CN1030093A - 肽的生产 - Google Patents

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Abstract

一种具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽如S、M 或L蛋白，可分泌到携有重组DNA的真核细胞外， 该重组DNA中有一个编码能在真核细胞内发挥功 能的信号肽的DNA，结合在具有乙型肝炎病毒表面 抗原性的肽的编码DNA的5'，培养携有该重组 DNA的真核细胞即可分泌出上述的肽。尤其是，L 蛋白不仅可分泌到细胞外，而且可在细胞内积聚。
所产生的具有乙型肝炎表面抗原性的肽可用作 预防乙型肝炎病毒感染的疫苗及诊断药盒的试剂。

Description

本发明涉及肽的生产，更具体地说，本发明涉及具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的生产，以及用于生产的DNA和真核细胞。
图1显示编码卵清溶菌酶信号肽的DNA。
图2、图3和图4分别图解说明pGLD    LP31-RcT、pGLD    LP25W和pGLD    LP39-RcT的构建方案。
图5显示编码adr型HBsAg蛋白（M蛋白，S蛋白）的DNA序列及其氨基酸序列;图6显示编码adw型HBsAgS蛋白的DNA序列及其氨基酸序列。
图7显示编码卵清溶菌酶信号肽的DNA序列;图8图解说明pGLD    LIIP39-RcT的构建方案。
乙型肝炎是常见于热带非洲、东南亚和远东地区的病毒性疾病，流行病学研究表明，它可引起慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌。其病原体是乙型肝炎病毒（HBV），一种DNA病毒，为直径42nm的球形颗粒，按发现者的名字命名为Dane氏颗粒。存在于病毒外层的被膜（env）蛋白包括表面抗原（HBsAg）S、M和L蛋白，根据抗原性的不同分为adr、adw、ayr和ayw等几个亚型。在日本只发现了adw和adr型。
除Dane氏颗粒外，在乙型肝炎患者的血液中还发现了小颗粒和管形颗粒，均具有与Dane颗粒同一类型的HBsAg。也已知道，针对病毒表面抗原的抗体也如其他病毒抗体一样能预防病毒感染，而且在HBV感染的情况下，有可能由HBV的HBsAg生产出乙型肝炎疫苗。但是HBV只感染人和黑猩猩;感染培养细胞的尝试尚未获得成功。因此只能由被感染病人的血液中得到HBsAg，而且可得到的小颗粒的量几乎不能满足诊断测试用剂的需要，亦不足以大量生产疫苗。
随着近年分子生物学的进展，已能够在微生物或动物细胞内引入并表达编码非细菌蛋白质的DNA。使用遗传工程技术，已通过在酵母内表达编码env蛋白质中HBsAgS（P25）蛋白的基因产生了HB疫苗[Valenzuela，P.et    al.，Nature，298，347（1982）;Miyanohara，A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1（1983）;Hitzeman，R.A.et    al.，Nucl.Acids    Res.，11，2745（1983）;Harford，N.et    al.，Developments    in    Biological    Standardization，54，125（1983）;Murray，K.et    al.，EMBO    J.，3，645（1984）;Choo，K.B.et    al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，131，160（1985）].
最近已在酵母内表达了编码HBsAgM蛋白（P31）（一种env蛋白质）的基因〔Itoh，Y.et    al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，138，268（1986）;Itoh，Y.and    Fujisawa，Y.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，141，942（1986）〕和编码HBsAg    L蛋白（P39）（也是一种env蛋白质）的基因〔Deoux，P.et    al.，Gene，48，155（1986）〕。通常只经过几个纯化步骤后就可分离出细胞内的基因产物。如产物能分泌到培养基中，纯化和分离将是很容易的。
已经知道，当在动物细胞（作为宿主细胞）中表达S或M基因时，S蛋白颗粒
[Liu，C.C.et    al.，DNA，1，213（1982）;Moriarty，A.M.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，2606（1981）;Dubois，M.F.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4549（1980）;Christman，J.K.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，1815（1982）]，及混合的S和M蛋白颗粒[Michel，M.L.，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，7708（1984）;Michel.，M.L.et    al.，Bio/Technology，3，561（1985）]释放到培养基中，但因为动物细胞的培养方法十分复杂，并从经济观点考虑，动物细胞有较多的缺点。如果酵母将env蛋白质分泌到培养基中，则可望简化免疫原的分离纯化，因为只要由培养基内分离出细胞便可大大减少细胞物质的污染。然而，目前尚没有酵母转化体可将env蛋白颗粒释放到培养基内的报导。
另一方面，已知在急性肝炎患者的血清中，在诱导HBs抗原抗HBs抗体系统、HBc抗原抗HBc抗体系统和HBe抗原抗HBe抗体系统之前，诱导前S抗原抗前S抗体系统〔A.Robert    Neurath    et    al.，Nature，315，154（1985）〕。目前，注意力集中在前S抗原和抗前S抗体在HBV感染中的作用、以及乙型肝炎的发病机制和预防问题上。最近在黑猩猩身上所作用的研究已经证明，针对前S区内前S2肽的抗血清能够中和HBV〔A.Robert    Neurath    et    al.，Vaccine，4，35（1986）〕，而且前S2肽疫苗能够预防由HBV引起的急性肝炎发作〔Y.Itoh    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，9174（1986）〕。据报导，抗前S区中前S1肽的抗体可抑制HBV与肝癌细胞的结合〔A.Robert    Neurath    et    al.，Cell，46，429（1986）〕。已逐步认识到抗前S抗体的主导重要性，并期望开发能诱导抗前S抗体的新型乙型肝炎疫苗。Michel等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，7708（1984）〕将L蛋白基因引入动物细胞（CHO细胞）内，以产生含有M和S蛋白的HBsAg颗粒。已知，其中已引入经修饰的M蛋白基因的酵母，能够产生由两种M蛋白（GP37和GP34）组成的HBsAg颗粒〔Y.Itoh    and    Y.Fujisawa，Biochem.Biophys.Res.Commun.，141，942（1986）〕。最近报导，已成功地表达了L蛋白基因并生产出了一种分子量为39KD的蛋白质（P39）〔P.Dehoux    et    al.，Gene，48，155（1986）〕。然而，当用商品药盒Ausria    Ⅱ（Abbott公司制造）测定时，所生产的HBsAg的量少到每升培养液中只有大约25μg（相当于每1mg总蛋白含0.1-0.2μg）。这个量要比由酵母生产的HBsAgS蛋白颗粒和HBsAg    M蛋白颗粒的量小得多。
本发明人开始研究建立一种通过酵母的细胞外分泌作用生产HBVenv蛋白的方法。
被分泌的蛋白质是在膜结合的多聚核糖体中合成、在内质网的腔侧分离并穿过高尔基器和分泌颗粒分泌到细胞外的〔Blobel，G.and    Dobberstein，B.，J.Cell    Biol.，67，835（1975）〕。已经明确的是，编码分泌蛋白质的基因几乎全都有一个不变的信号肽编码区，该编码区直接连接在所述蛋白质编码区的前面〔Walter，P.et    al.，Cell，38，5（1984）〕。这就是说，这个信号肽必定适应于蛋白质的分泌。
然而，在动物细胞中表达的env蛋白质（HBsAg    S和M）都是独特的蛋白质，因为虽然它们也被分泌到细胞外，但与其他分泌蛋白不同的是，它们都例外地没有这样一个信号肽。有关HBsAg蛋白的分泌曾作过如下解释：这些蛋白质最初是作为内质网的膜蛋白合成的，HBsAg单体聚集在膜上后，向膜的腔内伸出芽状凸起并形成HBsAg颗粒。然后颗粒穿过高尔基器进入分泌颗粒并被分泌到细胞外〔Eble，B.E.et    al.，Mol.Cell    Biol.，6，1454（1986）〕。然而，还没有看到有关酵母（一种类似动物细胞的真核细胞）向细胞外分泌env蛋白颗粒的报导。以重组DNA技术所作研究的结果发现，当本发明人使用包含直接连在env蛋白〔即S（P25）、M（P31、前S2+S）或L（P39、整个前S+S）蛋白〕编码基因前面的各信号肽编码区的基因时，env蛋白颗粒即被分泌到酵母细胞外。本发明人还测定了具有一个重组DNA的酵母的细胞内表达的程度，该重组DNA中，有一个信号肽编码区直接连在L-蛋白基因的前面。经测定发现，这些细胞内的抗原水平意外地比由一个未结合信号肽编码区的重组DNA诱导的抗原水平高得多。
本发明提供一个重组DNA，其中一个编码在真核细胞具有功能活性的信号肽的DNA结合在编码具有HBsAg抗原性的肽的DNA的5′端;本发明提供一种携带所述重组DNA的真核细胞，以及一种生产具有HBsAg抗原性的肽的方法，该方法包括培养携带所述重组DNA的所述真核细胞、在培养基内富集具有HBsAg抗原性的肽以及回收所述的肽。
编码具有HBsAg抗原性的肽的DNA包括adr、adw、ayw和ayr型的S蛋白基因、M蛋白基因和L蛋白基因。这些基因可以被部分地改变（修饰）。当利用产生胰蛋白酶样蛋白酶的酵母作宿主时，L蛋白和M蛋白有可能被蛋白酶降解，因此，最好能对基因作适当改变，以便去掉M蛋白N末端起第48位的精氨酸残基或含有该残基的肽（最好是44-49肽）。优选的基因包括编码图5所示氨基酸序列1-383的L蛋白基因（已修饰过的）、编码氨基酸序列109-383的M蛋白基因（已修饰过的）、及编码氨基酸序列158-383（或图6所示的氨基酸序列）的S蛋白基因。
作为编码信号肽的DNA，只要编码能在真核细胞内发挥功能的信号肽，任何DNA都可以利用，例如下面这些肽的信号序列：接合因子α1〔Brake，A.J.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4642（1984）;Bitter    G.A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5330（1984）〕、SUC2和PHO5〔Smith.R.A.et    al.，Science，229，1219（1985）〕、Killer〔Skipper，N.et    al.，Science，230，958（1985）;Baldari，C.et    al.，EMBO    J.，6，229（1987）〕、内切葡聚糖酶I〔Arsdell，J.N.V.et    al.，Bio/Technology，5，60（1987）〕、IFN-α1、IFN-α2和IFN-γ〔Hitzeman，R.A.et    al.，Science，219，620（1983）〕、泡盛酒曲霉葡糖淀粉酶〔Innis，M.A.et    al.，Science，228，21（1985）〕、小鼠免疫球蛋白λ和μ〔Wood，C.R.et    al.，Nature，314，446（1985）〕、鸡溶菌酶〔Oberto，J.and    Davison，J.，Gene，40，57（1986）〕、小麦α淀粉酶〔Rothstein，S.J.et    al.，Nature，308，662（1984）〕、以及流感HA〔Jabbar，M.A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，2019（1985）〕。这些信号序列都可以被部分地改变（修饰）。
用于表达的启动子可以是任何能在真核细胞内发挥功能的启动子，在酵母中最好使用GLD（GAPH）启动子、PH05启动子、PGK启动子、ADH启动子、以及PH081启动子。
表达载体可以是任何能在真核细胞中复制并能表达已插入的基因的载体。酵母内的表达载体包括pPHO17、pGLD906、和pGLD906-1〔Itoh，Y.et    al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，138，268（1986）〕。
可作宿主的真核细胞包括酵母、真菌及动物细胞，其中优选的是酵母。其中最好是啤酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）。
可通过用限制性酶处理并与适当连接物（adaptor）连接，而由HBV    DNA或其中插入了该DNA的质粒来制备具有HBsAg抗原性的肽的编码DNA。
亦可由含所述DNA的基因以酶学方法制备编码信号肽的DNA。因为信号肽一般都由大约20个氨基酸组成，所以该DNA也易于化学合成。
可用酶学方法由相应的基因制备启动子，亦可用化学方法合成。
可将启动子插入能在宿主内复制的质粒中制得表达载体。可在酵母内复制的质粒包括pSH19。
用酶学方法（DNA连接酶）将编码信号肽的DNA连接到编码具有HBsAg抗原性的肽的DNA的5′端，并将所得DNA产物，即编码具有HBsAg抗原性的肽的DNA与编码信号肽的DNA的结合产物，插入表达载体中启动子的3′端。可在编码具有HBsAg抗原性的肽的DNA的终止密码子之后连接一个链终止区（如PGK终止区），以提高产率，并可在信号肽DNA和HBsAg    DNA之间及启动子和信号肽DNA之间插入一个间隔DNA。间隔DNA最好由大约40个以下碱基组成。
可依照已知方法用重组DNA（质粒）转化真核细胞。
按已知方法培养所得的转化体。用于酵母的培养基包括Burkholder基本培养基〔Bostian，K.L.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505（1980）〕。一般在15℃至40℃，最好在24℃至37℃培养10至96小时，最好是24至72小时，必要时可进行通气或震荡。
根据本发明，通常被分泌到细胞外的具有HBsAg抗原性的肽都是含脂类的颗粒。因此，在培养后很容易借助已知方法（如离心）由培养液中得到上清部分，可适当地结合使用那些通常用于纯化蛋白质的方法来纯化分泌到细胞外的肽，这些方法包括盐析、等电点沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、高效液相层析、亲合层析、蔗糖梯度超离心及氯化铯梯度超离心等。
应特别提到的是，L蛋白不仅可分泌到细胞外，而且也在细胞内大量积聚。为此可在培养后用已知方法收集细胞，并适当地结合使用通常用于纯化蛋白质的方法来纯化细胞内积聚的肽（通常为颗粒），所用方法包括破坏细胞、盐析、沉淀及用聚乙二醇分级分离、凝胶过滤、离子交换层析、高效液相层析、亲合层析、蔗糖梯度超离心及氯化铯梯度超离心等。
本发明制得的env蛋白质与由感染HBV的病人血液中产生的已知HBsAg颗粒有同样的生物活性，可类似于HBsAg颗粒作为疫苗用于预防HBV感染并作为试剂用于诊断药盒（如作为检测抗HBsAg抗体的抗原）。
本说明书及附图中所用的碱基和氨基酸的缩写与IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的缩写一致，或者使用本领域内的惯用缩写法。下面列出了这些缩写的实例。除非特别说明，具有光学异构性的氨基酸都是指它们的L-异构体。
DNA    脱氧核糖核酸
RNA    核糖核酸
mRNA    信使RNA
A    腺嘌呤
T    胸腺嘧啶
G    鸟嘌呤
C    胞嘧啶
dATP    三磷酸脱氧腺苷
dTTP    三磷酸脱氧胸苷
dGTP    三磷酸脱氧鸟苷
dCTP    三磷酸脱氧胞苷
ATP    三磷酸腺苷
EDTA    乙二胺四乙酸
SDS    十二烷基硫酸钠
DTT    二硫苏糖醇
Gly    甘氨酸（G）
Ala    丙氨酸（A）
Val    缬氨酸（V）
Leu    亮氨酸（L）
Ile    异亮氨酸（I）
Ser    丝氨酸（S）
Thr    苏氨酸（T）
Cys    半胱氨酸（C）
1/2Cys    胱氨酸半（half    cystine）
Met    蛋氨酸（M）
Glu    谷氨酸（E）
Asp    天冬氨酸（D）
Lys    赖氨酸（K）
Arg    精氨酸（R）
His    组氨酸（H）
Phe    苯丙氨酸（F）
Tyr    酪氨酸（Y）
Trp    色氨酸（W）
Pro    脯氨酸（P）
Asn    天冬酰胺（N）
Gln    谷氨酰胺（Q）
Apr    氨苄青霉素抗性基因
Tcr    四环素抗性基因
ars1    自主复制序列1
IR    倒位重复
实施例
通过下列实施例更详尽地阐明本发明，但本发明不应只限于此。
寄存携带实施例1中所述质粒的微生物寄存单位及寄存号列于表1中。
表中IFO代表Institute    of    Fermentation，Osaka;FRI代表Fermentation    Research    Institute，Agency    of    Industrial    Science    and    Technology，Ministry    of    International    Trade    and    Industry，Japan.
表1
微生物    IFO    FRI
（IFO）    （FERM）
啤酒酵母 AH22R-/pGLD P31-RcT 10206 BP-1059
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP31-RcT 10337 BP-1744
（P-9320）
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP39-RcT 10336 BP-1745
（P-9321）
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP25W 10338 BP-1746
（P-9323）
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LIIP39-RcT 10426 BP-1747
（P-9648）
也可用SalI消化pGLD P31-R得到pGLD906-1的SalI消化的DNA。携带pGLD P31-R的啤酒酵母AH22R-/pGLD P31-R已寄存在IFO（寄存号为IFO 10145）和FRI（寄存号为FERM BP-800）。
实施例    1
制备编码信号序列的DNA（XhoI-EcoRI）
利用卵清溶菌酶的信号肽作为向培养基内分泌env蛋白质HBsAg的信号序列。参照已知的氨基酸序列〔Jung.A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5759（1980）〕，使用图1（a）所示在5′端具有XhoI位点并且在3′司哂蠩coRI位点的合成核苷酸序列。整个序列包含8个用磷酰胺（phosphamidide）法〔Caruthers，M.H.et    al.，Tetrahedron    Letters，22，1859（1981）〕合成的寡核苷酸构件（＃1、＃2、＃3、＃4、＃5、＃6、＃17、＃18）。
将＃2至＃6和＃17各10μl（5μg）混合。向其中加入20μl 10倍浓缩的激酶缓冲液〔0.5M Tris-HCl、0.1M MgCl2、0.1M巯基乙醇，pH7.6〕、20μl 10mM ATP、20μl（50U）T4多核苷酸激酶（Takara Shuzo有限公司生产）和80μl蒸馏水。于37℃反应2小时，然后于65℃处理20分钟以终止反应。向该反应混合物内加入＃1和＃18各10μl（5μg），再加入10μl T4连接酶（NEB公司生产）。使所得混合物于14℃反应过夜。将反应混合物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，切下80bp片段并经电泳洗脱由凝胶中提取该片段，然后溶解于20μl蒸馏水中。在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中，使1μg噬菌体载体M13mp10〔Messing，J.，Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕的双链DNA与10单位HindⅢ和10单位EcoRⅠ于37℃反应2小时，在HindⅢ位点和EcoRⅠ位点切断该DNA。于65℃加热处理该反应混合物15分钟灭活限制酶。向0.02μg所述DNA中加入0.1μg上述的80bp    DNA片段及0.5μg由DNA
5′-P-d
构成的合成的HindⅢ-XhoⅠ联结子，该联结子用磷酰胺法化学合成，并用T4多核苷酸激酶在5′末端进行了磷酸化。在20μl反应介质中用T4DNA连接酶进行DNA的连接，然后按Messing，J.的方法〔Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕将所得DNA引入大肠杆菌JM103中，以便形成噬菌斑。由白色噬斑中得到M13mp10-80，其中上述的80bp DNA片段被克隆到M13mp10中。于室温下，在1200μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中使20μg M13mp10-80的双链DNA与40单位XhoⅠ和40单位EcoRⅠ反应过夜，并在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离该反应混合物。切下80bp片段并经电泳洗脱由凝胶中提取。将其溶解于10μl蒸馏水中，于-20℃保存（图1和2）。
实施例    2
使用具有适于表达外来基因的CLD启动子的载体构建适于分泌的修饰的M蛋白编码基因的表达质粒，并用该质粒转化酵母
于室温下，在500μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇〕中，使40μg表达修饰的M蛋白（P31）的质粒pGLD P31-RcT（描述于日本专利申请128918号/1986的说明书中）与100单位限制酶EcoRⅠ和Sa1Ⅰ反应过夜，然后在琼脂糖凝胶上电泳，得到含修饰的M蛋白编码基因的1.1kb DNA片段。将0.5μg该DNA和0.5μg实施例1中得到的编码信号序列的DNA与0.05μg经Sa1Ⅰ消化的质粒pGLD906-1（见日本未审查专利公开43991号/1986）的DNA混合，并用T4DNA连接酶进行连接。用所得DNA转化大肠杆菌DH1得到氨苄青霉素抗性转化体。由转化体中得到质粒pGLD LP31-RcT，其中在GLD启动子下游以与启动子相同的方向上，插入了信号序列编码区及修饰的M蛋白编码基因-PGK终止区（图2）。
用pGLD LP31-RcT转化啤酒酵母AH22R-，得到转化体（AH22R-/pGLD LP31-RcT）。
实施例    3
在酵母中表达适于分泌的修饰的M蛋白基因
于30℃在5ml培养基〔每升含有3g K2HPO4、50g葡萄糖、4g天冬酰胺、100mg L-组氨酸、0.1mgKI、500mg MgSO4·7H2O、330mg CaCl2·2H2O、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、0.2mg泛酸钙、0.2mg烟酸和0.002mg生物素〕中将实施例2中制得的含有适于分泌的修饰的M蛋白编码基因表达质粒的酵母转化体振荡培养3天，将2ml培养液移入18ml上述培养基内，然后于30℃培养1天。再将2ml所得培养液移入18ml新鲜培养基〔每升含400mg KH2PO4、80g蔗糖、5g天冬酰胺、300mg L-组氨酸、2.0g KCl、0.1mgKI、650mg MgSO4·7H2O、429mg CaCl2·2H2O、10g葡萄糖、25mM Tris-马来酸（pH6.5）、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、4.0mg泛酸钙、4.0mg烟酸和0.040mg生物素〕中，并于30℃振荡培养3天。72小时后吸出样品并离心（10，000×g，10分钟）分离得到上清和细胞。
使用AuszymeⅡ（Abbott有限公司生产）测定上清中的HBsAg抗原性。结果示于表2;计算每升培养液所产生的HBsAg的量。
实施例4
制备编码信号序列的DNA〔XhoⅠ-TaqⅠ〕
利用卵清溶菌酶的信号肽作为能使env蛋白质HBsAg分泌到培养液内的信号序列。参照已知的氨基酸序列〔Jung，A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5759（1980）〕，使用了如图1（b）所示的在5′端具有XhoⅠ位点、在3′端具有TaqⅠ位点的合成的核苷酸序列。整个序列包含8个按磷酰胺法〔Caruthers，M.H.et    al.，Tetrahedron    Eetters，22，1859（1981）〕合成的寡核苷酸构件（＃1、＃2、＃3、＃4、＃5、＃6、＃7、＃8）。
将＃2至＃7各10μl（5μg）混合，向其中加入20μl 10倍浓缩的激酶缓冲液〔0.5M Tris-HCl、0.1M MgCl2、0.1M巯基乙醇，pH7.6〕、20μl 10mM ATP、20μl（50U）T4多核苷酸激酶（Takara Shuzo有限公司生产）和80μl蒸馏水。反应于37℃进行2小时，然后于65℃处理20分钟终止反应。向该反应混合物内加入＃1和＃8各10μl（5μg），再加10μlT4连接酶（NEB公司生产）。使所得混合物于14℃反应过夜。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离反应混合物，切下76bp片段并经电泳洗脱由凝胶中提取之，将其溶于20μl蒸馏水中。
实施例5
使用具有适于表达外来基因的GLD启动子的载体，构建适于分泌的S蛋白编码基因的表达质粒，并用该质粒载化酵母
于室温下，使80μg表达HBsAg S蛋白（P25）的质粒pHBs51（见日本未审查专利公开70989号/1986）与200单位限制酶HpaⅡ在500μl反应介质〔10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇〕中反应过夜，然后在琼脂糖凝胶上电泳以得到含S蛋白基因的0.815Kb DNA片段。将0.5μg该DNA与5μg实施例4中得到的编码信号序列的DNA混合，并用T4DNA连接酶使之连接，于37℃使所得产物与10单位XhoⅠ和10单位HpaⅡ在40μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应2小时。在琼脂糖凝胶上电泳分离该反应混合物，得到含信号序列的0.891kbs蛋白编码基因片段。使1μg噬菌体载体M13mp9〔Messing，J.，Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕的双链DNA与10单位HindⅢ和10单位PstⅠ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃反应2小时，在HindⅢ位点和PstⅠ位点处切断该DNA。于65℃将该反应混合物加热处理15分钟以灭活限制酶。向0.02μg所述DNA中加入0.1μg上述的0.89Kb    DNA片段、0.5μg由DNA
Figure 881021784_IMG2
构成的合成的HpaⅡ-PstⅠ联结子（该联结子以磷酰胺法化学合成并用T4多核苷酸激酶在5′端进行了磷酸化），和0.5μg实施例1中所用的合成的HindⅢ-XhoⅠ联结子，并在20μl反应介质中用T4DNA连接酶连接各DNA，然后按Messing，J.的方法〔Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕将所得DNA导入大肠杆菌JM103中以便形成噬菌斑。由一个白色噬斑得到M13mp9-LP25，其中0.89Kb DNA片段克隆到M13mp9中。
使20μg M13mp9-LP25的双链DNA与40单位XhoⅠ和40单位SalⅠ在600μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃反应4小时，然后在琼脂糖凝胶上电泳分离该反应混合物，得到含信号序列的0.9Kb S蛋白编码基因片段。0.5μg所述DNA和0.05μg经SalⅠ消化的pGLD906-1质粒DNA（见日本未审查专利公开43991号/1986）混合，用T4DNA连接酶连接之。用所得DNA转化大肠杆菌DH1，得到氨苄青霉素抗性转化体。由转化体中得到质粒pGLD LP25W，其中GLD启动子下游在与启动子相同的方向上插入了信号序列编码区和S蛋白编码基因-PGK终止区（图3）。
用pGLD LP25W转化啤酒酵母AH22R-，得到转化体（AH22R-/pGLD LP25W）。
实施例6
在酵母内表达适于分泌的S蛋白编码基因
将实施例5中制备的含有适于分泌的S蛋白编码基因表达质粒的酵母转化体，于30℃在5ml培养基〔每升含3gK2HPO4、50g葡萄糖、4g天冬酰胺、100mg L-组氨酸、0.1mgKI、500mg MgSO4·7H2O、330mg CaCl2·2H2O、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg （NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、0.2mg泛酸钙、0.2mg烟酸和0.002生物素〕中振荡培养3天，然后将0.5ml培养液移入4.5ml上述培养基中，于30℃培养1天。再将2ml所得培养液移入18ml新鲜培养基〔每升含400mg KH2PO4、80g蔗糖、5g天冬酰胺、300mg L-组氨酸、2.0g KCl、0.1mg KI、650mg MgSO4·7H2O、429mg CaCl2·2H2O、10g葡萄糖、25mM Tris-马来酸（pH6.5）、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、4.0mg泛酸钙、4.0mg烟酸和0.040mg生物素〕中，并于30℃振荡培养3天。72小时后取样，离心（10，000×g，10分钟）分离出上清和细胞。
使用AuszymeⅡ（Abbott有限公司生产）测定上清液的HBsAg抗原性。结果示于表2;计算出每升培养液所产生的HBsAg的量。
实施例7
使用具有适于表达外来基因的GLD启动子的载体，构建适于分泌的修饰的L蛋白编码基因的表达质粒，并用该质粒转化酵母
使20μg质粒pHBr330〔Ono，Y，et al.，Nucl.Acids Res.，11，1747（1983）〕与100单位限制酶BamHⅠ在50μl反应介质〔10mM Tris-HCl（pH7.5）、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃反应2小时，在琼脂糖凝胶上电泳分离，得到3.2kb DNA片段。使10μg该DNA与30单位EcoRⅠ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃反应2小时，然后于65℃下与30单位TaqⅠ反应2小时。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离反应混合物，得到0.34kb DNA片段。用T4DNA连接酶连接7μg所述DNA，并使之与50单位TaqⅠ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于65℃下反应3小时，得到0.68kb DNA片段。在0.5mM dATP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP和0.5mM dTTP存在下，使该片段与5U Klenow片段在100μl反应介质〔33mM Tris-醋酸盐（pH7.9）、66mM醋酸钾、10mg醋酸镁、100μg/ml BSA（牛血清清蛋白）〕中于37℃下反应5分钟，然后加入5μl 0.2M EDTA终止反应，并用苯酚-氯仿（1∶1）去蛋白。向其中加入0.5μg连接物5′-p-d（GGAATTCCTCGACC）和0.5μg5′-p-d（GGTCGAGGAATTCC）（两者都按照磷酰胺法化学合成并借助T4多核苷酸激酶在其5′端进行了磷酸化），并在20μl反应介质中与T4DNA连接酶反应而连接各DNA片段，然后于37℃下与30单位EcoRⅠ反应3小时（0.36Kb DNA）。使1蘥噬菌体载体M13mp9的双链DNA与10单位HindⅢ和10单位Sa1Ⅰ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃下反应2小时，在HindⅢ位点和Sa1Ⅰ位点处切断所述DNA。将该反应混合物于65℃下加热处理15分钟灭活限制酶。向0.02μg所述DNA中加入0.2μg上述的0.36Kb DNA片段、0.5μg用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ处理M13mp10-80（得自实施例1）所得到的85bp片段、以及0.1μg用限制酶EcoRⅠ和Sa1Ⅰ处理质粒pGLD P31-RcT（图2）所得到的1.1Kb DNA片段，并在20μl反应介质中用T4DNA连接酶连接各DNA，然后按Messing，J.〔Methods in EnzyMol.，101，20（1983）〕所述的方法将所得DNA导入大肠杆菌JM103中，以形成噬菌斑。由白色噬斑得到M13mp9-LP39-RcT，其中1.5Kb DNA片段被克隆到M13mp9中。
使20μg M13mp9-LP39-RcT的双链DNA与40单位XhoⅠ和40单位Sa1Ⅰ在600μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃下反应4小时，并在琼脂糖凝胶上电泳分离该反应混合物，得到含有信号序列的1.4Kb修饰的L蛋白编码基因片段。将0.5μg所述DNA和0.05μg经Sa1Ⅰ消化的质粒pGLD 906-1（见日本未审查专利公开43991号/1986）的DNA混合，并用T4DNA连接酶使之连接。用所得DNA转化大肠杆菌DH1，得到氨苄青霉素抗性转化体。由转化体中得到质粒pGLD    LP39-RcT，其中信号序列编码区和修饰的L蛋白编码基因-PGK终止区以与启动子相同的方向插入GLD启动子的下游（图4）。
用pGLD LP39-RcT转化啤酒酵母AH22R-，得到转化体（AH22R-/pGLD LP39-RcT）。
实施例8
在酵母中表达适于分泌的修饰的L蛋白编码基因
将含有实施例7中制备的适于分泌的修饰的L蛋白编码基因表达质粒的酵母转化体，在5ml培养基〔每升含有3gK2HPO4、50g葡萄糖、4g天冬酰胺、100mg L-组氨酸、0.1mgKI、500mg MgSO4·7H2O、330mg CaCl2·2H2O、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、0.2mg泛酸钙、0.2mg烟酸和0.002mg生物素〕中于30℃下振荡培养3天，然后将0.5ml培养液移入4.5ml上述培养基内，于30℃下培养1天。再将2ml所得培养液移入18ml新鲜培养基〔每升含有400mg KH2PO4、80g蔗糖、5g天冬酰胺、300mg L-组氨酸、2.0g KCl、0.1mg KI、650mg MgSO4·7H2O、429mg CaCl2·2H2O、10g葡萄糖、25mM Tris-马来酸（pH6.5）、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、4.0mg泛酸钙、4.0mg烟酸和0.04mg生物素〕中，并于30℃下振荡培养3天。72小时后吸出样品并离心（10，000×g，10分钟）分离成上清和细胞两部分。
使用AuszymeⅡ（Abbott有限公司生产）测定上清液的HBsAg抗原性。结果示于表2，计算出每升培养物所产生的HBsAg的量。
使用AuszymeⅡ测定所得细胞的HBsAg抗原性，所产生的HBsAg量约为每升培养液50mg。
表2
酵母转化体    分泌的HBsAg
（μg/L培养液）
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP31-RcT 350
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP25W 70
啤酒酵母 AH22R-/pGLD LP39-RcT 310
实施例9
制备编码信号序列的DNA〔XhoⅠ-TaqⅠⅡ型〕
利用卵清溶菌酶的信号肽作为使env蛋白HBsAg分泌到培养基内的信号序列。参照已知的氨基酸序列〔Jung，A.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5759（1980）〕，使用了如图7所示在5′端有一个XhoⅠ位点、在3′端有一个TaqⅠ位点的合成的核苷酸序列。整个序列由8个用磷酰胺法〔Caruthers，M.H.et    al.，Tetrahedron    Letters，22，1859（1981）〕合成的寡核苷酸构件（＃1、＃2、＃3、＃4、＃5、＃6、＃27、＃28）组成。
将＃2至＃6和＃27各10μl（5μg）混合，向其中加入20μl10倍浓缩的激酶缓冲液〔0.5M Tris-HCl、0.1M MgCl2、0.1M巯基乙醇，pH7.6〕、20μl 10mM ATP、20μl（50U）T4多核苷酸激酶（Takara Shuzo有限公司生产）和80μl蒸馏水。于37℃反应2小时，然后于65℃下处理20分钟终止反应。向该反应混合物内加入＃1和＃28各10μl（5μg），再加入10μlT4连接酶（NEB公司生产）。使所得到的混合物于14℃反应过夜。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离反应混合物，从凝胶上切下71bp片段并经电泳洗脱提取之，然后将其溶解于20μl蒸馏水中。
实施例10
使用具有适于表达外来基因的GLD启动子的载体构建适于分泌的修饰的L蛋白编码基因的表达质粒，并用该质粒转化酵母
于37℃下使20μg质粒pHBr330〔Ono，Y.et al.，Nucl.Acids Res.，11，1747（1983）〕与100单位限制酶Bam HI在600μl反应介质〔10mM Tris-HCl（pH7.5）、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应2小时，然后在琼脂糖凝胶上电泳分离，得到3.2Kb DNA片段。于37℃使10μg该DNA与30单位EcoRⅠ在20μl反应介质（50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应2小时，然后于65℃下与30单位TaqⅠ反应2小时。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离反应混合物，得到0.34Kb DNA片段。于37℃使2μg质粒载体pUC18的DNA与10单位HindⅢ和10单位EcoRⅠ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应过夜，在HindⅢ位点和EcoRⅠ位点处切断该DNA。保存于-20℃。向0.04μg该DNA中加入0.2μg上述的0.34Kb DNA片段、0.5μg实施例9中得到的71bp片段和0.5μg实施例1所用的合成的HindⅢ-XhoⅠ联结子，并在20μl反应介质中用T4DNA连接酶连接各DNA，然后按Messing，J.〔Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕所述的方法将所得DNA导入大肠杆菌JM103中，以便形成菌落。由白色菌落得到pUC18-0.42DNA，其中0.42Kb DNA片段被克隆到pUC18中。
于37℃使20μg pUC18-0.42DNA与40单位HindⅢ和40单位EcoRⅠ在800μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应过夜，并在琼脂糖凝胶上电泳分离反应混合物，得到0.42kb DNA片段。于37℃下使2μg质粒载体pUC18的DNA与10单位HindⅢ在20μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中反应过夜。使反应混合物中的NaCl浓度达到150mM，于37℃与10单位SalⅠ反应过夜，在HindⅢ位点和SalⅠ位点处切断所述DNA，将所得DNA于-20℃下保存。向0.04μg所述DNA中加入0.5μg上述的0.42kb DNA片段，0.1μg以质粒pGLD P31-RcT与限制酶EcoRⅠ和SalⅠ反应得到的1.1kb DNA片段，用T4DNA连接酶在20μl反应介质中连接各DNA，然后按照Messing，J.〔Methods in Enzymol.，101，20（1983）〕所述方法将所得DNA导入大肠杆菌JM103中，以形成菌落。由白色菌落得到pUC18-LIIP39-RcT，该质粒中1.5kbDNA片段被克隆到pUC18中。
使20μg pUC18-LIIP39-RcT的DNA与40单位XhoⅠ和40单位Sa1Ⅰ在600μl反应介质〔50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇〕中于37℃下反应5小时，在琼脂糖凝胶上电泳分离该混合物，得到含有信号序列的1.5Kb修饰的L蛋白编码基因片段。0.5μg所述DNA和0.05μg SalⅠ消化的质粒pGLD-906-1（见日本末审查专利公开43991号/1986）的DNA混合，用T4DNA连接酶完成DNA的连接。用所得DNA转化大肠杆菌DH1，得到氨苄青霉素抗性转化体。由转化体中得到质粒pGLD LIIP39-RcT，该质粒中，在GLD启动子下游与该启动子相同的方向上，插入了信号序列编码区及修饰的L蛋白编码基因-PGK终止区（图8）。
用pGLD LIIP39-RcT转化啤酒酵母AH22R-，得到转化体（AH22R-/pGLD LIIP39-RcT）。
实施例    11
在酵母中表达修饰的L蛋白编码基因
于30℃下，在5ml培养基〔每升含有3gK2HPO4、50g葡萄糖、4g天冬酰胺、100mg L-组氨酸、0.1mg KI、500mg MgSO4·7H2O、330mg CaCl2·2H2O、0.4mg CaSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoC3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2mg硫胺素、0.2mg吡哆醇、0.2mg泛酸钙、0.2mg烟酸和0.002mg生物素〕中将含有实施例10中制备的修饰的L蛋白编码基因表达质粒的酵母转化体振荡培养3天，然后将0.5ml培养液移入4.5ml上述培养基内，于30℃培养1天。再将2ml所得培养液移入18ml新鲜培养基〔每升含有400mg KH2PO4、80g蔗糖、5g天冬酰胺、300mg L-组氨酸、2.0g KCl、0.1mg KI、650mg MgSO4·7H2O、429mg CaCl2·2H2O、10g葡萄糖、25mM Tris-马来酸（pH6.5）、0.4mg CuSO4·5H2O、2.5mg FeSO4·7H2O、0.4mg MnSO4·4H2O、0.2mg（NH4）3PO4·12MoO3·3H2O、3.1mg ZnSO4·7H2O、10mg肌醇、0.2硫胺素、0.2mg吡哆醇、4.0mg泛酸钙、4.0mg烟酸和0.040mg生物素〕中，于30℃下振荡培养。48小时后吸出样品并离心（10，000×g，10分钟）分离出上清和细胞两部分。
使用AuszymeⅡ（Abbott有限公司生产）测定所得细胞的HBsAg抗原性;所产生的HBsAg的量为每升培养液大约50mg。
实施例12
纯化修饰的L蛋白
（1）由细胞内提取
将150g按照实施例11所述方法培养细胞所得到的并且在-20℃下冷冻保存的啤酒酵母AH22R-/PCLD LIIP39-RcT细胞均匀地悬浮于600ml含有0.1%聚氧乙烯（20）脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）-7.5M尿素-15mM乙二胺四乙酸四钠（EDTA）-2mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）-0.1mM（对脒基苯基）-甲磺酰氟盐酸盐（P-APMSF）-100mM磷酸钠的缓冲液（pH7.2）中，并在冰中用装有玻璃珠（直径0.50-0.75mm）的玻璃珠打浆机（Bead-Beater）（Biospec Products，USA）将悬浮液处理6分钟以破碎细胞。以12，000×g将该提取物离心30分钟得到540ml上清液。
（2）用聚乙二醇分级分离
向如上得到的上清液内逐步加入0.75倍体积的33%（W/W）聚乙二醇6000（PEG-6000），将pH值调到6.0。将混合物搅拌30分钟，以13，900×g离心30分钟，回收作为沉淀物的HBsAg部分。将沉淀物溶解于200ml含有7.5M尿素-15mM    EDTA-2mM    PMSE-0.1mM    P-APMSF-100mM磷酸钠的缓冲液（pH7.2）中，于4℃搅拌过夜。
（3）氯化铯（CsCl）梯度超离心
在一个Beckman    SW-28超离心管内逐层铺加4ml40%氯化铯（CsCl）-5M尿素-2mM    EDTA-1mM    PMSF-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、6ml    3%CsCl-5M尿素-2mM    EDTA-1mM    PMSF-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、7ml    20%CsCl-5M尿素-2mM    EDTA-1mM    PMSF-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、8ml    10%CsCl-5M尿素-2mM    EDTA-1mM    PMSF-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）和13ml上述溶液，于4℃以28，000rpm超离心16小时，浓缩和纯化密度在1.2附近的HBsAg修饰的L蛋白。
将通过上述超离心得到的浓缩和纯化了的HBsAg部分对含有7.5M尿素-15mM EDTA-2mM PMSF-0.1mM P-APMSF-100mM磷酸钠的缓冲液（pH7.2）透析，如此得到的溶液用上述CsCl梯度超离心再进行分级分离。将经过浓缩和纯化的HBsAg部分对PBS（8g/l NaCl、2.9g/l Na2HPO4·12H2O、0.2g/l KH2PO4、0.2g/l KCl）-0.1mM P-APMSF透析，得到31ml HBsAg修饰的L蛋白溶液。
（4）蔗糖梯度超离心
在Beckman    SW-28超离心管中逐层铺加6ml    50%蔗糖-2mM    EDTA-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、6ml    40%蔗糖-2mM    EDTA-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、6ml30%蔗糖-2mM    EDTA-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、6ml20%蔗糖-2mM    EDTA-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）、10%蔗糖-2mM    EDTA-0.05mM    P-APMSF-10mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）和7ml上面（3）中所述的HBsAg修饰的L蛋白溶液，于4℃以28，000rpm超离心16小时，以浓缩和纯化蔗糖浓度35%附近的HBsAg修饰的L蛋白。
将经过上述超离心得到的浓缩并纯化了的HBsAg修饰的L蛋白部分对PBS-0.1mM    P-APMSF透析，再次通过上述蔗糖梯度超离心分级分离所得溶液并透析，得到26ml    HBsAg修饰的L蛋白溶液。
（5）Sephacryl    S-400凝胶过滤
将上述（4）中得到的HBsAg修饰的L蛋白溶液加在用PBS平衡过的Sephacryl    S-400（Pharmacia，Sweden）柱（1.8×85cm，210ml）上，用同样缓冲液洗脱，收集到80ml    HBsAg修饰的L蛋白部分。浓缩洗脱物，得到5.0ml蛋白浓度为335μg/ml的HBsAg修饰的L蛋白的纯化样品。
实施例    13
修饰的L蛋白的性质
就下列性质研究实施例12中得到的HBsAg修饰的L蛋白。
（1）分子量
依照Laemmli〔Nature，227，680（1970）〕的方法所作SDS-聚丙烯酰胺平板凝胶电泳及银染色结果证明，HBsAg修饰的L蛋白系由分子量约为49，000和52，000的糖蛋白组成。
（2）N末端氨基酸序列
使用气相蛋白质序列仪（Applied    Biosystems，470A型，USA），采用自动Edman降解法对2.2毫摩尔HBsAg修饰的L蛋白作N末端氨基酸序列分析。使用Micro    Pak    SP-ODS（Varian，USA）柱，以高效液相层析法鉴定乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。在各步骤中测得的PTH-氨基酸示于表3。
表3
步骤    主要测得的氨基酸
1    Lys
2    Val
3    X
4    Gln
5    Gly
6    Met
7    Gly
8    Thr
9    X
10    Leu
11    X
12    Val
13    Pro
14    Asn
15    Pro
16    Leu
17    Gly
18    Phe
19    Phe
20    Pro
X：未鉴定出的氨基酸
（3）用电子显微镜观察
用电子显微镜（Nippon    Denki，1200E型）观察HBsAg修饰的L蛋白，可见有直径为23.3±3nm的球形颗粒，此外还见有短轴为12.7±1.1nm、长轴为4-120nm的管状颗粒。
（4）C末端氨基酸序列
使用2.04nmol    HBsAg修饰的L蛋白作C末端氨基酸分析，结果显示其C末端氨基酸为异亮氨酸。
实施例    14
修饰的L蛋白的纯化
依照实施例12中所述方法，使用210g冷冻储存的、按照实施例8中所述方法培养细胞并于-20℃下冷冻所得到的啤酒酵母AH22R-/pGLD LP39-RcT，提取并纯化HBsAg修饰的L蛋白，从而得到3.5ml纯化的HBsAg修饰的L蛋白样品，其蛋白质浓度为455μg/ml。
实施例    15
修饰的L蛋白的性质
研究了实施例14中所获HBsAg修饰的L蛋白的下列性质：
（1）分子量
按照实施例13（1）中所述方法分析HBsAg修饰的L蛋白的分子量，结果表明它由分子量50，000和52，000的蛋白质组成。
（2）N末端氨基酸序列
按照实施例13（2）所述方法分析2.7nmol    HBsAg修饰的L蛋白，结果示于表4。
表4
步骤    主要测得的氨基酸
1    Lys
2    Val
3    Met
4    Glu
5    Trp
6    Asn
7    X
8    X
9    X
10    X
11    Gln
12    Gly
13    Met
14    Gly
15    Thr
16    X
17    Leu
18    X
19    Val
20    Pro
X：未鉴定出的氨基酸
（3）用电子显微镜观察
用电子显微镜（Nippon    Denki，1200E型）对HBsAg修饰的L蛋白进行观察，结果可见有直径为24.6±3.9nm的球形颗粒。此外，还主要观察到短轴为13.2±1.7nm、长轴为4-130nm的管状颗粒。
（4）C末端氨基酸
使用2.15nmol    HBsAg修饰的L蛋白进行C末端氨基酸分析，结果测知C末端氨基酸为异亮氨酸。
实施例    16
修饰的M蛋白的纯化
于4℃以13，900×g将实施例3中所述的培养液离心10分钟，得到10l上清液。上清液加硫酸铵至饱和浓度60%后，混合物以12，000×g离心20分钟，回收沉淀的HBsAg修饰的M蛋白部分。将所得沉淀悬浮于70ml    25mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）中，并将悬液对同一缓冲液透析。所得溶液以27，000×g离心10分钟，得到70ml上清液。
（1）抗体柱
使70ml上清液通过用25mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）平衡的Formyl-Cellulofine柱（10ml），该柱结合了国际专利申请PCT/JP85/00161号（日本专利申请4092号/1986，1986年1月10日提交）的参考实施例1-3中所述的得自小鼠的抗HBsAg抗体。用1M硫氰酸铵-10mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）洗涤吸附了HBsAg的柱，并用4M硫氰酸铵-10mM磷酸钠缓冲液（pH6.0）进行洗脱。将洗脱物浓缩至体积为2.2ml。
（2）Sephacyl    S-300凝胶过滤
将上面得到的浓缩液加至用0.85%氯化钠-20mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）平衡过的Sephacyl    S-300（Pharmacia，Sweden）柱（1.8×74cm，3ml）上，用同样缓冲液洗脱。浓缩洗脱物得到1.5ml蛋白浓度为15μg/ml的纯化了的HBsAg修饰的M蛋白样品。
实施例    17
修饰的M蛋白的性质
研究了实施例16中所得HBsAg修饰的M蛋白的下列性质：
（1）分子量
按照Laemmli〔Nature，227，680（1970）〕的方法作SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳并进行银染色，结果表明HBsAg修饰的M蛋白系由分子量为大约34，000、31，000、28，000、24，000、17，000和14，000的蛋白质组成。
（2）电子显微镜观察
用电子显微镜（Nippon    Denki，1200E型）观察HBsAg修饰的M蛋白，结果可见直径为19.4±2.3nm的球形颗粒。
下面列出了质粒中信号肽DNA和HBsAg    DNA之间的间隔DNA序列：
（1）pGLD    LP39-RcT间隔序列
AAG    GTT    ATG    CAG    TGG    AAT    TCC    TCG    ACC    CGA
Lys    Val    Met    Gln    Trp    Asn    Ser    Ser    Thr    Arg
CAA    GGC
Gln    Gly
（2）pGLD    LP31-RcT间隔序列
AAG    GTT
Lys    Val
（3）pGLD    LP25W间隔序列
AAG    GTT    TTC    GGG    ATC
Lys    Val    Phe    Gly    Ile
（4）pGLD    LIIP39-RcT间隔序列
AAG    GTT    CGA    CAA    GGC
Lys    Val    Arg    Gln    Gly
根据本发明，具有HBsAg抗原性的肽分泌到细胞外并易于纯化。特别是L蛋白可分泌到细胞外，亦能在细胞内大量积聚。因此使得大量生产L蛋白成为可能。

Claims (35)

1、一种重组DNA，其中有一个可在真核细胞内发挥功能的编码信号肽的DNA结合在编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′末端。
2、一种根据权利要求1的重组DNA，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
3、一种根据权利要求1的重组DNA，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒S抗原性的肽、具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽、或者是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
4、一种根据权利要求1的重组DNA，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
5、一种根据权利要求1的重组DNA，为一种可在酵母细胞内复制的质粒。
6、一种根据权利要求1的重组DNA，为pGLD  LP31-RcT、pGLD  LP39-RcT、pCLD  LP25W或pGLD  LIIP39-RcT。
7、一种根据权利要求1的重组DNA，为pGLD  LP39-RcT或pGLD  LIIP39-RcT。
8、一种用重组DNA转化的真核细胞，所述重组DNA中有一个编码可在真核细胞内发挥功能的信号肽的DNA，结合在编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′端。
9、一种根据权利要求8的真核细胞，为酵母细胞。
10、一种根据权利要求8的真核细胞，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
11、一种根据权利要求8的真核细胞，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒S抗原性的肽，具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽、或者是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
12、一种根据权利要求8的真核细胞，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
13、一种根据权利要求8的真核细胞，为啤酒酵母AH22R-/pGLD LP39-RcT。
14、一种根据权利要求8的真核细胞，为啤酒酵母A H22R-/pGLD LIIP39-RcT。
15、一种根据权利要求8的真核细胞，为啤酒酵母AH22R-/pGLD LP31-RcT。
16、一种生产具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的方法，包括（1）培养用重组DNA转化的真核细胞，所述重组DNA中有一个编码能在真核细胞内发挥功能的信号肽的DNA，结合在编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′端，（2）在培养基内富集具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽，（3）回收分泌到培养基中的具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽。
17、一种根据权利要求16的方法，其中真核细胞是酵母细胞。
18、一种根据权利要求16的方法，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
19、一种根据权利要求16的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒S抗原性的肽、具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽，或者具有乙型肝炎病毒前S1、S2和S抗原性的肽。
20、一种根据权利要求16的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽。
21、一种生产具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽的方法，包括（1）培养用重组DNA转化的真核细胞，所述重组DNA中有一编码可在真核细胞内发挥功能的信号肽的DNA，结合在编码具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽的DNA的5′端，（2）在培养基内富集具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽，（3）回收具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
22、一种根据权利要求21的方法，其中真核细胞是酵母细胞。
23、一种根据权利要求21的方法，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
24、一种根据权利要求21的方法，其中转化的真核细胞是啤酒酵母AH22R-/pGLD LP39-RcT。
25、一种根据权利要求21的方法，其中转化的婧讼赴瞧【平湍窤H22R-/pGLD LIIP39-RcT。
26、一种生产重组DNA的方法，所述重组DNA中有一个编码可在真核细胞内发挥功能的信号肽的DNA，结合在编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′端，该方法包括将所述的编码信号肽的DNA连接在所述的编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′端。
27、一种根据权利要求26的方法，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
28、一种根据权利要求26的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒S抗原性的肽、具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽、或是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
29、一种根据权利要求26的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
30、一种根据权利要求26的方法，其中重组DNA是可在酵母细胞内复制的质粒。
31、一种生产用重组DNA转化的真核细胞的方法，所述重组DNA中有一个编码可在真核细胞内发挥功能的信号肽的DNA，结合在编码具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽的DNA的5′端，该方法包括用所述重组DNA转化真核细胞。
32、一种根据权利要求31的方法，其中真核细胞是酵母细胞。
33、一种根据权利要求31的方法，其中信号肽是卵清溶菌酶的信号肽。
34、一种根据权利要求31的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒S抗原性的肽、具有乙型肝炎病毒前S2和S抗原性的肽、或者是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
35、一种根据权利要求31的方法，其中具有乙型肝炎病毒表面抗原性的肽是具有乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原性的肽。
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