CN85106190A - 乙型肝炎病毒表面抗原的生产 - Google Patents

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Abstract

乙型肝炎病毒表面抗原P31可用培养承载DNA重组的转化株来生产，其中对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码是插入于启动子区的3′末端。

Description

技术范围
本发明是有关乙型肝炎病毒表面抗原及其生产，更具体地说本发明涉及（1）对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA重组体中的DNA密码是插入3′的启动子终端;（2）上述DNA重组体的生产;（3）转化株承载DNA重组体;（4）上述转化株的生产;（5）非糖基的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白质，和（6）乙型肝病毒表面抗原的生产。
工艺背景
乙型肝炎是一种病毒性疾病，特别是热带的非洲、东南亚和远东经常遭遇和流行这种疾病。它暗示乙型肝炎可转变为慢性肝炎，肝硬变和进一步演变为早期的肝癌。乙型肝炎病毒（下文均简称为HBV）属类病毒，这是一种DNA病毒，它是以球状颗粒存在，直径为42nm，在发现者之后，称为戴恩颗粒。上述颗粒的外层存在着HBV表面抗原（下文均简称为HBsAg），根据不同的抗原性，HPsAg可分为adr、adw、ayr和ayw几种附属型，其中的adw和adr流行于日本。
把乙型肝炎病人的血液加到戴恩颗粒上可以检测到微细的和管状的颗粒。这些颗粒被视为在戴恩颗粒上发现的HBsAg属同一类型。
众所周知，带有其他病的抗体对病毒的表面抗原可以予防感染，HBV的情况也是这样。由此看来，以HBsAg作依据似乎有可能生产疫苗以对抗乙型肝炎。然而，唯有人类和黑猩猩能够受HBV感染，所以到目前为止所有用培养细胞受HBV感染的尝试均告失败。所以暂时HBsAg的唯一可以得到的来源是从受感染的病人血液取得，而微细颗粒也能满意的获取，但这只作为检定试剂使用，而无法满足大规模的疫苗生产。
近期分子生物学的进展可以在非细菌的蛋白质引入DNA密码使其转化为细菌。如果对细菌中的HBsAg结构基团（下文均简写为HBsAg基因）的表达能成为运用DNA重组体技术的结果，那么，摆脱HBV感染危险而大量的生产HBsAg将可能实现，这将为乙型肝炎疫苗的实际应用开拓一条通路。
至于ayw型，那是在当前已知的adw、adr、ayw和ayr中最流行于欧洲和美洲的一种。HBsAg基因的位置和碱基顺序已经测定〔Galibert，F.et    al;Nature，281，646（1979）;Charnay，P.et    al;Nucleic    Acids    Res;7，335（1979）〕，而上述基因在《大肠杆菌》报告（Chanay，P.et    al;Nature，286，893（1980）;Edman，J.C.et    al;Nature，291，503（1981）〕中则表达为杂种蛋白质。
至于adw和adr则流行于日本。一些本发明者成功地创造了一种含有HBsAg的DNA，并在基因组中测定了上述基团的DNA碱基顺序和位置，进一步开创了用栽培的转化株承载DNA的方法大量生产HBsAg（Japanese    published    unexamined    patent    applications    Nos.194897/1983，201796/1983    and    74985/1984）。
最近，Machida，A.et    al.〔Gastroenterology，85，268（1983）;ibid.，86，910（1984）〕证实以病人血浆中取得的HBsAg微细颗粒对乙型肝炎病毒抗原起正反应，HBsAg颗粒中有P31蛋白质（分子重为31千道尔顿）和P35蛋白质（是糖结合P31而形成的结合蛋白，其分子重为35千道尔顿）。另外，迄今为止，认为主要的肽为P-Ⅰ（分子重为22-24千道尔顿）和P-Ⅱ（分子重25-29.5千道尔顿）〔Peterson，D.L.et    al;Proc.Natl.Aead.Sci.USA，74，1530（1977）〕。P31是由P-Ⅰ和前S期区中的氨基酸残基所合成，当加入于P-Ⅰ的N末端时证实聚合的人的血清清蛋白（聚-HSA）受体也在上述区域中出现。而且，1984年的报告引证了上述P31蛋白质有糖链的陈述。另一方面，可以这样考虑，由于在肝细胞上也发现上述受体，所以通过聚-HSA增生取代了戴因颗粒的粘附力。因而，如果在P31上能以抗体掩蔽在戴因颗粒上的聚-HSA受体，那么可以期望能够更有效的避免HVB感染，因为上述颗粒已不能再粘合肝细胞。
本发明涉及乙型肝炎疾毒表面抗原及其生产，更具体地说，本发明提供（1）在DNA重组体中对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码是插入启动子3′终端;（2）DNA重组体的生产;（3）转化株承载上述DNA重组体;（4）上述转化株的生产;（5）非糖基的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白质;（6）乙型肝炎病毒表面抗原P31的生产。而且本发明提供生产乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白质的生产方法。方法包含培养转化株以承载一种对乙型肝炎病毒表面抗原P31有碱基顺序密码的DNA，在培养中富集乙型肝炎病毒抗原P31，收集含有P31的溶液，并用提纯法，包括亲和色谱法处理含P31溶液。
本发明对于乙型肝炎表面抗原P31的DNA密码的实际应用可以是任何类型（adr，adw，ayr或ayw），同时用下述方法可以制备。所以日文版的Unexamined patent application（Ko Kai）No.194897/1983或Nucleic Acid Res;11，1747（1983）述及以碱的解离常数（kb）为3.2的adw HBv DNA插入于PBR 322-EcoRl/HBV 933质粒（下文简写为PHBV 933）。这是根据Hpai和EcoRl限制酶的双重消化作用而产生含有部分前-S区的961 bp DNA断片，以联结上述断片的方法，可以构成P31的DNA密码，而适当的接合体所含顺序为〔 〕另外，在日文版的Unexamined patent application No.74985/1984或Nucleic Acid Res.，11，1747（1983）述及另一选择即以碱的解离常数（kb）为3.19的adr HBV DNA插入于pBR 322-BamHI/HBr 330质粒（下文简写为pHBr 330），借此可以获得含部份前-S区的1398 bp DNA断片，用联结上述接合体于断片的方法可以制取P31的DNA密码。
对adw    HBsAg    P31的DNA密码，例如图1所示在DNA顺序中含28至873号碱基对的DNA;而对adrHBsAg    P31的密码，如图2所示在DNA顺序中含10至855号碱基对的DNA。
编码P31的DNA，它或是病毒的起点或是化学合成体。
对于ayr或ayw    HBsAg    P31的DNA密码可以根据上述同样的方法制取。
DNA重组体可以表达为编码P31的构成是由于启动子区的3′末端插入编码P31的DNA使每个受体都能起作用（例如大肠杆菌、精细杆菌、酵毋和动物细胞）.启动子区可以是任何含有RNA聚合酶结合部位或mRNA合成的起始部位。
大肠杆菌品系的使用，例如作为受体。DNA重组体可以表达为编码P31    DNA的构成是由于编码P31    DNA插入于启动子区3′末端而在大肠杆菌中起作用。举例说，在日本版的Unexamined    patent    application    NO.201796/1983，关于T4    DNA连接酶助剂中曾述及编码P31    DNA可插入象pTRP601或pTRP771载体中。大肠杆菌（如菌株C600，294，W3110，RRI或PR13）用已知方法随其混合物〔Cohen，S.N.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110（1972）〕或其变更而转化。
启动子的应用不限于trp启动子（trp-p），其他象reca启动子（日文版的Unexamined patent application NO.65099/1984〕，lac启动子和λPL启动子也可以用。转化株承载含编码P31 DNA新的重组体DNA，而编码P31 DNA可选用上述方法取得象安苄青霉素抗性和四环素抗性的表现型那样。
为了找出承载含有由抗药性转化株中取得的编码P31 DNA的新的重组体的质粒的株菌，可用下述技术，例如上述5′AATTCCACTGCATTGTAT3′接合体的链之一是用γ-32P-ATP和T4聚核苷酸激酶标记放耐性同位素作用，用此作为探查物和用已知的菌落杂交方法〔Grunstein，M.and Hogness，D.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961（1975）〕，从已经取得的抗药性转化株中必然地可以找出正反应的无性繁殖系（纯系）。
这样选择的转化株是在已知培养基中培养。作为培养基的如L液体培养基、Penassay液体培养基和M-9培养基并补充以葡萄糖和酪蛋白氨基酸〔Miller，J.，Experiments    in    Molecular    Genetics，431-433（Cold    Spring    Harbor    Laboratory，New    York，1972）〕。当有需要的时候，为了有效的启动子功能可加入3β-吲哚丙烯酸。
上述转化株的培养通常是在15°-43℃之间进行，而以28°-40℃之间较好，培养时间2-24小时之间，而以4-16小时之间较好。若需要可通气和（或）搅拌。
当酵母用作受体，可以下列方法制备酵母转化株。大肠杆菌-酵母往复载体YEp13〔Broach，J.R.et    al.，Gene，8，121（1979）〕，pSH15或pSH19〔Harashima，S.et    al.，Mol.Cell.Biol.，4，771（1984）〕，有插入的一个酵母启动子区，如可阻遏的酸性磷酸酶基因启动子区（Meyhack，B.et    al.，EMBOJ.，6，675（1982）〕，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子区〔Holland，J.P.and    Holland，M.J.，J.Biol.Chem.，255，2596（1980）〕或3-磷酸甘油酯激酶基因的启动子区〔Dobson，M.J.et    al.，Nucleic    Acid    Res.，10，2625（1982）〕，在T4DNA连接酶的作用下，编码P31    DNA正联接于上述区之后部。利用反应混合物，上述大肠杆菌受体系是用上面举出的Cohen    et    al方法进行转化。这样产生的转化株承载含编码P    31    DNA的新重组体DNA可以用安苄青霉素抗性作为表现型加以选择。为了找出承载由抗性中取得编码P31新的DNA重组体质粒的品系，同样的可用上述方法。
质粒DNA是由转化株分离出来的，而转化株则以碱萃取方法加以选择〔Birnboim，H.C.and Doly，J.，Nucleic Acid Res.，7，1513（1979）〕并应用于酵母的转化，例如亮氨酸需要的酒酵母菌系象AH22R（leu2 his4 canl cir+pho80）〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1（1983）〕或AH22R--衍生的K33-7B（pho80-AH22，pho8-2）或K33-8D（pho80-AH22，pho8-2trpl）用已知方法〔Hinnen，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927（1978）〕或其变更。酵母作为受体并不限于这些，不过以酒酵母菌系为佳。
酵母是在本来知道的培养基中取得转化。Burkholder在《minimum    medium》中举例说明培养基问题〔Bostian，K.L.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505（1980）〕。
培养的酵母菌转化通常是在15°-40℃之间，而以24℃-37℃之间较好，时间为10-96小时，而以24-72小时较好，若需要可通气和（或）搅拌。
对于精细杆菌的使用，例如作为受体是把编码P31的DNA插入于启动子区的3′末端，使其在精细杆菌或动物细胞中能有功能作用，同时受体是随着生成物DNA重组体而转化。P31可以用培养转化株的方法生产。不过大肠杆菌和酵母是更适宜作受体。
P31的生产可以糖基的形式或非糖基形式。由大肠杆菌转化获得的P31是直实非糖基物，但糖酶的一个分子要联接到一个P31分子上。
一般众所周知的HBsAg    DNA承载转化株的生长是受到表面抗原基因产物的产生的抑制。不过，根据本发明移去生长的抑制作用则P31的产率增高，这和使用编码P31    DNA的结果相同。
P31产物的活性可以用直接免疫测定方法测得〔Fujisawa，Y.et.al.，Nucleic Acid Res.，11，3581（1983）〕，这方法包含把样品结合到溴化氰活性纤维素酶纸上随着与AusriaⅡ-125（Dainabott）的125Ⅰ-反式-HBsAg抗体起反应。
细胞栽培后，以常规方法收集。就大肠杆菌的转化株来说，其细胞可适当处理，这可以把细胞悬浮于含有如尿素或胍氯化物的蛋白质性变剂中。而悬浮液置于凉处并加以搅拌，然后用离心方法分离出含P31上清液或让细胞悬浮于缓冲剂中，然后以声处理，溶菌酶使其破裂和（或）经过冻结和解冻再用离心法分离出含P31的上清液。这是其他方法中最理想的施例，不过要悬浮细胞并采集于缓冲剂中，加溶菌酶，搅匀以引起溶胞作用。再加含尿素（3-10M），搅拌混合物（在0-10℃，0.5-8小时）然后用离心法收集上清液。
就酵母转化株来说，细胞是用裂合酶（Kirin    Brewery    CO.）或用玻璃珠的机械方法。上述方法可加入表面活化剂如Triton（表面活化剂商品名）X-100或脱氧胆酸盐或加入象胍氢氯化物蛋白质变性剂，由此，可以更有利地萃取P31。
上述方法萃取的P31蛋白质的分离和提纯是在提纯方法包括亲和色谱法处理的指导下进行。
亲和色谱法可以说是用聚合的人的血清蛋白（聚-HSA）作为配体或抗体柱处理，用抗体于HBsAg，特别用单无性繁殖系抗体于HBsAg。
亲和色谱法用聚-HSA作为配体对P31蛋白质的提纯最有利作为亲和色谱法中的载体可用的如甲酰-Cellulofine（Seikagaku    Kogyo）或Affi-胶凝15（Bio-Rad），而甲酰-Cellulofine是理想的施例。
利用交联剂（例如戊二醛）可由聚合的人的血清蛋白生产聚-HSA。利用还原制（例如NaCNBH3）可以把聚-HSA结合到上面的载体上，如偶联产物聚-HSA载体的取得洗涤后，若需要，通常为方便其使用而挤入柱管中。
用聚-HSA作配体的亲和色谱法提纯P31蛋白质，上述含P31溶液（细胞抽提物上清液）可以被吸收于上述的管柱中以平衡予置的缓冲剂〔例如磷酸盐〕，然后再以缓冲剂洗脱。上面所说的缓冲剂含有适量的表面活化剂（例如特威恩20）或蛋白质变性剂（尿素）。改变这些添加剂的组合及其浓度就可以用作适当的洗脱剂。含P31蛋白质洗脱物收集后若需要可利用超滤作用加以浓缩，此是一例。
上述浓缩作用更理想的施例是以二硫苏糖醇还原后进一步经用疏水管柱的色谱处理如同高性能液相色谱利用反相管柱或疏水色谱法一样。
在上述高性能液相色谱法中作为载体的，可能提到的有烷基化了的（C1至C18左右）（聚）硅氧烷型载体，例如AP-202 300
Figure 85106190_IMG2
（C8）和AP-224 300
Figure 85106190_IMG3
（C8）（YMC-Shimakyu），超孔RPSC（Beckman）和高孔RP-34（Bio-Rad）.其中AP-202 300 （C8）和AP-224 300
Figure 85106190_IMG5
（C8）都是理想的，而AP-224 300
Figure 85106190_IMG6
（C8）则更为理想。
在疏水色谱中提到的载体可能有丁基-Toyo真珠650M（Toyo苏打生产的）和辛基琼脂糖（凝胶）CL-4B（Pharmacia）.利用反相管柱特别有利于高性触液相的应用。
上述高性能液相色谱使用反相管柱、水、C1至C6低级链烷醇（例如乙醇、丙醇）、乙腈等等。用作洗脱液，理想的施例是用三氟乙酸调节PH为1.2-5.0之间，而流出速率以0.1-100毫升/分为理想0.5-30毫升/分则更理想。
由于要求产生的为白色粉末，这样取得的含P31蛋白质部份可能是冻干的。
这样产出的P31蛋白质，其纯度（比活性）的检验可以用的方法如酶的免疫测定法，这方法包括使样品与带有塑料外壳的聚-HSA起反应和检测聚-HSA结合P31蛋白质。这检测方法是用辣根的过氧化物酶（HRP）偶联反式HB2Ag单无性繁殖系抗体或放射免疫测定法，该方法包括用AusriaⅡ-125（Dainabbott，USA）的125Ⅰ-反式-HBsAg检测聚HSA偶联P31蛋白质。
根据本发明使用生产方法能获得高纯的P31蛋白质，适于作药物用，此是实例。
举例，用本发明的方法在大肠杆菌承载一个对HBsAg    P31有碱基顺序密码的DNA里生产纯化的P31可以获得HBsAg    P31蛋白质，它是真实的纯且具有下列特性：
（1）在SDS-聚丙烯酰胺切片的凝胶电泳中，它是纯系的而用上述电泳（在还原的条件下）测得其分子重为32，000±1，000道尔吨。
（2）它含有蛋氨酸（或甲酰基盐蛋氨酸）。
（3）它含有异亮氨酸如羧基末端氨基酸。
（4）它使聚HSA坚固。
（5）它的比活性不少于1×106单位/毫克。
用本发明的方法生产的真纯P31蛋白质与产自以感染HBV病人的血液作原料的已知HBsAg细颗粒有相同的生物效能如上述HBsAg细颗粒同一方法，可用作检定，预防和（或）治疗HBV感染。
在此所说的为测定蛋白质纯度而作的P31蛋白质活性（比活性）的测定是由ELISA法完成。所以把试液（含P31蛋白质溶液）分为若干分，每分100ml，使进入带有HSA的免疫平皿Ⅱ（Nunc）的凹处，而其中聚HSA是参照例4-（1）在那里予作物理吸附。在4℃，反应过夜，平皿用含有5%牛血清和0.05%特威恩20的PBS洗涤，然后100μl的辣根过氧化物酶结合反式-HBsAg单无性繁殖系抗体溶液加入每个平皿的凹处。反应两个小时以后，平皿再以上述的缓冲剂洗涤。接着加入100μl的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.0），其中含有苯二胺（4mg/10ml）和过氧化氢水溶液（4μl/10ml）。在室温下反应30分钟，加50μl    2N硫酸则酶的反应被终止，用Titertek    Multiskan    MC于492nm吸光率测定。此试验的纯净样品是由例7取得并用作标准，而测得结果以单位数目的术语表示即吸光率（0.05光出度）以标准的1ng表示为1单位。
本说明书的图样和规定，碱、氨基酸等当用缩写表示时，该缩写是根据IUPAC-IUB委员会关于生物化学命名法或在有关范围的惯用缩写。下面列的是这些缩写的例子。这有可能牵涉氨基酸的旋光异构现象，必须注意，除非有别的说明，否则上述氨基酸都是指L型。
DNA    脱氧核糖核酸
RNA    核糖核酸
mRNA    信使RNA
A    腺嘌呤
T    胸腺咄啶
G    乌嘌呤
C    胞嘧啶
dATP    脱氧腺苷三磷酸
dTTP    脱氧胸苷三磷酸
dGTP    脱氧乌苷三磷酸
dCTP    脱氧胞苷三磷酸
ATP    腺苷三磷酸
EDTA    乙二胺四乙酸
SDS    十二烷磺酸钠
DTT    二硫荔糖醇
Gly    甘氨酸
Ala    丙氨酸
Val    缬氨酸
Leu    亮氨酸
Ile    异亮氨酸
Ser    丝氨酸
Thr    苏氨酸
Cys    半胱氨酸
1/2Cys    半胱氨酸
Met    甲硫氨酸，蛋氨酸
Glu    谷氨酸
Asp    天冬氨酸
Lys    赖氨酸
Arg    精氨酸
His    组氨酸
Phe    苯丙氨酸
Tyr    酪氨酸
Trp    色氨酸
Pro    脯氨酸
Asn    天冬酰酸
Gln    谷氨酰胺
Apr氨苄青霉素抗性基因
Tcr四环素抗性基因
PRλPR启动子
ars1    自发复即顺序1
IR    转化重复
附图简述
图1表示对adr    HBsAg    P31型的DNA顺序密码（上排）和相应氨基酸顺序（下排）
图2表示对adw    HBsAg    P31型的DNA顺序密码（上排）和相应的氨基酸顺序（下排）
图3是质粒pPHO17-1的图解，而符号E，S，B，H和X分别代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ
图4是质粒pPKT700-1的图解，而符号E，S，B，H和X分别代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ
图5是质粒pGLD906-1的图解，而符号E，S，B，H和X分别代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ
图6是质粒pTRP    P31-1提供附属型adr    HBsAg    P31在大肠杆菌表现度的图解，而符号E，B，C和P分别代表EcoRⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ和PstⅠ
图7是质粒pTRP    P31-W2提供附属型adw    HBsAg    P31在大肠杆菌的表现度的图解，而符号E，B，C，和P分别代表EcoRⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ和PstⅠ
图8是质粒pGLD    P31-R，pPHO    P31-R和pPKT    P31-R提供附属型HBsAg    P31在酵母中表现度的图解，而符号E，B，S，H，X和C分别代表EcoRⅠ，BamHⅠ，SalⅠ，HindⅢ和ClaⅠ
图9和图10每个均表示质粒pPHO    P31-W提供附属型adw    HBsAg    P31在酵母中表现度的图解而符号E，P，B，C，S和H分别代表EcoRⅠ，PstⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ，SalⅠ和HindⅢ
图11表示在SDS-聚丙烯酰胺粘的胶凝电泳结果，如同第（1）和（2）段例7的末尾部分。
执行本发明的最好方式
参考例1
制备含有酵母衍生的阻过酸磷酸酶启动子（pHO5-P）的表现运载体。
大肠杆菌质粒pJAl（50μg）含酒酵母S288 C和其衍生的阻过磷酸酶基因（PHO5）和组成酸磷酸酶和7.9kb DNA断片〔Kramer，R.A.and Anderson，N.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，6541（1980）〕这样进行处理，即以20单位的限制性内切酶BamHⅠ〔Takara Shuzo〕和20单位的限制性内切酶SalⅠ〔Takara Shuzo〕在100μl反应混合物（100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巯基乙醇〕在37℃反应3小时，接着用1.0%琼脂糖（Sigma）切片胶凝电泳于缓冲液〔100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，100mM硼酸，2mM EDTA（pH8.3）〕在140V起反应2小时。此后，凝胶部份含有0.63kb的DNA断片封接于渗析管，将管浸入缓冲液中电泳，而上述的DNA断片从凝胶中电动地洗脱〔McDonell，M.W.et al.，J.Mol.Biol.，110，119（1977）〕。在渗析管里的液体用酚萃取，接着用乙醚苯取并补充NaCl至浓度为0.2M。然后加入2体积的冷的乙醇，在-20℃时DNA则产生沉淀。
质粒pSH19（1μg）是送样处理的，即以2单位的限制性内切酶BamHⅠ和2单位限制性内切酶SalⅠ置于20μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巯基乙醇〕，于37℃时反应2小时。反应混合物是根据使用0.8%琼脂糖切片的电泳在与上述相同的条件下可以产生电导。电泳后，8.0kb的DNA断片用上述方法从凝胶中分离出来。接着与酚发生去蛋白作用，用冷的乙醇使DNA沉淀（参看图3）。400ng上述8.0kb DNA断片和0.63 kb DNA断片在20μl反应混合物〔66mM三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.6），6.6mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇1mM ATP，2单位的T4 DNA连接酶（Takara Shuzo）〕中，在14℃时混合和连接在一起，经过一夜反应后，以上述科恩等人的方法这反应混合物可用于转化大肠杆菌294。质粒DNA以上述碱萃取方法从每一转化株中分离出来。而转化株的选择是基于对氨苄青酶素的抗性而用作指示者，测定分子重量及限制性内切酶卵裂型。这方法的pPHO12质粒，其中0.63kb DNA断片由pJAl中分离出来。而pJAl曾插入pSH19的BamHⅠ-SalⅠ部位而被分离（参看图3）。
质粒pPHO12 DNA的3-μg部份是这样处理的，即以2单位的限制性内切酶SalⅠ在20μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（PH7.5），7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2M EDTA，7mM2-巯基乙醇〕中在37℃时反应2小时，接着与酚发生去蛋白作用，用冷的乙醇使DNA沉淀。而这DNA的3μg部分是这样处理的，以12单位的BAL 31核酸酶（Bethesda研究实验室）在50μl的反应混合物〔20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.1），12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA〕中，在30℃时反应2分钟，接着与酚发生去蛋白作用，再以冷的乙醇使DNA沉淀（参看图3）。
这XhoⅠ衍接物d（CCTCGAGG）（200ng）〔新英格兰生物实验室〕是在50μl的反应混合物（50mM三羟甲基氨基烷-盐酸（pH7.6），10mM MgCl2，10mM2-巯基乙醇，100μM ATP〕在37℃时以弹位的T4多核苷酸激酶〔Takara Shuzo〕在衔接末端5′使其磷酸化1小时。
40ng末端5′磷酸化了的衔接物〔5′-P-d（CCTCGAGG）〕和400ng上述BAL31处理的pPHO12    DNA在与上述相同的条件在T4    DNA连接酶的作用下混合和连接在一起。利用这反应混合物以科恩等人的方法，大肠杆菌可被转化。质粒DNA以上述碱萃取方法从每一转化株中分离出来。而转化株的选择是基于对氨苄青酶素的抗性而作为指示者和质粒pPHO17在与已选择的BamHⅠ和XhoⅠ进行双消化作用下而给出0.55碎片，DNA碱基顺序的分析是用双脱氧核苷酸方法〔Sanger等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463（1977）〕，此方法揭示BAL31核酸酶处理的结果从PHO5中的起始密码子ATG消除逆流的20bp（参看图3）。
2μg上述pPHO17质粒是这样的处理，即在20μl反应混合物〔6mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（PH7.9），150mM MgCl2，5mM2-巯基乙醇〕在37℃时以4单位的限制性内切酶XhoⅠ〔Takara Shuzo〕反应2小时，接着与酚起去蛋白作用并用冷的乙醇使DNA沉淀。
1μg DNA沉淀是这样处理的，即30μl的反应混合物〔40mM磷酸钾缓冲液（pH7.5），6.6mM MgCl2，1mM2-巯基乙醇，33μM dATP，33μM dGTP，33μM dTTP，33μM dCTP〕中在12℃时以5单位的DNA聚合酶Ⅰ大碎片（新英格兰实验室）作用30分钟使粘性末端转化为园钝，接着与酚起去蛋白作用并用冷的乙醇沉淀DNA。500ng上述DNA碎片和在上述〔5′-P-d（GGTCGACC）〕条件下磷酸了的衔接物SalⅠ，按上述条件，在T4 DNA逆接酶的作用下混合和连接在一起。利用反应混合物以科恩等人的方法使大肠杆菌转化。从氨苄青霉素转化株中pPHO17-1质粒其pPHO17质粒的XhOⅠ部位转化为已选择的SalⅠ部位。
参考例2
制备含有酵母磷酸甘油酸激酶启动子（PGK-P）。
（1）磷酸甘油酸激酶基因（PGK）的无性繁殖。
以Cryer，D.R.等人的方法〔Methods in Cell Biology，Vol.Ⅻ，Page 39-44（1975）〕制取的350μg酒酵母菌株Kyokai 3（可从IFO得到）的染色体DNA是这样处理的即在1ml反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，60mM NaCl〕在37℃时与200单位的限制性内切酶Hind Ⅲ〔Takara Shuzo〕作用3小时，接着在参考例一所述的条件下进行1%琼脂糖切片的凝胶电泳。电泳后，依DNA断片的大小可分为1至10份。每份中的琼脂糖凝胶块封于渗析管，在参考例一的条件下，DNA从凝胶块电动地洗脱出来。洗脱物以酚处理，并加入冷的乙醇将DNA沉淀。来自每一份的DNA 0.5μg在参考例一所述条件下进行电泳，即以1%琼脂糖切片凝胶并用萨瑟恩方法〔Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98，503（1975）〕让DNA吸收于硝化纤维过滤器上面（施来歇尔和舒尔）。从PKG的N末端给氨基酸以补充到低核苷酸密码5′-TGAAGATAAAGACAT-3′〔Dobson，M.J.et al.，Nucleic Acid Res.，10，2625（1982）〕，用克雷R·等人的方法合成〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765（1978）〕而上述低核苷酸是在37℃时30μl的反应混合物〔50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.6），10mM MgCl2，10mM2-巯基乙醇〕以10μCi的γ-〔32P〕ATP（Amersham）和10单位的低核苷酸激酶作用30分钟因而标记5′末端与32P结合在一起。以一个体积的酚与反应物中存在着的10μl 200mM EDTA（pH8.0）起去蛋白作用然后应用于琼脂糖4B（Pharmacia）柱（0.25×25cm）并以TEN（总排泄氮）缓冲液〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），200mM NaCl，1mM EDTA〕平衡之。标记低核苷酸洗出于空柱体积附近而被收集并用作对PGK基因筛选的探查物。以
Figure 85106190_IMG7
瑟恩方法利用上述硝化纤维过滤器和探查物来完成吸除作用，因此，探查物与含2.6kb至2.9kb DNA断片的第二部分样品起强烈的杂交作用。
再者，10μg无性繁殖载体pTR262〔Roberts，T.M.et al.，Gene，12，123（1980）〕的处理是在37℃时在50μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，60mM NaCl〕中与10单位的限制性内切酶HindⅢ作用2小时，接着与酚起去蛋白作用并以冷的乙醇（消化了的HindⅢ pTR262）沉淀DNA。在参考例一所述的条件下0.1μg消化了的HindⅢ pTR262与第三部分的DNA混合在T4联接酶的作用下，它们联接在一起。利用反应混合物，大肠杆菌DHl〔Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，254-255（1982）〕可以被转化并获得显示四环素抗性的1，300转化株。在它们之中，利用上面说的标记32P合成探查物的群体杂交作用选择了PGK基因承载转化株。〔Suggs，S.V.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6613（1981）〕从转化株给出的强烈的放射自显影信号，说明质粒pPKT3已被上述碱萃取方法所分离。与HindⅢ的消化作用导致2.95kb    DNA插入的检出并用萨瑟恩确认的与探查物的插入杂交的方法进行测试。
（2）PGK启动子断片的分离
50μg pPKT3 DNA质粒的处理是在37℃时，在100μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，60mM NaCl〕与50单位的限制性内切酶HindⅢ作用2小时，接着在参考例一所述的条件下以1%琼脂糖切片凝胶电泳。电泳后，以参考例一所述方法从凝胶中分离出2.95kb DNA断片（参看图4）。
5μg上述2.95kb DNA断片的处理是在37℃时，在20μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，175mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕与5单位的限制性内切酶作用3小时，而消化混合物根据1.2%琼脂糖切片凝胶电泳，在参考例一的条件下传导。电泳后，以参考例一所述方法将2.1kb DNA断片从凝胶中分离出来。0.5μg上述2.1kb DNA断片和由质粒pBR322与HindⅢ和SalⅠ起消化作用而得的0.5μg的3.74kb DNA按参考例一的条件在T4 DNA连接酶的作用下连接在一起。利用反应混合物，大肠杆菌DH1可被转化，而所希望得到的质粒pPKT101则可以氨苄青霉素抗性转化株中获得。
接着，消除PGK基因的结构基因区，即将10μg上述pPKT101 DNA质粒在37℃时，在30μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基烷-盐酸（pH7.5）7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2M EDTA，7mM2-巯基乙醇〕先以10单位限制性内切酶处理3小时，消化混合物与酚起去蛋白作用而冷的乙醇使DNA产生沉淀（SalⅠ-消化了的pPTK101）。1μg的SalⅠ-消化了的pPTK101，在室温时，在20μl反应混合物〔20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.1），12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA〕中以10单位的BAL 31核酸酶处理5分钟。此后，随即加入1体积酚以终止反应，接着以冷乙醇沉淀DNA（BAL-消化了的-pPTK101）。50μg如参考例一所述磷酸化了的Xhol衔接物和0.2μg的BAL-消化了的pPTK101按参考例一的条件在T4连接酶的作用下混合和连接在一起。此后，利用反应混合物转化大肠杆菌DH1而且是从氨苄青霉素抗性转化株中取得。而0.69kb pPKT567质粒则以启动子区pPKT101消除方向的SalⅠ部位取得。用双脱氧核苷酸的方法分析DNA碱基顺序证实pPKT567在BAL 31处理中已消除PGK结构基因而且是在5′-邻区-24内（参看图4）。
（3）表现载体的结构
5μg大肠杆菌-酵母往复机制载体pSH19的处理是在37℃时，在20μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2-巯基乙醇〕以限制性内切酶SalⅠ处理2小时，接着与酚起去蛋白作用并与冷乙醇起沉淀作用。1μg DNA按参考例一所说混合和把粘性末端连接到园钝末端的条件以DNA聚合酶Ⅰ大断片处理。500ng DNA断片和50ng磷酸化的XhoⅠ衔接物在参考例一所述条件下，利用T4 DNA连接酶使之混合和连接在一起。大肠杆菌DH1随反应混合物转化并从氨苄青霉素抗性中获得，转化株承载质粒pSH19-1，其中pSH19的SalⅠ部位转换为已获得的XhoⅠ部位（参看图4）。
15μg上述pSH19-1DNA在37℃时，在100μl的混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，60mM NaCl〕中，以24单位限制性内切酶HindⅢ处理10分钟。随后立即加入10μl 0.2M EDTA以终止反应。反应混合物按参考例1所述条件用0.7%琼脂糖切片凝进行电泳，8.3kb DNA断片在HindⅢ位置上裂开，按参考例1所述方法从凝胶中分离出来。3μg的上述8.3kb DNA断片在37℃时，在30μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕中以10单位的限制性内切酶XhoⅠ〔Takara Shuzo〕处理2小时。在参考例一所述条件下，用0.7%琼脂糖切片凝胶进行电泳。电泳后，以参考例一所述的方法从凝胶中分离出7.7kb DNA断片（参看图4）。
参考例2-（2）所述的pPKT567    DNA质粒于37℃时，在50μl反应混合物（50mM三羟甲基氨基甲烷-盐（pH7.6），50mM    NaCl，1mM二硫苏糖酸〕中，以每种10单位的限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ处理2小时。以后按参考例所述以1.2%琼脂糖切片凝胶进行电泳，而1.4kb    DNA断片则从凝胶中分离出来（参看图4）。
0.2μg的上述1.40kb    DNA断片和0.5μg的上述7.7kb    DNA断片依参考例1所述条件，在T4    DNA联接酶的作用下混合和连接在一起。大肠杆菌DH1随着反应混合物而转化并在氨苄青霉素抗性转化株中取得，且曾获得转化株承载的理想pPKT    700质粒。然后，上述pPKT700质粒的XhoⅠ位置上的质粒pPKT700-1以参考例1所述方法转化为SalⅠ位置（参看图4）。
参考例3
表现载体的结构包含酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GLD-P）（1）甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GLD）的无性繁殖
将5′-AGCAACTCTAACCAT-3′补充到GLD的pgap491〔Holland，J.P.et al.，J.Biol.Chem.，258，5291（1983）〕的低核苷酸上，则此密码可使氨基酸以克雷R等人的方法从N末端加以合成。以参考例2-（1）所述方法标记32P用作探查物。萨瑟恩吸除作用按参考例2-（1）所述用硝化纤维过滤器和上述探查物来完成。因此，探查物与含有2.0-2.3kb DNA断片的第七部分样品强烈的杂交。
在参考例1的条件下，参考例2-（1）所述的0.1μg Hind-消化了的pTR262与0.2μg第七部份样品中的DNA利用T4 DNA连接酶而联接在一起。利用反应混合物，以参考例2-（1）所述方法转化大肠杆菌DH1，并可从大约1，200四环素抗性转化株中取得，转化株与用菌落杂交作用分离出来的标记32P探查物有很强的杂交能力。用上述碱萃取法可以从转化株中分离出质粒pGLD9，当与HindⅢ记消化作用时，可以检出2.2kb插入DNA，而用萨瑟恩方法测试显示此插入DNA确与上述探查物杂交（参看图5）。
（2）GLD启动子断片的分离
100μg pGLD9 DNA质粒于37℃时，在200μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，60mM MaCl〕用50单位的限制性内切酶HindⅢ处理3小时，接着用1.0%琼脂糖切片凝胶在参考例1所述条件下电泳。电泳后，用参考例1所述方法从凝胶中分离出2.2kb DNA断片。10μg的上述2.2kb DNA断片于37℃时，在50μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕中以10单位的限制性内切酶HinfⅠ〔Takara Shuzo〕处理2小时然后以萨瑟恩利用GLD探查物的方法来完成杂交作用，因此，上述探查物被结合到0.5kb DNA断片上（参看图5）。
5μg的上述0.5kb DNA断片于37℃时，在30μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基烷-盐酸（pH7.5），在50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇〕中，以限制性内切酶HhaⅠ〔Takara Shuzo〕和TaqⅠ（New England BioLabs）各10单位处理3小时。接着以1.5%琼脂糖切片凝胶电泳，其在参考例1的条件下发生传导使用。之后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出0.36kb DNA断片（参看图5）。
1μg的上述0.36kb    DNA断片在参考例1所述条件下，以DNA聚合酶Ⅰ大断片处理，从而使得TaqⅠ粘性末端园钝。然后，1μg这种断片和50ng参考例所说的磷酸化的XhoⅠ衔接物在参考例1所述的条件下利用T4    DNA连接酶而联接在一起。反应后，加入过量的XhoⅠ，在温度37℃反应4小时后，在参考例2-（1）所述的条件下，用Sepharose（琼脂糖商品名）4B柱分离出结合0.36kb    DNA断片的衔接物。
10μg上述的2.2kb    DNA断片在参考例一的条件下用DNA聚合酶Ⅰ大断片处理，使其粘性末端园钝。在参考例1所述的条件下利用T4 DNA连接酶与参考例1所说的50ng的磷酸化的衔接物〔5′-P-d（CGCGGATCCGCG）（new England BioLabs）相连接。反应后，加入20单位的BamHⅠ，于37℃，反应3小时后，在参考例2-（1）所述条件下，利用Sepharose（琼脂糖商品名）4B柱分离出结合2.2kb DNA断片的衔接物。6μg的上述DNA断片，于37℃，在50μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM二巯基乙醇〕中，以2单位的限制性内切酶HhaⅠ处理2小时。此后，在参考例1条件下，用1.0%琼脂糖切片凝胶电泳。电泳后，以参考例1所述方法，把0.75kb DNA从凝胶中分离出来（参看图5）。
（3）表现载体的结构
10μg参考例2-（3）所说的pSH19-1质粒，于37℃，在50μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕中以限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ各10单位处理2小时。接着在参考例1所说的条件下以1.0%琼脂糖切片凝胶电泳，以后用参考例1所说的方法，从凝胶中分离出8.0kb DNA断片。
500ng上述的8.0kb    DNA断片，200ng例3-（2）所说的0.36kb    DNA断片和200ng例3-（2）所说的0.75kb    DNA在参考例1的条件下利用T4    DNA联接酶将它们联接在一起。利用反应混合物，转化大肠杆菌DH1并从氨苄青霉素抗性转化株中取得，转化株承载由三种DNA断片连接在一起而组成的pGLD906质粒则被分离。接着转换上述pGLD906质粒的XhoⅠ部位为SalⅠ部位而构成pGLD906-1质粒（参看图5）。
参考例4
聚HSA-Ccllulofine柱的生产
（1）聚合的人血清清蛋的生产
于20ml的人血清清蛋白（Albumin-Nichiyaku;Nippon Seiyaku，Tokyo）溶液（含4g人血清清蛋白）加入180ml磷酸盐缓冲盐水（PBS;8.1mM NaH2PO4，1.5mM KH2PO4，2.7mM KCl，137mM NaCl，pH7.2）和60ml戊二醛水溶液。搅拌混合物至均匀，然后在室温下静置1小时。于5℃时，上面的混合溶液对10升蒸馏水的透析作用终止聚合反应。此后，更换三次透析流体，这样，馀留的戊二醛便从反应混合物彻底的移除。由此而取得275ml聚合人血清清蛋白（聚HSA）溶液。
（2）聚HSA-Cellulofine柱的生产
于上法取得的90ml聚HSA溶液，加入10ml 10倍浓度的PBS，接着再加入40ml甲酰-Cellulofine。搅拌后，反应可以在室温下进行30分钟。然后于混合物中加入1.6g NaCNBH3，盖紧塞子后，整个混合物在室温下振动18小时。将混合物转移到玻璃过滤器上，凝胶则用PBS洗涤，从而移去仍未与甲酰-Cellulofine结合的聚HSA部份。上述方法中，聚-HSA粘合到Cellulofine的百分率约为73%并取得40ml聚-HSA-Cellulofine，其中约含24mg聚-HSA结合到每ml的Cellulofine。此凝胶悬浮于含有0.1M乙醇胺的PBS中，并加入NaCNBH3（200mg），混合物在室温下振动3小时，然后凝胶转移到玻璃过滤上，按顺序以PBS，3M尿素、6M胍氢氯化物和25mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗涤，再装入直径为5cm的柱而产生聚-HSA-Cellulofine柱。
例1
重组体DNA分子供附属型adr的乙型肝炎表面抗原P31基因表现，并使大肠杆菌进行转化。
如1984年日文版的《未检定的蛋白质的应用》第74985号和1983年的《核酸研究第11，1747页所述的pBR322-BamHⅠ/HBr330质粒（也称其简写为pHBr330）是用1983年日文版的《未检定的蛋白质的应用》第201796号其所举参考例1所述方法制备。50μg的上述pHBr330质粒，于37℃时，在100μl的反应混和物〔100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巯基乙醇中用限制性内切酶EcoRⅠ〔Takara Shuzo〕和BamHⅠ各20单位处理3小时，接着在参考例1所述条件下，以1.0%琼脂糖切片凝胶进行电泳。电泳后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出1.4kb DNA断片（参看图6）。
2μg的pBr322 DNA质粒于37℃时，20μl反应混合物〔10mM三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巯基乙醇〕中，以限制性内切酶BamHⅠ和ClaⅠ（New England BioLabs）各2单位处理2小时，接着以0.8%琼脂糖切片凝胶进行电泳，其在参考例1所述条件下受传导。此后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出4.01kb DNA断片。
500ng的上述4.01kb    DNA断片，500ng的上述1.4kbDNA断片和50ng的在5′末端磷酸化的合成接合体d（
Figure 85106190_IMG8
）以参考例1所述方法和条件下，利用T4 DNA连接酶连接在一起。上述接合体是用磷酸三酯方法〔Crea，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765（1978）〕化学合成。利用上述反应混合物，大肠杆菌294被转化并在氨苄青霉素抗原中获得包含有上面三种DNAs连接在一起的pHBrP31 DNA质粒（参看图6）。
1μg的pHBrP31 DNA质粒，于37℃时，在20μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巯基乙醇〕中以2单位限制性内切酶BamHⅠ处理2小时，接着与酚起去蛋白作用，再加入冷乙醇沉淀DNA（BamHⅠ-消化的pHBrP31）。
500ng的BamHⅠ-消化的pHBrP31在参考例1所述条件下以DNA聚合酶Ⅰ大断片处理，使粘性的末端园钝，接着与酚起去蛋白作用而与冷乙醇起沉淀作用。取得的300ng    DNA断片和50ng以参考例1所说的在5′末端磷酸化的PstⅠ衔接物〔5′-P-d（GCTGCAGC）〕（New    England    BioLabs）在参考例1所述条件下利用T4    DNA连接酶而连接在一起。利用反应混合物转化大肠杆菌294，而转化株是用参考例所述方法筛选而得，而pHBrP31-17质粒其pHBrP31质粒的BamHⅠ部位已转换为PstⅠ部位而被分离（参看图6）。
50μg的上述pHBrP31-17于37℃时，在100μl反应混合物〔20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），10mM MgCl2，50mM（NH4）2SO4〕中，以限制性内切酶ClaⅠ和PstⅠ〔Takara Shuzo〕各20单位处理3小时，接着在参考例1所述条件下以1.0%琼脂糖切片凝胶进行电泳。电泳后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出1.42kb DNA断片。
50μg如1983年日文版的《未检定的蛋白质的应用》第201796号和1983年的《核致研究》第11，3581页所说的pTRP771表现载体是在100μl上述反应混合物中以同样的条件用限制性内切酶处理，然后反应混合物在参考例1所述的条件下受1.0%琼脂糖凝胶切片的电泳，电泳后，以参考例所述方法从凝胶中分离出3.3kb    DNA断片。
200ng的上述1.42kb    DNA（给P31的DNA密码）和3.3kb    DNA在参考例1所述条件下，利用T4    DNA连接酶而连接在一起。上述反应混合物用作转化大肠杆菌294并由大肠杆菌株（294/pTRP    P31-R）承载pTRP    P31-R质粒，其中所说编码P31的DNA已插入表现载体而以参考例1的方法分离出来（参看图6）。
例2
给以附属型adw的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因表现的重组体DNA分子结构及以上述DNA分子转化大肠杆菌。
1983年在日文版的《未检定蛋白质的应用》第194897号和201796号和1983年的《核酸研究》第11，1747页所说的pBR-EcoRⅠ/HBV933 DNA质（简称为pHBV933）是以1983年日文版的《未检定的蛋白质的应用》第201796号参考例1所述方法制备。2μg的上述质粒，于37℃时，在20μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，100mM KCl，7mM2-巯基乙醇〕中，以2单位的限制性内切酶HpaⅠ〔Takara    Shuzo〕处理2小时，接着与酚起去蛋白作用并用冷的乙醇沉淀DNA。300ng的上述DNA和50ng的磷酸化的PstⅠ衔接物〔5′-P-（GCTGCAGC）〕在参考例1的条件下连接在一起。大肠杆菌的转化是用反应混合物，而转化株是以参考例1所述方法筛选取得，而pHBV933-5质粒中pHBV933的HPaⅠ部位已转换为已获得的PstⅠ部位（参看图7）。
500μg的上述pHBV933-5DNA质粒，于37℃时，在800μl的反应混合物〔20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），10mM MgCl2，50mM（NH4）2SO4〕中以500单位的限制性内切酶PstⅠ处理20分钟，随即与酚起去蛋白作用。上述反应产物是以参考例1所述的条件下用0.1%琼脂糖切片凝胶电胶为条件。此后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出1.7kb DNA断片一部分消化的PstⅠ（参看图7）。
3μg的上述1.7kb DNA于37℃时，在20μl的反应混合物〔100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕中，以6单位的限制性内切酶EcoRⅠ处理1小时，接着以1.0%琼脂糖切片凝胶进行电泳，其在参考例1所述条件下可传导。此后以参考例1所述方法从凝胶中分离出0.97kb DNA断片（参看图7）。
500ng的上述0.97kb DNA断片，500ng例1所说的3.3kb DNA（pTRP771的消化ClaⅠ-PstⅠ）和50ng例一所说的磷酸化的接合体d（
Figure 85106190_IMG9
）在参考例1所述的条件下利用T4DNA连接酶而连接在一起。反应混合物用来转化大肠杆菌294并从四环素抗性转化株获得由上面连接在一起的三种DNAs所组成的pTRP    P31-W质粒，它是用参考例一所述方法而被分离。用插入法在上述质粒的ClaⅠ部位插入含有大约330bp断片的启动子，其中断片是的取得如同1983年日文版的《未检定的蛋白质的应用》第201796号和ClaⅠ与HpaⅡ〔Takara    Shuzo〕所说的以消化质粒pTRP601而完成了pTRP    P31-W2（参看图7）。
例3
给以附属型adr的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因在酵母中表现的重组体DNA分子的结构及以上述DNA分子转化酵母。
（1）50μg例一所说的pHBrP31 DNA质粒于37℃时，在100μl的反应混合物〔100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巯基乙醇〕中，以限制性内切酶ClaⅠ和BamHⅠ各20单位，处理3小时。而反应混合物在参考例1所述条件下以1.0%琼脂糖切片凝胶进行电泳。电泳后，以参考例一所述方法从凝胶中分离出1.42kb DNA断片。
2μg的上述1.42kb    DNA断片按参考例1的条件以DNA聚合酶Ⅰ大断片处理使粘性末端园钝，接着与酚起去蛋白作用和以冷乙醇沉淀DNA。1.5μg的上述DNA和50ng参考例1所述的磷化的SalⅠ衔接物在参考例1所述条件下，利用T4    DNA连接酶而联接在一起。将10单位的限制性内切酶加入反应混合物中，于37℃进行反应3小时使得末端有粘性。反应使与酚起去蛋白作用，而样品须在参考例2-（1）的条件下通过Sepharose（琼脂糖的商品名）4B柱。1.43kb    DNA断片（附属型adr编码P31    DNA）包含收集洗脱于空柱体积附近的部分和以冷乙醇沉淀DNA（参看图8）。
1μg在参例一所述的pPHO17-1DNA表现载体，于37℃时，在20μl反应混合物〔6mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），6mM MgCl2，150mM NaCl，6mM2-巯基乙醇〕中，以2单位的限制性内切酶SalⅠ处理2小时，然后接着加入0.1单位的碱性磷酸酶，使在65℃时继续反应30分钟。此后，与酚进行去蛋白作用并加冷乙醇沉淀DNA（SalⅠ-消化的pPHO17-1）。接着，200ng的上述的1.43kb DNA断片和200ng的SalⅠ-消化的pPHO17-1在参考例1所述条件下利用T4 DNA连接酶而连接在一起。利用反应混合物转化大肠杆菌294，以参考例1所述方法筛选而取得转化株。而转化株（大肠杆菌294/pPHO P31-R）承载pPHO P31-R质粒，其中含附属型adr编码P31的DNA已被插入与被分离的PHO5启动子同一方位，用碱萃取法从转化株中分离出上述质粒，此法用作转化寄主酵母酒酵母AH22R-则用上面提到的欣纳恩等人的方法，转化株酵母（AH22R-/pPHO P31-R），承接上述质粒而被分离（参看图8）。（2）1μg参考例2-（3）所述的表现载体pPKT700-1DNA，于37℃时，以2单位的限制性内切酶SalⅠ处理2小时，然后进一步在例3-（1）所述条件下以0.1单位的碱性磷酸酶处理。此后，以冷的乙醇沉淀DNA（SalⅠ-消化的pPKT700-1）。
接着200ng例3-（1）所述的1.43kb    DNA和200ng    SalⅠ-消化的pPKT700-1在参考例1所述条件下利用T4    DNA连接酶而连接在一起。利用反应混合物和下列例3-（1）所述的步骤菌株（294/pPKT    P31-R）承载带有1.43kb    DNA断片的pPKT    P31-R质粒而断片含有附属型adr编码P31    DNA插入的那点如同被分离的PGK启动子同一方位。寄主酵母菌株随上述质粒转化而酵母转化株（K33-8D/pPKT    P31-R）则被分离（参看图8）。
（3）1μg参考例3-（3）所述的pGLD906-1表现载体在37℃时以2单位的限制性内切酶处理2小时，然后以例3-（1）所述的条件用0.1单位的碱性磷酸酶进一步处理，随后以冷的乙醇沉淀DNA（SalⅠ-消化的pGLD906-1）。
接着，200ng例3-（1）所述的1.43kb    DNA断片和SalⅠ-消化的pGLD906-1在参考例1所述条件下利用T4    DNA连接酶而连接在一起。以例3-（1）所述的方法利用反应混合物，菌株（294/pGLD    P31-R）承载带有1.43kb    DNA断片的pGLD    P31R质粒，其中的断片含有附属型adr编码P31    DNA插入的那一点与被分离的GLD启动子同一方位。寄主酵母K33-7B随上述质粒转化并取得酵母转化株（K33-7B/pGLD    P31-R）（参看图8）。
当这些转化株用常规方法培养，可取得理想的P31。
例4
重组体DNA分子的结构给以附属型adw的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因在酵母中的表现及用上述DNA分子进行酵母的转化。
（1）2μg例2所述的pBBV933 DNA质粒于37℃时，在20μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pB7.5），7mM MgCl2，100mM KCl，7mM2-巯基乙醇〕中，以2单位的限制性内切酶HpaⅠ处理2小时，接着与酚起去蛋白作用并以冷乙醇沉淀DNA。300ng的上述DNA和50ng参考例1所述的磷酸化的SalⅠ衔接物，在参考例1所述条件下利用T4    DNA连接酶而混合和连接在一起。反应混合物用来转化大肠杆菌294并从氨苄青霉素抗性转化株中获得pHBV933-8质粒，此质粒具有SalⅠ部位以代替已取得的pHB933质粒的HPaⅠ部位（参看图9）。
100μg上述pHBV933-8质粒于37℃时，在200μl反应混合物〔100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巯基乙醇〕中以限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ各100单位处理2小时。而反应混合在参考例1所述条件下受到以1.2%琼脂糖切片凝交的电泳。电泳后，以参考例1所述的方法从凝胶中分离出含有附属型adw编码P31 DNA断片的0.96kb DNA断片（参看图9）。
20μg pBR322 DNA质粒于37℃时，在100μl反应混合物〔6mM三羟甲基氨基甲烷-HCl（pH7.9），150mM NaCl，6mM MgCl2，6mM2-巯基乙醇〕中以限制性内切酶ClaⅠ和SalⅠ各20单位处理2小时，接着以1.0%琼脂糖切片凝胶进行电泳，此步骤在参考例1所述条件下得以传导。此后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出3.74kb DNA断片。
500ng的上述3.74kb DNA断片，500ng的上述0.96kb DNA断片和50ng例一所述的磷酸化的接合体d（
Figure 85106190_IMG10
）在参考例1所述的条件下利用T4    DNA连接酶而连接在一起。反应混合物用来转化大肠杆菌294并从氨苄青霉素抗性转化株中取得由上述三种DNAs连接在一起组成的pHBV    P31    DNA质粒（参看图9）。
50μg的上述pHBv P31质粒于37℃时，在100μl的反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2-巯基乙醇〕中，以限制性内切酶SalⅠ和ClaⅠ各20单位处理3小时，而反应混合物受到用1.0%琼脂糖切片凝胶在参考例一所述条件下能传导的电泳。此后，以参考例一所述方法从凝胶中分离出0.98kb DNA断片（参看图9）。
2μg的上述0.98kb    DNA断片在参考例1所述条件下以DNA聚合酶Ⅰ大断片处理使得粘性末端园钝，接着与酚起去蛋白作用并以冷醇沉淀DNA。至于被连接于SalⅠ衔接物〔5′-P-d（CGTCGACG），Bethesda研究〕的0.98kb    DNA断片接着以SalⅠ处理使得粘性的末端园钝。利用Sepharose（琼脂糖商品名）4B柱收集含有0.99kb    DNA断片（附属型adw编码P31    DNA），而上述的DNA则以冷乙醇沉淀（参看图9）。
200ng例3-（1）所述的SalⅠ-消化的pPHO17-1和200ng上面的0.99kb DNA断片，在参考例1所述条件下利用T4 DNA连接酶连接在一起。利用反应混合物转化大肠杆菌294而以参考例1所述方法筛选取得转化株。菌株承载带有0.99kb DNA的pPHO P31-W质粒。此质粒含有附属型adw编码P31 DNA，其插入方位与被分离的PHO5启动子相同。用碱萃取法从转化株中分离上述质粒。用欣纳恩等人的方法转化寄主酵母AH22R-，而承载上述质粒的酵母转化株（酒酵母AH22R-/pPHO P31W）则被分离（参看图9）。
上面含附属型adw编码P31    DNA的质粒和PGK启动子或GLD启动子也可用上面的步骤建造。
例5
重组体DNA的结构给以附属型adw的乙型肝炎病毒表面抗原31基因表现，而酵母则随着上述DNA而转化。
50μg的上述pTRP P31-W2质粒于37℃时，在100μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），10mM MgCl2，50mM NaCl，1mM二硫苏糖醇〕中，以20单位的限制性内切酶处理20分钟供部分的消化作用，而反应混合物受参考例1所述的条件下以0.8%琼脂糖切片凝胶电泳。据此，4.6kb线状DNA分子是PstⅠ卵裂的产物，以参考例一所述方法只是在一个部位从凝胶中分离出来（参看图10）。
5μg的上述4.6kb DNA分子于37℃时，在30μl反应混合物〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5），7mM MgCl2，10mM NaCl〕中以5单位的限制性内切酶ClaⅠ处理3小时，而反应混合物受参考例1所说条件下的1.0%琼脂糖切片凝胶电泳。此后，以参考例1所述方法从凝胶中分离出0.98kb DNA断片。
0.8μg的上述0.98kb    DNA断片于37℃时在20μl反应混合物〔33mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.9），66mM醋酸钾，10mM醋酸镁，5mM二硫苏糖醇〕中以2.5单位的T4    DNA聚合酶处理15分钟使得粘性的末端园钝，接着与酚起去蛋白作用并用冷乙醇沉淀DNA。利用例3-（1）所述方法，SalⅠ衔接物联接到0.98kbDNA断片，接着以SalⅠ处理使得粘性的末端园钝。利用Sepharose（琼脂糖的商品名）4B柱，把含有0.99kb    DNA断片（附属型adw编码P31    DNA）这部份加以收集而上述DNA则以冷乙醇沉淀。
200ng例3-（1）所述的SalⅠ-消化的pPHO17-1和200ng上面0.99kb DNA断片在参考例1所述条件下利用T4 DNA连接酶而联接在一起。利用反应混合物转化大肠杆菌294，而转化株是以参考例1所述方法筛选而取得。菌株（294/pPHO P31-W）承载带有0.99kb DNA断片的pPHO P31-W质粒，此质粒含有附属型adw编码P31 DNA，其插入部位与被分离的PHO 5启动子相同。上述pPHO P31-W质粒是以碱萃取法从转化株中分离出来，以上述欣纳恩等人的方法用作转化寄主酵母AH22R-，而以酵母转化株（AH22R-/pPHO P31-W）承载已被分离的上述质粒（参看图10）。
如果转化株用常规方法培养便可取得理想的P31。
例6（1）
P31基因在大肠杆菌的表现
每一转化株承载由例1或2所得的一个P31基团表现质粒于37℃时，在含有1.0%葡萄糖和1.0%酪蛋白氨基酸的M-9培养基中培养6小时，然后细胞便可收获并以缓冲液〔30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），50mM    NaCl，5mM    EDTA〕。洗涤细胞悬浮于含有10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），5mM    EDTA，1mM苯基甲基硫酰氟和5mg/ml溶菌酶的溶解溶液中，溶胞作用即生效。在上述溶胞产物中加胍氢氯化物至最后浓度为5M.在37℃保温2小时后，溶胞产物于室温下，用15，000rpm离心15分钟至产生上清液。上清液的P31活性是用上文所述的直接免疫测定法测定。这样测得的结果示于表2。P31每次获得产量是按照每毫升液体培养基的产量（计算）。我们可以发现这样计标的产量比1983年日文版《未检定蛋白质的应用》第201796所说表面抗原产量更高。
表2
转化株    HBsAg（单位/毫升    液体    培养基）
大肠杆菌294/pTRP    P31-R    220
大肠杆菌294/pTRP    P31-W2    300
一个单位HBsAg相当于125Ⅰ-反-HBsAg抗体附着于AusriaⅡ-125Kit的数量，而AusriaⅡ-125是结合于1ng的HBsAg的小颗粒上。
例6（2）
P31基因在酵母中的表现
在例3或4获得的每一酵母转化株和承载P31基因表现质粒于30℃时，在Burkholder培养基或其变更能级的低磷酸盐中培养两天，此后收集细胞并洗以生理盐水。
按照Miyanohara，A.等人的方法，细胞以裂合酶〔Seikagaku    Kogyo〕处理后转变为原生质球状态。此外，加入0.1%Triton（表面活化剂商品名）X-100以萃取P31。溶胞产物于室温下，用15，000rpm离心15分钟以产生上清液，并用AuszymeⅡ（Abbott）测定上清液的P31活性，而取得的结果表示于表3。每次计标的P31的产量均按照每升液体培养基的产量（计标）。
表3
P31（μg/l液体培养基）
酒酵母AH22R-/pPHO P31-R 1200
酒酵母AH22R-/pPHO P31-W 1100
以HBsAg颗粒作标准，用AuszymeⅡ测定P31。
例7
高纯P31蛋白质的生产
（1）萃取自细胞
100g以例6所述方法培养而得的大肠杆菌294/pTRP P31-R细胞在-20℃冻结并保存于冷冻状态，而此冷冻状态已均匀地悬浮于含有10mM EDTA和25mM磷酸钠的200ml的缓冲液（pH7.5）中。在此悬浮液中加入696mg苯基甲基硫酰氟和100mg溶菌酶，此混合物于37℃时加热15分钟。再于混合物中加入200ml含有尿素的25mM磷酸钠缓冲液（pH7.5），整个混合物用全混合器（Servall）以4，000rpm处理30秒使之均匀。此后于匀浆中再加600ml含8M尿素的25mM磷酸钠缓冲液，整个混合物于4℃搅拌4小时。于此溶胞产物再加3，000ml 25mM磷酸钠缓冲液（pH7.5），综合混合物再搅拌1小时。然后用18，900rpm（原文可能误写为xg）离心70分钟生成3，900ml上清液（9.7×103单位/毫升）。
（2）用聚-HSA-Cellulofine柱提纯
把上面获得的上清液通过例4所得的聚-HSA-Cellulofine柱（5×2cm）并用25mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）平衡以便在它上面吸收P31蛋白质。柱按顺序用300ml含0.05%特威恩20的PBS，220ml含0.05%物威恩20和0.5M NaCl的PBS，80ml含0.05%特威恩20的PBS和300ml含4M尿素的25mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗涤，然后以300ml含有7.5M尿素的磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗出P31。将活性部份（250ml）用YM-5膜（Amicon，USA）浓缩为7.2ml（2.3×106单位/毫升）。于7毫升所得的浓缩物中加入140毫克DTT，于80℃还原15分钟以后，浓缩物通过薄膜过滤器（ACRODISC;孔尺寸为0.2μm;Gelman）。
（3）用高性能液相色谱法以反相柱提纯
500μl上面获得滤液可以被AP202 300
Figure 85106190_IMG11
（C8）反相柱（YMC-Shimakyu）吸收，而高性能液相色谱则利用三氯乙酸-乙腈-正丙醇系统作为洗脱液系统而进行工作。
AP 202 300
Figure 85106190_IMG12
（C8）（4.6×150mm）;柱温为30℃;洗脱剂A为0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脱剂B为0.1%三氟乙酸-49.95%乙腈-49.95%正丙醇;洗出程序分为0（45%A+55%B）-分为25（25%A+75%B）-分为47（25%A+75%B）-分为49（5%A+95%B）-分为50分（45%A+55%B）;流速为1毫升/分;检测波长为280nm。一个分数率显示在这些条件（4.8毫升;3.1×104单位/毫升）下保留时间约为41分钟。便可收集和冻干这样取得的是含有149μg（1×106单位/毫克）高纯P31蛋白质（附属型adr）的白色粉末。
用上述方法生产的高纯P31蛋白质（附属型adr）有下列特性：
（1）均匀性
SDS-聚丙烯酰胺切片凝胶电泳是以Laemmli方法完成〔Nature，227，680（1970）〕，接着用银染色试剂“Daiichi”（Daiichi    Kagaku，Tokyo）染色并检出P31蛋白质是单带（参看图11）。
（2）分子重量
以SDS-聚丙烯酰胺切片凝胶电泳的结果作为根据，计算出P31蛋白质分子重约为32，000道尔顿（参看图11）。
（3）氨基酸的成分
在作为水解的玻璃管中置入20μg    P31蛋白质。在加入含4%基乙酸的恒沸点盐酸后，玻璃管在减压下密封，而水解作用是在110℃经过24，48，72，或96小时完成。水解后，打开玻璃管，在减压下移去盐酸，残迹溶于0.02N盐酸中而氨基酸的分析是用日立牌835型氨基酸分析仪来完成。根据Hirs′方法〔Methods    in    Enzymol.，11，197（1967）〕当磺基丙氨酸在氨基酸分析仪里存在时，在过甲酸氧化P31蛋白质后可以测得胱氨酸和半胱氨酸并在减压下在恒沸点盐酸中水解24小时。氨基酸的分析数据是取水解24，48和72小时结果的平均值。而对于异亮氨酸、亮氨酸和苯基丙氨酸则在使用水解96小时后取得数值;对于丝氨酸和苏氨酸的数值是用外推算到水解时间为0（零）。这样取得的结果表示表4。
表4
氨基酸    分子%
Asp/Asn    5.8
Thr    7.8
Ser    9.6
Glu/Gln    5.3
Pro    11.5
Gly    7.0
Ala    4.7
1/2Cys    3.9
Val    5.2
Met    2.5
Ile    5.2
Leu    12.7
Tyr    2.4
Phe    6.4
Lys    1.5
His    1.0
Arg    3.8
Trp    3.6
（4）N末端氨基酸顺序
N末端氨基酸顺序的分析，自动的埃德曼降解法是利用气相蛋白质顺序分析仪（应用生物体系470A型，美国）。乙内酰苯硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）是以高性能液相色谱利用Micro    Pak    C18-3    SP-DS柱（Varian，USA）来鉴定。在各个步骤检测的PTH-氨基酸表示于表5。
表5
步骤    检测的PTH-氨基酸
1    甲硫氨基酸
2    谷氨酰胺
3    色氨酸
4    天冬酰胺
5 X1）
6    苏氨酸
1）未能查明的氨基酸
（5）C末端氨基酸
将620μg上述的P31蛋白质置于玻璃管中以肼降解并加入0.1毫升无水肼。在减压下密封管子，并于100℃整个加热6小时。取得的降解产物是冻干的并溶于蒸馏水中。在此溶液中加入苯甲醛形成的混合物在室温下搅拌1小时然后进行离心至产生上清液。这上清液是冻干的并且氨基酸的分析要在使用日立牌835型氨基酸分析仪的条件下进行。从而检测得47毫微摩尔异亮氨酸。
用例6所述方法培养上述菌株而取得大肠杆菌294/pTRP    P31-W2细胞的应用而导致在上述同样方法中产生高纯型的P31蛋白质（附属型adw）。
例8
1μg参考例2-（3）所述的表现载体pPKT700-1DNA于37℃时，以2单位限制性内切酶SalⅠ处理2小时，然后在例3-（1）所述条件下进一步以0.1单位的碱性磷酸酶处理。然后以冷乙醇沉淀DNA（SalⅠ-消化的pPKT700-1）。
接着，200ng例3-（1）所述的1.43kb DNA断片和200ng SalⅠ-消化的pPKT700-1在参考例1所述条件下利用T4 DNA连接酶而连接在一起。利用反应混合物和按例3-（1）所述的方法，菌株（294/pPKT P31-R）承载含有附属型adr编码P31DNA，带有1.43kb DNA断片的pPKT P31-R质粒其插入方位与被分离的PGK启动子相同。上述质粒转化寄主酵母菌株AH22R-，而酵母转化株（AH22R-/pPKT P31-R）则被分离（参看图8）。
例9
1μg参考例3-（1）所述表现载体pGLD906-1    DNA在37℃时，以2单位限制性内切酶SalⅠ处理2小时，然后在例3-（1）所述条件下以0.1单位碱性磷酸酶进一步处理。随后，以冷乙醇沉淀DNA（SalⅠ-消化的-pGLD906-1）。
接着，200ng例3-（1）所述的1.43kb    DNA和SalⅠ-消化的pGLD906-1在参考例1所述条件下，利用T4    DNA连接酶而连接在一起。以例3-（1）所述方法利用反应混合物菌株（294/pGLD    P31-R）承载含有附属型adr编码P31    DNA，带有1.43kb    DNA的pGLD P31-R质粒其插入方位与被分离的GLD启动子相同。上述质粒转化寄主酵母AH22R-而获得酵母转化株（AH22R-/pGLD P31-R）（参看图8）。
例10
P31基因在酵母中的表现
在例8或9获得每一酵母转化株和承载P31基因表现质粒于30℃时在Burkholder培养基或其变更能级的低磷酸盐中培养2天，此后收集细胞并洗以生理盐水。
按照Miyanohara，A等人的方法，细胞以裂合酶〔Seikagaku    Kogyp〕处理后转变为原生质球状态。此后，加入0.1%Triton（表面活化剂商品名）X-100以萃取P31。溶胞产物于室温下，用15，000rpm离心以产生上清液，并用AuszymeⅡ〔Abbott〕测定上清液的P31活性而取得结果表示于表6，每次计标的P31的产量均按照每升液体培养基的产量（计标）。
表6
P31（μg/l液体培养基）
酒酵母AH22R-/pGLD P31-R 2400
酒酵母AH22R-/pPHO P31-W 350
以HBsAg颗粒作标准，用AuszymeⅡ测定P31。
例11
从例1和例2取得的承载表现P31基因表现质粒的大肠杆菌294中萃取质粒，以此质粒转化大肠杆菌C600取得大肠杆菌C600/pTRP    p31-R和大肠杆菌C600/pTRP    P31-W2。
例12
大肠杆菌C600菌株承载从例11取得的P31基因表现质粒于37℃时在含有2.0%葡萄糖和1.0%酪蛋白氨基酸的M-9培养基中培养8小时然后收集细胞并洗以缓冲液〔30mM三羟基甲氨基甲烷-盐酸（pH8.0），50mM    NaCl，5mM    EDTA〕。细胞悬浮于由10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0），5mM    EDTA，1mM苯基甲基硫酰氟和5mg/ml溶菌酶的溶液中，溶胞作用即生效。在上述溶胞产物中加胍氢氯化物至最后浓度为7M，在37℃保温2小时后，溶胞产物在室温下以15，000rpm离心15分钟至产生上清液。上清液的P31活性是用上文所述的直接免疫法测定。这样测得的结果表示于表7。P31每次获得的产量是按照每毫升液体培养基的产量（计算）。
表7
转化株    HBsAg（单位/毫升    液体培养基）
大肠杆菌C600/pTRP    P31-R    1500
大肠杆菌C600/pTRP    P31-W2    1300
一个单位HBsAg相当于125Ⅰ-反-HBsAg抗体附着于AusriaⅡ-125kit的数量，而AusriaⅡ-125是结合于1ng的HBsAg的小颗粒上。
例13
高纯P31蛋白质的生产
以例7所述方法用大肠杆菌C600/pTRP    P31-R取得的从聚-HSA-Cellulofine柱洗出的浓缩物中加入6mg    DTT，反还后在37℃时（静置）1小时，混合物通过薄膜过滤器过滤。500μl滤液可以被AP224 300A（C8）反相柱（YMC-Shimakyu）吸收，而高性能液相色谱则利用三氟乙酸-乙腈-正丙醇系统作为洗脱液系统而进行工作。
AP 224 300 （C8）（1×30cm）;柱温为30℃;洗脱剂A为0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脱剂B为0.1%三氟乙酸-49.95%乙腈-49.95%正丙醇;洗脱程序，分为0（70%A+30%B）-分为10（28%A+72%B）-分为30（24%A+76%B）-分为50（14%A+86%B）分为55（5%A+95%B）-分为58（5%A+95%B）-分为59（70%A+30%B）;流速为2.5毫升/分;检测波长为280nm。一个分数率显示在这些条件（20ml）1.7×104分/毫升）下保留时间约为42分钟便可收集和保存于-20℃。
用上述方法生产的高纯蛋白质（附属型adr）与例7所取得的P31蛋白质（附属型为adr）具有同样的特性。
例14
（1）1mg例13取得的P31蛋白质置入玻璃管中并在减压下移去溶剂。按照酚硫酸法（Analytical    Chemistry    28，350（1956）〕以葡萄糖作为标准来完成碳水化合物的定量分析。结果是在样品不大于0.3摩尔而检出碳水化合物，P31蛋白质分子重量的计算是以每摩尔P31蛋白质为31，000道尔顿。所以获得的蛋白质似手没有碳水化合物。
（2）在玻璃管中置入由例13获得的30μg    P31蛋白质进行水解，接着移去溶剂。加入三氟乙酸/恒沸点盐酸〔1∶2（V/V）〕后，在减压下密封管子，在170℃下经过25、50和180分钟时间完成水解作用。水解后，管子启封，移去三氟乙酸和盐酸，残迹溶于0.02N盐酸中，用日立牌835型氨基酸分析仪完成氨基酸分析。根据Hir′s方法当磺基丙氨酸存在于氨基酸分析仪里时，在过甲酸氧化P31蛋白质后可以测得胱氨酸和半胱氨酸并在减压下在恒沸点盐酸中水解24小时。苏氨酸、丝氨酸和色氨酸的定量分析是P31蛋白质在含有4%巯基乙酸的恒沸点盐酸中水解后，在减压情况下，分别以16、20、24和30小时进行的。氨基酸的分析数据是计算由水能25、50和180分钟取得的每一个数值的平均值。对于色氨酸是采用其水解24小时后的数值而对于丝氨酸和苏氨酸数值是用外推法推算至水能时为0（零）而测得的。这样获得的结果表于表8。
表8
氨基酸    分子%
Asp/Asn    5.5
Thr    7.9
Ser    10.3
Glu/Gln    4.7
Pro    11.9
Gly    7.3
Ala    4.4
1/2    Cys    3.8
Val    4.7
Met    2.5
Ile    5.1
Leu    13.5
Tyr    2.3
Phe    6.7
Lys    1.2
His    0.9
Arg    3.4
Trp    3.7
对这些微生物的研究已有了累积而其增长的数字表示于表9。
在表中，“IFO”和“FRI”各代表“对发酵作用的研究，Osaka”（日本）和“发酵研究院，工业科学和工艺代理，日本国际贸易和工业部”。E.Coli和S.cerevisiae分别代表大肠杆菌和酒酵母，“FERM    BP”数字代表在布达佩斯协议下累积的增长数字而“FERM    P”项在括弧里的数字代表在布达佩斯协议下未转变成累积前的增长数字
表9
IFO    FRI
微生物    IFO    No.    FERM    No.
E.coli    294    14171    -
E.coli    294/pTRP    P31-R    14355    BP-802
（P-7709）
E.coli    294/pTRP    P31-W2    14356    BP-803
（P-7710）
S.cerevisiae AH22R-10134 BP-804
（P-7824）
S.cerevisiae AH22R-/pPHO P31-R 10135 BP-805
（P-7825）
S.cerevisiae AH22R-/pPHO P31-W 10136 BP-806
（P-7826）
E.coli    C600/pTRP    P31-R    14425    BP-807
（P-8045）
S.cerevisiae AH22R-/pGLD P31-R 10145 BP-800
S.cerevisiae AH22R-/pPKT P31-R 10146 BP-801
E.coli    C600    14410    BP-808
（P-8154）
E.coli    294是众所周知的菌株〔Backman，K.et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，4174（1974）〕。
按照这项发明HBsAg    P31是用作检定和预防HBV感染的疫苗。

Claims (32)

1、DNA重组体其对乙型肝炎病毒表面抗原P31是插入启动子区的3′末端。
2、根据权利要求1，重组体DNA其启动子之一是色氨基酸启动子。
3、根据权利要求1，重组体DNA其启动子之一是阻遏酸性磷酸酶启动子。
4、根据权利要求1，重组体DNA其启动子之一是甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。
5、根据权利要求1，重组体DNA其启动子之一是3-磷酸甘油酯激酶启动子。
6、根据权利要求1，重组体DNA其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31。
7、根据权利要求1，DNA重组体其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adw乙型肝炎病毒表面抗原P31。
8、根据权利要求1，DNA重组体其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31而其启动子是色氨酸启动子。
9、根据权利要求1，DNA重组体其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31，而其启动子是阻遏酸性磷酸酶启动子。
10、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为PTRP P31-R。
11、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为pPHO  P31-R。
12、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为pTRP  P31-W。
13、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为pPHO  P31-W。
14、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为pGLD  P31-R。
15、根据权利要求1，DNA重组体，其中之一为pPKT  P31-R。
16、转化株承载具有对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码的重组体DNA，密码插入于启动子区的3′末端。
17、根据权利要求16，转化株其微生物之一属于大肠杆菌。
18、根据权利要求16，转化株其微生物之一属于酒酵母。
19、根据权利要求16，转化株其微生物之一属于大肠杆菌294。
20、根据权利要求16，转化株其微生物之一属于大肠杆菌C600。
21、根据权利要求16，转化株之一是大肠杆菌294/pTRP  P31-R。
22、根据权利要求16，转化株之一是大肠杆菌294/pTRP  P31-W2。
23、根据权利要求16，转化株之一是大肠杆菌C600/pTRP  P31-R。
24、根据权利要求16，转化株之一是酒酵母AH22R-/pPHO P31-R。
25、根据权利要求16，转化株之一是酒酵母AH22R-/pPHO P31-W。
26、根据权利要求16，转化株之一是酒酵母AH22R-/pGLD P31-R。
27、根据权利要求16，转化株之一是酒酵母AH22R/pPKT  P31-R。
28、生产DNA重组体方法中对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码是插入于某一个启动子区的3′末端，包括上述密码插入该启动子区的3′末端。
29、生产承载重组体DNA的转化株的方法，其对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码是插入于启动子区的3′末端，如上文规定包括转化带有DNA重组体的寄主。
30、乙型肝炎病毒表面抗原P31的生产方法包括（a）培养承载DNA重组体的转化株，而对乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密码是插入于某一个启动子区的3′末端;（b）在培养中富集乙型肝炎病毒表面抗原P31;（c）回复同一（过程）。
31、乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白质的生产方法包括（a）培养承载DNA转化株，其DNA具有对乙型肝炎病毒表面抗原P31的碱基顺序密码。（b）在培养中富集乙型肝炎病毒表面抗原P31;（c）收集含P31溶液和（d）提纯含P31溶液，包括亲和色谱处理。
32、根据权利要求33，其提纯方法包括利用聚合的人的血清清蛋白作配体的亲和色谱处理。
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