CN1303299A - 关于肽合成的方法以及组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明首先涉及肽尤其是T－20(也称为“DP－178”;SEQ IDNO:1)和T－20样肽的合成方法。该方法利用固相或液相合成法合成和组合具体肽片段组,获得目的肽。本发明进一步涉及作为所述目的肽(例如T－20)合成中的中间体的各个肽片段。本发明更进一步涉及可一起用来产生全长T－20和T－20样肽的所述肽中间体片段组。

Description

关于肽合成的方法以及组合物
1．前言
本发明首先涉及肽、尤其是T-20(也称为“DP-178”；SEQ ID NO:1)和T-20样肽的合成方法。该类方法利用固相和液相合成法合成和组合具体肽片段组，获得目的肽。本发明进一步涉及作为所述目的肽(例如T-20)合成中的中间体的各个肽片段。本发明更进一步涉及可一起用来产生全长T-20和T-20样肽的所述肽中间体片段组。本发明更进一步涉及纯化肽(尤其是T-20和T-20样肽)和纯化用作主题肽合成中的中间体的各个肽片段的方法。
2．背景
最近鉴定了大量的肽，它们具有抑制融合相关事件的能力、而更重要的是还具有有效的抗病毒活性。参见例如美国专利第5,464,933；5,656,480号和PCT公布号WO 96/19495T-20。因为这些肽将得到广泛应用，作为治疗学，例如需要能够大量合成该类肽。
尽管已有肽合成技术(参见例如Mergler等，1988,TetrahedronLetters 29:4005-4008；Mergler等，1988,Tetrahedron Letters 29:4009-4012；Kamber等(编辑)，“Peptides,Chemistry and Biology,ESCOM,Leiden,1992,525-526；和Riniker等,1993,Tetrahedron Letters 49:9307-9320)，但是目前没有可用于大规模、经济生产易于纯化的肽如T-20和T-20样肽的技术。
3．发明概述
本发明首先涉及肽、尤其是T-20(也称为“DP-178”；SEQ ID NO:1)和T-20样肽的合成方法。该类方法利用固相和液相合成法合成和组合具体肽片段组，获得目的肽。一般来说，本发明方法包括在固相支持体上合成T-20或T-20样肽的具体侧链保护肽片段中间体，在溶液中偶合所述保护片段，形成保护的T-20或T-20样肽，然后将侧链去保护，获得最终的T-20或T-20样肽。本发明方法的优选实施方案包括合成具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的T-20肽。
本发明进一步涉及用作所述目的肽(例如T-20)合成中的中间体的各个肽片段。本发明的肽片段包括但不限于具有下表1所示的氨基酸序列的肽片段：
                       表1
肽序号 氨基酸序列   T-20相应的编码氨基酸序列
    1  YTSLIHSL(SEQ ID NO:2)     1-8
    2  YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3)     1-15
    3  YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4)     1-16
    4  YTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO:5)     1-18
肽序号 氨基酸序列   T-20相应的编码氨基酸序列
    5 IEESQNQ(SEQ ID NO:6)     9-15
    6 IEESQNQQ(SEQ ID NO:7)     9-16
    7  QEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:8)     16-35
    8  QEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:9)     16-36
    9  EKNEQEL(SEQ ID NO:10)     17-23
    10  EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11)     17-26
    11  EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)     17-36
    12  NEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:13)     19-35
    13  NEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:14)     19-36
    14  LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)     24-35
    15  LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)     24-36
    16  DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)     27-35
    17  DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)     27-36
    18  EKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:19)     17-35
本发明更进一步涉及用作目的肽合成中的中间体的具体肽片段组。本发明的各组肽片段包括但不限于下表2所示的1-20组。
                         表2T-20相应的组别          氨基酸序列                           编码氨基酸序列1             YTSLIHSLIEESQNQQ  (SEQ ID NO:4)          1-16
          EKNEQELLELDKWASLWNWF                     17-36
                            (SEQ ID NO:12)
          YTSLIHSLIEESQNQQ  (SEQ ID NO:4)          1-16
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNWF        (SEQ ID NO:18)         27-36
          YTSLIHSLIEESQNQQ  (SEQ ID NO:4)          1-16
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNW         (SEQ ID NO:17)         27-35
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQ           (SEQ ID NO:6)          9-15
          EKNEQELLELDKWASLWNWF                     17-36
                            (SEQ ID NO:12)
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQ           (SEQ ID NO:6)          9-15
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNWF        (SEQ ID NO:18)         27-36
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQ           (SEQ ID NO:6)          9-15
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNW         (SEQ ID NO:17)         27-35
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQQ          (SEQ ID NO:7)          9-16
          EKNEQELLELDKWASLWNWF                    17-36
                            (SEQ ID NO:12)
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQQ          (SEQ ID NO:7)          9-16
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNWF        (SEQ ID NO:18)         27-36
          YTSLIHSL          (SEQ ID NO:2)          1-8
          IEESQNQQ          (SEQ ID NO:7)          9-16
          EKNEQELLEL        (SEQ ID NO:11)         17-26
          DKWASLWNW         (SEQ ID NO:17)         27-35
T-20相应的组别        氨基酸序列                          编码氨基酸序列10           YTSLIHSLIEESQNQQ   (SEQ ID NO:4)      1-16
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNWF      (SEQ ID NO:16)     24-3611           YTSLIHSLIEESQNQQ   (SEQ ID NO:4)      1-16
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNW       (SEQ ID NO:15)     24-3512           YTSLIHSL           (SEQ ID NO:2)      1-8
         IEESQNQ            (SEQ ID NO:6)      9-15
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNWF      (SEQ ID NO:16)     24-3613           YTSLIHSL           (SEQ ID NO:2)      1-8
         IEESQNQ            (SEQ ID NO:6)      9-15
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNW       (SEQ ID NO:15)     24-3514           YTSLIHSL           (SEQ ID NO:2)      1-8
         IEESQNQQ           (SEQ ID NO:7)      9-16
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNWF      (SEQ IDNO:16)      24-3615           YTSLIHSL           (SEQ ID NO:2)      1-8
         IEESQNQQ           (SEQ ID NO:7)      9-16
         EKNEQEL            (SEQ ID NO:10)     17-23
         LELDKWASLWNW       (SEQ ID NO:15)     24-3516          YTSLIHSLIEESQNQ    (SEQ ID NO:3)      1-15
         QEKNEQELLELDKWASLWNWF                 16-36
                            (SEQ ID NO:9)17          YTSLIHSLIEESQNQ    (SEQ ID NO:3)      1-15
         QEKNEQELLELDKWASLWNWF                 16-36
                            (SEQ ID NO:9)18          YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO:5)      1-18
         NEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:14)     19-3619          YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO:5)      1-18
         NEQELLELDKWASLWNW  (SEQ ID NO:13)     19-3520          YTSLIHSLIEESQNQQ   (SEQ ID NO:4)      1-16
         EKNEQELLELDKWASLWNW                   17-35
                            (SEQ ID NO:19)
本发明的部分基础是，本发明人意外发现某些固相液相合成反应的组合可高物料通过量和高产率地首次大规模生产高纯度T-20和T-20样肽。尤其是根据本发明的方法可以在1千克或1千克以上的规模合成T-20和T-20样肽。已经发现通过选择本发明的具体T-20肽片段用于固相合成时，可利用高效率的固相偶合技术而不必使用在固相合成中通常需要的3倍、4倍或甚至5倍的过量氨基酸和试剂。本发明方法在固相合成本发明的肽片段时仅使用约1.5倍量氨基酸。这种氨基酸和试剂用量的成本节约型降低使得本发明方法适用于大规模合成T-20和T-20样肽。
此外，本发明人令人惊奇地发现，可以每克固相树脂约0.8-1mmol载荷量固相合成某些肽片段。该载荷量明显高于在固相肽合成中通常达到的每克树脂0.25-0.4mmol的载荷范围。而且，本发明人发现在固相中采用超酸敏感型树脂合成所选定的肽片段可产生非常高纯度的肽片段。不必用色谱技术来纯化按照本发明生产的肽片段；只需要使用前使所述肽片段进行沉淀和/或研制步骤，或作为从所述树脂直接获得的肽片段使用。应用超酸敏感型树脂使本发明合成的保护肽可从该树脂裂解，而不需要同时去除侧链保护基团。这可减少杂质，并可使含有10个或10个以上氨基酸的肽以高纯度合成。通过偶合按照本发明生产的高纯度肽片段，从而在液相中根据本发明方法合成的T-20和T-20样肽的杂质类型主要包括未偶合的片段，而不是密切相关的类似物。因此，按照本发明生产的T-20和T-20样肽较按照常规技术生产的肽纯化容易得多。在下文第9和11部分中提供的实施例说明T-20全长肽的这类组合合成。第11部分中给出的实施例说明大规模合成和纯化T-20和T-20中间体肽。所以，本发明的方法可以以1千克或1千克以上的规模生产T-20和T-20肽中间体。
本发明人还意外发现，用在碱性pH范围可使用的高载荷量物质，可纯化本文所述的肽(如T-20和其它T-20样肽)以及某些肽片段。因此，本发明更进一步涉及纯化肽、尤其是T-20和T-20样肽和纯化用作主题肽合成中的中间体的各个肽片段的方法。
3.1定义
本文所用的氨基酸符号为常规符号，具体如下：
常见氨基酸缩写
氨基酸    单字母符号    常见缩写
甘氨酸         A          Ala
天冬酰胺       N          Asn
天冬氨酸       D          Asp
谷氨酰胺       Q          Gln
谷氨酸         E          Glu
组氨酸         H          His
异亮氨酸       I          Ile
亮氨酸         L          Leu
赖氨酸         K          Lys
苯丙氨酸       F          Phe
丝氨酸         S          Ser
苏氨酸         T          Thr
色氨酸         W          Trp
酪氨酸         Y          Tyr
4．附图简述
图1：T-20四片段方法。该图图示下文9.1部分提供的实施例采用的流程，该流程以上表2所示第6组中间体肽片段为原料合成全长T-20。
图2：T-20四片段方法，途径2。该图图示另一四片段流程，它偶合上表2所示的第6组肽中间体以合成全长T-20。
图3：T-20三片段方法。该图图示下文9.1部分提供的实施例采用的流程，该流程合成全长T-20。
图4：T-20三片段方法，途径2。该图图示下文9.2、9.3、9.4和9.5部分提供的实施例采用的流程，该流程合成全长T-20。
图5：T-20两片段方法。该图图示偶合上表2所示的第18组肽中间体以合成全长T-20的流程。
5．发明详述
5.1全长肽
本发明涉及可用来合成称为T-20或DP-178的肽的方法、肽片段、肽片段组。T-20是相当于得自HIV-1LAI分离株的跨膜蛋白gp41的氨基酸残基638-673并具有36个氨基酸的序列的肽(从氨基NH2末端到羧基COOH末端认读)：NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH
应该理解的是，本发明的方法、片段和片段组以及用于选择所述片段和片段组的技术除了可用来合成T-20外还可用来合成T-20样肽。本文所用术语“T-20样”是指美国专利第5,464,933；5,656,480或PCT公布号WO 96/19495中所列举的任何HIV或非HIV肽，其中每一文献通过引用整体结合到本文中。
除了本文所述T-20和T-20样肽外，本发明的方法、片段和肽片段组还可用来合成具有修饰氨基和/或羧基末端的肽。以T-20为例，这类肽具有下式结构：X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
其中X代表氨基；选自苄氧羰基、丹酰基和叔丁氧基羰基的疏水基团；乙酰基；9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)基团；或选自脂质-脂肪酸缀合物、聚乙二醇和碳水化合物的大分子载体基团；而Z代表羧基；酰胺基；叔丁氧基羰基；对-硝基苄酯基或选自脂质-脂肪酸缀合物、聚乙二醇和碳水化合物的大分子载体基团。加入该“X”和“Z”基团的技术是本领域技术人员周知的。
在优选的实施方案中，本发明方法用来合成具有其中X为乙酰基而Z为酰胺基的上式的肽。下文部分9中提供的实施例证明通过偶合下文部分5.2中所述的肽中间体成功合成T-20肽。在优选的方法中，可用任何非硅基柱填料(用于使载荷能力最大)纯化T-20和T-20样肽和中间体，所述柱填料包括但不限于锆基填料、聚苯乙烯基填料、聚丙烯基填料或其它聚合物基填料，它们在高pH(大于7)范围下是稳定的。例如Tosohaus(Montgomeryville,PA)销售的具有宽pH值范围的非硅基柱填料中包括pH值大于7的柱填料。可以在低、中或高压色谱中使用由该材料填充的柱。参见例如下文部分10中给出的纯化方法。
5.2肽中间体
本发明包括但不限于具有上表1中所列具体氨基酸序列的T-20和T-20样肽的肽片段中间体和表2所列的肽片段中间体组。可用所述肽中间体、尤其是下表2所列的肽片段组生产T-20和T-20样肽。
任何一种或多种表1或2所列的肽片段的氨基酸残基侧链可以用标准保护基团如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保护。t-Bu基团是氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的优选侧链保护基团；trt基团是氨基酸残基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的优选侧链保护基团；而Boc基团是氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选侧链保护基团。
在合成表1所列的片段1、2、3和4期间，必须优选用三苯甲基(trt)保护基保护组氨酸残基侧链。如果不对其进行保护，则使用来从树脂裂解肽片段的酸与组氨酸残基产生不利反应，导致所述肽片段的降解。
优选用三苯甲基(trt)基团保护本发明肽片段的谷氨酰胺残基。然而，优选不保护片段1-16和9-16羧基末端的谷氨酰胺残基。已经发现1-16片段的羧基末端的谷氨酰胺残基上保护基团缺失有利1-16片段与17-36片段反应，从而使偶合的片段仅约2％外消旋化。另外，如果需要任何本发明肽片段在有机溶剂中溶解性降低，则可以从所述片段的其它任何一个或多个谷氨酰胺残基中去除三苯甲基保护基。
优选保护本发明每个肽片段的所有天冬酰胺残基。此外，优选用Boc基团保护色氨酸残基。
根据上表1所列的肽化学式1-18的保护性肽片段包括但不限于下表3所列的化合物。
                         表3
肽化学式序号 化学式   T-20相应的编码氨基酸序列
    1a  AC-YTSLIHSL-COOH(SEQ IDNO:2) 1-8
    1b  FMOC-YTSLIHSL-COOH(SEQ IDNO:2) 1-8
    3a  AC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQID NO:4) 1-16
    3b  FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:4) 1-16
    3c  AC-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQID NO:4) 1-16
    3d  FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4) 1-16
    5a  AC-IEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:6) 9-15
    5b  FMOC-IEESQNQ-COOH(SEQ IDNO:6) 9-15
    6a  NH2-IEESQNQQ-OPNB(SEQ IDNO:7) 9-16
    6b  FMOC-IEESQNQQ-OPNB(SEQ IDNO:7) 9-16
    9a  AC-EKNEQEL-COOH(SEQ IDNO:1O) 17-23
    9b  FMOC-EKNEQEL-COOH(SEQ IDNo:10) 17-23
    1Oa  AC-EKNEQELLEL-COOH(SEQ IDNO:11) 17-26
    10b  FMOC-EKNEQELLEL-COOH(SEQ IDNO:11) 17-26
肽化学式序号 化学式   T-20相应的编码氨基酸序列
    11a  NH2-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12) 17-36
    11b  FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12) 17-36
    14a  AC-LELDKWASLWNW-COOH(SEQ IDNO:15) 24-35
    14b  FMOC-LELDKWASLWNW-COOH(SEQID NO:15) 24-35
    15a  NH2-LELDKWASLWNWF-NH2(SEQ IDNO:16) 24-36
    15b  FMOC-LELDKWASLWNWF-NH2(SEQ IDNO:16) 24-36
    16a  AC-DKWASLWNW-COOH(SEQ IDNO:17) 27-35
    16b  FMOC-DKWASLWNW-COOH(SEQ IDNO:17) 27-35
    17a  NH2-DKWASLWNWF-NH2(SEQ IDNO:18) 27-36
    17b  FMOC-DKWASLWNWF-NH2(SEQ IDNO:18) 27-36
    18A  FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:19) 17-35
上表3所列肽的任何一个或多个氨基酸残基侧链可用标准侧链保护基如上述tBu、trt和Boc保护。采用下文5.4部分中所讨论的一般技术代表性合成表3的肽见下文第7和第8部分。
5.3肽合成
如上所述，本发明某些单个肽片段优选用固相合成技术制备，而本发明其它肽优选用组合的固相和液相合成技术制备，所述合成使本文所述的T-20或T-20样肽的生产达成最大。然而，应该知道本发明的肽片段可用本领域熟知的技术合成或制备。参见例如Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman andCo.,NY，该文献通过引用整体结合到本文中。
本发明肽可交替合成，使得一个或多个连接所述肽氨基酸残基的键为非肽键。可用本领域熟知的反应形成这些替代非肽键，包括但不限于所列举但是仅为少数几个的亚氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮键。
在本发明又一实施方案中，包括上述序列的T-20和T-20样肽可用存在于其氨基末端和/或羧基末端的另外的化学基团合成，使例如所述肽的稳定性、活性和/或溶解性提高。例如，可将疏水基团如苄氧羰基、丹酰基、乙酰基和叔丁氧基羰基加入所述肽的氨基末端。同样，可将乙酰基或9-芴基甲氧基-羰基置于所述肽的氨基末端。(参见上述T-20的“X”修饰)。另外，疏水基团叔丁氧基羰基或酰胺基可加入所述肽的羧基末端。同样，对硝基苄酯基可位于所述肽的羧基末端。(参见上述T-20的“Z”修饰)。引入这类修饰的技术是本领域技术人员熟知的。
进一步，可合成T-20和T-20样肽，以改变其立体构型。可应用所述肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体而不是常见L-异构体。
更进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可用一个公知的非天然氨基酸残基取代。如上述的改变可用来提高本发明肽的稳定性、活性和/或溶解性。
可合成另外含有共价连接到其氨基和/或羧基末端的大分子载体基团的任何一种T-20或T-20样肽。这类大分子载体基团可包括例如脂质-脂肪酸缀合物、聚乙二醇、碳水化合物或另外的肽。所以，上文所述的T-20“X”修饰可另外代表共价连接到肽的氨基末端的任何上述大分子载体基团，优选另外的肽基团。同样，上述T-20“Z”修饰可另外代表任何上述大分子载体基团。
本发明的肽片段优选用标准FMOC方案经固相肽合成(SPPS)技术合成。参见例如Carpino等，1970,J.Am.Chem.Soc.92(19):5748-5749；Carpino等,1972,J.Org.Chem.37(22):3404-3409。在优选的实施方案中，固相合成本发明的肽片段在超酸敏感型固相支持体上进行，超酸敏感型固相支持体包括但不限于2-氯代三苯甲基氯树脂(参见例如，Barlos等，1989,Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946)和4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂(参见例如，Seiber,1987,Tetrahedron Letters 28(49):6147-6150，和Richter等，1994,TetrahedronLetters 35(27):4705-4706)。2-氯代三苯甲基氯和4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂均购自Calbiochem-Novabiochem Corp.,San Diego,CA。
在此描述可用于固相肽合成的一般生产方法和树脂装载。例如通过下列技术可进行树脂装载：树脂优选超酸敏感型树脂如2-氯代三苯甲基树脂，将其装载到反应室。用氯化了的溶剂如二氯甲烷(DCM)洗涤树脂。排干树脂床，加入1.5当量氨基酸和2.7当量二异丙基乙胺(DIEA)的约8-10体积的二氯乙烷(DCE)溶液。应该优选用Fmoc保护氨基酸的N-末端，必要或合适的情况下应该保护所述氨基酸的侧链。所述混合物用氮气鼓泡搅拌2小时。
值得注意的是，需要氯化了的溶剂来使所述2-氯代三苯甲基树脂充分膨胀。尽管根据文献资源DCE提供更高的载荷效率，但是可以用DCM代替，而载荷量几乎没有或没有降低。
搅拌后，排干所述树脂床，用DCM洗涤。用9∶1 MeOH∶DIEA溶液封端树脂上的活性部位约20-30分钟。排干树脂床，用DCM洗涤4次，用氮气吹扫干燥，获得载荷树脂。
Fmoc是氨基酸的N-末端的优选保护基团。根据装载的氨基酸，可以保护或不保护其侧链。例如当载荷Trp时，应该用Boc保护其侧链。同样，用trt可以保护Gln侧链。然而当在合成1-16肽片段的制备中载荷Gln时，则不应该保护其侧链。不必保护Leu的侧链。
根据需要可从Sean或Genzyme获得具有或没有侧链保护基团的用于装载所述树脂和肽合成的Fmoc保护氨基酸。作为上述方法的一个替代方法，可购买已经装载了合适氨基酸的树脂。
在下文部分6中的实施例描述了典型的树脂制备。
例如按照以下技术可实施固相肽合成技术：将荷载树脂加入所述反应室，用溶剂优选二氯甲烷(DCM；优选约10体积)调节，同时氮气搅拌约15分钟，使所述树脂珠膨胀。需要DCM来充分膨胀2-氯代三苯甲基树脂。在反应室中的所述树脂体积因为树脂珠膨胀而增加一倍或两倍，所述活性部分未被折叠而易于进行反应。所述树脂膨胀后，从反应室排干溶剂。
用2等份20％哌啶的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液每次处理所述树脂约10分钟，从而达到从所述末端胺或树脂去除Fmoc(9-芴基-甲氧基羰基)保护基。所需要的每等份的20％哌啶的NMP溶液的体积取决于正在进行的反应量。然后用等份NMP(约10体积)洗涤树脂5-7次，以去除Fmoc副产物(即二苯并富烯和其哌啶加合物)和残留的哌啶。
氯醌试验可用来测定去除Fmoc副产物和残留的哌啶是否完全。通过向约1mL丙酮中加入一滴氯醌的甲苯饱和溶液，从而制备氯醌试验溶液。通过加入一滴DMP洗涤液至氯醌试验溶液中，测试所述洗涤液。出现蓝色或紫色表示存在仲胺，表明仍然存在Fmoc副产物和/或残余哌啶。重复NMP洗涤直到不能观察到蓝色或紫色时为止。
同时，活化将加入所述树脂的在所述序列中的后续氨基酸，以在其羧基末端进行反应。应该用Fmoc保护每个氨基酸的胺末端。根据所加入的氨基酸，其侧链可能保护或可能没有保护。优选用t-Bu保护tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(P)的侧链，用trt保护His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的侧链，用Boc保护Lys(K)和Trp(w)的侧链。然而，如上所述，必须保护His的侧链。而且优选不保护片段1-16和9-16的羧基末端的Gln残基的侧链。Len或Ile的侧链的保护不是必需的。
如下活化氨基酸。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5eq)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5eq)和二异丙基-乙胺(DIEA)(1.5eq)在室温下溶解于NMP(约7.5体积)中。将所述溶液冷却至0-5℃，然后加入O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基尿鎓(uronium)六氟代磷酸盐(HBTU)(1.5eq)，接着搅拌5-15分钟使其溶解。重要的是在低温下进行活化，以使所述氨基酸的外消旋化最小。HBTU是加入所述冷却溶液中的最后试剂，因为活化和外消旋化不能在缺乏它的情况下发生。
将活化的氨基酸溶液加注到排干的树脂中，用DCM(约2.5体积)洗涤。请注意，所述氨基酸的活化是在NMP中进行，因为HBTU不溶于DCM中。然而此时向所述反应物中加入DCM以保持所述树脂珠的充分膨胀。用氮气鼓泡搅拌所述反应物约1小时。用如下所述的定性茚三酮试验可监测偶合完成情况。
为了用定性茚三酮试验检测所述反应的完成情况，取出2-20mg树脂样品，用甲醇洗净。向该样品中加入3滴76％苯酚的乙醇溶液、4或5滴0.2mM KCN的吡啶溶液和3滴0.28M茚三酮的乙醇溶液。用乙醇将所述样品稀释至体积约0.5mL，并放置于约75℃的加热块中5-10分钟。出现蓝色或紫色表示存在游离胺，说明所述反应仍未完成。可进一步将样品稀释至约3mL体积，以便更容易判定浓缩样品中的颜色变化程度。
假如1小时后观察到阳性茚三酮试验，则再继续进行所述偶合反应1小时。假如2小时后仍然存在阳性茚三酮试验，则排干所述树脂，在约10体积NMP中洗涤3次，用1当量活化氨基酸重复所述偶合反应。
如果在两个偶合循环之间使所述树脂储存过夜，则可以排干树脂床，在氮气层下用DCM覆盖。或者排干树脂床，储存在氮气层下，然后在进行下一个偶合循环之前用DCM洗涤液调适。如果所述完整片段准备在裂解前储存过夜，则所述树脂应该用DCM洗涤使其不含NMP，因为在NMP中可能发生明显的Fmoc去保护。
在判定所述偶合反应完成后，则排干树脂，用3等份(约10体积)NMP洗涤。重复所述肽片段的后续单体的偶合循环。在最后一个偶合反应后，用4等份(约10体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4等份(约10体积)DCM洗涤。可用氮气吹扫干燥树脂结合肽。
按照例如以下技术可裂解并分离通过固相合成技术合成的肽：用本领域众所周知的技术从树脂上切除所述肽。可用例如1％或2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液或用1％和2％TFA的DCM溶液的组合切除所述肽。也可用乙酸(HOAC)切除所述肽。裂解所需要的具体裂解试剂、溶剂和时间将取决于所要裂解的特定肽。裂解后使所述裂解部分进行标准处理方法以分离所述肽。通常真空下浓缩合并的裂解部分，然后用溶剂如乙醇、甲醇或庚烷重构。一般是加入水沉淀肽，并真空过滤收集所述肽。或者可在分离所述肽前研制所述产物。
在下文7.1-7.6部分给出的实施例介绍固相合成表1、2和/或3所示的肽中间体。
为了合成全长T-20肽，可将上表1的肽中间体偶合在一起产生T-20肽。例如可将表2所列的各组的肽中间体偶合在一起产生T-20全长肽。在第9部分给出了如此由中间体肽片段合成全长T-20的典型实例，并图示于图1-5中。在一些实施方案中，可采用四片段法合成T-20。“四片段法”合成是指以合成并可用固相和液相合成技术偶合成全长T-20肽的四个T-20中间体肽片段为原料的T-20合成方案。上表2所示的第5、6、8、9和12-15组中间体肽片段为优选片段组。图1和图2图示利用表2第6组肽中间体合成全长T-20的两个四片段法。对于该片段组，值得注意的是在所述片段偶合过程中单独引入氨基酸残基36(T-20羧基1-末端氨基酸残基)。在9.1部分给出的实施例中证实了示于图1的最佳T-20合成方案。
在另外的实施方案中，可采用三片段法合成T-20。“三片段法”合成是指以合成并用固相和液相合成技术偶合为全长T-20肽的三个T-20中间体肽片段为原料的T-20合成方案。上表2所示的第2-4、7、10和11组中间体肽片段为优选三片段组。图3和图4图示利用表2第3组肽中间体合成全长T-20的两个三片段法。对于该片段组，值得注意的是在所述片段偶合过程中单独引入氨基酸残基36(T-20羧基1-末端氨基酸残基)。在下文的9.1部分给出的实施例证实了示于图3的最佳T-20合成方案。在下文的9.2-9.5部分给出的实施例证实了示于图4的最佳T-20合成方案。
在另外的实施方案中，可采用两片段法合成T-20。“两片段法”合成是指以合成并用固相和液相合成技术偶合为全长T-20肽的两个T-20中间体肽片段为原料的T-20合成方案。上表2所示的第1和16-20组中间体片段为优选片段组。图5图示利用表2第20组肽中间体合成全长T-20的两片段法。对于该片段组，值得注意的是在所述片段偶合过程中氨基酸残基(T-20羧基末端氨基酸残基)单独引入。
可用本领域技术人员周知的液相肽合成技术合成本发明的肽中间体片段。在8.1-8.11部分给出的实施例描述表1、2和/或3所列的肽中间体的典型的液相肽合成法。例如Tosohaus(Montgomeryville,PA)销售的具有宽pH范围的非硅基柱填料中包括pH值大于7的柱填料。
6．实施例：树脂合成
在本文6.1-6.3部分描述的实施例中，合成可与固相合成肽和本文所述的肽中间体一起使用的氯代三苯甲基树脂。
6.1制备Fmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基树脂材料：                MW      eq     mmole     g       mL2-氯代三苯甲基氯树脂  --      1.0      25      25      -Fmoc-Trp(Boc)-OH      --      526.60   1.5     37.5    19.7二异丙基乙胺(DIEA)  129.25    1.7      42.5    5.5     7.4二氯乙烷(DCE)         --       --       --      --     250二氯甲烷(DCM)         --       --       --      --     6×2509∶1甲醇∶DIEA        --       --       --      --      200方法：
将2-氯代三苯甲基氯树脂(25g,1eq.)加入500mL肽反应室，用250mL DCM洗涤。排干树脂床，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的10体积DCE溶液。氮气鼓泡搅拌该混合物2小时。
排干树脂床，用250mL DCM洗涤。用200mL 9∶1 MeOH∶DIEA溶液对树脂上的活性部分进行20分钟封端。排干树脂床，用4×250mLDCM洗涤，用氮气吹扫干燥，获得34.3g载荷树脂。
从树脂分离Fmoc-氨基酸并相对于标准品进行分析，从而进行定量HPLC分析。HPLC分析所述物质表明所述树脂的载荷量为0.68mmol/g。
柱：Phenomenox Jupiter C18；299_；5μ
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈
65％B等梯度
保留时间：～14分钟
6.2制备Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基树脂材料：                MW       eq      mmole     g       mL2-氯代三苯甲基氯树脂  --       1.0      25       25      --FmocGlnOH            368.39   1.5      37.5     13.8    --二异丙基乙胺(DIEA)    129.25   1.7      42.5     5.5     7.4二氯乙烷(DCE)         --       --       --        --     75N,N-二甲基甲酰胺      --       --       --        --     200(DMF)二氯甲烷(DCM)         --       --       --        --     6×2509∶1甲醇∶DIEA        --       --       --        --     200方法：
用FmocGlnOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在75mL DCE和200mLDMF的混合物中的溶液重复在上文6.1部分给出的实施例中使用的方法。该反应获得33.8g载荷树脂。推测所述树脂的理论载荷为0.74mmol/g，并在以后使用该物质。
6.3制备Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基树脂材料：                 MW        eq        mmole     g     mL2-氯代三苯甲基氯树脂   --        1.0       250      250    --FmocLeuOH            353.42     1.5       375      132.5  --二异丙基乙胺(DIEA)    129.25     1.7       425      55     75二氯乙烷(DCE)          --        --         --      --     2000二氯甲烷(DCM)          --        --         --      --     6×15009∶1甲醇∶DIEA         --        --         --      --     1500方法：
将所述树脂加入3L肽反应室，用1.5 DCM洗涤。排干树脂床，加入FmocLeuOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的8体积DCE溶液。氮气鼓泡搅拌该混合物2小时。
排干树脂床，用1.5L DCM洗涤。用1.5L 9∶1 MeOH∶DIEA溶液对树脂上的活性部分进行封端30分钟。排干树脂床，用4×1.5LDCM洗涤，用氮气吹扫干燥，获得345g载荷树脂。
从树脂分离Fmoc-氨基酸并相对于标准品进行分析，从而进行定量HPLC分析。HPLC分析所述物质表明所述树脂的载荷量为0.72mmol/g。
柱：Phenomenox Jupiter C18；299_；5μ
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈溶液
        65％B等梯度
保留时间：～8分钟
7．实施例：固相合成肽
在下文7.1-7.6部分给出固相合成表1、2和/或3中所列的肽中间体的实例。
7.1制备片段Fmoc-AA(1-8)-OH(片段1b)结构：Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-OH(SEQ ID NO:2)
                        C93H122N10O15
                        MW1619.06材料：                            MW       eq       mmole    g     mLFmoc-Leu-2-氯代三苯甲基树脂       --       1.0     15.6     20.0   --Fmoc-氨基酸*                     --       1.5     23.4      --    --1-羟基苯并三唑(HOBT)水合物*      153.15    1.5     23.4     3.6    --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基尿鎓六氟代磷酸盐(HBTU)*        379.25    1.5     23.4     8.9    --二异丙基乙胺(DIEA)*              129.25    1.5     23.4     3.0    4.1N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*           --        --      --       --    150二氯甲烷(DCM)*                    --        --      --       --    5020％哌啶/NMP*                     --        --      --       --    2×200用于冲洗的NMP*                    --        --      --       --    200(每次洗涤)1％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液         --        --      --       --    3000.5％TFA/DCM                      --        --      --       --    200哌啶                              --        --      --       --乙醇                              --        --      --       --    110水                                --        --      --       --    200+100*每个偶合循环理论产量：25.3g                            预期收率：80-90％
                                       实际产量：20.0g方法：
向1L肽反应室中加入20.0g Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基树脂。在200mL(约10体积)DCM中用氮气搅拌约15分钟调节所述树脂，膨胀树脂圆珠，然后排干。
用2×200mL 20％哌啶的NMP溶液处理，每次10分钟，达到从所述末端胺去除Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)。然后按阴性氯醌试验测定，用200mL(约10体积)NMP洗涤所述树脂5-7次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶。
同时活化所述序列中的后续氨基酸Fmoc-Ser(tBu)，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)在室温下溶解于150mL(约7.5体积)NMP中。把该溶液冷却至0-5℃，然后加入HBTU(1.5eq)，搅拌1-15分钟溶解。将活化的酸溶液加入到排干的树脂中，用50mL DCM洗涤(约2.5体积)。氮气鼓泡搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测偶合完成情况。在判定所述偶合反应完成后，则排干树脂，用3×200mL(1体积)NMP洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸His(trt)、Ile、Leu、Ser(tBu)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用4×200mL(10体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×200mL(10体积)DCM洗涤。用氮气吹扫干燥所述树脂，获得42g树脂结合肽。
用300mL 1％TFA的DCM处理约2分钟，然后用200mL 0.5％TFA的DCM处理，从21g树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1∶1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约50mL体积，然后用110mL乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约250mL。加入200mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。风干所述产物，获得20.0g(70％)Fmoc-AA(1-8)-OH,95％HPLC纯。
柱：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分钟内梯度为80％B
        -99％B
保留时间：约23分钟
7.2制备片段Fmoc-AA(9-15)-OH(片段5b)结构：Fmoc-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-OH(SEQ ID NO:6)
               C117H129N10O18
                      MW 1963.39材料：                               MW       eq    mmole    g     mLFmoc-Gln(trt)-2-氯代三苯甲基树脂     --       1.0   12.0    20.0   --Fmoc-氨基酸*                        --       1.5   18.0    --     --1-羟基苯并三唑(HOBT)水合物*         153.15    1.5   18.0    2.8    --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸盐(HBTU)*        379.25    1.5   18.0    6.8    --二异丙基乙胺(DIEA)*                 129.25    1.5   18.0    2.3    3.1N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*              --       --     --     --     150二氯甲烷(DCM)*                       --       --     --     --     5020％哌啶/NMP*                        --       --     --     --     2×200用于冲洗的NMP*                       --       --     --     --     200(每次洗涤)用于裂解的DCM                        --       --     --     --     160乙酸(HOAc)                           --       --     --     --     20三氟乙醇                             --       --     --     --     20庚烷                                 --       --     --     --     250+250+100甲基正丁基醚                         --       --     --     --     100异丙醇                               --       --     --     --     60水                                   --       --     --     --     60+50*每个偶合循环理论产量：23.6g                             预期收率：89-95％
                                        实际产量：21.1g方法：
用20.0g Fmoc-Gln(trt)-2-氯代三苯甲基树脂和Fmoc-保护氨基酸Asn(trt)、Gln(trt)、Ser(tBu)、Glu(tBu)、Glu(tBu)和Ile重复以上7.1部分中给出的实施例中所用的方法。
在最后一个偶合反应后，用4×200mL(10体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×200mL(10体积)DCM洗涤。
用200mL 8∶1∶1 DCM∶TFE∶HOAc处理2小时，然后用2×100mL DCM洗液洗涤，从树脂裂解肽。合并洗脱液，真空下浓缩至约100mL体积，用250mL庚烷重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约250mL。从形成的双相混合物分离庚烷层。加入250mL庚烷和100mL MTBE沉淀产物，然后在室温下研制过夜，获得需要稠度的物质。真空过滤收集该固体，并用约100mL庚烷洗涤。再次加工所述产物，去除残余乙酸。将经过滤的固体在50℃下溶解于60mL异丙醇中。该溶液在冰浴中冷却至0-5℃，然后快速滴加60mL水。在冰浴中搅拌研制淤浆产物约1小时。真空过滤分离所述固体，并用约50mL水洗涤。风干所述产物，获得21.1g(90％)Fmoc-AA(9-15)-OH,95％HPLC纯。
柱：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分钟内梯度为80％B
        -99％B
保留时间：约23分钟
7.3制备片段Fmoc-AA(1-16)-OH(片段3d)结构：Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQID NO:4)
                     C199H245N22O32
                     MW3457.30材料：                              MW        eq      mmole    g      mLFmoc-Gln-2-氯代三苯甲基树脂         --        1.0     24.1    32.5    --Fmoc-氨基酸*                       --        1.5     36.2     --      --1-羟基苯并三唑(HOBT)水合物*        153.15     1.5     36.2    5.5     --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸盐(HBTU)*       379.25     1.5     36.2    13.7    --二异丙基乙胺(DIEA)*                129.25     1.5     36.2    4.7     6.3N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*             --        --       --      --     200二氯甲烷(DCM)*                      --        --       --      --     7520％哌啶/NMP*                       --        --       --      --     2×250用于冲洗的NMP*                      --        --       --      --     250(每次洗涤)1％三氟乙酸/DCM                     --        --       --      --     4×50吡啶                               79.10      --       --      --     4×0.5庚烷                                --        --       --      --     150+50甲醇                                --        --       --      --     50水                                  --        --       --      --     50+25*每个偶合循环理论产量：48.9g                       预期收率：89-95％方法：
用32.5g Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基树脂和所需要的Fmoc-保护氨基酸重复以上7.1部分中给出的实施例中所用的方法。按以上6.1部分给出的实施例中所述进行所述反应，只是如以上材料部分所示使用略微不同的溶剂体积。
在最后一个偶合反应后，用4×250mL(8体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×250mL(8体积)DCM洗涤。氮气吹扫干燥所述树脂，获得97.4g结合肽。
在17.7-g规模，用2×190mL 1％TFA的DCM处理1-2分钟，然后用1×120mL DCM处理，从树脂裂解树脂结合肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1∶1)上。合并裂解所述部分和洗涤液，真空下浓缩至约50mL体积，然后用200mL甲醇复制。继续浓缩以去除残余DCM至终体积约50mL。加入250mL水沉淀产物，并在室温下搅拌约30分钟。真空过滤收集该固体，并用约50mL水洗涤。风干所述产物，获得12.8g(84％)。再加工所述产物以去除吡啶盐。将过滤后的固体在室温下溶解于150mL甲醇中。于室温下加入200mL水沉淀所述产物。真空过滤分离所述产物，并用约50mL水洗涤。风干该物质，获得12.8g(84％)Fmoc-AA(1-16)-OH。
柱：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分钟内梯度为75％B
         -99％B
保留时间：约25分钟
7.4制备片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQ IDNO:4)
                         C186H237N22O31
                          MW3274.76材料：                            MW      eq     mmole      g      mLFmoc-Gln-2-氯代三苯甲基树脂       --      1.0    24.1      32.5    --Fmoc-氨基酸*                     --      1.5    36.2       --     --1羟基苯并三唑(HOBT)水合物*       153.15   1.5    36.2      5.5     --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸盐(HBTU)*     379.25   1.5    36.2      13.7    --二异丙基乙胺(DIEA)*              129.25   1.5    36.2      4.7     6.3N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*           --       --     --        --     200二氯甲烷(DCM)*                    --       --     --        --     7520％哌啶/NMP*                     --       --     --        --     2×250用于冲洗的NMP*                    --       --     --        --     250(每次洗涤)1％三氟乙酸/DCM                   --       --     --        --     4×50吡啶                             79.10     --     --        --     4×0.5庚烷                              --       --     --        --     150+50甲醇                              --       --     --        --     50水                                --       --     --        --     50+25*每个偶合循环理论产量：48.9g                          预期收率：85-90％方法：
用32.5g Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基树脂和所需要的Fmoc-保护氨基酸和以上材料部分所示的溶剂体积，重复以上7.1部分中给出的
实施例中所用的方法。
在最后一个偶合反应后，用4×250mL(8体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×250mL(8体积)DCM洗涤。氮气吹扫干燥所述树脂，获得97.4g结合肽。
在10-g规模，用乙酸酐和吡啶(各5eq)的100mL 3∶1 NMP∶DCM乙酰化所述树脂结合肽30分钟，然后用2×25mL DCM洗涤。用3×50mL 1％TFA的DCM，然后用2×50 DCM洗液从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1∶1)上。合并裂解分离部分和洗涤液，真空下浓缩至约100mL体积，然后用分批加入的3×50mL庚烷重构，同时继续该浓缩以去除残余DCM至终体积约150mL。最初沉淀的产物具有一定的粘稠度，但可在0-5℃的冰浴中搅拌研制约30分钟成为可过滤的固体。真空过滤收集固体，并用约50mL庚烷洗涤。再加工该产物以去除吡啶盐。将过滤后的固体在室温下溶解于50mL甲醇中。在冰浴中将所述溶液冷却至0-5℃，然后快速滴加50mL水。在冰浴中搅拌研制作为粘性固体的最初沉淀的物质约1小时至可过滤稠度。真空过滤分离产物，并用约25mL水洗涤。风干该产物，获得7.0g(90％)Ac-AA(1-16)-OH。随后如上所述再加工该产物获得6.2g(89％收率)96％HPLC纯的物质。
柱：ZorbaX LP C8,100_,20μ
流速：1mL/min
检测：UV,220nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:含有0.05％TFA的1∶1ACN∶IPA，在20分钟内
梯度为80％B-99％B
保留时间：约15分钟
7.5制备片段Fmoc-AA(17-26)-OH(片段10b)结构：Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH(SEQ ID NO:11)
                            C127H167N13O25
                             MW2275.82材料：                            MW      eq      mmole    g       mLFmoc-Leu-2-氯代三苯甲基树脂       --       1.0     19.5    25.0    --Fmoc-氨基酸*                     --       1.5     30.0     --     --1-羟基苯并三唑(HOBT)水合物*      153.15    1.5     30.0    4.6     --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸盐(HBTU)*     379.25    1.5     30.0    11.4    --二异丙基乙胺(DIEA)*              129.25    1.5     30.0    3.9     5.2N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*           --        --      --      --     200二氯甲烷(DCM)*                    --        --      --      --     7520％哌啶/NMP*                     --        --      --      --     2×250用于冲洗的NMP*                    --        --      --      --     250(每次洗涤)1％三氟乙酸/DCM                   --        --      --      --     3×400吡啶                             79.10      --      150     --     3×4乙醇，变性                        --        --      --      --     300水                                --        --      --      --     300*每个偶合循环理论产量：44.4g                  预期收率：90-105％
                               实际产量：46.9(105％)方法：
  用25.0g Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基树脂、所需要的Fmoc-保护氨基酸和以上材料部分所示的溶剂体积，重复以上7.1部分中给出的实施例中所用的方法。
 在最后一个偶合反应后，用4×250mL(10体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×250mL(10体积)DCM洗涤。
  用3×400mL(约15体积)的1％TFA的DCM，然后用1×200mL(7.5体积)DCM从树脂裂解肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1∶1)上，然后分析裂解液和洗涤液的产物含量。合并含产物所述部分，真空浓缩至约100mL体积，然后用300mL乙醇重构。继续该浓缩以去除残余DCM至终体积约250mL。向该搅拌溶液加入300mL水沉淀产物。真空过滤收集固体，并用约50mL水洗涤。风干该产物，获得46.4g(105％)97％HPLC纯的Fmoc-AA(17-26)-OH。
柱：Phenomenox Jupiter C18
流速：1mL/min
检测：UV,260nm
流动相：A:0.1％TFA水溶液
        B:0.1％TFA的乙腈，在20分钟内梯度为75％B-99％B
保留时间：约25分钟
7.6制备片段Fmoc-AA(27-35)-OH(片段16b)结构：Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH(SEQ ID NO:17)
                               C121H148N14O24
                                MW 2182.61材料：                            MW      eq      mmole    g      mLFmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基树脂                                --      1.0     22.4     33.0   --Fmoc-氨基酸*                     --      1.5     33.6     --     --1-羟基苯并三唑(HOBT)水合物*       153.15  1.5     33.6     5.1    --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸盐(HBTU)*      379.25  1.5     33.6     12.7   --二异丙基乙胺(DIEA)*               129.25  1.5     33.6     4.3    5.8N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*            --      --      --      --     225二氯甲烷(DCM)*                     --      --      --      --     7520％哌啶/NMP*                      --      --      --      --     2×250用于冲洗的NMP*                     --      --      --      --     250(每次洗涤)三氟乙醇                           --      --      --      --     30用于裂解的DCM                      --      --      --      --     240乙醇，变性                         --      --      --      --     300,100水                                 --      --      --      --     300,1501％三氟乙酸(TFA)的DCM              --      --      --      --     2×250吡啶                               79.10   --      --      --     2×2.5*每个偶合循环理论产量：48.9g                   预期收率：85-90％方法：
用33.0g Fmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基树脂、所需要的Fmoc-保护氨基酸和以上材料部分所示材料，重复以上7.1部分中给出的实施例中所用的方法。
在最后一个偶合反应后，用4×250mL(7.5体积)NMP洗涤所述树脂，然后用4×250mL(7.5体积)DCM洗涤。
用300mL(约10体积)8∶1∶1 DCM∶TFE∶HOAc溶液处理2小时从树脂裂解肽。排干树脂，并用2×250mL DCM洗涤。合并裂解溶液和洗涤液，并浓缩至约50mL体积，然后用250mL乙醇重构。在冰浴中搅拌冷却溶液至0-5℃。向该搅拌溶液加入125mL水沉淀产物。真空过滤收集固体，并用约50mL水洗涤。风干该产物，获得32.0g(65.4％)95％HPLC纯的Fmoc-AA(27-35)-OH。
用2×250mL 1％TFA的DCM溶液处理所述树脂，然后用100MLDCM洗涤树脂。将裂解部分以与TFA体积比1∶1收集到吡啶上。浓缩合并的洗脱液和水至约50mL体积。向该溶液中加入100mL乙醇后再加入150mL水。真空过滤产物淤浆获得第二收获产物10.7g(21.9％)(95％HPLC纯)，获得的合并总收获率为87.3％。因为其更有效而体积较小，所以优选1％TFA/DCM裂解。柱：Phenomenox Jupiter C5,300_,5μ流速：0.75mL/min检测：UV,260nm流动相：A:0.05％TFA水溶液
      B:0.1％TFA的1∶1 IPA∶MeOH，在10分钟内梯度为
        70％B-97％B
保留时间：约25分钟
8．实施例：液相合成肽片段
在下文的8.1-8.11部分中提供液相合成表1、2和/或3所列的肽中间体的实例。
8.1通过偶合谷胺酰胺的对硝基苄酯(OPNB)与
Fmoc-AA9-15OH制备片段Fmoc-AA9-16OPNB结构：Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:7)
                         C129H141N13O22
MW2227.65材料：                        MW        eq      mmole    g     mLFmocAA9-15OH                 1963.39    1        9.7    19     --HBrGlnOPNB(BaChem.#509709)   362.19     1.1      10.6   3.85   --HOAT                         136        1.1      10.6   1.45   --HBTU                         379.25     1.1      10.6   4.04   --EtPr2N(d=0.755)             129.25     2.1      20.3   2.62   3.48NMP                           --         --        --     --   2000.5N HCl                      --         --        --     --   250乙酸乙酯                      --         --        --     --   250己烷                          --         --        --     --   250理论产量：21.5g             预期收率：90-105％方法：
将FmocAA9-15OH(在以上7.2部分中合成)、HBrGlnOPNB、HOAT和EtPr2N合并在一个含有磁性搅拌棒的1L圆底烧瓶中，并加入NMP(200mL)。将生成的溶液置于氮气氛下，并搅拌冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入HBTU。在0-5℃下搅拌该溶液15分钟，去除冰浴，继续搅拌2.5小时(注释1)。
将反应化合物冷却至0-5℃，并加入0.5N盐酸水溶液(250mL)，沉淀所保护的肽。真空过滤收集固体，并在过滤瓶中干燥获得24g粗品FmocAA9-16OPNB。将该固体溶解于乙酸乙酯(250mL)中，经硫酸镁(10g)干燥，过滤并浓缩至100mL体积。将该溶液冷却至0-5℃，加入己烷(250mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，并干燥获得21.5g FmocAA9-16OPNB，收率100％,91-94％HPLC纯(注释2)。注释：1．用薄层层析(TLC)进行生产过程控制
90/10氯仿/乙醇
UV，碘检测
Rt FmocAA9-15OH    0.46
Rt FmocAA9-16OPNB  0.572．Phenomenox JupiterC5,5μ,300A
0.75mL/min,260nm
A：水/0.05％TFA
B：50％IPA/MeOH/0.05％TFA，
在10分钟内70-97％B,97％B8分钟。
保留时间：13.3分钟
8.2制备盐酸HAA9-16OPNB片段结构：HCl H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:7)
                   C144H132ClN13O20
                  MW 2041.02材料：              MW        eq    mmole    g     mLFmocAA9-16OPNB     2227.65     1    9.43     21    --哌啶                  --       --    --      --    10THF                   --       --    --      --    190甲基叔丁基醚(MTBE)    --       --    --      --    250己烷                  --       --    --      --    350甲醇                  --       --    --      --    1500.5NHCl               --       --    --      --    1002-丙醇                --       --    --      --    50理论产量：19.2g        预期收率：85-105％方法：
在一个含有磁性搅拌棒的1L圆底烧瓶中加入FmocAA9-16OPNB(在以上8.1部分中合成)和20∶1四氢呋喃/哌啶。将生成的溶液在氮气氛下于室温搅拌60分钟(注释1)。加入己烷(350mL)沉淀所述肽。从粘性固体倾析所述溶剂。用MTBE(200mL)在室温下研制固体18小时。真空过滤收集固体，干燥获得18.9g HAA9-16OPNB(注释2)。
将所述固体溶解于甲醇(150mL)中，搅拌冷却至0-5℃。加入0.5N盐酸水溶液(100mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(50mL)然后用2-丙醇(50mL)洗涤，干燥获得17.7g盐酸HAA9-16OPBN，收率92％,92A％HPLC纯(注释3)。注释：1．用HPLC进行生产过程控制Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内70-97％B,97％B8分钟保留时间：FmocAA9-16OPNB,13.3分钟；HAA9-16OPNB,10.7分钟2．此时分离的HAA9-16OPNB含有痕量哌啶和苄基富烯哌啶加合物。在与RAA1-8OH偶合前均去除。3．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.75mL/min,260nm
A 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％TFA
在10分钟内80-100％B,100％B5分钟
保留时间：HAA9-16OPNB,7.2分钟
TLC条件：
90/10二氯甲烷/乙醇
UV，碘检测
Rf:HAA9-16OPNB,0.64
8.3通过液相偶合片段AcAA1-8OH和HAA9-16OPNB
制备片段AcAA1-160PNB结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:4)
                     C194H246N23O34
                     MW3427.43材料：                   MW        eq      mmole    g      mLAcAA1-8OH               1440.86    1.3     0.13    0.186   --盐酸HAA9-16OPNB         2041.02    1       0.10    0.204   --HBTU                    379.25     1.1     0.11    0.042   --HOAT                    136.1      1.1     0.11    0.015   --EtPr2N                129.25     2.1     0.21    0.027   0.036DMF                       --        --      --       --    4.5DMSO                      --        --      --       --    0.5水                        --        --      --       --    7MTBE                      --        --      --       --    3.5理论产量：0.38g             预期收率：85-105％方法：
在25mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入AA1-80H(在以上7.1部分中合成)、盐酸HAA9-16OPNB(在以上8.2部分中合成)和HOAT。将所述固体溶解于含有EtPr2N的9∶1 DMF∶DMSO(5mL)，然后在氮气氛下冷却至0-5℃(注释1)。向冷却的溶液中加入HBTU。在0-5℃搅拌反应混合物15分钟，然后温热至室温，再搅拌60分钟(注释2)。加入水(7mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(10mL)洗涤，并干燥获得0.36g粗品AcAA1-16OPNB。在室温下用MTBE(3.5mL)研制所述固体1.5小时，真空过滤收集，并干燥获得0.335g AcAA1-16OPNB，收率88％,82％HPLC纯(注释3)。注释：1．重要的是在冷却至0-5℃和加入HBTU之前所有固体在溶液中。2．生产过程控制，TLC,HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B 5分钟。保留时间：HAA9-16OPNB,7.2分钟(Ac1-8OH在260nm的吸光
度为0)。
保留时间：AcAA1-16OPNB,12.45分钟
TLC条件：
90/10氯仿/乙醇
UV,碘检测
Rf:HAA9-16OPNB,0.64
Rf:Ac1-8OH,0.35
Rf:Ac1-16OH,0.483．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.75mL/min,260nm
A 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％TFA
在10分钟内70-97％B,97％B 8分钟
保留时间：Ac1-16OPNB,16.4。
8.4通过液相偶合片段FmocAA1-8OH和盐酸HAA9-16OPNB
制备片段FmocAA1-16OPNB结构：Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:4)
                      C207H253N23O34
                      MW3607.49材料：                     MW        eq    mmole    g      mLFmocAA1-8OH               1620.92    1     7.84     12.7   --盐酸HAA9-16OPNB           2041.02    1     7.84     16.0   --HBTU                      379.25     1.2   9.42     3.57   --HOAT                      136.1      1.2   9.42     1.28   --EtPr2N(d=0.755)         129.25     2.5   19.6     2.55   3.36DMF                        --         --     --       --   25010％氯化钠/水(重量/体积)     --         --     --       --   450甲醇                       --         --     --       --   200水                         --         --     --       --   100理论产量：28.3g           预期收率：85-100％方法：
在1L含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA1-8OH(在以上7.1部分中合成)、盐酸HAA9-16OPNB(在以上8.2部分中合成)、HOAT和DMF(250mL)。向所述溶液中加入EtPr2N。将该溶液冷却至0～5℃并加入HBTU。在0-5℃搅拌反应混合物15分钟，然后温热至室温，再搅拌70分钟(注释1)。将反应混合物冷却至0-5℃，并加入10％氯化钠/水(200mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(50mL)洗涤，并干燥获得27g粗品FmocAA1-16OPNB。将该固体溶解于甲醇(200mL)中，并加入氯化钠水溶液(10％重量/体积，300mL)的搅拌溶液中。真空过滤收集固体，用水(50mL)洗涤，干燥获得26gFmocAA1-16OPNB，收率92％,90A％HPLC纯(注释1)。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B 5分钟。保留时间：HAA9-16OPNB,7.2分钟，FmocAA1-8OH,7.9分钟。保留时间：FmocAAl-16OPNB,14.5分钟
8.5制备片段H-AA1-16OPNB结构：H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ IDNO:4)
              C192H243N23O32
              MW3384.41材料：            MW         eq     mmole    g     mLFmocAAl-16OPNB    3607.49    1      0.28    1.0    --哌啶              --         --      --     --    0.6二氯甲烷          --         --      --     --    11.4己烷              --         --      --     --    45理论产量：0.94g       预期收率：90-105％方法：
在50mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA1-16OPNB(在以上8.4部分中合成)、二氯甲烷(11.4mL)和哌啶(0.6mL)。将该溶液在室温氮气氛下搅拌90分钟(注释1)。将己烷(45ml)加入反应混合物中，并经真空蒸馏将所述溶剂体积减少至25mL。真空过滤收集生成的固体，干燥获得0.96g HAA1-16OPNB，收率102％。HLPC分析所述固体表明72A％HAA1-16OPNB和18A％富烯和哌啶-富烯加合物。注释：1．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.8mL/min,260nm
A 水/0-05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％TFA
在10分钟内80-100％B,100％B 5分钟。
保留时间FmocAA1-16OPNB,14.1分钟
保留时间HAA1-16OPNB,11.6分钟
保留时间富烯和哌啶-富烯加合物，5.5和4.8分钟。
8.6通过乙酰化HAA1-16OPNB的N-末端
制备片段Ac-AA1-16OPNB结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ IDNO:4)
              C194H246N23O34
              MW3427.43材料：            MW         eq      mmole    g      mLHAA1-16OPNB      3384.41     1       0.28    0.95    --乙酸酐(d=1.08)   102.09      3       0.84    0.086   0.080吡啶(d=0.978)    79.1        3       0.84    0.67    0.068DMF               --         --       --       --    10水                --         --       --       --    30MTBE              --         --       --       --    10己烷              --         --       --       --    10理论产量：0.96g           预期收率：80-100％方法：
在50mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入HAA1-16OPNB(在以上8.5部分中合成)、DMF(10mL)、乙酸酐和吡啶。将该反应混合物在室温氮气氛下搅拌60分钟(注释1)。加入水(20mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(10mL)洗涤，干燥获得0.87g AcAA1-16OPNB。为了去除残余富烯和哌啶富烯加合物，在室温下用1∶1MTBE/己烷(20mL)研制所述固体4.5小时。真空过滤收集固体，干燥获得0.82g AcAA1-16OPNB，收率85％，高于90A％HPLC纯(注释1)。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B 15分钟。保留时间HAA1-16OPNB,11.6分钟
保留时间AcAA1-16OPNB,12.1分钟
TLC,10％乙醇的二氯甲烷
UV，碘检测
RfAcAA1-16OPNB,0.69
8.7在存在His(trt)下从AcAA1-16OPNB选择性去除
对硝基苄基保护基团制备片段AcAA1-16OH结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQID NO:4)
                       C187H241N22O32
                       MW 3276.4材料：                      MW         eq      mmole    g       mLAcAA1-16OPNB                3424.86    1       0.23     0.80    --10％Pd/C,Degussa,50％水      --        --       --      0.30    --甲酸铵                      63.06      15      3.5      0.22    --DMF                          --        --       --       --     15水                           --        --       --       --     120乙酸乙酯                     --        --       --       --     100己烷                         --        --       --       --     44甲醇                         --        --       --       --     10饱和氯化钠水溶液               --        --       --       --     5MTBE                         --        --       --       --     4理论产量：0.76g            预期收率：70-85％方法：
在25mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入AcAA1-16OPNB(在以上8.6部分中合成)和DMF(10mL)。向该溶液中加入甲酸铵水溶液(0.5mL)，然后加入湿的披钯炭(Degussa,10％,50％水)。将该淤浆在室温氮气氛下搅拌120分钟(注释1)。使该淤浆通过一个紧密装填的C盐床过滤到90mL水中。用DMF(5mL)洗涤滤饼。用乙酸乙酯(100mL)洗涤水悬浮液。然后浓缩乙酸乙酯至20mL体积(注释2)。加入己烷(40ml)完成所述沉淀，从固体倾析所述溶剂。将所述固体溶解于甲醇(10mL)中，加入4∶1水/饱和氯化钠水溶液(25mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(10mL)洗涤，干燥获得0.62gAcAA1-16OH。用50％MTBE/己烷(8mL)在室温下将所述固体研制15小时，收集固体，干燥获得0.59g AcAA1-16OH，收率77％，90A％HLP纯(注释3)。注释：1．生产过程控制，HPLC
80/20二氯甲烷/乙醇
UV,碘检测
Rf:AcAA1-16OPNB,0.90
Rf:Ac1-16OH,692．随着所述溶剂体积的减少可以开始沉淀AcAA1-16OH。3．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.8mL/min,260nm
A 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％TFA
在10分钟内80-100％B,100％B 5分钟。
保留时间：AcAA1-16OH,10.73分钟
8.8通过液相偶合FmocAA27-35OH与HPheNH2
制备片段FmocAA27-36NH2结构：Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:18)                C130H159N16O24MW 2329.64材料：             MW        eq     mmole    g    mLFmocAA27-35OH     2182.61    1      18.4    40.2  --HPheNH2         162.21     1.2    22.1    3.6HBTU              379.25     1.2    22.1    8.4HOAT              136.1      1.2    22.1    3.0EtPr2N(d=0.755)   129.25     2.1    38.7    5.0   6.6DMF                                               500理论产量：42.8g    预期收率：90-105％方法：
在2L含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA27-35OH(在以上7.6部分中合成)、HOAT、HpheNH2和DMF(500mL)。加入EtPr2N，将该溶液冷却至0-5℃，然后加入HBTU。将反应混合物在0-5℃搅拌15分钟，然后温热至室温，再搅拌70分钟(注释1)。将该溶液冷却至0-5℃，加入水(500mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(100mL)洗涤，干燥获得43g FmocAA27-36NH2，收率100％，93A％HLPC纯(注释2)。注释：1．生产过程控制，TLC88/12二氯甲烷/甲醇UV，碘检测Rf:FmocAA27-35OH,0.49Rf:FmocAA27-36NH2,0.632．Phenomenex Jupiter,C18,5μ,300A
1.0mL/min,260nm
A 水/0.1％TFA
B ACN  在20分钟内75-99％B,99％B 5分钟。保留时间：29.4分钟
8.9制备片段H-AA(27-36)-NH2结构：H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2(SEQ ID NO:17)C115H148N16O22MW 2106.56材料：                    MW      eq    mmole     g       mLFmocAA(27-36)-NH2      2328.8   1.0    9.3      21.7    --哌啶                     85.15    5.0    46.6     4.0    4.6二氯甲烷(DCM)             --      --     --       --     100水                        --      --     --       --     2×100甲基叔丁基醚(MTBE)        --      --     --       --     100+30理论产量：19.6g          预期收率：85-95％方法：
在250mL配有磁性搅拌器和氮气层的圆底烧瓶中加入在以上8.8部分中合成的Fmoc-片段、二氯甲烷(约5体积)和哌啶。将所获得的溶液在室温下搅拌1.5小时(注释1)。
用2×100mL水洗涤所述溶液。分离各层，真空浓缩有机层至约原体积的一半。分批加入2×50mLMTBE，同时继续浓缩以去除DCM至出现大量沉淀和终罐体积约150mL时为止。
在0～5℃冰浴中搅拌并冷却所述产物淤浆约1小时。真空过滤分离固体，用2×15mL MTBE洗涤。风干所述产物，获得17.6g(89.6％)H-AA(17-36)NH2,95％HPLC纯(注释2)。注释：1．HPLC监测反应完成情况：柱：Phenomenox Jupiter C18；300_；5μ流速：1mL/min检测：UV,260nm流动相：A:0.1％TFA水溶液
      B:0.1％TFA的乙腈
     在20分钟内的梯度为75％B-99％B保留时间：约18分钟2．在处理中都有效去除了Fmoc副产物和二苯并富烯及其哌啶加合物；但是，所述物质在投入使用前应进行使用试验。如果所述物质不能通过使用试验，则通过溶解所述固体于DCM(5体积)中重复所述处理步骤，然后继续上述的方法。
8.10通过液相偶合FmocAA17-26OH与HAA27-36NH2
制备片段FmocAA17-36NH2结构：Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:12)                    C242H313N29O46MW 4364.38材料：             MW       eq      mmole      g      mLFmocAA17-26OH     2275.82    1      9.5      21.6HAA27-36NH2     2106.56    1      9.5      20HOAT              136.1      1.2    11.4     1.55HBTU              379.25     1.2    11.4     4.33EtPr2N(d=0.755)   129.25     2      19.0     2.46     3.25DMF                                                   400水                                                    6002-丙醇                                                1100理论产量：41.5g    预期收率：80-85％方法：
在2L含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA17-26OH(在以上7.5部分中合成)、HAA27-36NH2(在以上8.9部分中合成)、HOAT和DMF(400mL)。加入EtPr2N，将该搅拌溶液在氮气氛下冷却至0-5℃，加入HBTU。将反应混合物在0-5℃搅拌15分钟，然后温热至室温，再搅拌2.5小时(注释1)。向该反应混合物中加入水(500mL)沉淀所述肽(注释2)。搅拌所生成的淤浆45分钟，真空过滤收集固体，用水(100mL)洗涤并干燥。将所述固体返回含有磁性搅拌棒的2L圆底烧瓶中，加入60℃2-丙醇(1.1L)。在所述淤浆冷却至室温的同时在氮气氛下搅拌(过夜)。真空过滤收集固体，干燥获得37.5gFmocAA17-36NH2，收率90％,95.5A％HLPC纯(注释1)。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％ TFA
在10分钟内80-100％B,100％B 25分钟。
保留时间：FmocAA17-26OH,8.2分钟，HAA26-36NH2,8.4分钟
保留时间：FmocAA17-36NH2,13.3分钟2．当加入水时将所述反应混合物温热至38℃。8.11制备片段H-AA(17-36)-NH2结构：H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2(SEQ ID NO:19)
                  C227H303N29O44HCl材料：                 MW       eq     mmole     g     mLFmocAA(17-36)-NH2   4364.36    1.0    5.2      22.5   --5N NaOH(ag)             --       --     --       --    55四氢呋喃(TFH)           --       --     --       --    1701N HCl                  --       --     --       --    13饱和氯化钠(水溶液)      --       --     --       --    2×55庚烷                    --       --     --       --    3×25+50,200+50理论产量：21.6g         预期收率：95-100％方法：
向配有空气搅拌器和氮气层的250mL圆底烧瓶中加入在以上8.10部分中合成的Fmoc-片段、THF(约7.5体积)和5 N NaOH(约2.5体积)。将所获得的两相溶液在室温下搅拌10-15分钟(注释1)。
分离各层，用1N HCl将有机相调节至pH2-3。然后用2×55mL(2.5体积)饱和盐水溶液洗涤所述溶液(注释2)。分离各层，在15-20℃真空下浓缩有机层至约1/2原体积。分批加入3×25mL庚烷，同时继续浓缩以去除THF至出现大量沉淀和终罐体积约100mL时为止(注释2)。
在室温下搅拌所述产物淤浆约2小时。真空过滤分离固体，用约50mL庚烷洗涤。风干所述产物，获得21.0g(97.5％)H-AA(17-36)NH2。
可进行再加工去除残余的二苯并富烯副产物。在200mL庚烷中于室温下淤浆所述产物3小时。过滤所述物质，用约50mL庚烷洗涤，风干获得产物20.8g(96.6％)，超过95％HPLC纯。注释：1．HPLC监测反应完成情况：柱：ZorbaxLPC8；1OOA；2011流速：1mL/min检测：UV,260nm流动相：A:0.1％TFA水溶液
      B:0.1％TFA的1∶1 ACN∶IPA
在20分钟内的梯度为80％B-99％B保留时间：约18分钟2．所述固体最初沉淀为仍可搅拌的蜡状胶，进一步浓缩研制为可过滤固体。
9．实施例：合成全长T-20肽
在下文9.1-9.5部分给出的是利用所述肽中间体片段生产全长T-20肽的实施例。
在本部分给出的实施例证实成功联用固相和液相合成技术由肽中间体片段生产全长T-20肽。
9.1通过液相偶合AcAA1-16OH与HAA17-36NH2
制备片段AcAA1-36NH2
在此描述的合成路线代表最好的图1和3图解的T-20四片段法。在其中AcAA1-16OH通过固相技术合成的情况下，采用图1的方法，在其中AcAA1-16OH通过液相技术合成的情况下，采用图3的方法。注意在此合成的T-20全长肽具有在其氨基末端具有乙酰化修饰(即“X”)而在其羧基末端具有酰胺修饰(即“Z”)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)
              C414H543N51O74
                             MW7411.95材料：                  MW       eq      mmole    g      mLAcAA1-1OH             3276.4    10.24    0.79盐酸HAA17-36NH2      4178.56   10.24    1.0HOAT                  136.1     1.1      0.26    0.036HBTU                  379.25    1.0      0.95    0.25EtPr2N(d=0.755)      129.25    2.8      0.67    0.087   0.115DMF                                                      20水                                                       25饱和氯化钠                                               5MTBE                                                     10己烷                                                     10理论产量：1.77g         预期收率：85-100％方法：
在100mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入AcAA1-16OH(在以上7.4部分通过固相技术或在以上8.7部分通过液相技术合成)、HOAT、DMF(20mL)，然后加入EtPr2N(0.074mL)。在氮气氛下将溶液冷却至0-5℃，加入HBTU。在0-5℃搅拌溶液15分钟，加入盐酸HAA17-36NH2(在上文8.11部分中合成)，再加入0.041mlEtPr2N。去除冷却浴，搅拌反应混合物2小时(注释1)。加入水(25mL)和饱和氯化钠水溶液(5mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(10mL)洗涤，干燥获得1.74g粗品AcAA1-36NH2(注释2)。在室温下用MTBE/己烷研制所述固体2.5小时，真空过滤收集固体，干燥获得1.70g产物，收率96％,92A％HPLC纯。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B 15分钟。保留时间：AcAA1-16OH,11.8分钟。保留时间：HCl HAA17-36NH2,12.7分钟。保留时间：AcAA1-36NH2,22.9分钟。2．水流出物产生非常精细的沉淀。可能需要两次过滤。
9.2通过液相偶合FmocAA1-16OH与HAA17-36NH2
制备片段FmocAA1-36NH2(T-20)
在本部分给出的实施例证实成功联用固相和液相合成技术由肽中间体片段生产T-20肽。在此描述的合成路线特别代表图4描述的至该图中合成FmocAA1-36NH2时的T-20三片段法，。结构：Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)                     C427H551N51O75MW7593.01材料：             MW       eq      mmole     g       mLFmocAA1-16OH      3453.89   1       0.12      0.41盐酸HAA17-36NH2  4174.88   1       0.12      0.50HOAT              136.1     1.25    0.15      0.020HBTU              379.25    1.25    0.15      0.057EtPr2N(d=0.755)  129.25    2.5     0.30      0.039   0.051DMF                                                   10水                                                    182-丙醇                                                14理论产量：0.91g    预期收率：85-100％万法：
在25mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA1-16OH(在以上7.3部分中合成)、HCl HAA17-36NH2(在以上8.11部分中合成)、HOAT、DMF(10mL)，然后加入EtPr2N。在氮气氛下将溶液冷却至0-5℃，加入HBTU。在0-5℃搅拌反应混合物15分钟，然后温热至室温并搅拌1.5小时(注释1)。加入水沉淀肽，真空过滤收集固体并干燥。用2-丙醇(14mL)在室温下研制所述固体15小时，然后加入水(3mL)从所述溶液分离所需要的产物。真空过滤所述固体，干燥获得0.80g FmocAA1-36NH2，收率88％,85A％HPLC纯。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B 15分钟。
保留时间：FmocAA1-16OH,11.4分钟。
保留时间：HCl HAA17-36NH2,12分钟。
保留时间：FmocAA1-36NH2,20.4分钟。
TLC,9/1二氯甲烷/乙醇
UV,碘检测
Rft:FmocAA1-36NH2,0.71
9.3制备片段HAA1-36NH2(T-20)
在本部分给出的实施例证实成功联用固相和液相合成技术由肽中间体片段生产T-20肽。在此描述的合成路线特别代表图4描述的至该图中合成H-AA1-36NH2时的T-20三片段法。结构：H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Ieu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)
              C412H541N51O73
                               MW7370.94材料：             MW       eq    mmole    g      mLFmocAA1-36NH2   7593.01    1      0.105   0.80哌啶                                              0.5DMF                                               9.5水                                                20饱和氯化钠水溶液                                   5MTBE                                              5己烷                                              5理论产量：0.77g          预期收率：85-95％方法：
在25mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入FmocAA 1-36NH2(在以上9.2部分中合成)、DMF(9.5mL)和哌啶(0.5mL)。在室温氮气氛下搅拌该溶液2小时(注释1、2)。加入水(20ml)和饱和氯化钠水溶液(5mL)沉淀所述保护肽。真空过滤收集固体，干燥获得0.77g污染有富烯和哌啶-富烯加合物的HAA1-36NH2。在室温下用50％MTBE/己烷研制所述固体15小时，去除富烯和哌啶-富烯加合物。真空过滤固体，干燥获得0.73g HAA1-36NH2，收率95％,90A％HPLC纯。注释：1．生产过程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分钟内80-100％B,100％B15分钟。保留时间：FmocAA1-36OH,20.4分钟。保留时间：HCl HAA1-36NH2,19.9分钟。保留时间：富烯和哌啶-富烯加合物，5分钟。TLC,9/1二氯甲烷/乙醇UV,碘检测Rt:FmocAA1-36NH2,0.712．所述产物和原料在TLC或反相HPLC上完全分开。通过观测富烯和哌啶-富烯加合物跟踪产物组成。9.4通过N-末端乙酰化HAA1-36NH2制备片段AcAA1-36NH2(T-20)
在本部分给出的实施例证实成功联用固相和液相合成技术由肽中间体片段生产T-20肽。在此描述的合成路线特别代表图4描述的至该图中合成Ac-AA1-36NH2时的T-20三片段法。结构：Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)
            C414H543N51O74
                           MW7411.95材料：             MW      eq     mmole     g        mLHAA1-36NH2   7370.94   1      0.096     0.71乙酸酐(d=1.08)   102.09    3      0.29      0.029    0.027吡啶(d=0.978)    79.1      6      0.58      0.046    0.046DMF                                                  10水                                                   17.5饱和氯化钠水溶液                                     7.5理论产量：0.71g    预期收率：85-100％方法：
在25mL含有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入HAA1-36NH2(在以上9.3部分中合成)、DMF(10mL)、吡啶(0.046mL)和乙酸酐(0.027mL)(注释1)。在室温氮气氛下搅拌该溶液4小时(注释2)。加入水(7.5ml)和饱和氯化钠水溶液(5mL)沉淀所述保护肽。真空过滤收集固体，用水(10mL)洗涤，干燥获得0.65g AcAA1-36NH2，收率91％,90A％HPLC纯(注释3)。注释：1．对于该反应也可以用二氯甲烷作溶剂。2．生产过程控制，HPLC
Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.8mL/min,260nm
A 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％TFA
在10分钟内80-100％B,100％B 15分钟。
保留时间：HAA1-36OH,23.3分钟。
保留时间：AcAA1-36NH2,22.7分钟。3．所述产物和原料在TLC或反相HPLC上不能完全分开。9.5通过侧链去保护AcAA1-36NH2制备T-20肽
在本部分给出的实施例证实成功联用固相和液相合成技术由肽中间体片段生产T-20肽。在此描述的合成路线特别代表图4所示的T-20三片段法。结构：Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)
          C414H543N51O74
          MW4492.1材料：               MW          eq       mmole     g     mLAcAA1-36NH2       7411.95        1       0.035     0.26三氟乙酸                                                  2.25水                                                        15.1二硫苏糖醇                                                0.12MTBE                                                      170乙腈                                                      15理论产量：157mg    预期收率：25-50％方法：
用氮气对90∶5∶5(v/v/wt％)三氟乙酸/水/二硫苏糖醇溶液脱气，并冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入AcAA1-36NH2(在以上9.4部分中合成)。在0-5℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后温热至室温，搅拌2.5小时。将该溶液加入0-5℃MTBE(70mL)中沉淀所述肽。以2200rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析MTBE。将所述固体再悬浮于MTBE(50mL)中，以rpm离心旋转5分钟，倾析MTBE。重复该过程一次，然后将固体溶解于含有1％(体积)乙酸的1∶1水/乙腈(30mL)中，在室温下保存24小时(注释1)。将该溶液冷冻，然后用冷冻干燥器冷冻干燥获得155mg粗品T-20。经制备型HPLC纯化产生55mg全长T-20肽，95A％HPLC纯(注释2)。注释：1．快速去除Trp(Boc)的tBu侧链，留下TrpCOOH。在乙酸水溶液中于室温下TrpCOOH的脱羧需要至少24小时。2．制备型HPLC2”YMC,120A,10μ,C18220nm,50mL/minA 水/0-1％TFAB ACN/0.1％TFA39-49％B/40分钟10．实施例：纯化T-20肽
在此给出的实施例描述可在整体上明显增加肽纯化的条件下纯化T-20和T-20样肽的方法。材料
使用的柱：20×30cm，装填有Amberchrom CG-300S(Tosohaus；Montgomeryville,PA)35μm颗粒。缓冲液的制备
缓冲液A=用氢氧化铵将pH调节至8.5的100mM乙酸铵。
缓冲液B=乙腈。1．用约6柱体积20％B平衡柱。2．将T-20以每克肽50-100mL 85％A/15％B溶解。用2M碳酸钾调节pH至8-10。在T-20样品中乙腈浓度不大于15-20％。3．T-20溶液以500mL/分钟上柱，同时监测柱压力。4．T-20溶液上柱后，将3倍柱体积(10L)85％A/15％B溶液上柱，以洗出层析谱线。5．在303nm监测柱洗出液，在整个上柱期间收集洗出液。在层析期间调整波长或衰减使峰值有一定高度。吸光度是波长和测量杯光程长度的函数。6．如下开始梯度操作(每小时变化1.6％B)，并在整个层析期间监测压力。
时间(分钟)           ％B             流速(mL/min)
0                    15               330
788                  36               3307．当主峰开始洗出时收集10分钟流分(3.3L)。所有T-20应该用35％B
洗脱。平均收集35-40个流分。将流分贮存于0-5℃直到进行合
并流分的测定时为止。8．收集流分直到检测器吸光度小于0.1AU或在主峰洗出后达到主要
拐点时为止。9．用分析型反相HPLC监测每个流分的纯度。结果
T-20肽在pH大于7时溶解性更高。一般用于纯化肽的柱载体是硅基载体，所以只能在低pH范围使用，因为硅基支持物在较高pH范围时趋向于溶解。
在此描述的方法使用在宽pH范围(pH1-14)下稳定的聚苯乙烯基树脂载体。该方法显著增加柱容量，T-20上样量从10g增加到高达250-450g(对于8”直径×30cm柱)。
11．实施例：大规模合成和纯化T-20肽载荷树脂
可以以1.2mmole/g原料树脂或更高水平将FmocTrp(Boc)OH加样到非常活泼的2-CTC树脂上。当载荷水平高于每g原料树脂1.1mmole FmocTrp(Boc)OH(＞0.72mmol/g载荷树脂)时，对于片段的最后三个氨基酸难以获得阴性茚三酮试验。同样，当FmocLeuO-树脂载荷量大于0.85mmole/g时难以构建FmocAA17-26O-树脂，而当FmocGlnOH-树脂载荷量大于0.75mmole/g时难以构建AcAA1-16O-树脂。
当从销售商获得所述树脂时，对每个将装载的氨基酸用约1g2-CTC树脂进行应用试验。应用试验的目的是测定装载时将使用的氨基酸量，以获得所需要的载荷范围。对于每一种使用具有0.5当量过量DIEA的0.8、1.0和1.5当量FmocGlnOH；1.0、1.2和1.5当量FmocTrp(Boc)OH和0.8、1.0和1.5当量FmocLeuOH(相对于树脂的报告活性)。如果1mole FmocLeuOH不能载荷在1Kg2-CTC树脂上，则不应该从所述销售商接受所述2-CTC。以下是描述装载FmocLeuOH、FmocGlnOH和FmocTrp(Boc)OH的目的树脂。
1.0-1.1mole FmocLeuOH可装载到1Kg 2-CTC树脂上。计及盐酸损失量，装载FmocLeuOH后的树脂干重应该1.32倍或1.35倍于原料树脂的重量，测定的载荷量应该为0.75-0.81mmole/g。
0.8-1.0mole FmocGlnOH可装载到1Kg 2-CTC树脂上。计及盐酸损失量，装载FmocGlnOH后的树脂干重应该1.27倍或1.33倍于原料树脂的重量，测定的载荷量应该为0.63-0.75。
0.9-1.1mole FmocTrp(Boc)OH可装载到1Kg 2-CTC树脂上。计及盐酸损失量，载荷Fmoc Trp(Boc)OH后的树脂干重应该1.44-1.54倍于原料树脂的重量，测定的载荷量应该为0.63-0.72。
为了进行准确的重量增加分析，必须测定原料树脂的干燥失重(LOD)。它不应大于1％。如果残余溶剂(或DIEA/HCl)在干燥期间未完全从所述树脂去除(装载后)，则所分离的量将较高，所测定的载荷量较低。然而，载荷的总摩尔数(质量×测定的载荷量)应该在上述范围内。对于任何所提及氨基酸来说，如果高端载荷水平(或者每Kg原料树脂载荷的总摩尔数)超过10％，则用少量氨基酸进行使用试验。这对FmocGlnOH特别重要。
11.1大规模制备Fmoc-AA(Boc)-2-氯代三苯甲基树脂
以下部分的目的是进行大规模装载适合制备大量肽的树脂，以用于固相肽合成(SPPS)。用以下各种装载所述树脂：FmocTrp(Boc)OH、FmocGln(Boc)OH和FmocLeu(Boc)OH。每种原料残基装载到约4Kg 2-CTC树脂上。载荷的AA        2-CTC(Kg)    载荷量(Kg)    取代(mmol/g)1  载荷总摩尔数1FmocTrp(Boc)OH  3.7          4.493          0.56(0.56)    2.52(2.52)FmocLeu(Boc)OH  2.2          2.436          1.07(0.647)   2.6(1.58)FmocGln(Boc)OH  3.65         3.856          0.55(0.52)    2.12(2.0)1．第一个数是从相对于Fmoc-AA标准的基于重量的HPLC分析计算得数。括号内的数值是计及原料2-CTC树脂12％LOD的情况下由增加的重量计算出的数值。
原料2-CTC树脂购自Colorado BioTech，所报告的载荷量为1.4meq/g。以3.7公斤2-CTC为原料，使用的标准装载方法是1.5eqFmocTrp(Boc)OH、1.7eq DIEA的DCM(5体积)、室温下2小时。这产生4.493Kg FmocTrp(Boc)O-树脂，该树脂具有在从所述树脂裂解后通过FmocTrp(Boc)OH的重量基HPLC分析计算为0.56mmol/g(总计2.52摩尔)的载荷量。根据所述树脂的重量增加，对于所制备的1.62摩尔总量，计算的载荷量为0.36mmol/g。然而如果计及原料2-CTC树脂的12％LOD，则根据重量增加计算的载荷量对2.52摩尔总量同样为0.56mmole/g，但远远不足每4公斤树脂4摩尔FmocTrp(Boc)OH的目标载荷量。
采用标准载荷方法在两次操作中由3.9Kg 2-CTC制备总量4.59Kg FmocLeuO-树脂。
然而，所获得的载荷量明显低于预期载荷量。第一批在从所述树脂裂解后根据重量基HPLC分析FmocLeuOH计算的载荷量为1.07mmol/g。这明显是不可能的，因为计及原料2-CTC树脂的12％LOD根据增加重量计算的载荷量为0.647mmole/g(500g)。对于1.577mole总载荷量的实际载荷量可能接近0.647mmole/g。
由1.7Kg 2-CTC制备的第二批FmocLeu-O-树脂(2.154Kg)对于0.66mmole/g增加重量的载荷量具有的计算载荷量为0.68mmole/g。
用3.65Kg 2-CTC为原料，采用0.8eq FmocGlnOH和1eq DIEA的7体积的5/2DMF/DCM单批制备FmocGlnO-树脂总量3.856Kg。根据重量基HPLC分析计算的取代对于2.12摩尔FmocGlnO-树脂总量为0.55mmol/g。计及原料2-CTC树脂的12％LOD，根据重量增加计算的载荷量对于2.0摩尔FmocGlnO-树脂总量为0.52mmol/g。
一般来说，根据重量增加的载荷量应当大于或等于根据对所载荷的AA或去除的富烯的重量基HPLC分析计算的载荷量。所述原料2-CTC应该小于1％LOD，分离的FmocAAO树脂可能含有少量NMP、盐和/或残余FmocAAOH。
11.1.1大规模制备Fmoc-AA(Boc)-2-
氯代三苯甲基树脂的优选方法FmcoTrp(Boc)OH和FmocLeuOH
将空气敏感型2-氯代三苯甲基氯树脂(1eq,3.7Kg,5.18mole)加入SPPS室，用5体积DCM洗涤。排干溶剂，加入FmocTrp(Boc)OH或FmocLeu(Boc)OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的DCM溶液(5体积)(注释1)。搅拌淤浆2小时。排干溶剂，在所述树脂上保留的活性部位用9∶1 MeOH∶DIEA(5体积)进行末端封端30分钟。排干溶剂，用6×5体积DCM洗涤树脂。将树脂干燥至恒重，然后取样并分析载荷量(注释2)。相同的方法用于装载FmocLeuOH。FmocGluOH
将空气敏感型2-CTC(3.65Kg,1.4mmole/g)在氮气氛下加入40LSPPS室，用DCM(5体积)洗涤。将FmocGlnOH(1.506Kg,0.8eq)、DMF(5体积)和DIEA(1.0eq)加入20L反应器。排干SPPS室，加入DMF溶液(5体积)。用DCM(2体积)冲洗反应器，将冲洗液加入SPPS室。在氮气氛下在SPPS室中搅拌所述树脂2小时，排干。在所述树脂上保留的任何活性部位用9∶1 MeOH∶DIEA(5体积)进行末端封端30分钟。排干所述树脂，用DCM(6×5体积)洗涤，并干燥至恒重(3.856Kg)。取样树脂并测试载荷量(注释2)。注释：1．2-氯代三苯甲基氯树脂对润湿剂非常敏感。水封端所述树脂，产
生盐酸。只要所述溶剂一干，则DCE和DCM之间几乎没有区
别。2．通过从树脂裂解Fmoc氨基酸并用定量(wt/wt)HPLC分析相对于
标准品进行分析，可以测定树脂载荷量。
Phenomenex Jupiter C18,300A,Sm
1mL/min,260nm
A:0.1％TFA水溶液
B:0.1％TFA的乙腈
65％B，等梯度
保留时间：约8分钟
根据所述树脂的重量增加确定载荷量可能不准确，因为在干燥树脂前使用的洗涤量可能不足以完全从树脂去除NMP。计算如下：(Fmoc-AA-OH-树脂重量-2-CTC原料重量)/Fmoc-AA-OH-树脂重量(所载荷AA的MW-盐酸MW)
据观测，本发明的肽片段在DCM中的贮存时间(天)延长可明显增加从树脂的裂解。例如在制备FmocAA17-26OH过程中，两次将部分构建的片段在周末期间贮存在DCM中。在完成所述合成并从树脂取出后，所获得的FmocAA17-26OH收率为8％。怀疑在周末贮存期间在DCM中的痕量盐酸从树脂缓慢裂解部分构建片段。
允许FmocAA17-26O-树脂、AcAA1-16O-树脂和FrmoAA27-35O-树脂样品在DCM和IPA中于室温下贮存1周。用HPLC分析每一种的上清液。尽管未获得定量结果，但是所有片段在DCM中基本上均从树脂裂解，而在IPA中未观察到裂解。如果部分构建的片段需要贮存数天(一个周末内)，最好用NMP冲洗所述固体，排干树脂床，让其在氮气氛下处于NMP饱和状态下。
最后一次洗涤FmocLeuO-树脂、FmocGlnO-树脂、FmocTrp(Boc)O-树脂、FmocAA17-26O-树脂、AcAA1-16O-树脂和FrmoAA27-35O-树脂时用IPA代替DCM。将IPA饱和的FmocLeuO-树脂、FmocGlnO-树脂和FmocTrp(Boc)O-树脂在40℃干燥。由在4℃干燥的载荷树脂构建FmocAA17-26O-树脂、AcAA1-16O-树脂和FrmoAA27-35O-树脂。在完成所述合成时，用DOM然后用IPA洗净树脂结合片段。分离IPA饱和的树脂结合片段，并在室温和40℃干燥。从树脂裂解所述片段，并用HPLC进行分析。在片段纯度方面未观察到不同。在40℃干燥IPA饱和的树脂结合片段不会影响所分离的片段的质或量。
检测与NMP/DCM相对的在DMF中SPPS的片段(在两种溶剂体系中1g树脂膨胀为5mL)。用DMF作溶剂、TBTU对HBTU作偶联剂合成片段FmocAA27-35OH。分离获得的FmocAA27-35OH得率为77％,85.5A％纯。
片段FmocAA17-36NH2和AcAA1-36NH2的处理方案去除未偶联的片段。在固相合成中在缺失部位乙酰化(封端)这些片段将保证所述缺失片段在液相偶联中不发生偶联。在合成FmocAA17-36NH2和AcAA1-36NH2中未偶联的片段应该在IPA和ACN处理中去除。
11.2大规模制备片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)
用SPPS大规模制备片段AcAA1-16OH，在两次运行中由3.53KgFmocGlnOH-树脂产生的树脂结合片段总计为7.941Kg。在两次运行中有点过高估计原料FmocGlnOH-树脂的载荷量，根据重量基HPLC分析获得载荷量值为0.55mmol/g，而不是计及原料2-CTC的12％LOD根据重量增加获得的更准确的0.52mmol/g。除了树脂载荷量低于需要值外，在SPPS期间采用6％过量的每种氨基酸。
SPPS采用2.5当量在所述树脂上的第一种FmocGln(trt)OH和1.7当量在所述片段中的每种后续氨基酸(以0.55mmol/g载荷量为标准)。在8体积3∶1 NMP∶DCM中进行所述偶合反应。32个偶合反应(包括乙酰化)除了两个外所有反应将在2小时内完成。所有洗涤都用5体积NMP进行。
在3.4体积(以AcAA1-16O-树脂的干重为标准)1％TFA/DCM中于0-5℃洗涤树脂-结合片段5-6次，每次洗涤5分钟。将每次洗出液收集到1.36体积0.33 M碳酸氢钠水溶液上，以中和TFA。合并三相洗出液，加入水(2体积)。蒸馏去除DCM，将可过滤沉淀留在碳酸氢钠水溶液中。在蒸馏过程中，随着DCM的最后去除，所述多相淤浆在崩解为(collapsing into)可过滤淤浆之前变粘呈奶油状。将淤浆冷却至0-5℃，用O.1N盐酸将pH调节至3.0。在0-5℃搅拌淤浆1-2小时，过滤收集，洗涤并干燥。在余下的操作中收集固体，将其返回到所述反应器中用水研制1-2小时，然后收集并干燥。
用1％TFA的DCM在4次操作中完成从所述树脂裂解AcAA1-16OH。由纯度为93-96A％的3.53Kg FmocGlnO-树脂产生AcAA1-16OH总计为4.814Kg。根据由计及12％LOD原料2-CTC(理论值5.83Kg)重量增加测定的0.52mmol/g载荷量的总收率为83％。
AcAA1-16OH的钠盐不溶于DMF和NMP中，所以必需调节pH以质子化羧基末端。水洗涤保证从产物去除三氟乙酸钠。按重量/重量计非常微量的三氟乙酸钠将干扰与HAA17-36NH2的液相偶合。
应该在室温下干燥该片段。观测在40℃干燥湿的AcAA1-16OH的稳定性研究表明，在3天内降解约4％。有趣的是，该干燥固体在80℃下可稳定24小时。
11.2.1大规模制备片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)的优选方法
向40L肽反应室加入树脂结合的FmocGlnOH(1.53Kg,0.55mmol/g,0.84摩尔)。在氮气下使树脂在DCM(5体积)中搅拌调适15分钟，然后排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5体积)，在氮气下搅拌悬浮液20分钟。排干溶液，重复该过程。用5体积NMP洗涤树脂5次，以按氯醌试验测定除去二苯并富烯和哌啶(注释1)。
在洗净树脂的哌啶的同时，将在所述序列中后续氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)合并在NMP(6-7体积)中，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入HBTU(1.5eq)，搅拌该溶液10-15分钟，以溶解HBTU。将活化氨基酸的冷却溶液加入树脂，然后用DCM(2.5体积)冲洗(注释2)。在氮气吹扫下搅拌悬浮液2小时，然后取出树脂样品进行定性茚三酮试验(注释3)。如果茚三酮试验阴性，则排干容器，用3×5体积NMP洗涤(注释4)，用所述序列中的下一个氨基酸重复该循环。如果茚三酮试验阳性，则再搅拌悬浮液1小时，并再测试。如果茚三酮试验阴性，则进行下一个循环。如果茚三酮试验仍然阳性，再与1当量氨基酸和试剂偶合。如果茚三酮试验在1小时后为阳性，则用5当量乙酸酐和5当量吡啶的NMP(10体积)封端1小时。
在完成所述片段合成时，如上所述从最后的氨基酸去除Fmoc，并在乙酸酐和吡啶(各5eq)的3∶1 NMP∶DCM(10体积)溶液中搅拌所述树脂20-30分钟或直至茚三酮试验为阴性。排干树脂，用2×5体积NMP洗涤，用5体积DCM洗涤5次，干燥获得3.49Kg AcAA1-16O-树脂。
向40L SPPS反应室加入干燥的树脂结合的AcAA1-16(3.49Kg)。用6×3.4体积1％TFA/DCM从所述树脂裂解树脂结合肽(注释7)。将每一裂解洗出液收集到1.36体积0.33M碳酸氢钠水溶液上。合并双相部分，用2体积水稀释。减压(15英寸汞柱，20℃)浓缩双相混合物以去除DCM。在所述蒸馏期间再加入水(2体积)，根据需要持续搅拌(注释6)。当所述DCM被去除(数小时)时，将所述悬浮液冷却至0℃并用1N盐酸水溶液将pH调节至3。在0℃搅拌淤浆1小时并收集。将仍然潮湿的固体返回反应容器，用水(7体积)研制去除残留TFA和三氟乙酸钠。真空过滤收集固体，并干燥至恒重(1.12Kg,95A％)。根据0.52mmol/g载荷量的AcAA1-16OH收率为86％(注释7)。注释：1．向约1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯饱和溶液，然后加入1滴流出物。出现蓝色或紫色表示存在哌啶。随着所述树脂床高度的增加，将需要更大体积的NMP洗出哌啶。2．加入DCM保证所述树脂充分膨胀。3．定量茚三酮试验足以检测偶合效率。取出2-20mg树脂样品用甲醇洗净。向该样品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mM KCN的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀释该溶液至0.5-1mL，并将该溶液置于75℃的加热块中5-10分钟。蓝色或紫色表示存在游离胺(阳性)。澄明或淡蓝色为阴性结果。Protocol for
Qrantitative Ninhydrin Test References:Sarin,V.K.,Kent,S.B.H.,
Tam,J.P.,&Merrifield,R.B.(1981)Analytical Biochem.ⅲ,147-
157。4．如果所述树脂将储存过夜，用2×5体积NMP洗涤，排干并在氮
气下储存。不能储存在DCM下。这可使所述肽从树脂裂解和导
致明显的重量减轻。5．在254nm经TLC显色测量各个流分的产物含量。在开始的5份
洗出液中去除了主要产物。6．随着DCM的去除，所述反应物呈糖稀(marshmallow cream)稠度。
随着继续蒸馏，所述悬浮液逐渐成为固体淤浆。重要的是缓慢去
除DCM以避免产物油的流出。7．Vydac C8,5μ,300A
1mL/min,30℃,230nm
A 1000∶1水/TFA
B 800∶200∶1 IPA∶ACN∶TFA
60-95％B/30分钟
保留时间：13.1分钟
11.3大规模制备片段FmocAA(17-26)-OH(片段10b)
在两次相同规模的运行中，由2.4Kg FmocLeuO-树脂制备的FmocAA17-26O-树脂总量为5.3Kg。在四次相同规模的运行中由树脂裂解5.3Kg FmocLeuO-树脂，获得3.184Kg FmocAA17-26OH，平均纯度为94.4A％，收率为90％。
  采用1.5当量相对于载荷系数的各种氨基酸进行所述反应，导致对于每个偶合循环使用65％过量氨基酸。所有偶合反应在2小时内完成(茚三酮试验阴性)。
  用20％哌啶的NMP(5体积)去除Fmoc保护基团20分钟，重复该过程。用5×5体积NMP洗涤液使哌啶从树脂洗出。在8体积3∶1NMP∶DCM中进行偶合反应。排干偶合溶液，用3×5体积NMP洗涤液洗净所述固体。用序列中的下一个氨基酸重复该循环。完成所述片段时，用2×5体积NMP、5×5体积DCM洗涤树脂床，并干燥至恒重。
  用数份1％TFA的DCM洗涤液从所述树脂去除所述片段。不必冷却1％TFA的DCM溶液，因为该片段在1％TFA/DCM(1％/天)中的稳定性较AcAA1-16OH高得多。当收集含有产物的酸性DCM洗出液时，用吡啶对其进行中和。蒸馏合并的洗出液去除DCM，加入乙醇以保持溶液以及在蒸馏期间驱除残留的DCM。在去除DCM(由去除的馏出液的温度升高决定)后，加入水沉淀所述片段。真空过滤(少于60分钟)收集固体。将仍然潮湿的固体转移回反应器，用80/20乙醇/水(5体积)在0-5℃研制60分钟。真空过滤收集所沉淀的FmocAA17-26OH，用最小量80/20乙醇/水洗涤并干燥(真空，不加热，10天)。11.3.1大规模制备片段FmocAA(17-26)-OH(片段10b)的优选方法
在40L SPPS反应室中加入FmocLeuO-树脂(1.2Kg,0.776摩尔)，然后加入DCM(5体积)以膨胀所述树脂。需要DCM保证干燥的原料树脂完全膨胀。搅拌悬浮液20-30分钟，排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5体积)，搅拌该溶液20分钟。排干所述溶剂，重复所述过程。排干溶剂，用5×5体积NMP洗涤树脂，以去除哌啶(注释1)。
去保护时，在机械搅拌下在20L圆底烧瓶中加入所述序列中的下一个氨基酸(1.95eq)、HOBT(1.95eq)、DIEA(1.95eq)和NMP(6体积)。搅拌溶液直至固体溶解，然后冷却至0-5℃并加入HBTU(1.95eq)。搅拌溶液直至HBTU溶解或所述树脂不含哌啶(无论哪个均是首要的)，然后加入到所述树脂中。用DCM(2体积)洗涤反应器，将该反应转移到SPPS反应器。注意：氨基酸和试剂的化学计量应为1.5eq。
将所述树脂悬浮于偶合溶液中并轻轻搅拌。2小时后，从SPPS反应室取出树脂样品，进行定性茚三酮试验(注释2)。如果茚三酮试验阴性，则排干反应器，用3×5体积NMP洗涤，用所述序列中的下一个氨基酸重复该循环(DCM膨胀仅用于加载第一个氨基酸序列)。
如果所述茚三酮试验阳性，再搅拌所述悬浮液1小时，并再测试。如果茚三酮试验阴性，则进行下一个循环。如果茚三酮试验仍然阳性，则用1当量所述氨基酸和试剂再偶合。如果1小时后茚三酮试验阳性，则用5当量乙酸酐和5当量吡啶的NMP(10体积)封端1小时。
在完成所述片段合成时，排干树脂，用2×5体积NMP、5×5体积DCM洗涤，干燥获得2.67Kg FmocAA17-26O-树脂。
用5-6×1.7体积1％TFA的DCM从树脂(1.33Kg)裂解FmocAA17-26OH，每次5分钟。将1％TFA/DCM洗出液收集在含有吡啶(在所述洗出液中与TFA的体积比为1∶1)的烧瓶中。合并含有产物的洗出液(约14L)，蒸馏去除DCM至最小罐体积(约1/3原体积)。调节真空以维持罐温度于15-25℃。加入乙醇(6.5体积)，继续蒸馏直到去除DCM为止(根据馏出液的温度确定，注释3)。再调节真空维持罐温度于15-20℃。终罐体积应该为约8-10体积。将溶液冷却至5-10℃，在30分钟内加入水(6.5体积)沉淀FmocAA17-25OH。真空过滤收集固体，用水(2-3体积)洗涤。为了去除残余吡啶和/或盐，将仍然潮湿的固体返回反应器，加入预冷至0℃的80/20乙醇/水(5体积)。在0℃搅拌悬浮液60分钟，真空过滤收集固体，用最小量80/20乙醇/水洗涤，干燥至恒重，获得0.806Kg FmocAA17-26OH，收率90.6％,96A％纯(注释4)。注释：1．向1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯饱和溶液，然后加入1滴流
 出物。出现蓝色或紫色表示存在哌啶。2．定量茚三酮试验足以检测偶合效率。取出2-20mg树脂样品用甲
醇洗净。向该样品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mMKCN
的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀释该溶液至0.5-1
mL，并将该溶液置于75℃的加热块中5-10分钟。出现蓝色或紫
色表示存在游离胺(阳性)。澄明或淡蓝色为阴性结果。3．在真空蒸馏DCM期间的头馏分温度为10-15℃。当去除DCM时
头馏分温度升高至35℃。4．Vydac C8,5μ,300A
1mL/min,262nm,30℃
A 1000∶1水/0.1％TFA
B ACN/0.1％TFA
80-99％B/20分钟
保留时间：15.2分钟
   11.4大规模制备片段Fmoc-AA(27-35)-OH(片段16b)由4.45Kg FmocTrp(Boc)O-树脂合成FmocAA27-35OH总计4.694Kg。分两批进行固相合成，从所述树脂裂解为4批。由一批产生的FmocAA27-35OH纯度较另一批获得的物质低约5％。这是因为未鉴定的5A％杂质，该杂质在对FmocAA17-36NH2的加工过程中去除。装载到树脂上的FmocTrp(Boc)OH总量为2.5摩尔。按预期的约63％的树脂载荷量进行固相合成。所有的偶合反应在第一个2小时检测点完成。所述反应和用于SPPS的冲洗体积和裂解与在合成FmocAA17-26OH中使用的相同。如上所述从所述树脂裂解。快速过滤(15分钟)。90/10乙醇/水研制后干燥固体需要3天(真空，不加热)。所述片段在40℃干燥是稳定的。
11.4.1大规模制备片段Ac-AA(27-35)-OH(片段16b)
的优选方法
向含有FmocTrp(Boc)-树脂(1eq,2.2Kg,1.23摩尔)的SPPS室加入DCM(5体积)。搅拌悬浮液15分钟并排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5体积)，搅拌悬浮液10-15分钟，以去除Fmoc保护基团。重复该过程，用5-7×NMP(5体积)洗涤树脂至氯醌试验阴性(注释1)。
将后续氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.7eq)合并在NMP(6体积)中，然后冷却至0-5℃(注释2)。加入HBTU，搅拌溶解溶液10-15分钟。将活化氨基酸溶液加入所述树脂。用DCM(2体积)洗涤反应器，然后加入到所述树脂(注释3)。在氮气氛下搅拌悬浮液1-2小时。用定性茚三酮试验监测偶合完成情况(注释4)。如果茚三酮试验阴性，则排干容器，用3×5体积NMP洗涤，用所述序列中的下一个氨基酸重复该循环(所述DCM膨胀仅用于装载第一个氨基酸)。
如果茚三酮试验阳性，则再搅拌悬浮液1小时，并再测试。如果茚三酮试验阴性，则进行下一个循环。如果茚三酮试验仍然阳性，再与1当量所述氨基酸和试剂偶合。如果茚三酮试验在1小时后为阳性，则用5当量乙酸酐和5当量吡啶的NMP(10体积)封端1小时。
在完成所述片段合成时，排干树脂，用2×5体积NMP、5×5体积DCM洗涤，干燥获得4.11Kg FmocAA27-35O-树脂。
用6×1.7体积1％TFA的DCM从树脂(2.05Kg)裂解所述片段，每次5分钟。将1％TFA/DCM洗出液收集在含有吡啶(在所述洗出液中与TFA的体积比为1∶1)的烧瓶中。合并含有产物的洗出液，蒸馏(调节真空以维持罐温度于约15℃)去除DCM至约原罐体积的一半。逐渐加入乙醇(5体积)，继续蒸馏(调节真空以维持罐温度于20℃)直到去除DCM为止(根据馏出液的温度确定，注释5)。罐体积应该为约6-7体积。将混浊溶液冷却至10-15℃，在30分钟内加入水(3.5体积)并快速搅拌，以沉淀FmocAA27-35OH。真空过滤收集固体(15分钟)，用水(1体积)洗涤。为了去除残余吡啶，将潮湿的固体返回反应器，加入预冷至0℃的90/10乙醇/水(10体积)。在0-5℃搅拌淤浆60分钟，真空过滤收集固体，用90/10乙醇/水(0.5体积)洗涤，干燥至恒重，获得1.19Kg FmocAA27-35OH，收率89％,89.2A％纯(注释6)。
可通过用15体积9∶1乙醇/水研制所述固体并搅拌12小时，然后收集及干燥，再实施此方案。注释：1．向1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯饱和溶液，然后加入1滴流出物。出现蓝色或紫色表示存在哌啶。2．在室温下加入较少量的试剂HBTU以促进溶解。将HBTU加入预冷的溶液以使外消旋作用最小。3．在NMP中进行活化，因为HBTU在DCM中不溶解。DCM用来洗涤反应器，并加入树脂以保持树脂充分膨胀。4．定量茚三酮试验足以检测偶合效率。取出2-20mg树脂样品用甲
醇洗净。向该样品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mM KCN
的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀释该溶液至0.5-1
mL，并将该溶液置于75℃的加热块中5-10分钟。蓝色或紫色表
示存在游离胺(阳性)。澄明或淡蓝色为阴性结果。5．在真空蒸馏DCM期间的头馏分温度为10-15℃。当去除DCM时
头馏分温度升高至35℃。6．VydacC8,5μ,300A
1mL/min,262nm,30℃
A  水/0.1％TFA
B  ACN/0.1％TFA
80-99％B/20分钟
保留时间：15.3分钟
11.5通过液相偶合FmocAA(27-35)-OH与HPheNH2
大规模制备片段FmocAA(27-36)-OH
在四次运行中由4.676Kg FmocAA27-35OH制备FmocAA27-36NH2总计5.226Kg。残留偶合试剂或溶剂使收率大于100％。将其在下一阶段中除去。
在该阶段中在水排泄后固体粘着在反应器壁上被认为是一个重要问题。真空过滤分离粗制固体需要30分钟。对于所述操作平均干燥时间(真空，不加热)为8天。需要对在滤器上的所述固体加压，以在过量的水进入烘炉前将其除去。所述片段在40℃干燥是稳定的，真空烘炉需要加热。
用各批原料在0.5-1g规模进行使用试验，用来帮助确定质量和均一性。薄层色谱法(TCL)和HPLC用来监测原料向产物的转化。在片段FmocAA27-35OH中发现的主要杂质是三氟乙酸(或其盐)。在FmocAA27-35OH中存在的三氟乙酸与苯丙氨酸酰胺的活化和反应是一个快速过程。少量苯丙氨酸酰胺可用来消耗存在的任何三氟乙酸。更重要的是关于所购买的苯丙氨酸酰胺的质量问题。大多数销售商销售其盐酸盐。几批苯丙氨酸酰胺盐酸盐产生在HPLC上与原料共洗脱的杂质(5-15A％)。可用TLC从原料及产物分离杂质。所述杂质为由存在于苯丙氨酸酰胺的盐酸盐中的氯化铵产生的FmocAA27-35NH2。
11.5.1通过液相偶合FmocAA(27-35)-OH与HPheNH2
大规模制备片段FmocAA(27-36)-OH
向具有机械搅拌器的40L夹套式反应器中加入FmocAA27-35OH(1eq,1.185Kg)、HOAT(1.1eq)、盐酸HPheNH2(1.15eq)和DMF(12.5体积)。加入DIEA(2.1eq)，将溶液冷却至0-5℃，加入HBTU(1.2eq)。在0-5℃下搅拌反应混合物15分钟，然后温热至室温，再搅拌70分钟(注释1,HPLC用于生产控制)。在用HPLC判定反应完成后，在15-30分钟内加入水(12.5体积)，以沉淀肽。在室温下搅拌淤浆15分钟。真空过滤收集固体，用水(3体积)洗涤，干燥获得FmocAA27-36NH2(1.357Kg，收率107％,87.1A％HPLC纯(注释2)。
可通过用15体积9∶1乙腈/水研制所述固体并搅拌12小时，收集以及干燥，再次加工所述反应物。注释：1．生产过程控制，TLC：88/12二氯甲烷/甲醇UV，碘检测Rf:Fmoc AA27-35OH,0.49Rf:FmocAA27-36NH2,0.63Vydac C8,5m,300A30℃,1mL/min,262nmA  水/0.1％TFAB  ACN/0.15 TFA80-99％B/20分钟保留时间：FmocAA27-35OH,15.8保留时间：FmocAA27-36NH2,17.122．除非所分离的固体返回反应器并用水研制，否则一般获得的收率较理论值高。11.6由FmocAA(27-36)-OH大规模制备片段HAA(27-36)-OH
在平均2步收率86.4％的四次运行中由5.221Kg FmocAA27-36NH2制备HAA27-36NH2总计3.897Kg。对所述运行观测到的收率为74-97％，推测它反映从一次操作转入下一操作步骤。
在该阶段的处理及产品分离运行得非常好。如果在MTBE中留有适当量的DCM，则可以增强所述产物的纯化，所述固体的物理特性使得快速过滤和干燥。该产物分离过程已经加入下文11.6.2部分中所述的新阶段。
DCM是在对FmocAA27-36NH2去保护过程中用的溶剂。完成所述去保护时，用水洗涤有机溶液两次以去除大部分过量哌啶，然后浓缩至1/3原体积。加入MTBE沉淀所述片段。继续蒸馏去除大部分残留DCM并结束沉淀所述片段。重要的是去除大部分DCM，以避免在沉淀中的重量损失。此外，重要的是留下部分DCM在MTBE中，以保证产物提纯。二苯并富烯、哌啶/富烯加合物和残留的哌啶可溶于MTBE。收集并干燥HAA27-36NH2。必要时，用MTBE第二次研制所述固体(12小时)去除可存在于HAA27-36NH2中的残留二苯并富烯和更重要的哌啶/富烯加合物。用已烷研制可去除二苯并富烯但是不会去除哌啶/富烯加合物。从MTBE分离固体的干燥时间为1天。
因为HAA27-36NH2和相关杂质在DCM/MTBE中的高溶解性，所以需要分析方法来准确检测溶剂交换的终点。已经开发GC法分析MTBE中的DCM。当在MTBE中的DCM含量低于6％时结束蒸馏。
11.6.1由FmocAA(27-36)-OH大规模制备
片段HAA(27-36)-OH
向配有机械搅拌器和温度计的40L玻璃夹套式反应器中加入FmocAA27-36NH2(1eq,1.356Kg)、DCM(5体积)和哌啶(0.2体积)。在环境温度下搅拌溶液1.5小时(注释1)。用(2×5体积)水洗涤有机溶液。通过蒸馏(约25mmHg，夹套温度低于45℃以避免固体熔化)使有机层体积减少至1/3原体积。逐渐加入MTBE(5体积)至反应容器中，同时继续浓缩至出现大量沉淀而且所述罐体积约5体积时为止。当DCM含量低于6％时停止溶剂交换。将淤浆冷却至0-5℃，搅拌60分钟，然后真空过滤收集(快速)。用MTBE(2×O.5体积)洗涤固体并干燥至恒重，获得1.022Kg HAA27-36NH2，收率89.2％(2步)，91.1A％纯(注释1)。
可通过用MTBE(12.5体积)在23℃下研制13小时，然后真空过滤收集并干燥，再次加工所述反应物。注释：1．用HPLC进行生产过程的检测(IPC)和纯度检测  Vydac,C8,5,300A1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB ACN/0.1％TFA80-99％B/20分钟保留时间：FmocAA27-36NH2,16.5；HAA27-36NH2,8.4。
11.6.2通过液相偶合FmocAA(27-36)-OH和HPheNH2
改进制备片段HAA(27-36)-OH
开发了组合11.5-11.6.1部分、直接采用FmocAA27-35OH至HAA27-36NH2的新方法。该新方法消除了与分离FmocAA27-36NH2和干燥时间长有关的问题。以下进行详细描述。新方法去除了所述合成途径中的长干燥时间和分段。
向具有磁性搅拌器和氮气入口的100mL圆底烧瓶中加入FmocAA27-35OH(5.0g,1eq)、HOAT(0.459,1.2eq)和Phe-NH2(0.389,1.2eq)。向所述烧瓶加入10体积NMP(50mL)和DIEA(0.45g,1.5eq)，并在氮气氛下搅拌直到固体溶解为止。将溶液冷却至0-5℃，然后加入HBTU(1.04g,1.2eq)。在0-5℃的氮气氛下搅拌30分钟。将反应混合物温热至20℃并继续搅拌。加入HBTU后90分钟进行操作过程的检测(IPC)(注释1)。
在所述操作过程的检测(IPC)表明反应完成时，加入哌啶(1.379,7eq)至反应混合物中，在氮气氛下搅拌1.5小时。进行IPC(注释1)。如果Fmoc去除完成时，再搅拌30分钟并进行IPC。
结束时在不超过35℃的条件下，将反应混合物以一定比率加入到5％乙酸水溶液(30体积)中。搅拌所生成淤浆1-2小时，真空过滤收集(注释2)。用10体积(50mL)水洗涤固体。
将潮湿的固体返回所述反应器中，加入20体积水(100mL)，在环境温度下搅拌1-2小时。真空过滤收集固体，用10体积水(50mL)洗涤并干燥(注释3)。
用MTBE(20体积)在环境温度下研制所述干燥(注释4)固体2-5小时，以去除二苯并富烯和二苯并富烯哌啶加合物。真空过滤收集固体并干燥至恒重，获得4.55g(94.3％)HAA27-36NH2,85-90A％纯(注释1)。
在该方法中一般性除去Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)，然而如果有必要重复加工，则于20℃在10体积MTBE中搅拌所述固体2-3小时，然后收集并干燥。注释：1．用反相HPLC进行操作过程的检测：柱：Vydac C8,300A,5μ,30℃流速：1mL/min检测：UV,262nm流动相：A．水/0.1％TFA
      B．乙腈/0.1％TFA方法：在20分钟内80-99％B保留时间：
FmocAA27-36NH2(16.5min。HAA27-36NH2(8.4min)2．总过滤时间为10分钟。3．潮湿的过滤饼必须返回反应器，用水立即进行洗涤，避免所述固体的油化或胶化。4．所述粗产物必须彻底干燥，以保证MTBE研制除去二苯并富烯副
产物。11.7通过液相合成融合FmocAA(17-26)-OH与HAA(27-36)-OH
大规模制备片段FmocAA(17-36)-OH
在四次运行中由2.993Kg HAA27-36NH2和3.176KgFmocAA17-26OH制备FmocAA17-36NH2总计5.115Kg。平均收率84.3％。在水从反应混合物流出后过滤粗品固体平均需要40-50分钟。
在1-2g规模进行使用试验，测试在进行偶合反应之前将使用的片段和HBTU。根据使用试验确定原料和试剂的化学计量。在使用试验中还要记录下原料的溶解性。浑浊溶液可表示在FmocAA17-26OH中存在盐，并成为用水对片段进行洗涤的根据。必不可少的是加入HBTU之前反应混合物中所有组分都确实在溶液中，以确保原料完全转化为产物并且外消旋化和副产物形成最少。
通过用IPA沉淀显著增加了从流出的水溶液中分离的粗品FmocAA17-36NH2的纯度。FmocAA17-36NH2部分溶解于IPA。用约15体积预温至60-70℃的95/5的IPA/水研制FmocAA17-36NH2，然后搅拌并在数小时内冷却至室温，这可提高片段的纯度。FmocAA17-26OH的原料以及哌啶酰胺和HAA27-36NH2的烯胺脲加合物可溶于95％IPA。延长用95％IPA在室温下研制粗品FmocAA17-36NH2的时间对于去除杂质不那么有效。已在60-70℃完成稳定性研究。不把IPA溶液加热至52℃以上似乎对所分离的产物的质量影响最小。
11.7.1改进通过液相合成融合FmocAA(17-36)-OH
和HAA(27-36)-OH大规模制备
片段FmocAA(17-36)-OH的优选方法
向配有机械搅拌器和氮气入口的40L夹套式反应器中加入FmocAA17-26OH(1eq.,0.770Kg)、HAA27-36NH2(1eq.,0.720Kg)、HOAT(1.5eq.)和DMF(12.5相对于FmocAA17-26OH的体积)。加入EtPr2N(1.5eq.)并在室温下搅拌悬浮液直到固体溶解(肉眼观察)。将溶液在氮气氛下冷却至0-5℃，加入HBTU(1-1.05eq)。在0-5℃搅拌反应混合物直到HBTU溶解(肉眼观察，约15分钟)。将反应混合物温热至25℃并搅拌2小时(注释1)。将DMF溶液冷却至0-5℃，加入冷冻工艺水(12.5体积)，其加入速率使得溶液温度不超过25℃。搅拌所得的淤浆1-24小时，真空过滤收集固体并用水(3×4体积)洗涤。在滤膜上干燥固体16-24小时至约2倍理论重量。将95/5异丙醇/水(25体积)加入所述40L反应器并温热至45℃。快速搅拌下将半干燥的FmocAA17-36NH2加入到所述IPA溶液。将该悬浮液温热至52℃，然后搅拌12-16小时同时冷却至室温(注释2)。真空过滤收集固体，用最小量IPA洗涤并干燥获得1.261Kg FmocAA17-36NH2，收率85％,90.SA％HPLC纯(注释1)。可通过重复所述95/5 IPA/水的研制再加工所述反应物。注释：1．生产过程控制和纯度，HPLCVydac C8,5μ,300A1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB 80/20 IPA/ACN/0.1％TFA60-95％B/20分钟保留时间：HAA27-36NH2,6.73分钟
FmocAA17-26OH,10.67分钟
FmocAA17-36NH2,20.2分钟2．在该温度FmocAA17-36NH2将不能完全溶解于该体积中。收集固体前，停止搅拌并使固体沉淀。取出滤液样品并进行HPLC分析。如果滤液含有显著量FmocAA17-36NH2，则在收集固体前冷却至0℃。11.8由FmocAA(17-36)-OH大规模制备片段HAA(17-36)-OH
在四次运行中由5.112Kg FmocAA17-36NH2制备的HAA17-36NH2总量为4.965Kg。所述分离产量和HPLC痕量表示存在二苯并富烯和可能的溶剂。由于用碳酸钾除去二苯并富烯而不是哌啶，因此存在的二苯并富烯将不影响下一步偶合反应，所以二苯并富烯的哌啶加合物在化学上不是问题。
存在数个与该过程有关的问题。在12体积DMF中进行该反应。除去Fmoc基团的碱是1体积1.1M碳酸钾，碳酸钾不能与二苯并富烯形成难于除去的碱加合物。于室温下在约90分钟内进行去保护。
加入预冷至0℃的1∶1饱和氯化钠水溶液∶水的溶液，以共沉淀所述片段和二苯并富烯。产生需要数小时(5-8)过滤的精细牛奶状固体。分离后必须完全干燥(低于1％LOD)潮湿固体，以除去二苯并富烯杂质。干燥需要10天(真空，不加热)。干燥后，将所述固体返回所述反应器，用3∶1庚烷∶MTBE(20体积)在环境温度下研制18小时，以除去二苯并富烯。研制较短时间不能完全除去二苯并富烯，如果在所述固体上存在任意量的水，则不能除去二苯并富烯。如果二苯并富烯仍存在则可用3∶1庚烷∶MTBE(20体积)重复加工。
为了解决这些问题，开发以下新方法。将FmocAA17-36NH2(2.0g,1eq.)和庚烷(8体积)加入到配有磁性搅拌器、温度控制器和回流冷凝器的100mL圆底烧瓶中。加入2体积MTBE(4mL)并将淤浆加热至45-50℃(注释1)。加入哌啶(10eq.)。在45-50℃氮气氛下搅拌24-36小时(注释2)。在45-50℃加热过滤所述反应混合物(注释3)，然后用5体积(10mL)60∶40庚烷∶MTBE洗涤滤饼。注释：1．如果使MTBE逸出反应器，由此改变庚烷∶MTBE比，将使反应减慢，反应温度高于50℃可能使反应固体胶化。在5小时内主要去除Fmoc。2．用反相HPLC监测反应完成情况：柱：Vydac C8,300A,5μ,30℃流速：1mL/min  检测：UV,262nm流动相：A．水/0.1％TFA
      B．80∶20 IPA∶ACN 0.1％TFA方法：在30分钟内60-95％B3．热过滤帮助除去二苯并富烯的哌啶加合物。11.8.1由FmocAA(17-36)-OH大规模制备片段HAA(17-36)-OH
在室温下将FmocAA17-36NH2(1eq,1.26Kg)和DMF(12体积)加入40L夹套式反应器中。立即加入1.11M碳酸钾水溶液(1体积，5eq)(注释1)。在室温下搅拌该反应混合物3.5小时(注释2)。将反应混合物缓慢加至预冷至0℃的1∶1饱和氯化钠水溶液/水(10体积)的溶液中(约1-2小时)，其加入速率使得溶液温度不超过10℃。真空过滤收集固体，用橡皮挡板将水从滤饼压出(注释3)。将湿滤饼转移回反应容器，并用水(10体积)研制(搅拌)1-2小时以除去残留无机盐。真空过滤收集固体，用橡皮挡板挤压，然后转移到真空烘箱干燥至恒重。用3∶1庚烷∶MTBE(20体积)在室温下研制所述干燥固体(注释4)至少14小时，以除去二苯并富烯。真空过滤收集固体，用庚烷(2体积)洗涤，干燥获得1.20Kg HAA17-36NH2，收率99.5％,75A％纯。HAA17-36NH2含有5A％二苯并富烯。通过重复所述庚烷∶MTBE研制再加工所述反应物。注释：1．当加入碳酸钾水溶液时溶液变浑浊，但是继续搅拌又变澄清。注意温度升高4-5℃。2．HPLC用于IPC和纯度测定Vydac C8,260nm1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFA  B 80∶20 IPA/乙腈/0.1％TFA60-95％B/3O分钟3．产物沉淀为细颗粒，导致过滤缓慢。4．所述物质必须不含水以便庚烷有效除去二苯并富烯。
11.9通过液相合成由AcAA(1-16)-OH和FmocAA(17-36)-OH
大规模制备片段AcAA(1-36)-OH
用HOAT和DIEA将AcAA1-16OH溶解于DMF中，冷却至0℃并加入HBTU。搅拌15分钟或直到HBTU溶解为止，然后加入HAA17-36NH2。在不存在HAA17-36NH2的情况下预活化AcAA1-16OH是一种保护措施，后来发现并不是必要的。此外，证明将HAA17-36NH2溶解入含有活化AcAA1-16OH的0℃DMF溶液中在较大规模时速度缓慢。
在四次运行中由3.92Kg AcAA1-16OH和4.96Kg HAA17-36NH2制备的AcAA1-36NH2总量为6.972Kg，平均收率80.1％。在此期间的两次操作平均收率为87％，而另两次操作的平均收率为73％。
在1-2g规模进行使用试验，测试在进行偶合反应之前将使用的片段和HBTU。根据使用试验确定原料和试剂的化学计量。在使用试验中还要记录下原料的溶解性。浑浊溶液可表示在AcAA1-16OH中存在盐，并成为用水对片段进行洗涤的依据。必不可少的是加入HBTU之前反应混合物中所有组分都确实存在于溶液中，以确保原料完全转化为产物并且外消旋化和副产物形成最少。
将片段AcAA1-16OH和HAA17-36NH2以及试剂HOAT和DIEA溶解于DMF中，冷却至0℃并加入HBTU。其中一次操作需要再加入等量的DIEA以拾取HAA17-36NH2上的HCl。从所述反应混合物和水流出物(过滤时间10分钟)中分离粗品产物。将仍然潮湿的固体返回含有预温至55℃的乙腈的反应器中，然后快速搅拌同时在3小时内冷却至35℃，然后冷却至20℃过夜。将所述淤浆冷却至0-5℃，再搅拌1-2小时，真空过滤收集固体。在该过程中，在55℃下AcAA1-36NH2几乎成为溶液。随着溶液的冷却，AcAA1-36NH2从溶液中沉淀出来(油)。随着溶液的冷却，所述油固化甚至成为精致的白色固体。在该变化过程中，大量固体可能沉集到反应器壁和搅拌轴上。其中大部分随着在20℃搅拌淤浆过夜而脱落。收集固体后，将溶器装以足量的水以掩没任何粘着在反应器或搅拌轴的固体。搅拌淤浆直到所有残留的固体均脱离反应器壁和搅拌轴(约1小时)，然后用作对所述滤饼的洗液。乙腈洗涤去除未反应的原料和任何截短的小于20个氨基酸的片段。11.9.1通过液相合成由AcAA(1-16)-OH和FmocAA(17-36)-OH
大规模优选制备片段AcAA(1-36)-OH
向反应器中加入AcAA1-16OH(938g,1eq)、HAA17-36NH2(1.19Kg,1eq)、HOAT(1eq)、DMF(19体积，相对于AcAA1-16OH)和DIEA(1eq)。搅拌淤浆直到固体溶解，然后冷却至0-5℃并加入HBTU(1.03eq)。在0-5℃搅拌溶液15分钟或直到固体溶解，温热至20℃并搅拌2小时。取样反应混合物进行IPC(注释1)。当判定反应完成时，以使得溶液温度不超过35℃的速率加入水(19体积)(注释2)。
搅拌淤浆1-24小时，然后真空过滤收集固体(10分钟)，用水(2×3体积)洗涤。挤压滤饼尽可能除去水。同时向反应器中加入95％乙腈/水(30体积，相对于AcAA1-16OH装料)，搅拌下温热至55℃。
分批将潮湿的固体加入反应器中以避免成块。搅拌淤浆，同时在3小时内冷却至35℃，然后冷却至20℃过夜。冷却至0-5℃，搅拌2小时，停止搅拌并取样溶液。
真空过滤收集固体。用90％乙腈/水(3.6体积)洗涤反应器和管道(line)。
向反应器中加入足量水以掩没任何粘附在反应器壁或搅拌轴上的固体(约30体积)。在环境温度下搅拌直到固体不再粘附在反应器壁和搅拌轴上(约1小时)。收集所述固体和其余部分并干燥至恒重(1.83Kg，收率86％)。
用90/10乙腈/水重复研制所述干燥固体。注释：1．IPC和纯度测定，HPLC
YMC ODS-A,150×4.6mm,5μ,120A
1mL/min,260nm,30℃
A 水/0.1％TFA
B THF/0.1％TFA
60-90％B/30分钟，90-95％B/1分钟，95％B/5分钟。
AcAA1-16OH:6.37分钟
HAA17-36NH2:8.91分钟
AcAA1-36NH2:18.07分钟2．如果在加入水期间温度高于35℃，沉淀出的固体可能熔化，导致成块和/或沉集在反应器壁上。
11.10去保护AcAA(1-36)-OH的侧链
本实验的目的是在沉淀中改变MTBE加入速率，以保持温度小于20℃，而且还分离并脱羧粗品T-20固体(即除去溶液脱羧作用)。
在加样到HPLC柱之前通过沉淀从ACN/水分离粗品固体T-20。用基于重量的HPLC分析检测所述固体的T-20百分含量。
在90/5/5 TFA/水/二硫苏糖醇中除去侧链保护基后，将溶液冷却至0℃并加入MTBE(45体积，相对于AcAA1-36NH2装料)。这是保证完全沉淀T-20所需要的最小MTBE量。混合时温度升高，最初的5体积必须缓慢加入以保持温度低于20℃(约60分钟)。随着加入MTBE的增加，加入速率可以加快。在沉淀期间保持温度低于20℃防止固体随着从溶液沉淀出来而发生成块。
目前的裂解/纯化方法包括在适应色谱纯化的规模进行去保护。将从去保护的混合物分离的粗品T-20的TFA盐溶解于pH5乙腈/水中，过滤并静置15小时以实现色氨酸吲哚的脱羧。在脱羧完成后，稀释溶液并转移到纯化装置(purifcation suite)准备上柱。在稀释期间，所述溶液总是变成雾状，将该雾浊溶液泵入柱上。这使得固体沉积在柱的上端并在纯化进行期间逐渐消蚀柱效能。使T-20在pH5的乙腈/水中脱羧数小时，以形成几乎不溶的聚集体。
已研制避免在溶液中脱羧的方法。将在室温真空下对从MTBE沉淀中作为TFA盐分离的粗品T-20进行脱羧5-7天。发现在40℃真空下3天后完成脱羧。所分离固体的TFA含量为9％。所述物质可在0℃保存长至1个月，损失1％(wt/wt)。
从MTBE分离T-20-TFA后可在乙醇/水(1∶9)与HOAc中进行盐交换。粗品T-20的乙酸盐明显更稳定并可优选。两种分离方法中的任一种都将允许在较大规模进行侧链去保护，T-20将不暴露于用于脱羧的乙腈/水/HOAc条件，已知该条件引起聚集。去保护AcAA(1-36)OH的侧链的新方法：
制备90/5/5 TFA/水/二硫苏糖醇溶液(13体积)并用氮气吹扫3分钟。在环境温度的氮气氛下将AcAA1-36NH2分批加入到90/5/5 TFA/水/二硫苏糖醇(13体积)中。一旦加入在溶液中，就在环境温度下搅拌4小时，然后冷却至0℃。为了沉淀T-20，缓慢滴加冷却至0-5℃的MTBE(45体积)，开始时将温度保持在20℃以下(加入时间约1-2小时)。真空过滤收集固体(注释1)。立即用3×5体积MTBE洗涤反应器、管道和滤饼。取出固体，取样进行t=0IPC(注释2)，真空干燥5天或直到HPLC显示无变化。注释：1．在该过滤过程中避免吸引空气通入所述固体，因为所述去保护溶
液是吸湿性的。在洗出TFA溶液前吸引空气通入固体可产生粘  性或油性固体。2．采用HPLC法TM2-0003-01(TFA法)。乙酸铵法(TM2-0006-01)不能分离各种羧化中间体。去保护AcAA(1-36)OH的侧链
在12次运行中去保护的AcAA1-36NH2总量为7.226Kg。仅制得6.972Kg AcAA1-36NH2，说明所述中间体是吸湿性的。将从MTBE流出物分离的固体溶解于10体积1∶1 ACN/水中，过滤并用碳酸氢钠调节pH至3.5。加入乙酸(1.5体积％)(pH4.5-5)，在环境温度下搅拌溶液15小时实现脱羧基作用。用25体积水稀释溶液获得总计为40体积的85/15水/ACN溶液。在所有情况下该溶液均为浑浊液，而且在部分情况下出现精细固体(聚集的T-20)。取样进行IPC，将所述溶液转移到所述纯化装置。用wt/wt HPLC分析计算所述运行的粗品T-20产量。
在室温下在90/5/5 TFA/水/DTT中4-5小时后完成AcAA1-36NH2去保护。在8小时时已发生显著的降解(2％)。在5℃在相同混合物中，在8小时时去保护未完成，而是在23小时完成去保护。在室温下5小时后与在5℃下23小时所获得的粗品T-20的纯度无差别。因为分离体积(约55体积)较反应(去保护)体积(13体积)大得多，所以必需将AcAA1-36NH2溶解在20L坛中的TFA溶液中，然后将该溶液转移到40L反应器中。
用MTBE沉淀达到从去保护混合物中分离粗品羧化型T-20(为TFA盐)。沉淀所述肽需要的MTBE量3-4倍于去保护混合物的量。使用体积分两次(或更少)的MTBE的裂解混合物使肽沉淀。MTBE加入所述裂解混合物使过滤固体容易，而把所述混合物加入MTBE产生难于过滤的精细沉淀。在MTBE加入TFA溶液期间温度从5℃升高至40-45℃。温度升高对所分离的粗品T-20的纯度没有影响(187/117,119)。在加入MTBE期间有部分成块的固体。搅拌淤浆1-2小时以分散所述团块。在MTBE加入期间将温度维持在20℃以下产生更好过滤的更均一的固体(196/31)。此后将控制加入MTBE速率。在氮气氛下过滤收集粗品T-20。在洗出TFA之前，如果在过滤期间固体暴露于潮湿的空气，所述固体将变粘。洗出TFA后，所述固体对空气是稳定的。操作方法：
在20L坛中制备90/5/5 TFA/水/二硫苏糖醇溶液(13体积)，然后用氮气吹扫3分钟。分批加入AcAA1-36NH2(650g)以防止成块。一旦所述固体在溶液中，将所述溶液转移到70L反应器中。用最小量90/5/5 TFA/水/二硫苏糖醇洗涤所述坛和管道。在环境温度下的氮气氛下搅拌溶液4小时，然后冷却至0-5℃。以使内部温度低于30℃的速率加入MTBE(45体积)。在氮气流下真空过滤收集固体。用2×2体积MTBE洗涤反应器、管道和固体，干燥至恒重(594g,70A％)。
将所述固体(594g)溶解于50％ACN/水(8体积，相对于AcAA1-36NH2装料)并过滤。用50％ACN/水(2体积)洗涤所述容器和管道。用碳酸氢钠调节溶液pH至3.5-4.0，然后加入乙酸(0.18体积)将pH调节至4.9。在环境温度下搅拌溶液15小时(IPC，注释1)，然后用1M碳酸钾调节pH至9-9.5。加入水(25体积)稀释所述溶液成为85/15水/ACN。对生成的浑浊溶液取样进行wt/wt HPLC分析，并转移到所述纯化装置。注释：1．方法TM2-0003-012．方法TM2-0006-01
11.11纯化HAA(1-36)-OH
分为纯化、冷冻干燥和包装三个阶段：
％(wt／wt)=100-杂质％-乙酸盐％-水％-TFA％。在各批中的乙酸盐含量为6-8％。
从6.97Kg AcAA1-36NH2分离的T-20总量为2.08Kg(净重)。这表示AcAA1-36NH2的产率为49.3％。T-20的色谱纯收率平均为55％。单独运行的收率变化范围为41-55％。最低的收率是因为柱或泵故障导致多次通过。一般来说，如果采用色谱法，收率范围为50-55％。所分离的T-20的纯度为93-95A％。
在纯化期间检查四个梯度，是为了比较目的在于最小化操作时间的方法：
1．15-22％ACN/60分钟，22-36％ACN/525分钟，330mL/分钟。
2．16-26％ACN/60分钟，26-40％ACN/525分钟，330mL分钟。
3．第二个三联梯度(Second Trimeris gradient)。15-36％ACN1788分钟，330mL/分钟。
4．原三联梯度(Origina Trimeris gradient),20-23％ACN/112分钟，23-36％ACN/488分钟，330mL/分钟。
用Amberchrom树脂(35cm床高)填充(轴向压缩)20厘米(cm)柱。在溶液中对各批500-700g AcAA1-36NH2进行去保护和脱羧。该规模产生含有约400g肽(约75A％T-20)的柱原料。所述原料溶液通常是混浊的并可能含有悬浮固体。用15％B以500mL/min将混浊溶液加样在柱上。对于任何操作在柱加样期间都没有压力产生。流速减少到330mL/min，在指定的时间内运行特定梯度。收集流分，合并含有超过78％的T-20的流分(100-110L)，用水稀释使乙腈含量约15-20％(约140L)。洗涤柱，然后用15％B平衡。将含T-20的溶液以900mL/min加样回所述8英寸柱上。所述％B增加至50％，冲洗出柱的T-20约25L。
将所述溶液在1L钟罩中冷冻并冻干成粉。所分离的T-20通常为92-94A％HPLC，并含有6-8％乙酸盐和3-4％水。优选方法：
将T-20的85/15水/乙腈溶液(27L)(pH9.2)以500mL/min泵入8英寸HPLC柱。在30分钟内流速降低至330mL/min(每5分钟递增30-40mL/min)。开始线性梯度，在600分钟内为20％B-36％B。收集流分直到吸光度低于0.2AUFS为止。用HPLC(注释1)分析流分中的含量。用80％B以900mL/min洗涤柱10分钟，然后降回至15％B并以900mL/min平衡。合并含有78A％以上的T-20的流分(113L)，用缓冲液(28.2L)稀释使所述乙腈浓度为15-20％。以900mL/min将溶液泵至所述柱上。％B增至50％，以900mL/min将T-20从所述柱洗脱出约25L。T-20浓度约为9-10mg/mL。将溶液转移至1L冻干罐中，冷冻并冻干获得216.29T-20，收率54.9％,94.1A％纯。注释：1．用HPLC分析流分的含量和纯度。
YMC ODS-A,150×4.6mm,5μm,120A
1mL/min,220nm,30℃
A  70/30 50mMNH4OAc(pH7，用氢氧化铵调节)：ACN
B  5:95 50mM NH4OAc(pH7，用氢氧化铵调节)：ACN
0-15％B/50分钟，15-100％B/2分钟，100％B/3分钟。
T-20保留时间：29.0分钟
11.12肽的热稳定性
进行一系列试验以特征鉴定所述中间体T-20片段的热稳定性。用水饱和T-20片段，过滤，然后置于密封容器中并暴露于高温。在数个时间点收集样品并用HPLC法分析获得纯度变化。用热解重量分析法(TGA)也可特征鉴定干燥T-20片段的稳定性。
除了AcAA1-16OH外所有片段均可以在40℃干燥3天。只在两种片段FmocAA27-35OH(3％)和FmocAA27-36NH2(1.4％)中在80℃24小时后观察到一般程度的降解。片段AcAA1-16OH开始为97A％纯。在40℃3天后，它为93.4A％纯并干燥。再在80℃24小时后，它仍然为93.9A％。应该在环境温度下干燥潮湿的AcAA1-16OH。
稳定性研究的目的是确定所述片段是否可在40℃而不是在环境温度下干燥。所述研究表明所述片段在40℃干燥是稳定的。这将显著降低干燥时间。
已完成在模拟其分离和纯化的不同溶剂和温度条件下检测片段Ac(1-16)-OH、Fmoc(27-35)-OH、Fmoc(17-26)-OH、Fmoc(27-36)-NH2、Fmoc(17-36)-NH2、H(17-36)-NH2和Ac(1-36)-NH2的研究。所有片段在其分离和/或纯化的溶剂体系中是稳定的，用X表示稳定性：
                               时间中间体           储存液          开始  1小时  6小时   1天   3天F(27-35)-OH    9∶1 EtOH∶H2O,    X      X      X      X     X
           40℃F(17-26)-OH    80∶20 EtOH/H2O,   X      X      X      X     X
           40℃F(27-36)-NH2   1∶1 NMP/H2O,     X      X      X      X     X
           40℃Ac(1-16)-OH    0.01M HCl,            X      X      X      X     X
           5-10℃F(17-36)-NH2   95％IPA/H2O,       X      X      X      X     X
           60-65℃
           50％H2O/NMP,           X      X      X      X     X
           50℃
           90∶10 EtOH/H2O,       X      X      X      X     X
           40℃H(17-36)-NH2   1.5∶1 H2O/DMF,      X      X      X      X     X
           40℃Ac(1-36)-NH2   9∶1 CAN/H2O,        X      X      X      X     X
           50℃
           50％H2O/NMP,          X      X      X      X     X
           50℃
           85∶15 EtOH∶H2O,       X      X      X      X     X
           70℃X=HPLC含量和杂质、肉眼检测外观
本发明范围不限于本文所述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案仅用来说明本发明的各个方面，而且作用上等同的方法和组分均属于本发明范围。实际上，根据以上的描述和附图，除了本文指明和描述的之外，对本发明进行的各种改进对本领域技术人员来说将是显而易见的。这类改进属于后附权利要求书范围。

Claims (28)

1．合成下式肽的方法：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQIDNO:1)，该方法包括：
(a)使式：Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)的侧链保护肽与式：NH2-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)的侧链保护肽反应，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWE-NH2(SEQ ID NO:12)；
(b)使在(a)中产生的肽的氨基末端去保护；
(c)使在(b)中产生的肽与式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽反应，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；
(d)使在(c)中产生的肽的氨基末端修饰为乙酰修饰物；和
(e)使(d)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
2．合成下式肽的方法：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，该方法包括：
(a)使式：Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)的侧链保护肽与式：NH2-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)的侧链保护肽反应，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；
(b)使在(a)中产生的肽的氨基末端去保护；
(c)使在(b)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，产生下式侧链保护肽：
Ac-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；和
(d)使(c)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
3．合成下式肽的方法：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽的氨基末端去保护：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；
(b)使在(a)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；
(c)使在(b)中产生的肽的氨基末端去保护；
(d)使在(c)中产生的肽的氨基末端修饰为乙酰修饰物；和
(e)使(d)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
4．合成具有以下化学式的肽的方法：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽的氨基末端去保护：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；
(b)使在(a)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，产生下式侧链保护肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；和
(c)使(b)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
5．权利要求3或4的方法，其中式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HPheNH2反应：
Fmoc-DKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:17)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)；
(b)使在(a)中产生的肽的氨基末端去保护；和
(c)使在(b)中产生的肽与下侧链保护肽反应式：
Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)，获得下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
6．权利要求3或4的方法，其中式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HPheNH2反应：
Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:15)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:16)；
(b)使在(a)中产生的肽的氨基末端去保护；和
(c)使在(b)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-EKNEQEL-COOH(SEQ ID NO:10)，获得下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
7．权利要求3或4的方法，其中式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式肽的氨基末端去保护：
Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:16)；和
(b)使在(a)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:10)，获得下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
8．权利要求3或4的方法，其中式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HPheNH2反应：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:19)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
9．权利要求1或3的方法，其中式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽的氨基末端去保护：
Fmoc-IEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:7)；
(b)使在(a)中产生的侧链保护肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-YTSLIHSL-COOH(SEQ ID NO:2)，获得下式侧链保护肽：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)。
10．权利要求2或4的方法，其中式：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HGlnOPNB反应：
Fmoc-IEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:6)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-IEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:7)；
(b)使在(a)中产生的侧链保护肽的氨基末端去保护；
(c)使在(b)中产生的侧链保护肽与下式侧链保护肽反应：
Ac-YTSLIHSL-COOH(SEQ ID NO:2)，产生下式侧链保护肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:4)；
(d)使在(c)中产生的侧链保护肽的羧基末端去保护，产生下式侧链保护肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)。
11．权利要求1或3的方法，其中式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HGlnOPNB反应：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:3)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:4)；和
(b)使在(a)中产生的肽的羧基末端去保护，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)。
12．合成下式肽的方法：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽的氨基末端去保护：
Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)；
(b)使在(a)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:3)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；
(c)使在(b)中产生的肽的氨基末端修饰为乙酰修饰物；和
(d)使(c)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
13．权利要求12的方法，其中式：Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HPheNH2反应：
Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH2(SEQ ID NO:8)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)。
14．合成下式肽的方法：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽的氨基末端去保护：
Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)；
(b)使在(a)中产生的肽与下式侧链保护肽反应：
Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH(SEQ ID NO:5)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；
(c)使在(b)中产生的肽的氨基末端修饰为乙酰修饰物；和
(d)使(c)的侧链保护肽的侧链去保护，产生下式肽：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
15．权利要求14的方法，其中下式：Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)的侧链保护肽用以下方法合成，该方法包括：
(a)使下式侧链保护肽与HPheNH2反应：
Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-NH2(SEQ ID NO:13)，产生下式侧链保护肽：
Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)。
16．权利要求1、2、3、4、12或14的方法，其中下式：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
17．权利要求1、2、3或4的方法，其中下式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
18．权利要求5的方法，其中下式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
19．权利要求6的方法，其中下式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
20．权利要求7的方法，其中下式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
21．权利要求8的方法，其中下式：Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
22．权利要求9的方法，其中下式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
23．权利要求10的方法，其中下式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
24．权利要求11的方法，其中下式：Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
25．权利要求13的方法，其中下式：Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
26．权利要求15的方法，其中下式：Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)的侧链保护肽以约1千克或1千克以上的产量生产。
27．一组肽片段，它包括一组选自以下的肽片段：(a)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(b)YTSLIHSLIEESQNQQ,(SEQ ID NO:4),EKNEQELLEL(SEQ ID N0:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(c)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQELLEL,(SEQ ID NO:11),   DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(d)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(e)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(f)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(g)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(h)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(i)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(j)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(k)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(l)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(m)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(n)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(o)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),   IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(p)YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3),QEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:8)；(q)YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3),QEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:9)；(r)YTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO:5),NEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:14)；(s)YTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO:5),NEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:13)；和(t)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4)EKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:19)。
28．一种选自下列肽的肽：YTSLIHSL(SEQ ID NO:2)；IEESQNQ(SEQ ID NO:6)；IEESQNQQ(SEQ ID NO:7)；QEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:8)；EKNEQEL(SEQ ID NO:1O)；EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11)；NEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:13)；LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；和EKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:19)
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