.等Nature，286，893（1980）;Edman，J.C.等Nature，291，503（1981）]。
本专利的一些发明者在构建含有在日本常见的亚型adw和adr的HBsAg基因DNA已经成功;所说基因DNA的碱基顺序以及它在基因组中的座位也已确定;并且通过带有这种重组DNA的转化体的培养，开辟了大规模生产HBsAg的途径（日本未审核专利公布号194897/1983，201796/1983和74985/1984）。
Machida，A.等[Gastroenterology，85，268（1983）;ibid.，86，910（1984）]新近报告，从乙型肝炎病毒e抗原阳性病人的血浆中得到的HBsAg小颗粒，已经证明含有P31蛋白（分子量：31千道尔顿）和P35蛋白（一个有糖的与P31连接的结合蛋白;分子量：35千道尔顿），除了迄今已鉴定的那些主要肽之外，还有如P-I（分子量：22-24千道尔顿）和P-Ⅱ（分子量：25-29.5千道尔顿）[Peterson，D.L.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，1530（1977）]。P31由P-I和与P-I的N端连接的编码55个氨基酸残基的Pre-S区组成，在这个区域中已经知道存在有多聚的人血清蛋白（多聚-HSA）受体。上面引用在1984年发表的报告说明上述P31蛋白有糖链。另一方面可以想到的是戴恩颗粒经由多聚人血清蛋白附着在肝细胞因而能增殖，由于多聚-HSA和受体也存在于肝细胞表面上。所以可
以指望的是用抗P31的抗体去成功地掩盖在戴恩颗粒上的多聚-HSA受体，则将会阻止所说颗粒与肝细胞的结合，从而有助于更有效地阻止HBV的感染。
另一方面，用各种蛋白酶对P31进行限制性水解，例如胰蛋白酶在离N-端第48个氨基酸（精氨酸）残基的位点上选择地降解P31，得到其有分子量为28千道尔顿的蛋白质（P28）。同样P31基因在啤酒酵母中表达中，由于酵母细胞中存在着大量与胰蛋白酶类似的蛋白酶，所以看到的趋向是基因产物的分解，导致P28的形成（图1）。除这个P28以外，由于酵母中存在着与胰蛋白酶类似的蛋白酶，分解P31N端的第16个和第18个精氨酸残基以及第177个和第196个赖氨酸残基的结晶，其中也可能形成30-、21-和19-千道尔顿的蛋白质。
如上所述，从乙型肝炎e抗原-阳性病人的血浆中得到的HBsAg颗粒含有P31蛋白和P35蛋白（一个以糖与P31连接的结合蛋白，分子量：35千道尔顿），除主要肽外还有像P-Ⅰ和P-Ⅱ[Stibbe，W，等，J.Virol.，46，626（1983）]。特别是命名为戴恩颗粒的传染性HBV的主体，拥有P31蛋白和P35蛋白，此外还有P-Ⅰ和P-Ⅱ作为表面抗原。在HBV中发现应用多元抗原比用单元抗原作为疫苗材料更为有效。那就是较好的疫苗应有P31蛋白和P35蛋白以及P-Ⅰ和P-Ⅱ。虽然对乙型肝炎病毒的疫苗生产已想通过重组DNA技术在世界上实现，但只有Michel，M.L.等报告[proc、Natl.Acad.Sci.USA，81，7708（1984）;Bio/Technology，3，561（1985）]用动物细胞以满足上述的需要。然而不足的是他们应用动物细胞作为寄主需要很大的费用。
本发明提供：
（1）具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合能力的经修饰的P31蛋白，是从乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白通过修饰使至少它的一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感。
（2）含有的DNA，是编码修饰过的P31蛋白的DNA;而修饰过的P31蛋白具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合的能力，它是从乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白通过使至少它的一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感的这样修饰而来的。
（3）转化体带有的DNA中含有编码修饰过的P31蛋白的DNA;而修饰过的P31蛋白具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合的能力;它是从乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白通过使至少它的一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感的这样修饰而来的。
（4）从乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白通过使至少它的一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感的这样修饰而来的具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合能力的经修饰过的P31蛋白的生产方法，包含带有的DNA中含有编码所说修饰过的P31蛋白的DNA的转化体培养，和从培养物中分离在培养中产生和积累的所说经修饰过的P31蛋白。
（5）生产经修饰过的P31蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原P25蛋白的方法，包含带有的DNA中含有编码所说修饰过的P31蛋白DNA的转化体培养和编码所说P25蛋白DNA的转化体培养;而所说修饰过的P31蛋白是具有乙型肝炎病毒表面抗原活性和与多聚人血清蛋白结合的能力;它是从乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白通过使至少它的一个对类胰蛋白酶敏感的位点变成不敏感的这样修饰而来的。
根据发明，编码修饰过的P31蛋白的DNA可以是任何一个亚型（adr、adw、ayr、ayw）并且能被制备，例如用下述方法。
质粒pBR322-BanHI/HBr330（这里和以后都写成“PHBr330”）含有的3.19Kbadr-型HBV DNA（在日本未审核专利公布号74985/1984或Nucleic Acid Res.，11，1747（1983）中叙述]插入在用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶解的地方，得到含有Pre-S区部分的1398bp的DNA片段。P-31编码的DNA是通过把含有顺序
的合适接引头与上述片段连接而产生的，并被插入到合适的运载体上。
编码其他亚型P31的DNA也能用与上述相同的方法制备。
例如通过下述方法可以使产生编码修饰的P31蛋白的DNA，而这个修饰的P31蛋白，在其N
端缺失第48位氨基酸（精氨酸）或缺失其N端含所说精氨酸的肽链，（精氨酸是那些对与胰蛋白酶相似的蛋白酶敏感位点中的一个），或用其他氨基酸或肽链取代所说的精氨酸或含所说精氨酸的肽链。
在亚型adr P31基因中，能识别限制性内切酶xho I的位点，如图2所示，位在编码N端第48位氨基酸-精氨酸的区域内。因此，消除精氨酸密码子能通过用xho I酶分解P31基因然后用外切核酸酶，例如核酸酶BAL31除去精氨酸编码区域;或用xho I酶降解P31基因，再用大片段DNA多聚酶修复xho I酶解位点并再插入一个适合的连接子。从产物中选择出与基因阅读框架同相的。
编码修饰的P31蛋白的DNA也可以用化学合成。此时合成出的编码48位氨基酸，精氨酸的DNA顺序或编码含有精氨酸肽链DNA，其精氨酸密码子是缺失的，或通过用编码其他氨基酸的这样密码子或肽的这样密码子群取代;此外这样密码子的阅读框架仍保持相同相位。
此外，如图5所示用限制性内切酶Sal I和xba I酶解质粒pBR-Sal-6得到的267bp的DNA片段，插入到运载体M13mpl1的SalI-xba I切点上并用插入后的产物去感染大肠杆菌JM103（pharmacia P-L Biochemicals）。生长以后，M13噬菌体便释放到培养液中，即用聚乙二醇沉淀，然后用酚处理得到M13噬菌体单链DNA。
然后，改变P31蛋白N端48位氨基酸-精氨酸密码子AGG例如变成谷氨酰胺密码子CAG的引物d5′（CCCAGTCTGCGAGAAG）3′，能用化学合成法制备。把这个引物和以前制备的M13 DNA彼此混合。变成双链以后，在DNA多聚酶I大片段酶作用下，产物能被存在的T4DNA连接酶所环化。把环状DNA引入到大肠杆菌JM103，把释放在平皿上的M13噬菌体DNA转移到滤膜上，并用所说的以同位素32P标记的合成引物进行噬斑杂交[Maniatis T.等.，分子克隆，实验手册，冷泉港实验室，312页（1982）]用限制性内切酶Sal I-xba I酶解从噬菌体制备的DNA，因它有可被检测的强的信号，所以便能得到267bp的DNA片段。用所说的片段代替质粒pBR-Sal-6上267bp Sal I-xba I片段，便得到编码修饰过的P31蛋白的DNA（修饰过的P31基因）。
因为在编码亚型adw P31或亚型adyw P31的DNA上没有xho I识别的切点，所以有关修饰过的P31基因能通过如上所述位点突变技术所产生（Smith M.和Gillam S.，基因工程，3，1（1981）]。
含有HBsAg基因全部或部分的质粒DNA，装配型质粒DNA，噬菌体DNA等等，能用作所说位点-指定突变的DNA模板。M13噬菌体DNA和φX174噬菌体DNA是较理想的模板DNA，因为它们是单链DNA，容易制备。如带有全部或部分HBsAg基因并在其中插入的M13噬菌体或φX174噬菌体，当被应用时，在噬菌体颗粒中原来存在的单链DNA能够通过用聚乙二醇沉淀在培养液中存在的噬菌体颗粒，用酚处理脱蛋白，用酒精沉淀回收。带有全部或部分HBsAg基因并在其中插入的双链质粒DNA或装配型质粒DNA用作模板DNA时，双链DNA能被改变成单链DNA，可在它应用之前把双链DNA在100℃热处理1到10分钟，最好为3到5分钟，接着就用冰水猝冷。
位点突变的引物可以用任何合适的DNA顺序，它含有设想好的替代的DNA顺序，并能与模板DNA杂交，所以它在DNA合成中有引物的功能。虽然任何方法都可应用制备所说的引物，但都希望用化学合成制备具有合适顺序的单链DNA。
这样的引物和先前制备的单链DNA混合一起并在DNA多聚酶Ⅰ大片段酶作用下恢复成双链。双链DNA在T4DNA连接酶作用下能被环化。把这个环化DNA引入到大肠杆菌。通过噬斑杂交能够筛选到期望的突变体[Maniatis T.等，分子克隆，实验手册，冷泉港实验室，P312，（1982）]，或者用放射性同位素标记的引物作为探针进行菌落杂交筛选期望的突变体。从这样方法得到的噬斑或菌落制备噬菌体DNA或质粒DNA。用所说的DNA就能构建修饰过的P31基因。
为了消除N端的第48位氨基酸（精氨酸）或消除含精氨酸的肽既可以用使48位氨基酸精氨酸单独缺失的方法，也可以用使含48位氨基酸精氨酸的肽缺失的方法来构建DNA。缺失的肽的大小可以任意，只要HBsAg活性和与多聚人血清蛋白
结合的能力在没有所说的肽时仍能保持。然而，应该缺失的肽的大小，较好的是在含有第48个氨基酸精氨酸肽链的范围内包括N端的第26个到55个氨基酸，更好的是在含有第48个氨基酸精氨酸肽链的范围内包括第44个到第49个氨基酸。
可以加入除精氨酸或赖氨酸以外的一个氨基酸或肽链以代替缺失的第48个氨基酸、精氨酸或缺失的含有所说精氨酸的肽。这样，加入的肽链应该包含1到50个氨基酸，最好约为1到4个氨基酸。
从N端数算的第16个和第18个氨基酸（精氨酸）的密码子以及第177个和第196个氨基酸（赖氨酸）的密码子，能用除赖氨酸和精氨酸外的密码子通过上述位点突变的技术取代，得到修饰的P31基因。
上述对类胰蛋白酶敏感位点的修饰，至少在P31N端第48个氨基酸（精氨酸）或含有所说氨基酸精氨酸的肽链上进行较好，而只修饰第48个氨基酸（精氨酸）或含所说氨基酸精氨酸的肽链则更好。
用于上述加入或取代的除赖氨酸和精氨酸外的其他氨基酸密码子是，例如，门冬酰胺密码子，门冬氨酸密码子，丙氨酸密码子，异亮氨酸密码子，甘氨酸密码子，谷氨酰胺密码子，谷氨酸密码子，半胱氨酸密码子，丝氨酸密码子，酪氨酸密码子，色氨酸密码子，苏氨酸密码子，缬氨酸密码子，组氨酸密码子，苯丙氨酸密码子，脯氨酸密码子，甲硫氨酸密码子和亮氨酸密码子。
构建能够表达编码修饰过的P31DNA的重组DNA可通过把这个编码修饰过的P31DNA插到能够在一个或多个不同寄主（即大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，动物细胞）中有功能的启动子区域的3′端。
启动子区域可以是任何启动子区域，只要它含有一个与RNA多聚酶结合，mRNA合成起始的必需位点。
例如，当大肠杆菌用作寄主时，构建能够表达编码修饰过的P31蛋白DNA的重组DNA，可通过把这个编码修饰过的P31DNA插到能够在大肠杆菌中有功能的启动子的3′端就能达到。例如，编码修饰过的P31的DNA在T4DNA连接酶作用之下，就可插入到表达运载体pTRP601，pTRP771，等等之中，（这些已在公开号为201796/1983日本的未审核的专利中公开）。应用这个反应混合液，和已知的方法（Cohen，S.N.等.，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，69，2110（1972）]或它的修饰方法把大肠杆菌株株（即菌株C600，294，W3110，RRL，PR13）转化。应用的启动子不需要限于色氨酸启动子（trp-p）而重组A启动子（日本未审核专利公布号65099/1984），乳糖启动子，λPL启动子等等也都可以应用。
在上述情况中得到的转化体，带有新的重组质粒DNA，它含有编码修饰的P31的DNA，能用，对氨苄青霉素或四环素抗性或两者抗性作为表现型进行筛选。为把带有新的重组质粒DNA的菌株是否含有编码修饰过的P31的DNA检出，应用了例如下述的技术。把上述接头的一条链即5′AATTCCACTGCATTGTAT3′，在T4多核苷酸激酶存在下用r-32p-ATP进行放射性标记，然后用这个标记脱氧寡核苷酸为探针，从已经得到的抗药性转化体中通过本质上是已知菌落杂交法[Grunstein，M.和Hogness，D.S.，proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961（1975）]能把阳性克隆可靠地定位判别出来。
把在这种情况下挑出的转化体培养在原来已知的培养基上。关于培养基可以被提到的，例如，L肉汁培养液，青霉素分析培养液，或含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M-9培养基[Miller，J，分子遗传学的实验，431-433（冷泉港实验室，纽约，1972）]。为加强启动子作用，需要时可在培养基中加入像3β-吲哚丙烯酸的这样的药剂。
所说转化体的培养，一般在15-43℃中进行，最好在28°-40℃培养时间为2-24小时，最好为4-16小时，如果需要可用通空气和/或搅拌。
例如，当酵母菌用作寄主时，按以下方法准备酵母转化体。酵母菌启动子区域，例如阻遏的酸性磷酸酯酶基因启动区域（Meyhack，B.等.，EMBO J，6，675（1982）］，3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子区域[Holland，J.P和Holland，M.J.，J.Biol.chem.，255，2596（1980）]或3-磷酸甘油酸激酶基因启动子区域[Dobson，M.J.等，Nucleic Acido Res.，10，2625（1982）]，被插入到大肠杆菌-酵母菌穿梭运载体上如
YEp13[Broach，J.R.等.，Gene，8，121（1979）]上，pSH15或PSH 19[Harashima，S，等.，Mol.Cell.Biol.，4，771（1984）]上，接着在T4DNA连接酶存在下把编码修饰过的P31蛋白的DNA，连接在所说的启动子区域后面。而且，还能把终止转录的终止区插到紧靠编码修饰过的P31蛋白的DNA后面，因而增加修饰过的P31蛋白的产量。关于终止密码子，能应用的有基因3′端非编码区域，例如，3-磷酸甘油酸激酶基因或3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的3′端非编码区。把以上反应混合液，通过上述Cohen等的方法用于转化上述的寄主大肠杆菌菌株，这样得到的转化体，带有新的重组DNA，它含有编码修饰后的P31蛋白的DNA，通过利用氨苄青霉素抗性作为表型能被选择出来。带有新的重组质粒DNA，它具有修饰后P31蛋白-编码的DNA的菌株在相同情形下应用上述的方法能被挑选出来。
从这样选择到的转化体中用硷抽提法[Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic Acid Res.，7，1513（1979）]分离质粒DNA;然后用已知的方法[Hinnen，A.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927（1978）]或用其修改的方法把分离到的质粒DNA用于转化像啤酒酵母亮氨酸缺陷型菌株那样的酵母菌，例如AH22R-（leu2his4 Canl cir+pho 80）[proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1（1983）]或AH22R-衍生的K33-7B（pho80-AH22，pho8-2）或K33-8D（pho80-AH22，pho8-2 trpl）。酵母菌作为寄主不限于这些，但啤酒酵母是最好的。
以此方式得到的酵母转化体被培养在原来已知的培养基中。关于培养基，可以提到的有，例如，Burkholder最低培养基[Bostian，K.L.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505（1980）]。
酵母转化体的培养一般在15-40℃中进行，最好在24-37℃，一般培养10-96小时，最好是24-72小时。如果需要，可以用通空气和/或搅拌去完成。
例如，当枯草杆菌或动物细胞用作为寄主时，修饰后P31蛋白的生产可以通过把编码修饰后P31蛋白的DNA插入到能够在枯草杆菌或动物细胞中有功能的启动子区域的3′端;把这样所得的重组DNA，应用本质上是已知的方法转化寄主，并培养这样得到的转化体就能达到。在所说的寄主中，酵母是最好的。
产物中修饰后的P31的活性能被测定，例如用把样本结合到溴化氰活化的纤维素纸上，接着就与Austria Ⅱ-125（Dainabbott）的125碘-抗-乙型肝炎表面抗原的抗体反应进行直接免疫分析[Fujisawa，Y.等，Nucleic.Acid.Res.11，3581（1983）]。
培养以后，用已知的方法收集细胞。在大肠杆菌转化体情况中，收集的细胞悬浮在含有蛋白质变性剂例如尿素或盐酸胍的缓冲溶液中，在冷室中搅动悬浮液然后离心，得到含有修饰后的P31的上清液;或把细胞悬浮在缓冲液中，然后用超声波破碎，或用溶菌酶和/或冻融法破碎细胞，接着离心就可得到含有修饰后P31的上清液。然而，在这些和其他合适的方法中，最好的方法是包括，例如，细胞的收获，把细胞悬浮在缓冲液中，加入溶菌酶、匀浆增进悬浮液裂解，加入到含有尿素（3-10摩尔）的缓冲液中，搅拌所得到的混合液（在0-10℃，0.5-8小时）和进行离心得到上清液。
在酵母转化体情况中，细胞用Zymolyase（Kirin Brewery）裂解，或用玻璃珠通过机械处理使之破碎，或用其他类似的方法。此外，加入的表面活化剂，例如Triton X-100或去氧胆酸盐，和/或蛋白质变性剂，例如，尿素或盐酸胍，因而修饰后的P31能有利地提取出来。
含有修饰后的P31的提取液可用DEAE-Toyopearl或丁基-Toyopeal进行柱层析处理，每一个用含有10毫摩尔EDTA和1毫摩尔二异丙基磷酸氟或其他蛋白酶抑制剂的10毫摩尔磷酸缓冲液平衡。修饰后的P31的分离和纯化通过亲和层析处理在效率上也能增强。吸附在这些柱上的修饰后的P31能用含有合适的限定浓度的盐的缓冲液洗脱。像所要求那样，收集含有修饰后的P31洗脱部分，通过超过滤能被浓缩。
从上述提取液中分离修饰后的P31蛋白，同时通过包括亲和层析处理的纯化方法进行纯化。
关于亲和层析，可以提到用多聚化的人血清蛋白（poly-HSA）作为配体的亲和层析，和用抗HBsAg的抗体，特别是单克隆抗体的抗体柱处理。
用poly-HSA作为配体的亲和层析用于修饰后的P31蛋白的纯化是很有利的。
适用于这样亲和层析的可用载体包括甲酰-Cellulofine（Seikagaku Kogyo）和亲和胶-15（Bio-Rad）。其中，尤其是甲酰-Cellulofine最好。
poly-HSA可以通过多聚化的人血清蛋白与交联剂（即戊二醛）进行生产。例如，用还原剂（即NaCNBH3）把这个结合到上述载体上，接着如要求那样，进行清洗。这样所得到的与poly-HSA结合的载体一般装在柱子中应用于所说的亲和层析中。
为P31蛋白的纯化，可用以poly-HSA为配体的亲和层析，把上述含有P31的溶液（细胞提取的上清液）放在用缓冲液（即磷酸缓冲液）平衡好的上述柱中，接着用缓冲液洗脱吸附着的P31。关于所说的缓冲液，其中可以加入合适量的表面活性剂（即吐温20）或蛋白质变性剂（尿素）或其他类似物;合适的洗脱液可以从这些添加物的种类和浓度方面综合考虑进行配制。
因此含有P31蛋白的洗脱液部分可被收集，并如要求那样，例如，通过超过滤浓缩。
所说的浓缩液能用Sephacryl S-300或其类似物进行凝胶过滤处理。修饰后的P31蛋白是在空柱体积附近部分中被洗脱的。
通过各种层析方法得到的修饰后的含P31蛋白部分，还能用这样纯化的方法如蔗糖梯度超离心或氯化铯梯度超离心进行进一步纯化。
可用于产生修饰的P31蛋白和P25蛋白的编码修饰的P31蛋白的DNA，包括上述的DNA，并能按照上述的方法制备。
编码亚型adw P25蛋白的DNA（P25基因）也能够用3.2Kb的adw乙型肝炎病毒的DNA插入到质粒pHBV 933中并从这个质粒上得到，本法在日本未审核的专利，公开号为194897/1983上或Nucleic Acid Res.11，1747（1983）上叙述过。在大肠杆菌中能够表达adw P25基因（通过pHBV933分离）的表达质粒pTRP SS-6[Fujisawa，Y.等，Nucleic.Acid.Res.，11，3581（1983）]，是用cla I和pst I双酶解得到含有P25基因的0.82Kb DNA片段的。编码另一个亚型的P25的DNA也能用上述方法相同的技术进行制备。用合适的连接子连到DNA片段上并把这个得到的片段插到运载体上。
较好的是修饰的P31和P25在亚型上是不同的，更好的是修饰的P31是adr而P25是adw亚型。
构建能同时表达编码修饰的P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA的重组DNA，可以通过把编码修饰的P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA，分别插到能在一个或多个不同寄主（即大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，动物细胞）中起功能作用的启动子区域的3′端就能达到。
启动子区域可以是任何启动子区域，只要它含有为由RNA多聚酶合成mRNA的必需位点。
例如，当大肠杆菌用作寄主时，构建能够表达编码修饰的P31的DNA和编码P25的DNA的重组DNA，可以通过把这个编码修饰的P31的DNA和编码P25的DNA插到能够在大肠杆菌中有功能的启动子的3′端就能达到。用这种重组DNA通过已知的方法（Cohen，S.N.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110（1972）]或它的修改方法转化大肠杆菌菌株（即C600，294，W 3110，RR1，PR13）。应用的启动子不需要限定在色氨酸启动子（trp-p），而重组A启动子（日本未审核专利公布号65099/1984）乳糖启动子，λPL启动子等等也都可以应用。
在上述情况中得到的转化体，带有新的重组质粒DNA，它含有编码修饰的P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA，例如，能用对氨苄青霉素抗性或四环素抗性，或两者抗性作为表现型进行选择。为分离带有含编码修饰的P31蛋白DNA和编码P25蛋白DNA新的重组质粒DNA的菌株，应用了上述的技术。
例如，当酵母菌用作寄主时，按以下方法能够制备酵母转化体。把两个（相同的或不同类的）酵母启动子区域，例如阻遏的酸性磷酸酯酶启动子区域[Meyhack，B.等，EMBO J.，6，675（1982）]，3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子区域[Holland，J.P和Holland，M.J.，J.Biol，Chem.，255，2596（1980）]，或3-磷酸甘油酸激酶基因启动子区域[Dobson，M.J.等.，Nucleic.Acid.Res.，10，2625（1982）]，插入到大肠杆菌-酵母的穿梭运载体如YEP
13[Broach，J.R.等，Gene，8，121（1979）]上，pSH15或pSH19[Harashima，S.等，Mol.cell.Bial.，4，771（1984）]上，接着在T4DNA连接酶存在下，把编码修饰的P31蛋白的DNA连接在所说启动子区域的一个后面，而在另一个启动子后面连接编码P25蛋白的DNA。如上述情况一样，可以把终止密码子插到编码修饰的P31蛋白的DNA后面和/或编码P25蛋白的DNA后面。用前述Cohen等的方法，把上述反应混合液去转化上述寄主大肠杆菌的菌株。这样得到的带有新的重组DNA的转化体，它含有编码修饰P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA，例如通过利用氨苄青霉素抗性为表型而能被选择出来。带有新的重组质粒DNA，其上具有编码修饰的P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA的菌株，可通过用碱抽提方法[Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic.Acid.Res.，7，1513（1979）]分离质粒DNA，并从用不同限制性内切酶处理，例如，又通过琼脂糖凝胶电泳分析所得DNA片段的大小而被挑选出来。
从选择到的转化体中用硷抽提法[Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic.Acid.Res.，71513（1979）]分离质粒DNA，然后用已知的方法[Hinnen，A.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927（1978）或它的修改方法把分离到的质粒DNA用于转化像啤酒酵母的需要亮氨酸菌株那样的酵母，例如AH22R-（leu2 his4 canl cir+pho80）[proc.Natl，Acad，Sci USA，80，1（1983）]或AH22R-衍生的K33-7B（pho80-AH22，pho8-2）或K33-8D（pho80-AH22，pho8-2，trpl）。作为寄主的酵母不限于这些，但啤酒酵母是最好的。
例如，当枯草杆菌或动物细胞用作为寄主时，修饰的P31蛋白和P25蛋白的生产，可以通过把编码修饰的P31蛋白的DNA和P25蛋白的编码DNA插入到能在枯草杆菌或动物细胞中有功能的启动子区域的3′端;把这种重组DNA，应用本质上是已知的方法去转化寄主并培养所得到的转化体。
产物中的修饰的P31和P25的活性测定，例如可以用Ausria Ⅱ-125（Dainabbott）或Auszyme Ⅱ（Abbott）。
所得到的转化体可与上述带有修饰的P31蛋白的编码DNA的转化体同样的方法进行培养，修饰的P31和P25的提取，也可用前述提取修饰的P31那样相同的方法进行。
从抽提液中分离和纯化修饰的P31和P25，例如，可以用凝胶过滤，羟基磷灰石柱层析，离子交换柱层析，超离心和/或用抗HBsAg抗体的亲和层析进行。
根据对修饰的P31 DNA产物和P25DNA产物用Western印渍法的分析，检测到有38-37千道尔顿的蛋白（P37）和25千道尔顿的蛋白（P25）。P37有31千道尔顿的蛋白，其上有糖链结合，并有多聚-HSA受体和HBsAg抗原性。P25也有HBsAg抗原性。从酵母中提取的P37和P25以凝结的形式存在。
带有以多元抗原基因插入其中的质粒的转化体比带有以单个基因插入其中的质粒的转化体生产抗原量显著的大。
根据本发明，修饰的P31蛋白以及P37和P25像已知的HBsAg小颗粒所具有的一样，有相同的生物学活性，而这些小颗粒的生产是用HBV-感染物质实体的血液作为起始材料的;它们也与所说的HBsAg小颗粒一样，在同样的情况中能用作预防HBV感染的疫苗和诊断HBV感染的抗原。
在这个说明书和随同的插图中的那些缩写，是用国际纯化学和应用化学联合会-国际生物化学联合会的生化试剂命名委员会所推荐的;或是在相关的工艺领域中以缩写表示碱基和氨基酸的通用方法。下面给出的是一些范例。除非另有特殊说明，这里可能具有光学异构体的氨基酸都是L型。
DNA 脱氧核糖核酸
RNA 核糖核酸
mRNA 信使RNA
A 腺嘌呤
T 胸腺嘧啶
G 鸟嘌呤
C 胞嘧啶
dATP 脱氧腺嘌呤核苷三磷酸
dTTP 脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸
dCTP 脱氧胞嘧啶核苷三磷酸
ATP 腺苷三磷酸
EDTA 乙二胺四乙酸
SDS 十二烷基硫酸钠
DTT 二硫苏糖醇
Gly 甘氨酸
Ala 丙氨酸
Val 缬氨酸
Leu 亮氨酸
Ile 异亮氨酸
Ser 丝氨酸
Thr 苏氨酸
Cys 半胱氨酸
1/2cys 1/2半胱氨酸
Met 甲硫氨酸
Glu 谷氨酸
Asp 天冬氨酸
Lys 赖氨酸
Arg 精氨酸
His 组氨酸
Phe 苯丙氨酸
Tyr 酪氨酸
Trp 色氨酸
Pro 脯氨酸
Asn 天冬酰胺
Gln 谷氨酰胺
APr抗氨苄青霉素基因
TCr抗四环素基因
ars 1 自主复制顺序1
IR 反向重复
附图的简短描述
图1用Western印渍法对基因产物分析结果的说明。图中，泳道1图示的是来自大肠杆菌C600/pTRPP31-R细胞提取液分析的结果;而泳道2是来自大肠杆菌C600/pTRPP31-R细胞提取液经胰蛋白酶处理的结果;而泳道3则是来自啤酒酵母AH22R-/pPHOP31-R细胞提取液分析结果。
图2亚型adr乙型肝炎表面抗原P31的碱基顺序（上列）和相当的氨基酸顺序（下列）。
图3pTRPP31-Ra中修饰部分的硷基顺序（在上面的）和对应的氨基酸顺序（在下面的）。在图中斜短线表示缺失部分，而符号“Z
”表示加入的部分。
图4pTRPP31-Rb和pTRPP31-Rc的每个修饰部分的碱基顺序（上面的）和相当的氨基酸顺序。图中斜的短线表示缺失部分。
图5pPHOP31-Ra，pPHOP1-Rb和pPHOP31-Rc运载体构建的设计图。图中B，C，E，H，S和Xb分别代表BamH I，Cla I，EcoR I，Hind Ⅲ，Sal Ⅰ的Xba Ⅰ。
图6pGLDP31-Ra，pGLDP31-Rb和pGLDP31-Rc构建的设计图。
图7啤酒酵母AH22R-/pPHOP31-Ra细胞提取液的Western印渍法分析的结果（泳道1），AH22R-/pPHOP31-Rb（泳道2），AH22R-/pPHOP31-Rc（泳道3）和AH22R-/pPHOP31-R（泳道4）。
图8.pTB553和pTB555的构建设计图。
图9.pTB556和pTB558的构建设计图。
图10.pPHO17-1的构建设计图。
图11.pPKT700-1的构建设计图。
图12.pGLD906-1的构建设计图。
图13.pTRPP31-R的构建设计图。
图14.pPHOP31-R的构建设计图。
图15.质粒pBRSal-6d的构建设计图。
图16.质粒pGLDP31-Rd的构建设计图。
图17.质粒pGLDP31-RdT的构建设计图。
图18.质粒pGLDP31-RCT的构建设计图。
图19.pGLDP25-W的构建设计图。
图20.pPHO3125的构建设计图。
图21.pGLD2531的构建设计图。
图22.pGLD25T31CT的构建设计图。
实例
下面的参照例和工作例是为进一步说明本发明。但是，本发明决不限于此。
参照例1.含有酵母可阻遏的酸性单酯酶启动子（PHO5-P）的表达运载体的构建
取大肠杆菌质粒pJAL（50微克）[Kramer，R.A.和Anderson，N.proc.Natl.Acad.sci.usA，77，6541（1980）]，把它含有来自啤酒酵母s288c的可阻遏的酸性磷酸酯酶基因（pH05）和组成的酸性磷酸酯酶基因（pH03）的7.9Kb DNA片段，用20单位限制性内切酶Bam HT（TaKarashuzo）和20单位限制性内切酶salI（TaKara
shuzo），在反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，2毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解3小时，接着在缓冲液[100毫摩尔Tris-HCl，100毫摩尔硼酸，2毫摩尔EDTA（pH8.3）]中，用1.0%琼脂糖（sigma）板进行凝胶电泳在140伏特2小时。电泳以后，把含有0.63KbDNA片段的凝胶薄片封入透析袋中;把透析袋浸入缓冲液中电泳;所说的片段从凝胶上经电洗提下来[McDonell，M.W.等，J.Mol.Biol.，110，119（1977）]。在透析袋中的透析液用酚抽提，并再用醚提提，加NaCl到0.2摩尔浓度，加入2倍体积冷乙醇后放到-20℃使DNA沉淀。
把质粒pSH19的1微克部分用2单位限制性内切酶BamHI和2单位限制性内切酶Sal I在20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH8.0），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，2毫摩尔2-巯基乙醇]在37℃酶解2小时;然后把反应混合液用0.8%琼脂糖板状凝胶在前述操作条件下进行凝胶电泳。电泳以后，应用前述的方法把8.0Kb的DNA片段从凝胶中分离出来，用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀（参阅图10）。
取所说8.0Kb DNA片段的400毫微克部分与前述0.63Kb DNA片段的200毫微克部分相混合，DNA连接是在20微升反应混合液[66毫摩尔Tris-HCl（pH7.6），6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫苏糖醇，1毫摩尔ATP，2单位T4DNA连接酶（TaKarashuzo）]中在14℃进行过夜。用这个反应混合液，按照Cohen等的方法转化大肠杆菌菌株294。从用对氨苄青霉素抗性作为指标所选择到的转化体中，通过检查用上述硷提取法分离到的质粒DNA的分子量和限制性内切酶的酶解式样，选择到一个质粒，pPHO12，它带有插在PSH19的BamHI-SalI位点上，来自pJAI的0.63kbDNA片段（参阅图10）。
取质粒pPHO12DNA3微克部分，用2单位限制性内切酶SalI在20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，175毫摩尔NaCl，0.2摩尔EDTA，7毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酯解2小时，接着用酚脱蛋白和用冷酒精沉淀DNA。取这个DNA的3微克部分，用12单位的BAL31核酸酶（Bethesda研究实验室出品）于50微升反应混合液[20毫摩尔Tris-HCl（pH8.1），12毫摩尔CaCl2，12毫摩尔MgCl2，1毫摩尔EDTA）在30℃处理2分钟，随之用酚脱蛋白，用冷乙醇沉淀DNA（参阅图10）。
取Xhol连接子d（CCTCGAGG）]200毫微克;新英格兰生物实验室出品），在50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.6），10毫摩尔MgCl2，10毫摩尔2-巯基乙醇，100微摩尔ATP]中用3个单位T4，多核苷酸激酶在37℃处理1小时使之5′端磷酸化。
取5′端磷酸化的XhoI连接子[5′-P-d（CCTCGAGG）]40毫微克部分与上述经BAL-31处理过的pPHO12DNA400毫微克混合并在T4DNA连接酶存在和上述条件下实现连接。利用这个反应混合液，采用Choen等方法转化大肠杆菌294。在从用氨苄青霉素抗性作为指标选到的转化体中通过上述的硷提取法分离到的质粒DNA中选到一个质粒，pPHO17，把它用BamH I和Xho I双酶解可以得到0.55Kb片段。用双脱氧核苷酸法[Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463（1977）]，对其硷基顺序的分析表明，经BAL-31核酸酶处理，结果消除了PHO5上从ATG密码子开始的上游20个硷基对（参阅图10）。
然后，取2微克所说质粒pPHO17用4单位限制性内切酶Xho I（Takara Shuzo）在20微升反应混合液（6毫摩尔Tri-HCl（pH7.9），150毫摩尔NaCl，6毫摩尔MgCl2，6毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解2小时，接着用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀DNA。
取所说DNA1微克部分用5单位DNA多聚酶I大片段（新英格兰生物实验室出品）在30微升反应混合液[含40毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.5），6.6毫摩尔MgCl2，1毫摩尔2-巯基乙醇，33微摩尔dATP，33微摩尔dGTP，33微摩尔dTTP，33微摩尔dCTP]中在12℃作用30分钟使粘性末端变成齐头末端，接着用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀DNA。把所说DNA片段500毫微克与50毫微克在上述情况下磷酸化的SalI连接子[5′-P-d（GGTCGACC）]（新英格兰生物实验室出品）混合一起，在上述条件下由T4DNA连接酶作用进行连接。用这个反应混合液按照Cohen等
的方法转化大肠杆菌294;从抗氨苄青霉素的转化体中，回收到一个质粒pPHO17-1，在它上面，质粒pPHO17的Xho I位点已改变成Sal I位点（参看图10）
参照例2含有酵母磷酸甘油酸激酶启动子（PGK-P）的表达运载体的构建
（1）磷酸甘油酸激酶基因（PGK）的克隆化
把从按Cryer，D.R.等方法（细胞生物学方法，12卷第39-44页（1975）]从啤酒酵母菌株Kyokai3（从IFO可以得到）制备得到的染色体DNA（350微克）用200单位限制性内切酶Hind Ⅲ（Takara shuzo）在1毫升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，60毫摩尔NaCl]在37℃酶解三小时，接着就用在参照例1中所叙述的条件在1%琼脂糖板状凝胶电泳。电泳以后，通过琼脂糖凝胶的划分，按照大小的级别把DNA片段分级成部分1-10。相当于每个部分的琼脂糖凝胶小片装入透析袋中加封，应用参照例1中所叙述的条件，DNA就从所说的凝胶小片中被电洗脱下来，洗脱液用酚处理然后加入冷乙醇，从而促使DNA沉淀。从每个部分DNA取出0.5微克，按照参照例1中所叙述的条件，用1%琼脂糖板状凝胶进行电泳，然后用Southern的方法[Southern，E.M.，J.Mol.Biol.98，503（1975）]把DNA吸附在硝酸纤维素泸膜（Schleicher和Schull）上。与编码PGKN端5个氨基酸的寡核苷酸互补的寡核苷酸5′-TGAAGATAAAGACAT-3′，[D-obcon，M.J.等，Nucleic Acid Res.，10，2625（1982）]采用Crea，R.等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765（1978）进行合成;并取所说寡核苷酸1微克与10微居里γ-[32P]ATP（Amersham）在存在10单位多核苷酸激酶和在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.6），10毫摩尔MgCl2，10毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃反应30分钟，从而使5′端标记上32P。在所说的反应混合液中加入10微升200毫摩尔EDTA（pH8.0）;并在用酚脱蛋白以后，把这个混合液装在用TEN缓冲液[10毫摩尔Tris-HCl（pH8.0），200毫摩尔NaCl，1毫摩尔EDTA]中平衡的Sepharose 4B（Pharmacia）柱（0.25×25厘米）。收集在空柱体积附近洗脱出来的标记的寡核苷酸并用它作为探针筛选PGK基因。当用上述硝酸纤维素泸膜完成印渍后和所说的探针，通过上述Southern方法，则探针强烈地与含有2.6-2.9KbDNA片段的第3部分的样本杂交。
然后，取10微克克隆的运载体pTR262[Roberts，T.M.等Gene 12，123（1980）]与10单位限制性内切酶Hind Ⅲ在50微升的反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，60毫摩尔NaCl]中于37℃酶解2小时，接着用酚去蛋白并用冷乙醇沉淀DNA（Hind Ⅲ-酶解pTR262）。取0.1微克Hind Ⅲ-酶解pTR262和0.2微克部分3号的DNA混合一起，按照在参照例1中所述的条件，用T4DNA连接酶进行连接，用所说的反应混合液转化大肠杆菌DH1[Maniatis，T.等，分子克隆化，冷泉港实验室，254-255（1982）]，得到表达四环素抗性的1300个转化体。
从这些转化体中，用上述32P标记的合成探针通过菌落杂交[Su-ggs，s.V.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6613（1981）]，选择到带有pGK基因的转化体。从放射自显影底片给出强信号的转化体中，用上述硷提取的方法分离到一个质粒，pPKT3，用Hind Ⅲ酶解，检查出其上插入有2.95Kb的DNA。通过Southern方法检查确定所说的插入物与所说的探针能杂交。
（2）pGK启动子片段的分离
取质粒pPKT3DNA（50微克）用50单位限制性内切酶Hind Ⅲ在100微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，60毫摩尔NaCl]中在37℃酶解2小时，接着按照参照例1所叙述的条件用1%琼脂糖板状凝胶电泳。电泳以后，按参照例1叙述的方法从凝胶中分离2.95Kb的DNA片段（参阅图11）。
取5微克所说的2.95Kb的DNA片段，用5单位限制性内切酶Sal I在20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，175毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇]，于37℃酶解3小时，接着按照参照例1所叙述的条件，用1.2%琼脂糖板状凝胶进行电泳。电泳以后，按参照例1所叙述的方法从凝胶中分离2.1Kb的DNA片段。取0.5微克所说的2.1Kb的DNA片段与用Hind Ⅲ-Sal Ⅰ酶解质粒pBR322得到的3.74Kb
DNA0.5微克混合，用T4DNA连接酶按照参照例1所叙述的条件进行连接。用所说的反应混合液转化大肠杆菌DHI，并从氨苄青霉素抗性的转化体中回收得所期望的质粒，pPKT101（参阅图11）。
然后，为消除pGK基因中的结构基因区，把所说质粒pPKT101先用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ在30微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl，（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，175毫摩尔NaCl，0.2摩尔EDTA，7毫摩尔2-巯基乙醇]于37℃酶解3小时，随之用酚脱蛋白，用冷乙醇沉淀DNA（Sal Ⅰ-酶解pPKT101）。此后，取1微克Sal Ⅰ-酶解pPKT101用10单位BAL 31核酸酶在20微升反应混合液[20毫摩尔Tris-HCl（pH8.1）]12毫摩尔CaCl2，12毫摩尔MgCl2，1毫摩尔EDTA]中在室温处理5分钟，随之立即加入1倍体积的酚以终止反应，接着进一步用冷乙醇沉淀DNA（BAL-酶解的pPKT101）。取50毫微克磷酸化的Xhol连接子按照参照例1所叙述的与0.2微克BAL酶解的pPKT101相混合，并在T4DNA连接酶存在下按参照例1所述的条件进行连接。用所说的反应混合液转化大肠杆菌DH1，从氨苄青霉素抗性的转化体中，回收到一个pPKT101-衍生的质粒，pPKT567，它缺失起自pPKT101的Sal Ⅰ位点与朝启动子Ⅳ方向延伸的0.69Kb部分。用双脱氧核苷酸方法分析DNA硷基顺序证明，在pPKT567中，BAL酶解已消除pGK结构基因和5′端非编码区域到-24硷基（参阅图11）。
（3）表达运载体的构建
取5微克大肠杆菌-酵母穿梭运载体pSH19，用6单位限制性内切酶Sal Ⅰ在20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，175毫摩尔NaCl，0.2毫摩尔EDTA，7毫摩尔2-巯基乙醇]于37℃酶解2小时，接着用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀DNA。取1微克所说的DNA用DNA多聚酶 Ⅰ大片段按照参照例1所述的条件进行处理，使那里的Sal Ⅰ粘性末端变成齐头末端，把500毫微克所说的DNA片段与50毫微克磷酸化的Xho Ⅰ接头相混合，按参照例1所叙述那样，根据参照例1所述的条件进行连接。用所说的反应混合液转化大肠杆菌DH1，从氨苄青霉素抗性转化体中得到一个带有质粒，pSH19-1，的转化体，它是由改变pSH19的Sal Ⅰ位点为Xho Ⅰ位点所成的（参阅图11）。
取15微克所说质粒pSH19-1的DNA用24单位限制性内切酶Hind Ⅲ于100微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，60毫摩尔NaCl]中在37℃酶解10分钟，接着立即加入10微升0.2摩尔EDTA以终止反应。反应混合液在0.7%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述的条件进行电泳，通过应用参照例1中所述的方法，回收得由在质粒一个Hind Ⅲ位点上酶解生成的8.3Kb片段。取3微克所说的8.3Kb的DNA片段用10单位限制性内切酶Xho Ⅰ（Takara Shuzo）于30微升的反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔MaCl，7毫摩尔2巯基醇]中在37℃酶解2小时，接着用0.7%琼脂糖板状凝胶按参照例1所叙述的条件进行电泳。电泳以后，用参照例1所叙述的方法，从凝胶中分离7.7Kb的DNA片段（参阅图11）。
取10微克在参照例2所叙述的质粒pPKT567DNA，用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ各10单位于50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.6），50毫摩尔NaCl，1毫摩尔2硫苏糖醇，10毫摩尔MgCl2]中在37℃酶解2小时。按照参照例Ⅰ所叙述的条件完成下面1.2%琼脂糖板状凝胶的电泳。从凝胶中分离到1.40Kb的DNA片段（参阅图11）。
把0.2微克所说的1.40Kb的DNA片段与0.5微克上述7.7Kb的DNA片段混合，并用T4DNA连接酶接参照例1所叙述的条件进行连接。用所说的反应混合液转化大肠杆菌DH1，从氨苄青霉素抗性转化体中选出带有所期望的质粒，pPKT700。然后按照参照例1所叙述的步骤，构建具有SalⅠ位点以代替质粒pPKT700中的XhoⅠ位点的质粒，pPKT700-1（参阅图11）。
参照例3含有3磷酸甘油醛脱氢酶启动子（GLD-P）的表达运载体的构建
（1）3磷酸甘油醛脱氢酶基因（GLD）的克隆
用上述Crea，R.等的方法，合成了与GLD部分中编码pgap491的N端5个氨基酸[Holland，J.P.等，J.Biol.Chem.258，5291（1983）]的寡核苷酸互补的5′-AGCAACTCTAACCAT-3′，并按照参照例2（1）中所叙述的步骤标记以32p，用作
为探针。用参照例2（1）中所叙述的硝酸纤维素薄膜和所说的探针，依据Southern印渍法，探针与含有2.0-2.3Kb的DNA片段的第7部分的样本强烈地杂交。
取0.1微克在参照例2（1）中所叙述的HindⅢ酶解pTR262与0.2微克的第7部分的DNA混合，用T4DNA连接酶在参照例1所叙述的条件下，实现连接。用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1，用参照例2（1）中所叙述的方法完成得到约1，200个抗四环素的转化体。从这些转化体的菌落杂交中，选出一个能与32P-标记的探针强烈地杂交。质粒，pGLD9，就是从这个转化体通过上述硷提取的方法分离到的。根据用Hind Ⅲ酶解，检查到有2.2Kb的插入DNA，进一步用Southern方法试验，确定了这个插入物能与所说的探针杂交（参阅图12）。
（2）GLD启动子片段的分离
取100微克质粒pGLD9DNA用50单位限制性内切酶Hind Ⅲ于200毫升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，60毫摩尔NaCl]中，在37℃酶解3小时，接着用1%琼脂糖板状凝胶按照参照例所述的条件进行电泳。电泳完后，通过参照例1所述的方法从凝胶中分离2.2KbDNA片段，取10微克所说2.2KbDNA片段用10单位限制性内切酶HinfⅠ（Takara Shuzo）于50微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇]中，在37℃酶解2小时，接着用GLD的探针和Southern的方法杂交，因此所说的探针是结合到0.5KbDNA片段上（参阅图12）。
取5微克所说0.5Kb DNA片段，用10单位的限制性内切酶Hha Ⅰ（Takara Shuzo）和10单位Tag Ⅰ（新英格兰生物实验室）于30微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，在37℃酶解3小时，接着用1.5%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述的条件电泳。电泳以后，用参照例1所述的方法从凝胶中分离0.36Kb DNA片段（参阅图12）。
取1微克所说的0.36Kb DNA片段用DNA多聚酶Ⅰ大片段按参照例1所述条件进行处理，使其处Tag Ⅰ粘性末端变成齐头末端。然后，取1微克这种片段与50毫微克磷酸化的Xho Ⅰ接头相混合，用T4DNA连接酶按参照例1所述的条件进行连接。其后加入过量的Xho Ⅰ，在37℃酶解4小时后，用Sepharose4B柱按参照例2（1）中所述的条件分离到有连接子的0.36KbDNA片段。
分别地，取10微克上述2.2KbDNA用DNA多聚酶Ⅰ大片段按参照例1所述的条件进行处理，因而使粘性末端变成齐头末端，然后与50毫微克BamHI连接子（新英格兰生物实验室）先按参照例1所述的条件磷酸化（5′-P-d（CGCGGATCCGCG）]，后用T4DNA连接酶按参照例1所述的条件进行连接。其后，加入20单位Bam HI在37℃进行酶解3小时;然后用Sepharose 4B柱按参照例2（1）中所述的条件，分离其上带有连接子的2.2Kb DNA片段。取6微克所说的DNA片段，用2单位限制性内切酶Hha Ⅰ在50微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，于37℃酶解2小时，接着用1%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述的条件电泳。电泳完后，用参照例1所述的方法从凝胶中分离0.75KbDNA片段（参阅图12）。
（3）表达运载体的构建
取10微克在参照例2（3）中所述质粒pSH19-1的DNA用限制性内切酶Bam HI和Xho Ⅰ各10单位于50微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇]中于37℃酶解2小时，接着用1%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述条件电泳。电泳完后，用参照例1所述方法从凝胶中分离8.0KbDNA片段。
取500毫微克所说的8.0KbDNA片段与在参照例3（2）中所述的0.36KbDNA片段200毫微克和0.75KbDNA片段200毫微克混合，用T4DNA连接酶按参照例1中所述条件进行连接。用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1并从氨苄青霉素抗性转化体中分离带有由三个DNA片段连接组成的质粒，pGLD906的转化体。然后，按照参照例1所述的步骤，从所说质粒pGLD906通过把Xho I位点改变成Sal Ⅰ位点而衍生质粒，pGLD906-1（参考图12）。
参照例4能表达乙型肝炎病毒ard亚型表面抗原P31基因的重组DNA的组建和所说DNA对大肠杆菌的转化
在日本的未审核的专利公开号74985/1984和Nucleic.Acids.Res.，11，1747（1983）中所述的质粒pBR322-Bam HI/HBr330DNA（也称作“pHBr330”）是按公开号为201796/1983的日本的未审核专利的参照例1所述的方法制备的。取所述质粒pHBr33050微克用限制性内切酶ECO RI（Takara Shuzo）和Bam HI各20单位于100微升反应混合液[100毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），7毫摩尔NaCl2，50毫摩尔NaCl，7毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解3小时，接着用1.0%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述条件电泳。电泳完后，用参照例1所述的方法从凝胶中分离1.4Kb DNA片段（参考图13）。
取2微克质粒pBR322DNA用限制性内切酶Bam HI和Cla Ⅰ（新英格兰生物实验室）各2单位于20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，2摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解2小时，接着用0.8%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述条件电泳。其后，用参照例1所述的方法从凝胶中分离4.01Kb DNA片段。
取500毫微克上面的4.01Kb DNA片段，500毫微克上述1.4Kb DNA片段以及50毫微克合成的接引头。
d（5′CGATACAATGCAGTGG3′）
3′TATGTTACGTCACCTTAA5′
通过在参照例1中所述的方法使接引头5′端磷酸化，用T4DNA连接酶，按参照例1所述的条件连接在一起。上面的接引头是用磷酸三酯法[Crea，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765（1978）]进行化学合成的。应用上述反应混合液转化大肠杆菌294，并从氨苄青霉素抗性转化体中分离由上面三个DNA连接一起组成的质粒（pHBrP31）（参考图13）。
取1微克质粒pHBrP31 DNA用2单位限制性内切酶Bam HI于20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，2摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解2小时，接着用酚去蛋白，用加入冷酒精沉淀DNA（Bam HI-酶解pHBrP31）。
取500毫微克Bam HI-酶解pHBrP31用DNA多聚酶Ⅰ大片段按照参照例1所述的条件填补使粘性末端变成齐头末端;接着用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀DNA。取300毫微克所说的DNA片段和50毫微克pStI连接子[5′-P-d（GCTGCAGC）]（新英格兰生物实验室），用参照例1的方法磷酸化连接头的5′端，在T4DNA连接酶存在下按参照例1所述的条件连接在一起。用这反应混合物转化大肠杆菌294，并用参照例1所述的方法，核对转化体，分离到一个质粒，pHBrP31-17，它由pHBr31质粒来的Bam HI位点已经改变成Pst I位点（参考图13）。
取50微克所说pHBrP31-17用限制性内切酶Cla I和Pst I（Takara Shuzo）各20单位于100微升反应混合液[20毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），10毫摩尔NaCl2，50毫摩尔（NH4）2SO4）中在37℃酶解3小时，接着用1.0%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述的条件电泳。电泳完后，用参照例1所述的方法从凝胶中分离1.42Kb DNA片段。
取50微克表达运载体pTRP771（在日本的未审核专利公开号201796/1983和Nucleic.Acid.Res.，11，3581（1983）中描述过]用限制性内切酶Cla I和pst I于100微升上述反应混合液中并在相同条件下酶解。反应混合液在1.0%琼脂糖板状凝胶上按参照例1中所述条件进行电泳。电泳完后用参照例1中所述的方法从凝胶中分离3.3Kb DNA片段。
取200毫微克所说的1.42Kb DNA（编码P31的DNA）和500毫微克3.3Kb DNA在T4DNA连接酶存在下按参照例1所述的条件连接在一起。用这个反应混合液去转化大肠杆菌294，通过用参照例1所述的方法分离到一个带有质粒（pTRPP31-R）的转化体：大扬杆菌株（294/pTRPP31-R），而pTRPP31-R质粒包含表达运载体和插在所说运载体上的所说编码P31的DNA（参考图13）。
另外，用质粒pTRPP31-R质粒转化大肠杆菌C600得到大肠杆菌C600/pTRPP31-R株。
参照例5能够用在酵母中表达的乙型肝炎病毒adr亚型表面抗原P31基因的DNA分子的构建和所说DNA分子对酵母的转化
（1）取50微克在参照例4中所述的质粒pKBrP31DNA用限制性内切酶Cla I和Bam HI各20单位于100微升反应混合液[100毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），7毫摩尔MgCl2，100毫摩尔NaCl，2毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解3小时，接着用1.0%琼脂糖板状凝胶按参照例1所述条件进行电泳。此后，用在参照例1中所述的方法从凝胶中分离1.42Kb DNA片段。
取2微克所说的1.42Kb DNA片段，在DNA多聚酶I大片段存在下按照参照例1所述的条件补齐，因而使粘性末端作成齐头末端，接着用酚脱蛋白并用冷乙醇沉淀DNA。取1.5微克所说的DNA与50毫微克经按参照例1所述磷酸化的Sal I连接子，在T4DNA连接酶存在下用参照例1所述的条件连接在一起。在这个反应混合液中加入限制性内切酶Sal I，在37℃保温3小时完成酶解，导致粘性末端的形成。在用酚脱蛋白以用，反应混合液上Sepharose 4B柱，按照参照例2（1）中所述的条件，收集在空柱体积附近洗脱的含有1.43Kb DNA片段的部分。所说的DNA，即编码亚型adr P31的DNA，用冷乙醇沉淀（参考图14）。
取1微克在参照例1中所述的表达运载体pPHO17-1用2单位限制性内切酶Sal I于20微升反应混合液[6毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），6毫摩尔MgCl2，150毫摩尔NaCl，6毫摩尔2-巯基乙醇]中在37℃酶解2小时，接着加入0.1单位硷性磷酸酯酶，再在65℃酶解30分钟。其后用酚进行脱蛋白并加冷乙醇沉淀DNA（Sal I-酶解pPHO17-1）。
然后，取上述1.43Kb DNA片段200毫微克和200毫微克Sal I-酶解的pPHO17-1，在T4DNA连接酶存在下按参照例1所述的条件把它们连接在一起。用这个反应混合液转化大肠杆菌294并用在参照例1中所述的方法检查转化体。这样分离到一个带有质粒pPHOP31-R的转化体（大肠杆菌294/pPHOP31-R），而质粒pPHOP31-R上的1.43Kb DNA片段，含有编码亚型adr P31的DNA插入方向是与pHO-5启动子方向一样。用硷抽提法从这个转化体分离所说质粒pPHOP31-R;并用它通过上述Hinnen等的方法转化酵母寄主啤酒酵母AH22R-，分离到带有所说质粒的酵母转化体（AH22R-/pPHOP31-R）（参看图14）。
参照例6用有GLD启动子外源基因表达运载体构建P25基因表达的质粒
取5微克质粒pPHO17-58（申请号为193765/1984于1984年9月13日登记的日本的专利实施例中叙述过）（日本的未审核专利公开号70989/1986）用限制性内切酶Xho I酶解，并按参照例1中所述的用琼脂糖板状凝胶电泳方法分离含有亚型adwP25基因的0.82Kb DNA片段。取0.5微克所说的DNA与按参照例3所述的用Xho I酶解外源基因表达质粒pGLD906-1所得到的0.1微克DNA相混合，用T4DNA连接酶进行连接。用此反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从一个转化体中得到了质粒，pGLDP25-w，其上带有P25基因的插入方向是与GLD启动子方向相同（图19）。
实施例1 P31经除去第48个氨基酸精氨酸密码子修饰的亚型adr P31基因的构建
取1.0微克质粒pTRPP31-R用2单位限制性内切酶Xho I（Nippon Gene）在15微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，接着用酚去蛋白，用加入冷乙醇沉淀DNA。此DNA再用2.5单位S1核酸酶（Bethesda研究实验室）于20微升反应混合液[30毫摩尔醋酸钠缓冲液（pH4.6），50毫摩尔NaCl，1毫摩尔ZnSO4，5%甘油]中在室温处理30秒钟，接着立即用酚脱蛋白并用加入冷乙醇沉淀DNA。把此DNA与50毫微克5′端磷酸化的Bam HI连接子[5′-P-d（CCGGATCCGG）]（Bethesda研究实验室）混合，并于20微升反应混合液[66毫摩尔Tris-Hcl（pH7.6），6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫苏糖醇，1毫摩尔ATP，2单位DNA连接酶（新英格兰生物实验室）]中在14℃进行连接过夜。在反应混合液中再加入10单位Bam HI（Nippon Gene）。在37℃酶解2小时以后，反应混合液在0.8%琼脂糖板状凝胶于缓冲液[100毫摩尔Tris-Hcl，100毫摩尔硼酸，2毫摩尔EDTA（pH8.3）]中电压140伏电泳2小时。电泳完后把含有带加入其中的Bam HI连接子的3.1Kb和1.6Kb DNA片段的凝胶薄片封装入透析袋中。把透析袋浸没在缓冲液中电泳，而DNA片段在电泳中被洗提[McDonell，M.W.等，
J.Biol.Chem.110，119（1977）]。透析袋中的含有物用酚抽提并再用醚抽提。然后加入NaCl到0.2摩尔的浓度，接着通过加入2体积的冷乙醇使所说的DNA片段沉淀。按照上述的条件，通过用T4DNA连接酶的处理把所说的DNA片段变成环状DNA。在这个反应混合液中加入5单位限制性内切酶Xho I，在37℃酶解2小时以后，把此反应混合液用于转化大肠杆菌DH1（Maniatis，T.等，分子克隆化，冷泉港实验室，254-255（1982）]得到四环素抗性转化体。从一个所说的转化体中得到一个质粒pTRPP31-Ra，它有代替亚型adr P31基因的Xho I位点的Bam HI位点和缺失第48个氨基酸精氨酸的密码子，所说质粒突变位点的顺序表示在图3中。
取1.0微克因限制性内切酶Xho I酶解的质粒pTRPP31-R用5单位的外切核酸酶Bal 31（Bethesda研究实验室）在20微升反应混合液[20毫摩尔Tris-Hcl（pH8.1），12毫摩尔CaCl2，12毫摩尔MgCl2，1毫摩尔EDTA]中于室温酶解3秒钟，接着立即用酚脱蛋白并加冷乙醇使DNA沉淀。把此DNA用T4DNA连接酶按上述的条件连接，使变成环状DNA，之后又用限制性内切酶Xho I酶解。用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1。从这样得的四环素抗性转化体中，通过菌落免疫分析，筛选到与抗HBsAg抗体有反应的克隆，所以能选择出保持P31基因正确阅读框架的质粒。结果得到这样的克隆pTRPP31-Rb和pTRPP31-Rc。用M13双脱氧的方法[Go-shio Ka，K.等.，Saibo Kogaku（细胞工程），1，79-87（1982）]对质粒突变位点顺序的分析。分析的结果表示在图4中。
实施例2 修饰的P31基因在大肠杆菌中的表达
在实施例1中所述的质粒pTRPP31-Ra，pTRPP31-Rb和pTRPP31-Rc用于转化大肠杆菌菌株294和C600得到下面的转化体：294/PTRPP31-Ra，294/pTRPP31-Rb，294/pTRPP31-Rc，C600/pTRPP31-Ra，C600/pTRPP31-Rb和C600/pTRPP31-Rc。
把每个转化体培养在含2.0%葡萄糖和1%酪蛋白氨基酸的M-9培养基中于37℃经时8小时;然后收获细胞，用缓冲液[30毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），50毫摩尔NaCl，5毫摩尔EDTA]洗之。把洗后的细胞悬浮并在含有10毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），5毫摩尔EDTA，1毫摩尔苯甲磺酰氟和5毫克/毫升溶菌酶的裂解液中裂解。加入盐酸胍于裂解液中至最后浓度达到7摩尔;接着在37℃保温2小时。以后把裂解液在每分钟15，000转室温离心15分钟。取得到的上清液的限定量滴到一张溴化氰活化的泸纸上。把这张泸纸浸没有5%甘氨酸溶液[5%甘氨酸，50毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），0.5摩尔NaCl，0.1%Triton X-100]中16小时，然后用清洗液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），0.5摩尔NaCl，0.1%Triton X-100，0.2%牛血清白蛋白]充分清洗。所说的泸纸片用与125I-抗HBsAg单克隆抗体（106CPm/毫升）反应3小时，接着用清洗液清洗。在空气中干燥以后，用伽马线计数器测定这张泸纸片的放射活性，并计算出抗原量。这样得到的结果列于表1中，在那里产量是以每升培养液表示。纯的标准HBsAgP31样品用作分析中的标准。
表1
转化体 HBsAg（毫克/升培养液）
大肠杆菌294/pTRPP31-Ra 1.5
大肠杆菌294/pTRPP31-Rb 1.8
大肠杆菌294/pTRPP31-Rc 2.0
大肠杆菌C600/pTRPP31-Ra 2.3
大肠杆菌C600/pTRPP31-Rb 2.6
大肠杆菌C600/pTRPP31-Rc 2.4
实施例3 用具有PHO-5启动子的外源基因表达运载体构建表达修饰的P31基因的质粒和用所说的质粒对酵母的转化
取5微克pPHOP31-R质粒用10单位限制性内切酶Sal I（Nippon Gene）于30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时。此后，按上述的条件在琼脂糖板状凝胶上分离含有P31基因的1.42Kb的DNA片段，并从凝胶中回收所说的DNA。取0.5微克所说的DNA与0.1微克用限制性内切酶Sal I酶解的pBR322相混合并用T4DNA连接酶进行连接。用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性菌。从一个所说的转化体中得到一个质粒，pBR-Sal-6，在它带有1.42Kb DNA片段中含
有插入在pBR322Sal I位点上的亚型adr P31基因（图5）。
取20微克pBR-Sal-6用10单位限制性内切ECORI（Nippon Gene）于50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解10分钟。（部分酶解），并按上述的条件在琼脂糖板状凝胶上分离到只在所说质粒中存在的二个ECORI位点中一个位点被降解而生成的5.78KbDNA片段。然后，把所说的DNA片段从凝胶中回收（图5）;取2微克所说的5.78Kb DNA用4单位限制性内切酶Xba I（Nippon Gene）于20微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，在37℃酶解2小时。反应混合液的琼脂糖板状凝胶电泳得到5.53Kb DNA（图5）。
取5微克pTRPP31-Ra用10单位ECORI和10单位Xba I酶解，接着就用5%聚丙烯酰胺板状凝胶在缓冲液[100毫摩尔Tris-Hcl，100毫摩尔硼酸，2毫摩尔EDTA（pH8.3）]中于150伏电泳1小时。电泳完后，回收0.25Kb DNA片段。而且，跟着也用同样的方法处理pTRPP31-Rb和pTRPP31-Rc，分别回收得0.25Kb DNA片段。取0.05微克每种0.25Kb DNA片段与0.1微克上述5.53Kb DNA相混合，并用T4DNA连接酶进行连接。用连接混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从这种情况中得到转化体中，分别回收到质粒，pBR-Sal-6a，它带有插在其中的由pTRPP31-Ra衍生的0.25Kb DNA片段，和带有插在其中的由pTRPP31-Rb衍生的0.25Kb DNA片段的质粒pBR-Sal-6b，以及带有插在其中的由pTRPP31-Rc-衍生的0.25Kb DNA片段的质粒pBR-Sal-6c（图5）。
取5微克pBR-Sal-6a用10单位限制性内切酶Sal I酶解，并按上述条件在琼脂糖板状凝胶上分离含有修饰的P31基因的1.42Kb DNA片段。取0.2微克所说的DNA与0.1微克用Sal I酶解质粒pPHO17-1衍生的DNA相混合并用T4DNA连接酶完成连接。用反应混合液转化大肠杆菌DH1，从而得到氨苄青霉素抗性转化体，从所说的转化体中得到带有修饰的P31基因其插入方向与pHO-5启动子相同的质粒，pPHOP31-Ra。同样，得到的质粒，pPHOP31-Rb它带有用Sal I酶解pBR-Sal-6b得到相应的1.42Kb DNA片段其插入方向与pPHO17-1相同;以及得到的质粒，pPHOP31-Rc，它带有用Sal I酶解pBR-Sal-6c得到相应的1.42Kb DNA片段其插入方向与pPHO17-1相同（图5）。
pPHOP31-Ra，pPOHP31-Rb，pPHOP31-Rc分别用于转化酵母寄主啤酒酵母AH22R-得到转化体（AH22R-/pPHOP31-Ra，AH22R-/pPHOP31-Rb和AH22R-/pPHOP31-Rc。
实施例4 用具有GLD启动子外源基因构建表达修饰的P31基因的质粒和用所说质粒对酵母的转化
取0.1微克用Sal I酶解质粒pGLD906-1得到的DNA与0.2微克在实施例3中所述的pBR-Sal-6a衍生来的1.42Kb DNA片段相混合并用T4DNA连接酶实现连接。用连接反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素-抗性转化体。从所说的转化体中，得到一个质粒，pGLDP31-Ra，它带有修饰的插入方向性与GLD启动子相同的P31基因。同样，得到的一个质粒，pGLDP31-Rb，它带有在实施例3中所述的由pBR-Sal-6b得来的插入的方向性与pGLD906-1相同的1.42Kb DNA片段，以及另一个质粒，pGLDP31-Rc，带有在实施例3中所述的由pBR-Sal-6c得来的插入的方向性与pGLD906-1相同的1.42Kb DNA片段（图6）。
把pGLDP31-Ra，pGLDP31-Rb和pGLDP31-Rc分别用去转化酵母寄主啤酒酵母AH22R-得到转化体（AH22R-/pGLDP31-Ra，AH22R-/pGLDP31-Rb，和AH22R-/pGLDP31-Rc）。
实施例5 修饰的P31基因在酵母中的表达
在实施例3和例4得到的带有修饰的P31基因表达质粒的酵母转化体每一个在Burkholder氏的和他的低磷酸盐培养基中于30℃培养2天。此后，收获细胞并用生理盐水清洗。
用裂解酶（Seikagaku Kogyo）按Miyanohara，A.等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80 1（1983）]的方法把细胞变成原生质体。然后把0.1%Triton X-100加入到原生质体液中以提取修饰的P31。裂解液在室温每分钟15，000转离心15分钟。这样得到的上清液用AuszymeⅡ
（Abbott）测定P31的活性。所得到的结果列于表2。每一个P31产量是根据每升培养液计算的。
表2
酵母转化体 修饰的P31（微克/升培养液）
啤酒酵母菌AH22R-/pPHOP31-Ra 259
AH22R-/pPHOP31-Rb 548
AH22R-/pPHOP31-Rc 1，391
AH22R-/pGLDP31-Ra 950
AH22R-/pGLDP31-Rb 950
AH22R-/pGLDP31-Rc 1，402
实施例6 修饰P31蛋白颗粒的生产
把在实施例2中生产过的酵母转化体AH22R-/pPHOP31-Rb在含5%葡萄糖的Burkholder的低磷酸盐培养基中在30℃培养2天。然后收集细胞并用0.85%NaCl清洗。取20克湿的细胞悬浮在含8毫克裂解酶60000，10毫摩尔EDTA，1毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF）和14毫摩尔2-巯基乙醇的80毫升10毫摩尔磷酸钾缓冲液（KPB）中并在室温培育3小时进行裂解。裂解物在每分钟8000转5℃离心10分钟。这样得到沉淀物，它含有细胞膜和细胞壁片段，再悬浮于80毫升10毫摩尔磷酸钾缓冲液（KPB）（pH7.4）-10毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF中，接着在5℃和每分钟8000转离心10分钟。这样得到的沉淀物再一次悬浮在10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF，并通过离心得到沉淀物。由细胞膜和细胞壁碎片组成的所说沉淀物悬浮在80毫升10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF-0.1%Triton X-100中，而把这个混合液在5℃搅拌二小时以提取修饰的P31蛋白。把所说的悬浮液在每分钟8000转5℃离心10分钟得到上清液。修饰的P31蛋白在这个提取液中的含量约为5-10%。
把80毫升所说的提取液加至用10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA平衡的DEAE-Toyopearl（Toyo Soda Kogyo）柱（1.2×6.5公分）上，接着用含有0.1摩尔NaCl的10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA，充分淋洗柱。然后通过逐渐增加NaCl的浓度把修饰的P31蛋白洗脱下来。
用超过滤膜把这样得到的修饰的P31洗脱部分进行浓缩，并把这浓缩物再用先以0.1摩尔KPB（pH7.4）-0.1摩尔NaCl-10毫摩尔EDTA平衡的Sephacryl S-300（Pharmacia出品）柱（1.7×77公分）进行凝胶过滤。把在空柱体积附近洗脱下来的修饰的P31蛋白铺在Beckman Sw41离心管中的5-40%CsCl梯度上，并在5℃每分钟40，000转进行离心16小时。
把修饰的P31部分对10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA进行透析，然后再铺在上述Sw41转头用的离心管中的5-30%蔗糖梯度上，接着用每分钟38，000;转5℃离心6小时。
离心完后，收集含有修饰的P31蛋白部分，在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，检查到凝胶上相当于37千道尔顿的分子量的主区带。
实施例7 质粒pTB553和pTB555的构建
取pTRPB31-R和pTRPP31-Ra（每个10微克）分别用100单位ECO RI甲基化酶（新英格兰生物实验室出品）于50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），1毫摩尔EDTA，5毫摩尔DTT，50微摩尔S-腺苷甲硫氨酸]中37℃作用1小时。ECO RI甲基化酶通过在65℃加热处理5分钟使之失活，并通过酒精沉淀回收DNA。把这个质粒用限制性内切酶Cla I和Pst I各30单位于80微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔DTT，50毫摩尔NaCl]中在37℃酶解1小时，接着用琼脂糖板状凝胶电泳。从而得到含有P31基因或含有修饰的P31基因的1.4Kb DNA片段。取2微克这种DNA用4单位T4DNA多聚酶（PL出品）在30微升反应混合液[33毫摩尔Tris-醋酸盐（pH7.9），66毫摩尔K-醋酸盐，10毫摩尔Mg-醋酸盐，100微克/毫升BSA，0.5毫摩尔DTT，0.2毫摩尔dNTP]中在37℃作用5分钟补齐。通过加入4微升0.2摩尔EDTA（pH7）终止这个反应，并在用酚-氯仿（1∶1）抽提之后用乙醇沉淀回收DNA。取2微克带齐头末端的DNA片段并溶解在15微升连接缓冲液[66毫摩尔Tris-Hcl（pH7.6），6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔DTT，66微摩尔ATP]。在那里再加入0.2微克5′端磷酸化的ECORI连接子[5′-P-d（GGAATTCC）]和2
单位T4DNA连接酶，在14℃进行连接17小时。连接酶通过在65℃热处理10分钟使之失活并加入5体积蒸馏水再用30单位限制性内切酶ECORI于ECORI的反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔2-巯基乙醇，100微克/毫升BSA]中经3小时完成酶解。连接子和与连接子连接的P31DNA在Sepharose 4B柱（直径0.5厘米和长15厘米）彼此分开，并用乙醇沉淀回收与ECORI连接子连接的P31 DNA。
在日本的申请书号中133490/1985[日本的未审核专利公开号63282/1986]的说明书中所述的质粒pTB106的IL-2基因区，分别地把其5′端一边的Pst I酶切位点和3′端一边的Bam HI酶切位点改变成ECO RI位点，而缺失IL-2基因区的pTB389质粒用限制性内切酶ECO RI酶切，用硷性磷酸酯酶处理消除5′端磷酸基团。
把与ECORI连接子连接的1.4KbDNA片段与由pTB389DNA得来的ECORI片段相混合并在T4DNA连接酶存在下完成连接。如果就构建成含SV40启动子用以转化动物细胞的质粒pTB553（含P31）和pTB555（含修饰P31）（图8）。
实施例8 质粒pTB556和pTB558的构建
通过日本的专利申请号为133490/1985[日本的未审核专利公开号、63282/1986]的专利说明书中所述的质粒pTB348的0.95Kb Bam HI片段与所说的专利说明书中描述的质粒pTB399的3.8Kb Bam HI片段，在T4DNA连接酶存在下连接制备的pTB491，用限制性内切酶Hind Ⅲ和Pst Ⅰ酶解分离到1.1Kb DHFR（二氢叶酸还原酶）DNA。
此外，质粒pTB308的构建是通过用S1核酸酶处理带有克隆在其上的鸟类肉瘤病毒（ASV）LTR（Kitamura等.，Nature，297，205-208，（1982）]，的λY73-11A的0.9Kb Hind Ⅲ-Sac IDNA片段，并用Hind Ⅲ连接子连到经上述如此处理过的DNA上，并把此连接产物插到pTB106上的Hind Ⅲ的酶切位点上而成的。然后把这个质粒上ASV LTR的Hind Ⅲ酶切位点上游除去（pTB311），然后又用限制性内切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶解在那里附近除去SV40启动子区（pTB313），接着用限制性内切酶Bst XI酶解除去0.3Kb片段而改变双ASV LTR为单ASV LTR。pTB401就是这样构建的。用限制性内切酶Sal和Pst Ⅱ酶切这个质粒就能得含0.8Kb片段的ASVLTR。
把上述含1.1Kb Hind Ⅲ-Pst Ⅰ片段的DHFRDNA和含0.8Kb Sal Ⅰ-Pst Ⅰ片段二者与通过用限制性内切酶Hind Ⅲ和Sal Ⅰ酶切pTB553或pTB555得到的片段相混合在T4DNA连接酶存在下进行连接。pTB556（含P31）和pTB5558（含修饰的P31）就是这样的构建的（图9）。这些质粒有DHFR基因带有ASVLTR作为启动子，P31基因或修饰的P31基因带有SV40复制起始区作为启动子的这样结构，并都以相同的方向连接一起。
实施例9 动物细胞的转化
把含10%胎牛血清的Eagle氏的MEM培养基放入Falcon平皿（直径6厘米）并接入TK-缺失的L-细胞在37℃培养过夜。以后，把这些细胞（7×105细胞/平皿）与在其附近放入的0.2微克质粒pTK61[通过从大肠杆菌LE578（Gene，7，335-342（1979）;由Dr.Engnist赠与）分离质粒中得到，它带有pBR322-衍生的与含有克隆其中的3.5Kb Bam HI DNA片段的单纯疱疹病毒（HSV）TK基因的重组体，然后重新把含有2Kb Pvu Ⅱ片段（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1441-1445（1981）TK基因克隆在pBR322和10微克pTB553或pTB555DNA按照Graham等的[Virology，52，456-467（1973）]方法相混合。在37℃培养4小时后，用新鲜培养基代替老的培养基并继续培过夜。在第二天，培养基换成含有10%胎牛血清的HAT培养基（含有15微克/毫升次黄嘌呤，1微克/毫升氨基蝶呤，5微克/毫升胸苷和0-25微克/毫升甘氨酸的MEM培养基）。在37℃大约继续培养2-3星期中，每隔3或4天变换一次培养基，变成TK+的细胞增殖并形成集落。
至于质粒pTB556和pTB558，可把DHFR-CHO细胞[Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77，4216-4220（1980）]培养在含有5%胎牛血清的HAM F12培养基，用每平皿1微克质粒，按照Graham等（见上）的方法以获得基因的感染。二天以后，培养基换成含10%透析过的胎牛血清和35微克/毫升脯氨酸的Dulbeco氏的修改的MEM培养基，以后继续在这个选择培养基上培养。大约2-3星期，变成DHFR+的细胞增殖并形
成集落。
实施例10 转化体的纯系化
把在实施例9中得到的各个转化体的细胞用已知的方法（即限制的稀释法）进行纯系化。完成纯系化以后，每个L（TK+）细胞纯系培养在含有10%胎牛血清的Eagle氏的MEM培养基，而每个CHO（DHFR+）细胞纯系培养在含5%胎牛血清和35微克/毫升脯氨酸的Dulbecco氏的修改的MEM培养基。为了分离每个纯系，细胞培养物上清液用AusriaⅡ-125（Dianabbott）分析HBsAg活性。
得到的结果列在表3中。
表3
质粒 转化体（纯系） HBsAg CPm
pTB533L-P31-533-10 4，287
pTB555L-P31-555-4 2，278
pTB556C-P31-556-2 1，137
pTB558C-PP31-558-1 3，002
实施例11 修饰的P31基因产物的内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H处理
取在实施例6所述的啤酒酵母AH22-/pPHOP31-Rb株的0.1克湿细胞通过把它们悬浮在0.5毫升7.5摩尔尿素-10毫摩尔KPB（pH7.4）-10毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF中，加入1克直径0.45-0.5毫米的玻璃珠并用混合器（Taiyo Kagaku自动混合器）剧烈地搅拌进行破碎。所得的混合液在5℃每分钟12，000转离心10分钟以得到上清液。在所说的0.2ml上清液中，加入等体积的0.2摩尔2-巯基乙醇-0.4%SDS-100毫摩尔柠檬酸钠缓冲液（pH5.5），而在提取液中的蛋白酶通过在95℃加热处理5分钟而使之钝化。在所说的0.4毫升提取液中，加入0.8毫升冷乙醇，在冰中保持15分钟后，混合液在5℃每分钟12，000转离心以得到沉淀物。把所说沉淀物悬浮在0.2毫升50毫摩尔的柠蒙酸缓冲液（pH5.5）中。在0.1-毫升的悬浮液部分中，加入0.05单位的内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H（Seikagaku Kogyo）。在37℃反应2小时以后，取反应混合的样本以及未反应的沉淀物的样本在还原条件下进行SDS-聚丙烷酰胺凝胶电泳，并用转移印渍装置（Bio-Rad）把蛋白转移到硝酸纤维素膜上。接着用过氧化酶标记的抗HBsAg抗体（Auszyme Ⅱ;Abbott实验室）和免疫印渍分析盒（Bio-Rad）测定HBsAg表明，反应混合液的样本含有34-千道尔顿P31基因产物。用对HBsAg的单克隆抗体也得到同样的结果。这就说明，37-千道尔顿修饰的P31基因的产物有在其中加入的糖链，而所说糖链的一部分用内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H能被切掉。
实施例12 具有以谷氨酰胺密码子代替亚型adr P31基因的第16和第18氨基酸（精氨酸）密码子的修饰的P31基因的构建
取10微克在实施例3中所述的质粒pBR-Sal-6c用20单位Sal Ⅰ和20单位Xba Ⅰ于20微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]在37℃酶解2小时，接着把反应混合液在5%聚丙烯酰胺板状凝胶电泳。电泳完后，含有0.25KbDNA片段的凝胶小片封装入透析袋中并用实施例1中所述的方法回收0.25Kb DNA片段。取0.2微克双链噬菌体运载体M13mp11 DNA[Messing，J.Methods in Enzymology，101，20（1983）]用2单位Sal Ⅰ和2单位Xba Ⅰ于20微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中酶解2小时，因而使DNA在Sal Ⅰ和Xba Ⅰ位点酶切。限制性内切酶通过把所说的反应混合液在65℃加热处理5分钟而使之失活。取上述0.5微克的0.25Kb DNA片段加到0.01微克所说的DNA，中，此二者DNA于10微升反应混合液在T4DNA连接酶存在下连接一起，并把此连接产物应用Messing，J.的方法[Methodsin Enzymology，101，20（1983）]引入到大肠杆菌JM103中，使其形成噬菌斑。从这白色的噬斑中，得到在M13mp11中带有上述0.25KbDNA片段克隆的M13mp11-101。
通过Messing，J.的方法，从M13mpll-101噬菌体颗粒中制备噬菌体DNA（单链DNA）。应用所说的单链DNA，寡核苷酸-指导诱变（Smith.M.及Gilliams，Genetic Engineering，3，1，1983）进行如下。在1微克单链M13mp11-101DNA中，加入18毫微克包含用磷酸三酯法合成的DNA并用T4多核苷酸激酶使5′
端磷酸化的5′-p-d（AGGCCTTGCACTTGGGGATCTAG）的引物于10微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），10毫摩尔MgCl2]中在90℃热处理5分钟之后，让反应液在室温保持30分钟进行退火。在所说的反应混合液中加入10微升反应混合液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），1毫摩尔ATP，1毫摩尔MgCl2，1毫摩尔dATP，1毫摩尔dCTP，1毫摩尔dGTP，1毫摩尔dTTP，10毫摩尔DTT，2单位DNA多聚酶 Ⅰ大片段（Takarashnzo），0.5单位T4DNA连接酶]，通过在室温作用16小时，单链DNA被修复成双链型式。用这个反应混合液，通过上述的Messing，J.的方法去转化大肠杆菌JM103，令噬菌斑形成。为使从得到的噬菌斑中能够选择到噬菌体DNA含有与上述合成引物相同的顺序所以进行了噬菌斑杂交[Benton，W.D.和Davis，W.R.Science，196，180（1977）]。取1微克上述化学合成的DNA d（AGGCCTTGCACTTGGGGATCTAG）用5单位T4多核苷酸激酶（Takara Shuzo）在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.6），10毫摩尔MgCl2，10毫摩尔2-巯基乙醇]中与20微居里γ-[32P]ATP（Amersham）在37℃反应30分钟使其5′端标记上32P。把等体积的酚加到反应混合液中进行脱蛋白。以后，把反应混合液上到用TEN缓冲液[10毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0），200毫摩尔NaCl，1毫摩尔EDTA]平衡的Sepharose 4B（Pharmacia）柱（0.25×25厘米）回收最先洗脱物32P标记的合成DNA并用作噬斑杂交的探针。应用Benton，W.D.和Davis.R.W.的方法进行噬斑杂交。大约检查4，000个噬斑，结果发现有36个噬斑与探针杂交。从噬菌斑的一个中，分离到噬菌体DNA，用在实施例1中所述的M13双脱氧法对它的DNA硷基顺序的分析证实P31基因的第16个精氨酸（Arg16）和第18个精氨酸（Arg18）的密码子均改变成谷氨酰胺密码子。所说的噬菌体命名为M13mp11-102。
取20微克双链M13mp11-102DNA用40单位ECORI和40单位Xba Ⅰ于100微升反应混合液[50毫摩尔Tris-Hcl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，接着用5%聚丙烯酰胺板状凝胶电泳，通过电泳从凝胶中分离和回收230bPDNA片段。取0.05微克所说DNA片段与0.1微克在实施例2所述的由pBR-Sal-6得来的5.53KbDNA片段相混合，用T4DNA连接酶实现连接。用连接混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从这些所说的转化体中得到带有插入其上的由M13mp11-102得来的230bp DNA片段的质粒pBR-Sal-6d（图15）。在所说的质粒中含有修饰的P31基因是缺失对蛋白酶敏感的Arg48的密码子并具有用谷氨酰胺密码子代替Arg16和Arg18密码子的基因。
实施例13 用具有GLD启动子的表达外源基因运载体构建表达修饰的P31基因的质粒并用所说的质粒转化酵母菌
取5微克在实施例12中所述的pBR-Sal-6d质粒，用10单位Sal Ⅰ酶解，并通过琼脂糖板状凝胶电泳分离到含有1.42KbDNA片段的修饰的P31基因，并从凝胶中回收所说的DNA。取0.2微克所说的DNA与在参照例3中所述用Sal Ⅰ酶解质粒pGLD906-1得到的DNA0.1微克相混合，并用T4DNA连接酶进行连接。用此反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从所说的转化体中，得到一个带有插入其中的方向性与GLD启动子相同的修饰的P31基因的质粒，pGLDP31-Rd（图16）。
用pGLDP31-Rd转化酵母寄主啤酒酵母AH22R-，得到不需要亮氨酸的转化体，AH22R-/pGLDP31-Rd。
实施例14 具有与修饰的P31基因下游区相连的PGK终止密码子的表达修饰的P31基因的质粒的构建和所说质粒对酵母的转化
如在参照例2中所述有磷酸甘油酸激酶（pGK）基因插入其中的质粒pPKT3含有约290bP的pKG基因的3′端非编码区。Hitzeman，R.A.等[Nucleic.Acid.Res.，10，7791-7808（1982）]已经证明，在所说的终止区区域中存在着终止信使RNA的信号，为促进修饰的P31基因转录的完成，所以想把pGK基因的3′端非编码区连接在紧靠修饰的P31基因之后。
因此，取60微克质粒pPKT3用限制性内切酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ各50单位于100微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，
10毫摩尔MgCl2]中在37℃酶解5小时，接着用5%聚丙烯酰胺板状凝胶在缓冲液[100毫摩尔Tris-Hcl，100毫摩尔硼酸，2毫摩尔EDTA（pH8.3）]中于150伏电泳2小时。电泳完后，含有0.28Kb DNA片段的凝胶细片装封入透析袋中，而0.28Kb DNA片段应用参照例1所述的方法从凝胶中洗脱出来，接着用酚和用醚抽提，以后用加入乙醇回收所说的DNA。因为上述的0.28Kb DNA片段，在3′端非编码区之外终止密码子后缺失20bP，而缺失的DNA顺序是应用化学合成的。因之，应用上述Crea，R.等的方法合成了具有下述顺序的DNA：
5′AAATTGAATTAATTGAATTGAAAT3′
3′TTTAACTTAATTAACTTAACTTTAGC5′
并根据参照例1所述的条件把其5′端磷酸化。
取10微克在实施例12所述的质粒pBR-Sal-6d，用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ和10单位限制性内切酶Aha Ⅲ于50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，在37℃酶解2小时，把这反应混合液在0.8%琼脂糖板状凝胶上电泳，因而分离出含修饰的P31基因的0.85Kb DNA片段。从凝胶中回收所说的DNA。
取0.2微克通过用限制性内切酶Hind Ⅲ和Sal Ⅰ酶解质粒pBR322所得到的3.74KbDNA片段，0.05微克上述的0.28KbDNA片段（含有pGK基因的终止区），50毫微克上述磷酸化的化学合成的DNA以及0.1微克上述的0.85Kb DNA片段（含有修饰的P31基因）混合在一起，在T4DNA连接酶存在下按照参照例1所述的条件实现连接。用反应混合液转化大肠杆菌DH1，并从得到的氨苄青霉素抗性转化体中，分离到一个带有由四个DNA片段连接一起组成的质粒，pBR-Sal-6dT的转化体。然后，按照参照例1所述的方法，把所说的质粒pBR-Sal-6dT的Hind Ⅲ位点改变Sal Ⅰ位点而得到质粒，pBR-Sal-6dTS。
取5微克pBR-Sal-6dTS用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，在37℃酶解2小时。然后，按照上述的条件在琼脂糖板状凝胶上分离到含有修饰的P31基因和pGK终止区的一个1.15KbDNA片段并从凝胶中回收所说的DNA。把0.5微克所说的DNA与用Sal Ⅰ酶解质粒pGLD906-1得到的DNA0.1微克相混合，并用T4DNA连接酶进行连接。用反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从一个所说的转化体中，得到带有修饰的P31基因-pGK终止区以与GLD启动子同一方向插入其中的质粒，pGLDP31-RdT（图17）。
用pGLDP31-RdT转化酵母寄主啤酒酵母AH22R-并分离到转化体（AH22R-/pGLDP31-RdT。
实施例15 修饰的P31基因在酵母中的表达
把在实施例13和14中得到的带有各自的修饰的P31基因表达质粒的酵母转化体每一个振摇培养在5毫升培养基中[每升含有3克K2HPO4，30克葡萄糖，4克天门酸胺，100毫克L-组氨酸，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·H2O，330毫克CaCl2·2H2O，0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸和0.002毫克生物素]于37℃一天。然后取2毫升培养物液体转移到18毫升新鲜培养基[每升含有，300毫克KH2PO4，50克蔗糖，4克天门酸胺，100毫克L-组氨酸，1.5克KCl，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·5H2O，330毫克CaCl2·2H2O，10克葡萄糖，25毫摩尔Tris-马来酸盐（pH6.5），0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸，以及0.002毫克生物素]中，进一步在30℃进行振摇培养2天。然后通过离心收集细胞，并用实施例5所述的方法得到细胞提取液和用于分析P31的活性。结果AH22R-/pGLDP31-Rd的P31产量按每毫升培养液计算为29微克而AH22R-/pGLDP31-Rd的P31产量按每毫升培养液计算则为47微克。
实施例16
（1）从细胞中提取
按照实施例15所述方法培养得到的啤酒酵母AH22R-/pGLDP31-Rd，接着就在-20℃冰冻的冷冻保存的酵母细胞（1公斤）均匀地悬浮在含有7.5摩尔尿素，10毫摩尔乙二胺四乙酸四钠（EDTA）2毫摩尔苯甲磺酰氟（PMSF），0.1毫摩尔（P-咪苯）甲磺酰氟盐酸盐（P-APMSF）和10毫摩尔磷酸钠的4，000毫升（pH7.5）缓冲液中。把这个悬浮液放在Dynomill型KDL球磨（WAB.BaSel，瑞士）中，加用0.50-0.75毫米玻璃珠破碎细胞，以4，000毫升/小时流速进行连续地处理，为增加抽提的效率，这步操作重复二次。提取液13，900Xg离心30分钟得到5，500毫升上清液。用AuSZyme测定，HBsAg浓度为4.2微克/毫升。
（2）用聚乙二醇分级
在上面所得的上清液中，逐步地加入0.5体积33%（W/W）聚乙二醇6000（PEG-6000），接着用13，900Xg离心30分钟，通过这步，HBsAg部分以沉淀物被回收。把所得到的沉淀物溶解在含有7.5摩尔尿素，10毫摩尔EDTA，2毫摩尔pMSF，0.1毫摩尔P-APMSF和10毫摩尔磷酸钠的1，000毫升缓冲液（pH7.5）中，并加入氯化钠至最后浓度0.2摩尔。在这个溶液中再加入0.25体积33%（W/W）pBG-6000，接着便用13，900Xg离心30分钟。在这样得到的上清液中，又再加入0.5体积33%（W/W）pEG-6000，接着用13，900Xg离心30分，使得沉淀物。把这个沉淀物溶解于120毫升5.0摩尔尿素-0.145摩尔氯化钠-5毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH7.5）中。
（3）用SephacrylS-300凝胶过滤
SephacrylS-300（Pharmacia瑞典）柱（5×102厘米，2，000毫升）用5.0摩尔尿素-5毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH7.5）平衡，把上面得到的溶液上柱并用相同的缓冲液进行洗脱。收集相当于柱的空柱体积240-毫升洗脱部分。
（4）超离心
放入Beckman SW-28头的超离心管中的8.5毫升40%氯化铯（CsCl）-5摩尔尿素-2毫摩尔EDTA-1毫摩尔pMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.4）上，铺以8.5毫升30%CsCl-5摩尔尿素-2毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.4），进而把20毫升上述溶液铺在其上面，在4℃每分钟28，000转进行超离心16小时，从而把HBsAg浓缩和纯化在约1.2密度附近。
（5）羟基磷灰石柱
用超离心浓缩和纯化的HBsAg部分对含0.05毫摩尔P-APMSF的50毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.0）中透析一天，然后把它通过用上述缓冲液平衡的羟基磷灰石柱（2.5×10厘米，50毫升）以吸附HBsAg，接着用上述平衡的缓冲液洗柱。
然后用300毫升含有0.05毫摩尔P-APMSF的50毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.0）和300毫升含0.05毫摩尔P-APMSF的600毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.0），以线性浓度梯度洗脱方法对HBsAg进行洗脱。收集HBsAg部分对PBS透析并通过膜过泸器得到有HBsAg蛋白浓度为65微克/毫升的纯化的HBsAg溶液42毫升。
取10毫升上述溶液与有1.18毫克/毫升浓度的55毫升明矾溶液相混，在4℃3小时从而使HBsAg在明矾上吸附。因而得到HBsAg浓度为10微克/毫升的65毫升疫苗。
实施例17 具有与修饰的P31基因下游区相连的GK终止区的修饰的P31基因的表达质粒的构建和所说的转化体对酵母的转化
取10微克在实施例3所述的质粒pBR-Sal-6c用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ和10单位限制性内切酶Xha Ⅰ于50毫升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，接着就进行聚丙烯酰胺板状凝胶电泳。电泳完后，把含有0.25KbDNA的凝胶小片装封入透析袋中用按参照例1所述的方法从凝胶中洗脱DNA片段，接着用酚和醚抽提。以后，用酒精沉淀回收所说的DNA。
取3微克在实施例14中所述的质粒pBR-Sal-6dT用5单位限制性内切酶Sal Ⅰ和5单位限制性内切酶Xba Ⅰ于20微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔
MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，接着进行0.8%琼脂糖板状凝胶电泳，用上述的方法从凝胶中分离和回收4.65KbDNA片段。
把0.05微克上述0.25KbDNA片段和0.2微克4.65KbDNA片段相混合一起，并按照参照例1中所述条件在T4DNA连接酶存在下实现连接。用反应混合液转化大肠杆菌DH1，从氨苄青霉素抗性转化体中，分离到一个带有由上述二个DNA片段连接一起组成的质粒，pBR-Sal-6cT的转化体。然后，按照参照例1所述的步骤，把所说质粒pBR-Sal-6cT上的Hind Ⅲ位点改变成Sal Ⅰ位点而得到质粒，pBR-Sal-6cTS。
取5微克pBR-Sal-6cTS用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37℃酶解2小时。然后，在琼脂糖板状凝胶上按照上述的条件分离1.15KbDNA片段并从凝胶中回收所说的DNA。取0.5微克所说的DNA与0.1微克从pGLD906-1质粒中用Sal Ⅰ酶解得到的DNA相混合，并用T4DNA连接酶进行连接。用这反应混合液转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。从一个所说的转化体中，得到一个带有修饰的P31基因-pGK终止区以与GLD启动子同一方向插入的质粒，pGLDP31-RCT（图18）。
用pGLDP31-RCT，转化酵母，啤酒酵母AH22R-并分离到一个转化体（AH22R-/pGLDP31-RCT）。
实施例18 修饰的P31基因在酵母中的表达
在实施例17中得到的带有修饰的P31基因表达质粒的酵母转化体在5毫升培养基[每升含有3克K2HPO4，30克葡萄糖，4克天门冬酰胺，100毫克L-组氨酸，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·7H2O，330毫克CaCl2·2H2O，0.4毫克CuSO4·0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸和0.002毫克生物素]在30℃振动培养1天。然后把2毫升培养物液转移到18毫升新鲜培养基[每升含有，300毫克KH2PO4，50克蔗糖，4克天门酰胺，100毫克L-组氨酸，1.5克KCl，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·7H2O，330毫克CaCl2·2H2O，10克葡萄糖，25毫摩尔Tris-马来酸盐（pH6.5），0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸和0.002毫克生物素]中再在30℃振动培养2天。用离心收获细胞，用实施例5所述的方法得到细胞提取液和分析P31的活性。结果，AH22R-/pGLDP31-RCT的P31产量按每毫升培养液计算为17.8微克。
实施例19
（1）从细胞中提取
用实施例18所述的方法培养后，就在-20℃冷冻的啤酒酵母AH22R-/pGLDP31-RCT的冷冻保存酵母细胞（500克）均匀地悬浮在2，500毫升内含0.1%聚氧化乙烯（20），山梨聚糖单油酸盐（TWeen-80），7.5摩尔尿素，10毫摩尔乙二胺四乙基四钠（EDAT），2毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF），0.1毫摩尔（P-咪苯）甲基磺酰氟盐酸盐（P-APMSF）和100毫摩尔磷酸钠的缓冲液（pH7.2）把这悬浮液在Dynomill型KDL球磨（WAB，BaSel，瑞士）中，用0.50-0.75毫米的玻璃珠加入以破碎细胞，以4，000毫升/小时流速连续处理。为增加提取的效率，这个操作重复二次。提取液在13，000Xg离心30分钟得到3，300毫升上清液。HBsAg浓度用Auszyme Ⅱ测定为34.6微克/毫升。
（2）用聚乙二醇分级
在上面得到的上清液中逐步地加入0.65体积33%（W/W）聚乙二醇6000（pEG-6000），随之调pH到6.0。混合液搅动30分钟，然后在13，900Xg离心30分钟以沉淀形式回收HBsAg部分。把得到的沉淀物溶解于1000毫升内含7.5摩尔尿素，10毫摩尔EDTA，2毫摩尔PMSF，0.1毫摩尔P-APMSF和100毫摩尔磷酸钠的缓冲液（pH7.2）中，并把pH调到7.0，接着加入氯化钠到最后浓度为0.3摩尔。在这个溶液中加入0.25体积33%（W/W）pEG-6000，30分钟以后，以13，900Xg离心30分钟。在这样得到的上清液
中，再加入0.29体积的33%（W/W）pEG-6000并调pH到6.0，随之搅拌30分钟。把混合液在13，900Xg离心30分钟以收集沉淀。把此沉淀物溶解在120毫升5.0摩尔尿素-0.145摩尔氯化钠-5毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH7.5）中。
（3）用Sephacryl S-300凝胶过滤。
取Sephacryl S-300（Pharmacia，瑞典）柱（5×102厘米，2，000毫升）用5.0摩尔尿素-0.145摩尔氯化钠-5毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH6.0）平衡，并把上述得到的溶液上柱，用相同缓冲液进行洗脱，收集相当于柱的空柱体积的240毫升洗脱部分。
（4）抗体柱
取上面得到的240毫升洗脱液，用0.145摩尔氯化钠-5毫摩尔EDTA-0.1毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH6.0）稀释5倍，并通过用相同缓冲液平衡的并结合有得自小鼠的抗HBsAg抗体[号为PCT/JP85/00161的国际申请书（日本的专利申请书号：4092/1986，于1986，1月10日登记）中参照例1到例3中叙述]的Formyl-Cellulofine柱（200毫升）。用1摩尔硫氰酸铵-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH6.0）清洗HBsAg吸附一柱，并用4摩尔硫氰酸铵-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH6.0）进行洗脱，把约300毫升的洗脱液浓缩成40毫升的体积。
（5）用Sephacrgl S-400凝胶过滤
（将Sephacryl S-400（Pharmacia，瑞典）柱（5×102厘米，2，000毫升）用5.0摩尔尿素-0.145摩尔氯化钠-5毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH6.0）平衡后，把上述得到的浓缩液上柱并用相同的缓冲液洗脱收集HBsAg部分186毫升。把洗脱部分浓缩到120毫升体积。
（6）超离心
放在Beckman SW-28转头的超离心管中的8.5毫升40%氯化铯（CsCl）-5摩尔尿素-2毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.4）上，铺加8.5毫升30%氯化铯-5摩尔尿素-2毫摩尔EDTA-1毫摩尔PMSF-0.05毫摩尔P-APMSF-10毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.4），在其上再铺加20毫升上述溶液。在每分钟28，000转4℃超离心16小时，从而把HBsAg集中和纯化在约1.2密度附近。
把用上述离心得到的浓缩和纯化的HBsAg部分对PBS透析并通过膜滤器得到50毫升纯化的有HBsAg蛋白浓度250微克/毫升的HBsAg溶液。
实施例20
在实施例16中得到的HBsAg就下列性质进行研究：
（1）用Laemmli[（Nature 227，680（1970），]的方法在SDS-聚丙烯酰胺板状凝胶电泳的结果，以及用银染色，在相当于分子量37，000和34，000道尔顿地方的电泳带检查是HBsAg蛋白质。
（2）N端氨基酸顺序
N端氨基酸顺序分析是通过把74.2微克HBsAg蛋白借助自动的Edman降解法应用气相蛋白顺序仪（Applied Biosystems Model 470A，USA）进行的。通过高效液相色分析谱法应用Micro PaK SP-ODS柱（Varianan，USA）对乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）进行鉴定。PTH-氨基酸在各步中检查的结果列于表4。
表4
步别 检查到的主要氨基酸
1 甲硫氨酸
2 谷氨酰胺
3 色氨酸
4 ×
5 ×
6 ×
7 ×
8 苯丙氨酸
9 组氨酸
10 谷氨酰胺
11 丙氨酸
12 亮氨酸
13 亮氨酸
14 门冬氨酸
15 脯氨酸
在表中，×表示未能被鉴定的氨基酸
（3）用电镜观察
用电镜（Nippon Denki，1200E型）观察HBsAg颗粒结果，观察到的颗粒大小为19.1±2.0毫米。
在实施例19中得到的HBsAg经鉴定也有相同的特征。
实施例21 能同时表达亚型adr修饰的P31基因和亚型adw P25基因的质粒的构建1
取30微克在实施例3中所述的亚型adr修饰的P31基因表达质粒pPHOP31-Rc用60单位Sal Ⅰ于100微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解10分钟（部分酶解），用琼脂糖板状凝胶按参照例1所述的方法，分离到酶解质粒上存在的二个Sal Ⅰ位点中的一个所得的9.7KbDNA片段并回收之。取2微克这种DNA片段用4单位限制性内切酶ScaⅠ（新英格兰生物实验室）在20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37℃酶解2小时，并把此反应混合液进行琼脂糖板状凝胶电泳以分离6.85KbDNA。
取20微克在申请号193765/1984的日本专利（日本的未审核专利公开号70989/1985）说明书中所述的亚型adw P25基因表达质粒pPHO17-58用40单位限制性内切酶Bam HI（Nippon Gene）和40单位Hind Ⅲ（Nippon Gene）于100微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，并把反应混合液进行琼脂糖板状凝胶电泳以分离5.5KbDNA。然后，取2微克这种DNA片段用5单位DNA多聚酶 Ⅰ大片段（新英格兰生物实验室）于30微升反应混合液[40毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.5），6.6毫摩尔MgCl2，1毫摩尔2-巯基苏糖醇，33微摩尔dATP，33微摩尔dGTP，33微摩尔dTTP，33微摩尔dCTP]中处理，使DNA片段两端的单链部分变成双链。取50毫微克5′端磷酸化的Sal Ⅰ连接子[5′-p-d（GGTCGACC）]（新英格兰生物实验室）与2微克上述齐头末端DNA片段用T4DNA连接酶连接。反应混合液用酚和用醚抽提并加入NaCl浓度到0.2摩尔。加工体积冷乙醇并使DNA在-20℃沉淀。取2毫克所说的DNA片段用10单位限制性内切酶Sal Ⅰ和4单位Sca Ⅰ在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），10毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37℃酶解3小时，并把反应混合液进行琼脂糖板状凝胶电泳以分离4.2KbDNA片段。
取0.5微克所说的6.85KbDNA片段（来自pPHOP31-RC）和0.5微克4.2KbDNA片段（来自pPHO17-58）在20微升反应液中用T4DNA连接酶把它们连接在一起。用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1从氨苄青霉素抗性菌落中应用微筛选法[Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic.Acid.Res.，7，1513（1979）]选择得pPHO3125。（图20）。
实施例22 能同时表达亚型adr修饰的P31基因和亚型adw P25基因和质粒的构建2
取30微克在参照例6所述的亚型adw P25基因表达质粒pGLDP25-W用50单位限制性内切酶XhoⅠ（Nippon Gene）于100微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中，在37℃酶解10分钟[部分酶解]，并按参照例1所述的方法，用琼脂糖板状凝胶分离到质粒上存在的二个Xho Ⅰ位点只酶切其中一个所得的10.2KbDNA片段并回收之。取4微克这种DNA片段用4单位限制性内切酶Sca Ⅰ酶解在琼脂糖板状凝胶上分离到切下的7.3KbDNA片段并回收之。取1微克所说的DNA片段用DNA多聚酶Ⅰ大片段按照在实施例21所述的方法处理DNA而使XhoⅠ酶切端单链成为双链。
取20微克在实施例4中所述亚型adr修饰的P31基因表达质粒pGLDP31-RC用40单位限制性内切酶Sca Ⅰ和40单位限制性内切酶Bam HI在100微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37℃酶解2小时，并把这反应混合液进行琼脂糖板状凝胶电泳以分离5.4KbDNA片段。取1微克所说的5.4KbDNA片段，用DNA多聚酶Ⅰ大片段按实施例21所述的方法
进行处理，使Bam HI酶切一端单链变成双链。
取0.5微克上述7.3Kb DNA片段（来自pGLDP25-W）和0.5微克5.4Kb DNA片段（来自pGLDP31-RC）在20微升反应混合液中用T4DNA连接酶将其连接一起。应用这个反应混合液转化大肠杆菌DH1，从一个氨苄青霉素抗性菌落中应用微量筛选法分离到pGLD2531（图21）。
实施例23 用pPHO3125和pGLD2531转化酵母菌并用所说的转化体生产HBsAg
取10微克在实施例21中所述的pPHO3125，应用已知的方法[Hinnen，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75，1927（1978）]转化啤酒酵母AH22R-得到不需要亮氨酸的转化体AH22R-/pPHO3125。用10微克在实施例22中所述的pGLD2531通过同样的方法得到转化体AH22R-/pGLD2531。
把带有上述质粒能同时表达亚型adr修饰的P31基因和亚型adw P25基因的酵母转化体，每一个在Buckholder氏的和他的5%蔗糖-低磷酸盐的培养基中在30℃培养2天。以后，收获细胞并用生理盐水清洗。
用Zymolase（Seikagaku Kogyo）按Miyanohara，A.等[Proc.Natl.acad.Sci.USA，80，1（1983）]的方法把细胞变成原生质体。然后加入0.1%Triton X-100于原生质体中抽提HBsAg。裂解液在室温每分钟15，000转离心15分钟。用Auszyme Ⅱ（Abbott）测定这样得到的上清液中HBsAg的活性。结果裂于表5。每个HBsAg产量是根据每升培养液计算。
表5
酵母转化体 HBsAg（微克/升培养液）
啤酒酵母AH22R-/pPHO31258，000
啤酒酵母AH22R-/pGLD253110，000
取20微升所说上清液在还原条件下[Laemmli，U.K.Nature，227，680（1970）]进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用转移印渍装置（Bio-Rad）把蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用过氧化酶标记的抗-HBsAg抗体（Auszyme Ⅱ;Abbott）和免疫印渍分析盒（Bio-Rad）对HBsAg测定表明，AH22R-/pPHO3125的提取液含有37千道尔顿的HBsAg蛋白（+痕量37KD蛋白）和25千道尔顿的HBsAg蛋白，两者比例约为1∶9。AH22R-/pGLD2531的提取液，其37-千道尔顿HBsAg蛋白的量（+痕量34KD）几与25-千道尔顿HBsAg蛋白相等。
实施例24 能够同时表达亚型adr修饰的P31基因和亚型adw P25基因的质粒的构建3GLD906-1
取12微克在参照例3中所述的质粒p用10单位Bam HI和10单位Xho Ⅰ于50微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解3小时，并把反应混合液按前述的条件在1%琼脂糖板状凝胶上进行电泳。电泳完后，用参照例1所述的方法回收含有GLD启动子的1.1KbDNA片段。
取15微克在公开号70989/1986的日本的未审核专利中所述的质粒pPHO17-58，用15单位Xho Ⅰ和15单位Aha Ⅲ在反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37℃酶解3小时，并把此反应混合液按前述的条件在1.2%琼脂糖板状凝胶进行电泳。电泳完后，回收含有亚型adwP25基因的0.69KbDNA片段。
取10微克在实施例17中所述的质粒pBR-Sal-6CT用8单位Hind Ⅲ和8单位Aha Ⅲ于30微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解3小时，并把此反应混合液放在5%聚丙烯酰胺板状凝胶上电泳。电泳完后，回收含有pGK终止区的0.29KbDNA片段。
取3微克质粒pBR322用8单位Hind Ⅲ和8单位Bam HI于20微升反应混合液[10毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），50毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中在37℃酶解2小时，并把此反应混合液放在0.8%琼脂糖板状凝胶上电泳以回收4.02KbDNA片段。
把以上得到的四类DNA片段，通过上述方法混合一起（0.1微克含GLD启动子的1.1KbDNA片段，0.1微克含adwP25基因的0.69KbDNA片段，0.03微克含pGK终止区的0.29KbDNA片段以及0.2微克来自pBR322的4.02Kb DNA片段），并在20微升反应混合液[66毫摩尔Tris-HCl（pH7.6），6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫苏糖醇，1毫摩尔ATP]中，用200单位T4DNA连接
酶在14℃连接16小时。用此反应混合液转化大肠杆菌DH1以得到氨苄青霉素抗性转化体。从一个所说的转化体中分离到一个质粒pSC-HBw1，其中GLD启动子，P25基因和pGK终止区按所期望地连接起来（图22）。
取5微克质粒pSC-HBwl用4单位Hind Ⅲ在20微升反应混合液中在37℃酶解3小时以得到6.1KbDNA片段。把5微克所说DNA片段用5单位DNA多聚酶Ⅰ大片段在30微升反应混合液[40毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH7.5），6.6毫摩尔MgCl2，1毫摩尔2巯基乙醇，33微摩尔dATP，33微摩尔dGTP，33微摩尔dTTP，33微摩尔dCTP]中，使DNA片段二端的单链部分变成双链。在所说的DNA片段里加入100毫微克在5′端磷酸化的Bam HI连接子[5′-CAGATCTG-3′]（新英格兰生物实验室）并用T4DNA连接酶连接，接着用2体积乙醇把DNA沉淀。取所说DNA用8单位Bam HI和20单位Bgl Ⅱ在30微升反应混合液[50毫摩尔Tris-HCl（pH7.5），100毫摩尔NaCl，10毫摩尔MgCl2，1毫摩尔二硫苏糖醇]中于37酶解5小时，反应混合液在1%琼脂糖板状凝胶电泳以分离2.1KbDNA片段。
取0.2微克在实施例17中所述从Bam HI酶解质粒pGLDp31-RCT得来的11KbDNA片段和0.2微克上面的2.1Kb DNA片段相混合在20微升反应混合液[66毫摩尔Tris-HCl（pH7.6），6.6毫摩尔MgCl2，10毫摩尔二硫苏糖醇，1毫摩尔ATP]中用100单位T4DNA连接酶在14℃16小时进行彼此进行。用此反应混合液转化大肠杆菌DH1以得到氨苄青霉素抗性转化体。从一个转化体中得到一个质粒pGLD 25T 31CT（图22）。
实施例25 用pGLD 25T31CT转化酵母菌并用所说转化体生产HBsAg
用10微克在实施例24中所述的pGLD25T31GT转化啤酒酵母AH22R-[Hinnen，A.等.，Proc.NaTl.Acad.Sci.，USA，75，1927（1978）]以得到转化体（AH22R-/pGLD25T31CT）。
把上述转化体在5毫升培养基[每升含有3克K2HPO4，30克葡萄糖，4克天冬酰胺，100毫克L-组氨酸，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·7H2O，330毫克CaCl2·2H2O，0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸和0.002毫克生物素]中在30℃振摇培养1天。然后，取2毫升培养物液转移到18毫升新鲜培养基[每升含有300毫克KH2PO4，50克蔗糖，4克门冬酰胺，100毫克L-组氨酸，1.5克KCl，0.1毫克KI，500毫克MgSO4·7H2O，330毫克CaCl2·2H2O，10克葡萄糖，25毫摩尔Tris-马来酸盐（pH6.5），0.4毫克CuSO4·5H2O，2.5毫克FeSO4·7H2O，0.4毫克MnSO4·4H2O，0.2毫克（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O，3.1毫克ZnSO4·7H2O，10毫克肌醇，0.2毫克硫胺素，0.2毫克吡哆醇，0.2毫克泛酸钙，0.2毫克烟酸和0.002毫克生物素]中，并在30℃再进行振摇培养2天，用离心收集细胞，并用生理盐水清洗。
细胞用Zymolyaes[Seikaga KuKogyo出品]按Miyanohara，A.等方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，801（1983）]改变成原生质体，以后在原生质体中加入0.1%TritonX-100，接着就提取HBsAg。裂解液在室温以15，000转离心15分钟得到上清液。用AuSzyme Ⅱ（Abbott）分析上清液中HBsAg活性表明，每升培养液产生HBsAg20-30毫克。
把15毫克上面细胞悬浮于100微升样品缓冲液[Laemmli，U.K.，Nature，227，680（1970）]中在100℃加热处理10分钟。取30微升得到的上清液进行SDS-聚丙烯酰胺板状凝胶电泳[Laemmli，U.K.，Nature，227，680（1970）]，并用转移印渍装置Bio-Rad把蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用过氧化酶-标记抗-HBsAg抗体（Auszyme Ⅱ;Abbott）和免疫印渍分析盒（Bio-Rad）对HBsAg测定表明，37，34和25千道尔顿蛋白与抗-HBsAg抗体作用。
已经由保存机构保存的微生物和动物细胞系连同它们的保存号列于表6中。
在表中IFO代表大阪，发酵研究所，FRI代表日本，国际贸易和工业部，工业科学和技术局发酵研究所，E.Coli代表大肠杆菌，S.Cererisiae代表啤酒酵母。FERMBP号是按布达佩斯条约规定的保存号。
表6
保存的菌株和细胞系 IFO FRI
CGMCC
（IFO） （FERM）
E.Coli 294 14171
E.Coli 294/pTRPP31-R14355 RP-802
E.Coli C600 14410 BP-808
E.Coli C600/pTRPP31-R14425 BP-807
S.Cerevisiae AH22R-10134 BP-804
S.Cerevisiae AH22R-/pPHO P31-R10135 BP-805
S.Cerevisiae AH22R-/pPHO P31-Ra10154 BP-1060 0098
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD P31-RdT10172 BP-1066 0104
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD P31-Rb10155 BP-1061 0099
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD P31-Rc10156 BP-1062 0100
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD P31-Rd10169 BP-1063 0101
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD P31-RcT10206 BP-1059 0105
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD 17-5810137 BP-854
S.Cerevisiae AH22R-/pPHO312510171 BP-1065 0103
S.Cerevisiae AH22R-/pPHO253110170 BP-1064 0102
S.Cerevisiae AH22R-/pGLD25T31cT10208 BP-1073 0106
C-P31-558-1 50058
E.Coli294是一已知菌株[Backman，K.等.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，73，4174（1974）]。
Claims (15)
1、生产经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adrP31蛋白的方法，该方法包括在适当的培养基中培养携带含有编码经修饰的P31蛋白的DNA的重组DNA的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)转化株，收集该转化株的细胞，溶解或粉碎所收集的细胞和提取经修饰的P31蛋白，
所述的修饰，其特征在于(i)缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病毒表面抗原亚型adrP31蛋白N端的第44位至第49位氨基酸残基的密码子；(ii)乙型肝炎病毒表面抗原亚型adrP31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
2、生产经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P25蛋白的方法，该方法包括在适当的培养基中培养携带含有编码经修饰的P31蛋白和P25蛋白的DNA的重组DNA的啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）转化株，收集该转化株的细胞，溶解或破碎所收集的细胞和提取经修饰的P31蛋白和P25蛋白，
所述的修饰，其特征在于（ⅰ）缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第44位至第49位氨基酸残基的密码子;（ⅱ）乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
3、生产含有编码经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白的DNA的重组DNA的方法，其特征在于（ⅰ）缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第44位至第49位氨基酸残基的密码子;（ⅱ）乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
4、生产含有编码经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白的DNA和编码乙型肝炎病毒表面抗原亚型adw P25蛋白的DNA的重组DNA的方法，所述方法包括将编码经修饰的P31蛋白的DNA和编码P25蛋白的DNA插入到载体中，
所述的修饰，其特征在于（ⅰ）缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第44位至第49位氨基酸残基的密码子;（ⅱ）乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
5、生产携带含有编码经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白的DNA的重组DNA的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转化株的方法，所述方法包括用该重组DNA转化啤酒酵母宿主，
所述的修饰，其特征在于（ⅰ）缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第44位至第49位氨基酸残基的密码子;（ⅱ）乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
6、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pPHOP31-Ra（CGMCC No.0098）。
7、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLDP31-Rb（CGMCC No.0099）。
8、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLDP31-Rc（CGMCC No.0100）。
9、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLDP31-Rd（CGMCC No.0101）。
10、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLDP31-RcT（CGMCC No.0105）。
11、按权利要求5的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLDP31-RdT（CGMCC No.0104）。
12、生产携带含有编码经修饰的乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白的DNA和编码乙型肝炎病毒表面抗原亚型adw P25蛋白的DNA的重组DNA的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转化株的方法，该方法包括用所述重组DNA转化啤酒酵母宿主，
所述的修饰，其特征在于（ⅰ）缺失或用Ser-Ile-Phe-Pro-Asp-Pro-Gly-Thr密码子或Trp-Thr密码子取代乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端第44位至第49位氨基酸残基的密码于;（ⅱ）乙型肝炎病毒表面抗原亚型adr P31蛋白N端的第16位和第18位氨基酸残基的每个密码子都可由Gln密码子取代。
13、按权利要求12的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pPHO3125（CGMCC No.0103）。
14、按权利要求12的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLD2531（CGMCC No.0102）。
15、按权利要求12的方法，其中转化株是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-/pGLD25T31cT（CGMCC No.0106）。
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