TWI233931B - Methods and compositions for peptide synthesis - Google Patents
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Description
1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（1 ) 1. 緒言 本發明首先係有關合成肽，特定言之T-20 (亦稱爲” DP-178n ; SEQ ID NO : 1 )及似T-20肽之方法。這種方法利用 固相及液相合成法來合成及組合特定肽片段之族群，產生 所需肽。本發明尚有關在所需肽（例如：T_20 )之合成法中 作爲中間物之個別肽片段。本發明尚有關這類肽中間物片 段之族群，其可共同用於生產全長度Τ-20及似Τ-20肽。本 發明尚有關純化肽之方法，特定言之Τ-20及似Τ-20肽，及 在該肽之合成法中作爲中間物之個別肽片段。 2. 背景 近來，已鑑定出許多種具有抑制融合作用相關反應之能 力，及重要的是亦具有強力抗病毒活性之肽。參見例如： 美國專利案 Nos· 5,464,933 ; 5,656,480 及 PCT 公告案 No. WO 96/19495T-20。由於此等肽已廣泛用爲例如：醫療劑，因 此需要大規模合成之能力。 雖然已有合成肤之技術（參見例如！美格勒（Mergler)等 人，1988，Tetrahedron Letters 29:4005-4008 ;美格勒等 人，1988 ，Tetrahedron Letters 29:4009-4012 ;康柏 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (Kamber)等人編輯，”肽化學及生物學”，ESCOM，莱登 (Leiden)，1992，525_526 ;及李尼克（Riniker)等人， 1993，Tetrahedron Letters 49:9307-9320)，但目前尚無可 用於大規模經濟生產容易純化之肽（如：T_20與似T-20肽） 之技術。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（2 ) 3.發明總結 本發明首先係有關合成肽，特定言之T-20 (亦稱爲"DP-178丨丨，SEQ ID NO: 1)及似T-20肽之方法。這種方法利用固 相與液相合成法來合成及組合特定肽片段之族群，以產生 所需肽。通常，本發明方法包括於固體擔體上合成T_20或 似Τ-20肽之側鏈受保護之特定肽片段中間物，受保護之片 段於溶液中偶合，形成受保護之Τ-20或似Τ-20肽，然後脱 除側鏈之保護，產生最終Τ-20或似Τ-20肽。本發明方法之 較佳具體實施例涉及合成如SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列 之T-20肽。 本發明尚有關在合成所需肽（例如：T-20 )時作爲中間物 之個別肽片段。本發明之肽片段包括（但不限於）：彼等如 下表1所示胺基酸序列者。 表1 肽編號 胺基酸序列 T_20之相應編號 之胺基酸序列 1 YTSLIHSL 1-8 2 YTSLIHSLIEESQNQ 1-15 3 YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 4 YTSLIHSLIEESQNQQEK 1-18 5 IEESQNQ 9-15 6 IEESQNQQ 9-16 7 QEKNEQELLELDKWASLWNW 16-35 8 QEKNEQELLELDKWASLWNWF 16-36 9 EKNEQEL 17-23 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----訂----- !23393 A7 B7 五、 發明説明（
胺基酸序列 T-20之相應编號 之胺基酸序列 EKNEQELLEL 17-26 EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36 NEQELLELDKWASLWNW 19-35 NEQELLELDKWASLWNWF 19-36 LELDKWASLWNW 24-35 LELDKWASLWNWF 24-36 DKWASLWNW 27-35 DKWASLWNWF 27-36 EKNEQELLELDKWASLWNW 17-35 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 本發明尚有關在合成所需肽時作爲中間物之特定肽片段 訂 唉鮮。根據本發明肽片段族群包括族群1至2 0，如下表2 户斤示。 經 央 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 2 表2 胺基酸序列 T-20之相對編 號之胺基藥產ii YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36 YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNWF 27-36 YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNW 27-35 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明説明（4 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 族群 胺基酸序列 T-20之相對編 號之胺基酸序列 4 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQ 9-15 EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36 5 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQ 9-15 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNWF 27-36 6 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQ 9-15 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNW 27-35 7 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQQ 9-16 EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36 8 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQQ 9-16 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNWF 27-36 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) €衣· 、?τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明説明（5 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 族群 胺基酸序列 T-20之相對編 號之胺基酸序列 9 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQQ 9-16 EKNEQELLEL 17-26 DKWASLWNW 27-35 10 YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 EKNEQEL 17-23 LELDKWASLWNWF 24-36 11 YTSLIHSLIEESQNQQ 1-16 EKNEQEL 17-23 LELDKWASLWNW 24-35 12 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQ 9-15 EKNEQEL 17-23 LELDKWASLWNWF 24-36 13 YTSLIHSL 1-8 IEESQNQ 9-15 EKNEQEL 17-23 LELDKWASLWNW 24-35 -8- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 A7 ___________ B7 五、發明説明（7 ) 胺基酸序列 T-20之相對編 號之胺基酸序列 20 NEQELLELDKWASLWNW 19-35 YTSLIHSLIEESQHQQ 1-16 EKNEQELLELDKWASLWNW 17-35 本發明一部份根據本發明者意外發現某些固相液相合成 反應之組合可以首度大規模製造高純度T — 20及似T-20肽， 且物料通過量高及產率高。已發現，爲固相合成法選擇本 發明特定T-20肽片段時，可發展出固相技術之高效性偶合 法，不需使用過量3倍、4倍或甚至5倍胺基酸及固相合成 法一般需要之試劑。本發明方法於本發明肽片段之固相合 成法中僅使用過量約1.5倍之胺基酸。減少胺基酸及試劑 用量之節省成本作法使得本發明方法適合大規模合成T-20 及似T-20肽。 此外，本發明並驚人地發現，在固相中，依每克固相樹 脂約0· 8至1毫莫耳之承載量，可合成某些肽片段。此承載 量顯著高於固相肽合成中典型可達到之每克樹脂025至 〇·4毫莫耳之承載範圍。此外，本發明者已發現在固相中 使用對酸超級敏感之樹脂來合成特定肽片段時，可產生特 別高純度之肽片段。不一定要採用層析技術來純化根據本 發明產生之肽片段；片段僅在使用之前簡單地經過沈澱及 /或研磨步驟，或自樹脂中得到後即直接使用。使用對酸 超級敏感之樹脂時，所合成受保護之本發明肽可自樹脂上 裂解，不會同時排除側鏈保護基團。此作法減少雜質，並 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 1233931 B7 五、發明説明（8 ) 可合成高純度之包含10個胺基酸或更多胺基酸之肽。根 據本發明方法，由根據本發明產生之高純度肽片段於溶液 相中偶合形成之T-20與似T-20肽之雜質形態主要由未偶合 之片段組成，而非由極相近之類似物組成。因此，根據本 發明方法產生之T-20與似T-20肽遠比根據一般技術產生之 肽容易純化。下文第9節中所示實例説明這種T_20全長度 肽之組合式合成法。 本發明者亦意外地發現如Τ-20及其他似Τ-20肽之肽，及 本文所述之某些肽片段可採用可在鹼性ρ Η範圍使用之高 容量材料純化。因此本發明尚有關純化肽，特定言之Τ-20 及似Τ-20肽，及在合成該肽時作爲中間物使用之個別肽片 段之方法。 3.1定義 本文採用之胺基酸代號爲一般代號且如下： 常用胺基酸縮寫 胺基酸 單一字母代號 常用縮寫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 酸 胺酸 酸 胺 酸醯胺胺酸酸胺酸酸丙酸酸酸酸 胺冬冬醯胺胺白胺胺基胺胺胺胺 丙天天麵麵組異白離苯絲蘇色路 andqehilkfstwy anpnuseuserrpr uLSLSHrlIileeyhehry aaagghillpsttt 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明説明（9 ) 4· J示之簡要説明 圖1 : T-20四片段合成法。此圖説明依下文第9 j節所示 實例合成全長度T-20之圖解，其係由上表2所示之中間肽 片段族群ό開始。 圖2 : Τ-20四片段合成法，途徑2。此圖説明另一種四 片段反應圖，其係由肽中間物族群6偶合，如上表2所 示，以合成全長度Τ-20。 圖3 : Τ-20三片段合成法，此圖説明依下文第9 j節所示 實例之反應圖，以合成全長度T_20。 圖4 : Τ-20三片段合成法，途徑2。此圖説明依下文第 9.2，9.3，9.4及9.5節所示實例之反應圖，以合成全長度 Τ-20 〇 圖5 : Τ-20二片段合成法。此圖説明由上表2所示肽中 間物族群18偶合之反應圖，以合成全長度Τ-20。 5.本發明之詳細説明 5.1 全長度肽 本發明係有關可用於合成已知爲Τ-20或稱DP-178之肽之 方法、肽片段、肽片段族群。Τ-20爲相當於HIV-Uai單離 株之穿透膜蛋白質gp 41之胺基酸殘基638至673，且具有 36個胺基酸之序列（由胺基NH2至羧基COOH末端）： nh2-ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-cooh (SEQIDN0:1) 咸了解，本發明方法、片段及片段族群與用於選擇該等 片段與片段族群之技術除了用於合成T-20外，亦可合成似 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I------^--衣！ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233931 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1Q ) T-20片段。本文採用之”似Τ-20” 一詞係指任何mv或對於 美國專利案 Nos· 5,464,933 ; 5,656,480 或 pCT 公告案 Νο. W0 96A9495中之非HIV肤；各該專利案係以提及ρ之方式 完全併入本發明。 除了上述T-20與似T-20肽外，本發明之方法、片段及片 段族群可用於合成具有經修飾之胺基酸及/或羧基末端之 肽，以T_2〇爲例，此等肽可如下式：
X-YTSLmSL 腿 QNQQE 咖 QELLELDKWASLWNWF-Z 其中X代表胺基；選自苯酉旨基、二甲基胺基蕃基續酿基 (dansyl)及T-丁氧羰基之疏水性基團；乙醯基；9_苟基一甲 氧談基（FMOC);或選自下列之大分子载體基團：脂質_ 脂肪酸共軛物，聚乙二醇，及碳水化合物；及义代表羧 基；胺基；T-丁氧羰基；對硝苄酯基；或選自下列之大分 子載體：脂質-脂肪酸共軛物，聚乙二醇及碳水化合物。 添加此等"X”與"Z”基團之技術係相關技藝習知者。 在較佳具體實施例中，本發明方法係用於合成如上式之 肽，其中X爲乙醯基，z爲醯胺基。下文第9節所示之實 例證實可由下文第5.2節所述之肽中間物偶合，成功合成 T-20肽。在較佳方法中，τ_2〇與似τ_2〇肽及中間物可採用 以非f石爲王之管枉填料純化，此等填料係爲了使承載容 I達最大私度，且包括（但不限於）：以锆爲主之填料，以 聚苯乙晞、聚丙烯酸或其他在高pH範圍（>7)下安定之聚 合物爲王之楱料。例如：在包括pH大於7之廣泛範圍 内之X不各矽化物之管柱填料爲由特索豪斯公司（T〇s〇haus， -13- 本紙張尺度適用中國ΐϋ準（CNS)A4規疋(21() χ 297 )— - --------一---裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1233931 Α7 Β7 五、發明説明（11 )
Montgomeryville，PA)出售者。填充此材料之管柱可在低 壓、中壓或高壓層析法下操作。參見例如：下文第1 〇節 所示之純化法。 5.2肽中間物 本發明涵括（但不限於）：如上表1所示明確胺基酸序列 之T-20與似T-20肽之肽片段中間物，及表2所示肽片段中 間物族群。這種肽中間物（尤指上表2所列族群）可用於生 產T-20及似T-20肽。 表1或2所列肽片段之胺基酸殘基之任一個或多個側鏈 可利用標準保漠基團保護’如：第三丁基（t_Bu )，三苯甲 基（trt)及第二丁氧羧基（b〇c)。t_Bu基團爲胺基酸殘基 Tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)及Asp(D)之較佳側鏈保護基團； 且trt基團爲胺基酸殘基His(H)，Gln(Q)，Asn(N)之較佳側 鏈保護基；且Boc基團爲胺基酸殘基Lys(K)及Trp(W)之較 佳側鏈保護基團。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成表1所列片段1、2、3及4之期間，必需保護組胺酸 殘基之側鏈，最好使用三苯甲基（trt)保護基團。若未加以 保護時，使用酸自樹脂上裂解肽片段時將會不利於與組胺 酸殘基之反應，導致肽片段降解。 較佳者，以三苯甲基（trt)保護本發明肽片段之麩醯胺殘 基。然而，最好不要保護片段1-16及9-16之羧基末端之越 δ盈胺殘基。已發現1-16片段之幾基末端上麵醯胺殘基上沒 有保護基團時，有助於1-16片段與17-36片段之反應，使 得片段之偶合結果僅出現約2 %消旋作用。此外，若希望 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） A7 1233931 B7 五、發明説明（12 ) 本發明任何肽片段在有機溶劑中之溶解度低時’可消除片 段中其他任一個或多個麩醯胺殘基之三苯甲基保護基團。 較佳者，係保護本發明各肽片段上所有天冬醯胺殘基。 外，最好以Boc基團保護色胺酸殘基。 根據上表1所列式1-18之肽之受保護之肽片段包括（但不 限於）：下表3所列化合物。 表3 肽之結構 式編號 結構式 相當於T-20之 胺基酸序列編號 la Ac-YTSLIHSL-COOH 1-8 lb FMOC-YTSLIHSL-COOH 1-8 3a Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB 1-16 3b FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB 1-16 3c Ac-YTSLfflSLIEESQNQQ-COOH 1-16 3d FMOC-YTSLIHSL1EESQNQQ-COOH 1-16 5a Ac-IEESQNQ-COOH 9-15 5b FMOC-IEESQNQ-COOH 9-15 6a nh2-ieesqnqq-opnb 9-16 6b FMOC-IEESQNQQ-OPNB 9-16 9a Ac-EKNEQEL-COOH 17-23 9b FMOC-EKNEQEL-COOH 17-23 10a Ac-EKNEQELLEL-COOH 17-26 10b FMOC-EKNEQELLEL-COOH 17-26 11a nh2-ekneqelleldkwaslwnwf-nh2 17-36 lib fmoc-ekneqelleldkwaslwnwf-nh2 17-36 14a Ac-LELDKWASLWNW-COOH 24-35 14b FMOC-LELDKWASLWNW-COOH 24-35 15a nh2-leldkwaslwnwf-nh2 24-36 15b fmoc-leldkwaslwnwf-nh2 24-36 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 1233931 A7 B7 五、發明説明（13 ) 肽之結構 式編號 結構式 相當於T-20之 胺基酸序列編號 16a Ac-DKWASLWNW-COOH 27-35 16b FMOC-DKWASLWNW-COOH 27-35 17a nh2-dkwaslwnwf-nh2 27-36 17b fmoc-dkwaslwnwf-nh2 27-36 18A FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH 17-35 上述表3所列肽之胺基酸殘基之任一個或多個側鏈可依上 述用標準側鏈保護基團如：tBu，trt及Boc保護。表3之肽 之代表性合成法示於下文第7及8節，其係採用下文第5.4 節所討論之一般技術進行。 5.3肽合成法 如上文所討論，本發明有些個別肽片段最好使用固相合 成技術製造，其他本發明之肽則最好組合使用固相及溶液 相合成技術製造，該合成法最後則生產如本文説明之T-20 或似T-20肽。然而，咸了解本發明之肽片段可利用相關技 藝習知之技術合成或製備。參見例如：克雷頓（Creighton)， 1983，蛋白質學：結構與分子原理（Proteins: Structures and Molecular Principles)，紐約 W.H.富里曼公司（界.11· Freeman and Co·，NY )，該案係以提及之方式完全併入本 文中。 本發明合成之肽亦可使連接肽之胺基酸殘基之键結爲非 肽键結。這些非肽键結可利用相關技藝上習知之反應形 成，且可包括（但不限於）：亞胺基、醋、醯肼、胺基脲、 及偶氮键，等等。 本發明另一項具體實施例中，合成含上述序列之T-20與 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1^· 訂 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（14 似T_20肽時，可於其胺基及/或羧基末端另含其他化學基 團，以便例如：加強肽之安定性、反應性及/或溶解性。 例如：可在肽之胺基末端增加疏水性基團如：苯酯基、二 甲基胺基莕基續S盛基、乙醯基或第三丁氧羧基。同樣地， 可在肽之胺基末端放置乙醯基或9-芴基甲氧羰基。（參見 上文中T-20之” X "修飾法）。此外，可在肽之羧基末端增 加疏水性基團，第三丁氧羰基，或醯胺基。同樣地，可在 肽之羧基末端放置對硝爷g旨基。（參見上述T-20之"Z，，修 飾法）。引進此等修飾法之技術係相關技藝習知者。 此外可合成立體組態改變之Τ_2〇及似Τ·20肽。例如：可 使用肽之一個或多個胺基酸殘基之D_異構物，而非一般L_ 異構物。 此外，本發明肤之至少一個胺基酸殘基可被一種習知之 非天然胺基酸殘基取代。這類變化可用於提高本發明肽之 安定性、反應性及/或溶解性。 任何合成之T-20或似T-20肽均可另具有一個與其胺基與 /或羧基末端共價鍵結之大分子載體基團。這種大分子載 體基團可包括例如：脂質·脂肪酸共軛體、聚乙二醇、碳 水化合物或其他肽。上述τ_2〇之"χ ”修飾法因此可另代表 與肤之胺基末端共價键結之上述大分子載體基團，以其他 肽基圏較佳。同樣地，上述Τ-20之” Ζ，，修飾法可另代表上 述任何大分子載體基團。 較佳者，本發明之肽片段可採用固相肽合成（spps)技 術，使用標準FM0C方法合成。參見例如：卡皮諾 -17-
本紙張尺度翻I7國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） --------；---^裝--------訂---------^9— (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1233931 A7 五、發明說明（15 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) (Carpino)等人，1970，J. Am. Chern. Soc. 92(19):5748-5749 ;卡皮諾等人，1972，J. Org. Chem. 37(22):3404-3409。在較佳具體實施例中，本發明肽片段之固相合成法 係於對酸超級敏感之固體擔體上進行，該擔體包括（但不 限於）：2-氯三苯甲基氯樹脂（參見例如：巴洛斯（Barlos) 等人，1989，Tetrahedron Letters 3〇r30V3943-3Q46 ^ Ά ά-Μ 甲基-3_甲氧苯氧丁酸樹脂（參見例如：賽柏（Seibe〇等 人，1987，Tetrahedron Letters 28Γ49):6147-6ΐ 50，及李希 特（Richter)等人，1994，Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706)。2·氯三苯甲基氯及4_羥甲基_3·甲氧苯氧丁酸二種 樹脂均可講自卡爾生化·諾瓦生化公司（〇8113丨0(：116111-Novabiochem Corp·，San Diego，CA) 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 固相肽合成法所採用樹脂之生產與承載法之一般過程將 説明於本文中。樹脂之承載法可利用例如：下列技術進 行：在反應槽中添加樹脂，以對酸超級敏感之樹脂較佳， 如：2-氯三苯甲基樹脂。使用氣化溶劑（如··二氣甲燒 (DCM))洗滌樹脂。瀝乾樹脂床，添加含在約8至1 〇倍體 積二氯乙烷（DCE)中之1.5當量胺基酸與2.7當量二異丙基 乙胺（DIEA)之溶液。應保護胺基酸之N-末端，以Fmoc較 佳，若必要或適當時，亦應保護胺基酸之側鏈。通入氮氣 攪拌混合物2小時。 應注意，需要氯化溶劑使2-氯三苯甲基樹脂適當膨脹。 雖然根據文獻指出，DCE提供之承載效率較高，但仍可改 用DCM僅微幅或不會降低其承載量。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 經 中 央 標 準 局 員 費 合 作 社 印 製 五、發明説明（16 ) 攪拌後，瀝乾樹脂床，以DCM洗滌。樹脂上之活性 以9:1 MeOH:DIEA溶液封端20至30分鐘。撕收’、土 里 树脂床瀝乾， 以DCM洗滌4次，以氮氣沖刷乾燥，產生已承载之樹浐 Fmoc爲胺基酸^末端之較佳保護基團。依所承載1胺 基酸而定，可保護或不保護其側鏈。例如：當承載下印 時，應以Boc保護其側鏈。同樣地，應以饴保^ΐη之側 鏈。然而，當i-16肽片段之合成法中承載咖時，「不 應」保護其側鏈。不一定要保護Leu之側鏈。 用於承載於樹脂上及合成肽iFm〇c保護之胺基酸不論 是否需要保護側鏈，均可來自希恩（Sean)或基因酵素 (Genzyme)公司。除了上述方法外，亦可購得已承載適當 胺基酸之樹脂。 下文第6節所示實例舉例説明樹脂製法。 可根據例如：下列技術進行固相肽合成技術：添加已 載之樹脂至反應槽中，在氮氣攪拌下，以溶劑（以二氯， k ( DCM )較佳’約1 〇倍體積較佳）處理約丨5分鐘，使樹脂 小珠膨脹。需使用DCM使2-氯三苯甲基樹脂適當膨脹e 小珠膨脹時，反應槽中之樹脂體積將成爲2倍或三倍， 曝露出活性位置並可供進行反應。待樹脂膨脹後，自反 槽中瀝乾溶劑。 以2份20%六氫吡啶之N•甲基吡咯啶酮（NMp)溶液處 理樹脂各10分鐘，可自末端胺或樹脂上脱除Fmoc ( 9-基-甲氧羰基）保護基團。每一份2〇%六氫峨淀之nMP溶 體積將依所操作之反應而定。然後以數份NMp (約1 〇倍 4
IT 承 甲 當 並 應 芴 液 體 鮮 19- 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS )八4規格（21〇><297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 五、發明説明（17 ) 積）洗滌樹脂5至7次，以排除Fmoc副產物（亦即二苯幷富 烯及其六氫吡啶加合物）及殘留之六氫吡啶。 可採用鼠目κ試驗來判斷是否完全排除Fmoc副產物及殘 留之吡啶。氯醌試驗之製法爲添加一滴飽和氯醌之甲苯溶 液至約1毫升丙酮中。取一滴洗液加至氣醌試驗溶液中， 可檢測NMP洗液。若出現藍色或紫色陽性反應，表示含 有二級胺，亦即表示仍含有Fmoc副產物及/或殘留之六氫 吡啶。重複NMP洗滌，直到不再出現藍色或紫色爲止。 同時，加至樹脂中接續胺基酸序列之羧基末端被活化以 便進行反應。各胺基酸之胺末端應使用Fmoc保護。依所 添加之胺基酸而定，可保護或不保護其側鏈。較佳者，以 t-Bu 保護tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)及 Asp(P)之側鏈，以 trt 保 護 His(H)，Gln(Q)及 Asn(N)之側鏈，及以 Boc 保護 Lys(K) 及Trp(W)之側鏈。然而，如上文曾討論，片段1-16及9-16 之幾基末端上Gin殘基之側鏈最好未受保護。不必要保護 Len或lie之側鍵。 依下列方法活化胺基酸。於室溫下，使Fm〇c保護之胺 基酸（1.5當量），1_羥基苯幷三唑水合物（hobt )(1.5當量） 及二異丙基乙胺（DIEA )(1.5當量）溶於NMP (約7.5倍體積） 中。溶液於0至5°C下冷卻，然後添加〇-苯弁三吐-卜基一 N，N，N’，N’-四甲基糖醛鑕六氟磷酸鹽（HBTU)(1.5當量）， 並攪:拌5至1 5分鐘使之溶解。活化作用必需在低溫下進 行，使胺基酸之消旋化達最低程度。HBTU爲最後加至冷 溶液中之試劑，因爲沒有HBTU時，無法進行活化及消旋 -20- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐] ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明説明（18 ) — 化。 將活化胺基酸之溶液加至瀝乾之樹脂中，以DCM (約2.5 倍體積）洗滌。由於HBTU不溶於DCM，因此應注意，胺
基酸之活化作用係於NMp中進行。然而，此時添加DCM 至反應中係爲了維持樹脂小珠適當膨脹。通入^以攪拌反 應約1小時。採用下文説明之定性茚滿三酮試驗追腙偶合 反應是否完成。 採用足性印滿三酮試驗檢測反應是否完成時，取2至2 〇 笔克樹脂樣本’以甲醇洗滌乾淨。在樣本中添加3滴76〇/〇 苯酚之乙醇，谷液’ 4或5滴〇·2 KCN之吡啶溶液，及3 滴0·28 Μ印滿二_之乙醇溶液。樣本經乙醇稀釋至約〇 5 毫升之體積，置入約75。。之加熱套中5至10分鐘。出現藍 或糸色，表π含有游離胺，表示反應尚未完全。再稀釋樣 本至約3笔升體積’以便更容易測定濃縮樣本之顏色變化 程度。 人右1小時後觀察到陽性茚滿三酮試驗結果時，再繼續偶 口反應1小時。右2小時後仍爲陽性茚滿三酮試驗結果 時，則歷乾樹脂，乂人的，Λ y、 *、、、勺1 0倍體積NMP中洗滌3次，使用1 當量活化胺基酸重複偶合反應。 若偶口循之間需儲存樹脂過夜時，樹脂床可以涯乾並 於氮氣套下覆蓋上DCM。或者，瀝乾樹脂床，於氮氣套 儲存進行下一個偶合循環之前先經DCM處理。若所 $成之片段需先儲存過夜再裂解時，應以顧洗蘇樹脂 不° NMP爲止，因爲在NMP中會顯著脱除Fmoc之保 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
1233931 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 護。 右判斷偶合反應完成時，〉歷兹谢炉 了 《粍树如，以3份（約i 〇倍 積）NMP洗滌。重複循環，繼續合成肽片段。最後一 ^ 合反應後，先後以4份（約10倍體積）ΝΜρ及4份（約二= 體積）DCM洗滌樹脂。與樹脂結合之肽則經氮氣沖刷^ 燥。 利用固相合成技術合成之肽可根據例如··下列技術製解 及單離：採用相關技藝上習知之技術，自樹脂上裂解肽。 例如：可使用1〇/。或2%三氟乙酸（TFA)之DCM溶液或1%與 2%TFA之DCM溶液組合來裂解肽。亦可使用乙酸（hdac') 裂解肽。明確之裂解試劑，溶劑及裂解所需時間將隨待裂 解之特定肽而定。裂解後，裂解部份經過標準操作法來單 離肽。典型作法爲，合併裂解部份，眞空濃縮，然後與溶 劑如··乙醇、甲醇或庚烷再組成。通常，添加水使肽沈 澱，並眞空過濾收集。或者，先研磨產物後，再單離肽。 下文第7.1至7.6節所示實例説明表i、2及/或3所示肽中 間物之固相合成法。 爲了合成全長度Τ·20肽，上表1肽中間物可共同偶合， 產生Τ-20肽。例如：上表2所列肽中間物族群可共同偶 合’產生Τ-20全長度肽。這種由中間物肽片段合成全長度 Τ-20之代表性實例示於下文第9節，且圖解説明於圖1至5 中0 在某些具體實施例中，可依照Τ-2〇之四片段合成法。” 四片段合成法Μ係指Τ-20合成圖中，由四個Τ·20中間物肤 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐 -------^---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 Α7 _ Β7 五、發明説明（2〇 ) 片段開始，採用固相與液相合成技術合成並偶合成全長度 T_20肽。上表2所示中間物肽片段族群5、6、8、9及1 2 至1 5代表較佳族群。圖1與2説明二種四片段合成法，其 利用表2肽中間物族群6合成全長度τ-20。此族群中應注 思胺基殘基36 ( Τ-20叛基1 -末端胺基酸殘基）係於片段偶 合過程中個別引進。圖1所示τ_2〇合成圖之最後結果説明 於第9 · 1節之實例中。 此外，亦可依照Τ-20之三片段合成法·”三片段合成法” 係指Τ_20合成圖由三個τ_20中間物肽片段開始，使用固相 與液相合成技術合成並偶合成全長度Τ·2〇肽。上表2所示 中間物片段族群2至4、7、1 0及1 1代表較佳之三片段族 群。圖3與4説明二種三片段合成法，其利用表2肽中間物 叙群3來合成全長度τ-20。此族群中應注意，胺基酸殘基 36 ( Τ-20羧基末端胺基酸殘基）係於片段偶合過程中個別 引進。圖3所Τ_20合成圖之最後結果説明於下文第9 1節之 實例中。圖4所示Τ_20合成圖之最後結果説明於下文第9 2 至9.5節之實例中。 另一項具體實施例中，可依照Τ-20之二片段合成法。” 二片段合成法’’係指Τ-20合成圖中，由二個Τ-20中間物肽 片段開始，採用固相及液相合成技術合成及偶合成全長度 Τ-20肽。中間物片段族群1及1 6至2 0示於上表2，代表較 佳片段族群。圖5説明利用表2肽中間物族群2 〇合成全長 度Τ-20之二片段合成法。此族群中應注意，胺基酸殘基 (Τ-20羧基末端胺基酸殘基）係於片段偶合過程中個別引 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） --------—€衣— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233931 A7 B7 五、發明説明（21 ) 進。 可採用相關技藝上習知之溶液相肽合成技術來合成本發 明之肽中間物片段。第8.1至8.U節所示實例説明表i、2 及/或3所列肽中間物之溶液相肽合成法實例。例如：pH 範圍廣（包括大於7之pH値）之以不含矽化物之管柱填料係 由特索豪斯公司（Tosohaus，Montgomeryville，PA)出售。 6.實例：樹脂Μ法 本文第6.1至6.3節説明合成氯三苯甲基樹脂之實例，其 可利用本文説明之肽及肽中間物之固相合成法。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 61 Emoc-Trp(Boc)-2-氯三笨甲某樹脂之製法 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 2-氯三苯甲基氣樹脂 -- 1.0 25 25 Fmoc-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.5 19.7 二異丙基乙胺(DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4 二氯乙烷(DCE) -- -- 250 二氯甲烷(DCM) -- -- -- 6 X 250 9:1 甲醇：DIEA 方法： 麵 -- -- 200 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 添加2-氯三苯甲基氯樹脂（25克，1當量）至500毫升肽反 應槽中，以250毫升DCM洗滌。樹脂床瀝乾，添加含於1 〇 倍體積中之Fmoc-Trp(Boc)-OH (1.5當量）與DIEA (1.7當量） 溶液。於氮通氣下攪拌混合物2小時。 樹脂床瀝乾，以250毫升DCM洗滌。以200毫升9:1 MeOH:DIEA溶液爲樹脂之活性位置進行封端作用2 0分 鐘。樹脂床瀝乾，以4 X 250毫升DCM洗滌，以氮氣沖刷 乾燥，產生34.4克承載之樹脂。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） A7 1233931 B7 五、發明説明（22 ) 進行定量HPLC分析法時，自樹脂上裂解Fmoc-胺基酸， 並相對於對照組分析。物質之HPLC分析法顯示樹脂之承 載量爲0.68毫莫耳/克。 管柱·· Phenomenox Jupiter C18 ； 30〇Α ί 5 μ 流速：1毫升/分鐘
檢測：260 nm UV 移動相：A : 0.1 % TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液 65% B等濃度 滯留時間：約1 4分鐘 6.2 Fmoc-Gln_2-氯三苯甲基樹脂之製法 ----------衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 2-氯三苯甲基氯樹脂 -- 1.0 25 25 Fmoc-Gln-OH 368.39 1.5 37.5 13. 8 -- 二異丙基乙胺(DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4 二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 75 Ν,Ν-二甲基甲醯胺(DMF) -- -- -- -- 200 二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6 X 250 9:1 甲醇：DIEA -- -- -- -- 200
、1T 方法: 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 採用含FmocGlnOH(l·5當量）與DIEA(l·7當量）之7 5毫 升DCE與200毫升DMF混合物溶液重複上文6.1所示實例所 採用之方法。添加DMF，以安定Fmoc-Gln_OH。該反應產 生33.8克承載之樹脂。假設樹脂之理論承載量爲0.74毫莫 耳/克，並以此物質繼續進行。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 1233931 B7 五、發明説明（23 ) 6.3 Fmoc-Leu-2-氯三苯甲基樹脂之製法 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 2-氯三苯甲基氯樹脂 1.0 250 250 -- Fmoc-Leu-OH 353.42 1.5 375 132.5 -- 二異丙基乙胺（DIEA) 129.25 1.7 425 55 75 二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 2000 二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6 X 150 9:1 甲醇：DIEA -- -- -- -- 1500 方法: 添加樹脂至3升肽反應槽中，以1.5升DCM洗滌。瀝乾樹 月旨床，添加含Fmoc-Leu-OH (1.5當量）與DIEA (1.7當量）之 8倍體積DCE溶液。通入氮氣攪拌2小時。 瀝乾樹脂床，以1.5升DCM洗滌。以1.5升9:1 MeOH : DIEA溶液爲樹脂之活性位置進行封端作用3 0分鐘。瀝乾 樹脂床，以4 X 1.5升DCM洗滌，以氮氣沖刷乾燥，產生 345克承載之樹脂。 自樹脂上裂解Fmoc-胺基酸，並相對於標準物進行定量 HPLC分析。物質之HPLC分析法顯示樹脂之承載率爲0.72 毫莫耳/克。 管柱：Phenomenox Jupiter C18 ; 300A ; 5# 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液 65% B等濃度 滯留時間：約8分鐘 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •i衣· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明説明（24 ) 7.實例：肽之固相合成法 下文第7.1-7.6節出示表1、2及/或3所列肽中間物之固 相合成法實例。 7.1 Fmoc-AA(l-8)-OH 片段（片段 1 b)之製法 結構式:
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-
Leu-OH ---------^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 C33H121N10O15 MW 1619.06 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc-Leu_2-氯三苯甲基樹脂 — 1.0 15.6 20.0 — Fmoc-胺基酸* — 1.5 23.4 — — 1·羥基苯幷三唑(HOBT)水合物* 153.15 0-苯幷三唑-1-基-N，N，N’，N'-四甲基糖酸鑌 1.5 23.4 3.6 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 23.4 8.9 -- 二異丙基乙胺(DIEA)* 129.25 1.5 23.4 3.0 4.1 N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)* — — — — 150 二氯甲烷(DCM)* — — — — 50 20%六氫吡啶/NMP* — — — — 2 X 200 潤洗用之NMP* -- -- — — 200(每次 洗鲦） 1%三氟乙酸(TFA)之DCM溶液 — — — — 300 0.5% TFA/DCM — — — — 200 p比啶 — — — — 乙醇 — — — — 110 水 — — 200 + 100 *每個偶合循環
、1T -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1233931 A7 B7 理論收t : 25.3克 五、發明説明（25 ) 期望收率：80-90% 實際收量:20.0克 方法 : 添加20.0 *Fm〇c_Leu-2_氯三苯甲基樹脂至1升肽反應槽 中。树脂於200毫升（約1 〇倍體積）dcm中，於氮攪拌下 處理約1 5分鐘，使小珠膨脹，然後瀝乾。 採用2 x 200毫升20%六氫吡啶之NMP液各處理1 0分 鐘’自胺末端排除Fmoc(9_芴基甲氧羰基）。然後以2〇〇毫 升（約1 〇倍體積）NMP洗滌樹脂5至7次，以排除Fmoc副產 物（二苯幷富烯及其六氫吡啶加合物）及殘留之六氫吡啶， 由氯酿試驗測得爲陰性反應爲止。 门時’使序列中接績之胺基酸（Fmoc-Seu(tBu))活化，供 於瘦基末端進行反應。於室溫下，使Fnioc保護之胺基酸 (1.5當量）、1-羥基苯幷三唑水合物（hobtk! 5當量）及二 異丙基乙胺（DIEA)( 1.5當量）溶於15〇毫升NMP (約7.5倍 體積）中。溶液於0至5°C下冷卻，然後添加hbtu ( 1.5當 量），並攪拌5至1 5分鐘使之溶解。添加活化胺基酸之溶 液至瀝乾樹脂中，以5 〇毫升（約2 5倍體積）DC1V[洗滌。以 A通氣攪拌1小時。以定性茚滿三酮試驗追踪偶合反應是 否完成。若判斷偶合反應完成後，樹脂瀝乾，以3 χ 2〇〇 毫升（1倍體積）NMP洗滌。 使用各1 · 5當量Fmoc保護之胺基酸His(trt)，Ile，Leu， Ser(tBu)，Thr(tBu)及Tyr(tBu)重複循環，供繼續合成肽片 段。最後一次偶合反應後，依序以4 X 2〇〇毫升（j 〇倍體積 -28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（26 ) NMP，4 X 200毫升（1 0倍體積）DCM洗滌樹脂。以氮氣沖 刷乾燥樹脂，產生4 2克與樹脂結合之肽。 使用300毫升1% TFA之DCM溶液，自21克樹脂上裂解 肽約2分鐘，然後使用200毫升0.5% TFA之DCM溶液裂 解。於吡啶上（與TF A呈1:1體積比）收集裂解溶離份。合 併裂解洗液，眞空濃縮至約5 0毫升體積，然後與110毫升 乙醇再組合，同時繼續濃縮，以排除殘留之DCM，至終 體積約250毫升。添加200毫升水使產物沈澱。漿物於室 溫下攪拌3 0分鐘。眞空過濾收集固體，以約100毫升水洗 滌。產物風乾，產生 20.0 克（79%) Fmoc-AA(l-8)-OH， HPLC純度爲95%。 管柱：Phenomenox Jupiter Cl8 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液，於20分鐘内，由80% B至 99% B之梯度 滯留時間：約2 3分鐘 7.2 Fmoc-AA(9_15)-OH 片段（片段5 b)之製法 結構式:
Fmoc-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-
Gln(trt)_OH
Ci 17H129N10O18 MW 1963.39 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 B7 五、發明說明（27 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc_Gln(trt)-2-氯三苯甲 基樹脂 一 1.0 12.0 20.0 -- Fmoc-胺基酸* — 1.5 18.0 — — 1-羥基苯幷三唑(HOBT)水合物> 0-苯幷三唑-1-基-N，N，N’，Nf-四甲基糖酸鑕 κ 153.15 1.5 18.0 2.8 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 18.0 6.8 — 二異丙基乙胺(DIEA)* 129.25 1.5 18.0 2.3 3.1 N-甲基_2-吡咯啶酮(NMP)* — — — — 150 二氯甲烷(DCM)* — — — — 50 20%六氫吡啶/NMP* — — -- — 2x200 潤洗用NMP* -- -- — -- 200(每次 洗)條） 裂解用DCM — — — — 160 乙酸(HOAc) — — — — 20 三氟乙醇 — ~ — — 20 庚烷 -- -- -- 250+250+ 100 甲基三級丁基醚 — — — — 100 異丙醇 — — — — 60 水 *每個偶合循環 理論收量：23.6克 期 實 望收率：89-95% 際收量：21.1克 60 + 50 方法： 使用 20.0 克 Fmoc-Gln(trt)-2·氯三 .苯甲基樹脂 ，及Fmoc保 護之胺基酸 Asn(trt)，Gln(trt) Glu(tBu)及lie重複上文第7.1節所 ，Ser(tBu)，Glu(tBu)， 示實例之方法。 最後一次偶合反應後，依序以4 X 200毫升（1 0倍體積） -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------—裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（28 ) NMP及4 X 200毫升（1 0倍體積）DCM洗滌樹脂。 使用200毫升8:1:1 DCM:TFE:HOAc裂解樹脂上之肽2小 時，然後以2 X 100毫升DCM洗滌。合併之溶出液眞空濃 縮至約100毫升體積，然後與250毫升庚烷再組合，同時 繼續濃縮排除殘留DCM至終體積約250毫升，自所形成雙 相混合物分離庚烷層。添加250毫升庚烷與100毫升MTBE 使產物沈澱，然後於室溫下研磨一夜，產生具所需堅實度 之物質。眞空過濾收集固體，以約100毫升庚烷洗滌。再 度操作產物，排除殘留之乙酸。過濾之固體溶於50°C之 60毫升異丙醇中。溶液於冰浴中冷卻至0〜5°C，然後依迅 速滴加速率添加6 0毫升水。產物漿物於冰浴中研磨攪拌 約1小時。眞空過濾分離固體，以約5 0毫升水洗滌。產物 風乾，產生 21.1 克（90%) Fmoc-AA(9-15)_OH，HPLC 純度 95% 0 管柱：Phenomenox Jupiter Cl8 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1 % TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液，於20分鐘内由80% B至 99% B之梯度 滯留時間：約2 3分鐘 7.3 Fmoc-AA (1_16)·ΟΗ 片段（片段 3 d)之製法 結構式 :
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)- -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------ς----裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（29 )
Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-OH C199H245N22O32 MW 3457.30 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc-Gln-2-氯三苯甲基樹脂 — 1.0 24.1 32.5 — Fmoc-胺基酸* — 1.5 36.2 — — 1-羥基苯幷三唑(HOBT)水合物* 〇-本弁二基_ 凡;^，^[^-四甲基糖酸鑌 153.15 1.5 36.2 5.5 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 36.2 13.7 — 二異丙基乙胺(DIEA)* 129.25 1.5 36.2 4.7 6.3 N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)* — — — — 200 二氯甲烷(DCM)* — — — — 75 20%六氫吡啶/NMP* — — — — 2x250 潤洗用NMP* __ -- — 250(每次 洗滌） 1%三氟乙酸/DCM — — — — 4x50 79.10 — — — 4x0.5 庚烷 — — — — 150 + 50 甲醇 — — — -- 50 水 *每個偶合循環 理論收量：48.9克 期望收率：85-90% 50 + 25 方法: 採用32.5毫克Fmoc-Gln-2-氯三苯甲基樹脂及所需Fmoc保 護之胺基酸重複上文第7.1節所示實例之方法。依上文第 6.1節所示實例進行反應，但稍微改變上述材料所示溶劑 之體積。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^---_-----------訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931
五、發明說明（30 ) 取後一次偶合反應後，依序以4 χ 250毫升（8倍體積） NMP，4 X 250毫升（8倍體積）DCM洗滌樹脂。樹脂於氮 氣沖刷下乾燥，產生97.4克結合之肽。 依17·7克之規模，依序使用2 χ ι9〇毫升1% tfa之dCM 溶液1至2分鐘，及1 X 120毫升DCM裂解樹脂上與樹脂結 合之肽。於说淀上（與TFA呈1:1體積比）收集裂解溶離 份。合併溶離份與樹脂’眞空濃縮至約5 〇毫升體積。添 加250毫升水使產物沈澱，於室溫下攪拌約3 〇分鐘。眞空 過濾收集固體，以約5 0毫升水洗滌。產物風乾，產生 12· 8克（84% )。再度操作產物以排除p比淀鏘鹽。過遽之固 體溶於室溫下之150毫升甲醇中。於室溫下添加2〇〇毫升 水，使產物沈澱。眞空過濾分離產物，以約5 〇毫升水洗 滌。此物質風乾，產生 12.8 克（84%) Fmoc-AA(l-16)-OH。 管柱·· Phenomenox Jupiter Cl8 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液，於20分鐘内，自75% B至 99% B之梯度 滯留時間：約2 5分鐘 7.4 Ac-AA(l-16V〇H片段（片段3 c)之製法 結構式:
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln- -33 - _____ —— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（31 )
0H C186H237N22O31 MW 3274.76 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc-Gln-2·氯三苯甲基樹脂 — 1.0 24.1 32.5 — Fmoc_胺基酸* — 1.5 36.2 — — 1-羥基苯幷三唑(HOBT)水合物* 0_苯幷三唑-1-基·Ν，Ν，Ν·，Ν’_ 四甲基糖酸鑕 153.15 1.5 36.2 5.5 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 36.2 13.7 — 二異丙基乙胺(DIEA)* 129.25 1.5 36.2 4.7 6.3 Ν-甲基-2-吡咯啶酮(ΝΜΡ)* — — — — 200 二氯甲烷(DCM)* — — — -- 75 20%六氫吡啶/ΝΜΡ* — — — — 2x250 潤洗用之ΝΜΡ* — -- — 250(每次 洗務） 1%三氟乙酸/DCM — — — — 4x50 ρ比淀 79.10 — — — 4x0.5 庚燒 — — — — 150 + 50 甲醇 — — — — 50 水 *每個偶合循環 理論收量：48.9克 期望收率：85-90% 50 + 25 方法: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 採用32.5克Fmoc-Gln_2-氯三苯甲基樹脂及所需之Fmoc保 護之胺基酸，及上文材料中所指示溶劑體積，重複上文第 7.1節所示實例之方法。 最後一次偶合反應後，依序以4 X 250毫升（8倍體積） NMP及4 X 250毫升（8倍體積）DCM洗滌樹脂。以氮氣沖 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（32 ) 刷乾燥樹脂，產生97.4克結合之肽。 依1 0克之規模，使用乙酸酐與吡啶（各5當量）於1〇〇毫 升3:1 NMRDCM中，乙醯化與樹脂結合之肽3 〇分鐘，然 後以2 X 25毫升DCM洗滌。 使用3 X 50毫升1% TFA之DCM溶液裂解樹脂上之肽， 並以2X50毫升DCM洗滌。於吡啶上（與TFA呈1:1體積比） 收集裂解之溶離份。合併溶離份與洗液，眞空濃縮至體積 約100毫升，然後分批添加3 X 5 0毫升庚垸再組合，同時 繼續濃縮，以排除殘留DCM至最終體積约15〇毫升。先有 一些膠黏之產物沈澱，但於0至5°C之冰浴中擺掉研磨約 3 0分鐘形成可過濾之固體。眞空過濾收集固體，以約5 0 毫升庚烷洗滌。產物再度操作排除吡啶鏘鹽。過濾之固體 溶於室溫下之5 0毫升甲醇中。溶液於冰浴中冷卻至〇至5 °C，然後以快速滴加速率添加5 0毫升水。物質先呈膠黏 固體沈澱，此固體於冰浴中攪拌約1小時研磨成可過濾之 堅實度。眞空過濾分離產物，以約2 5毫升水洗滌。產物 風乾，產生7.0克（90%) AcAA(l-16)-OH。產物繼續依上述 再度操作，產生6.2克（回收率89%)物質，HPLC純度 96% 〇 管柱：Zorbax LP C8，ΙΟΟΑ，20// 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 220 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B ··含 0.05% TFA之 1:1 ACN:IPA，於20 分鐘内，由 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--- 線#- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1233931 A7 B7 五、發明說明（33 ) 80% B至99% B之梯度 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 滯留時間：約1 5分鐘 7.5 Fmoc-AA(17-26)-OH 片段（片段 10b)之製法 結構式：
Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-
Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH C127H167N13O25 MW 2275.82 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc-Leu-2-氯三苯甲基樹脂 — 1.0 19.5 25.0 — Fmoc-胺基酸* — 1.5 30.0 — — 1-羥基苯幷三唑(HOBT)水合物* 0-苯幷三唑-1-基-Ν，Ν，Ν·，Ν'- 153.15 1.5 30.0 4.6 — 四甲基糖酸鑕 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 30.0 11.4 麵· 二異丙基乙胺CDIEA)* 129.25 1.5 30.0 3.9 5.2 Ν-甲基-2-吡咯啶酮(ΝΜΡ)* — — — — 200 二氯甲烷(DCM)* — — — — 75 20%六氫吡啶/ΝΜΡ* — — — — 2x250 潤洗用之ΝΜΡ* -- -- -- — 250(每次 洗滌） 1%三氟乙酸/DCM — — — — 3x400 外匕淀 79.10 — 150 — 3x4 變性乙醇 — — — -- 300 水 — — — — 300 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *每個偶合循環 理論收量：44.4克 期望收率·· 90-105% 實際收量：46.9克（105%) -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（34 ) 方法: 採用25.0克Fmoc-Leu_2-氯三苯甲基樹脂及所需之Fmoc保 護之胺基酸，及上文材料中所指示溶劑體積，重複上文第 7.1節所示實例之方法。 最後一次偶合反應後，依序以4 X 250毫升（1 0倍體積） NMP及4 X 250毫升（10倍體積）DCM洗滌樹脂。 依序使用3 X 400毫升（約15倍體積）1% TFA之DCM溶液 及1 X 200毫升（7· 5倍體積）DCM裂解樹脂上之肽。於吡啶 上（與TF A呈1:1體積比）收集裂解溶離份，然後分析溶離 份與洗液中之產物含量。合併含產物之溶離份，眞空濃縮 至約100毫升體積，然後與300毫升乙醇再組合。繼續濃 縮，以排除殘留之DCM至終體積約250毫升。在攪摔之溶 液中添加300毫升水，使產物沈澱。眞空過濾收集固體， 與約50毫升水洗滌。產物風乾，產生46.4克（105%) Fmoc-AA(17-26)-OH，HPLC 純度 97%。 管柱 Phenomenox Jupiter Cl8 流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液，於20分鐘内，自75% B至 99% B之梯度 滯留時間：約2 5分鐘 7.6 Fmoc-AA(27-35)_OH 片段（片段 16b)之製法 結構式： -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂----- 1233931 A7 B7 五、發明說明（35 )
Fmoc-Asp-(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH C121H148N14O24 MW 2182.61 材料： 分子量 當量 毫莫耳克 毫升 Fmoc-Trp(Boc)-2·氯三苯甲 基樹脂 -- 1.0 22.4 33.0 -- Fmoc-胺基酸* — 1.5 33.6 — — 1-羥基苯幷三唑(HOBT)水合物* 0-苯幷三唑-1 基-N，N，N\N’- 四甲基糖酸銪 153.15 1.5 33.6 5.1 六氟磷酸鹽(HBTU)* 379.25 1.5 33.6 12.7 ~ 二異丙基乙胺CDIEA)* 129.25 1.5 33.6 4.3 5.8 N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)* — — — — 225 二氯甲烷(DCM)* — — — ~ 75 20%六氫吡啶/NMP* — — — — 2x250 潤洗用之NMP* -- -- — — 250(每次 洗滌） 三氟乙醇 — — — — 30 裂解用之DCM — — — — 240 變性乙醇 — — — — 300，100 水 — — — — 300, 150 1%三氟乙酸(TFA)之DCM溶液 — — — -- 2X250 p比淀 79.10 -- —— — 2X2.5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *每個偶合循環 理論收量：48.9克 期望收率：85-90% 方法: 採用33.0克Fmoc-Trp(Boc)-2_氯三苯甲基樹脂及所需之 Fmoc保護之胺基酸，及上文材料中所示溶劑體積，重複 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（36 ) 上文第7.1節所示實例之方法。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 最後一次偶合反應後，依序以4 X 250毫升（7.5倍體積） NMP及4 X 250毫升（7.5倍體積）DCM洗滌樹脂。 使用300毫升（約10倍體積）8:1:1 DCM:TFE:HOAc溶液處 理2小時，裂解樹脂上之肽。瀝乾樹脂，以2 X 250毫升 DCM洗滌。合併裂解溶液與洗液，濃縮至約5 0毫升體 積，然後與250毫升乙醇再組合。溶液於冰浴中攪拌冷卻 至0-5°C。在攪;拌溶液中添加125毫升水，使產物沈澱。眞 空過濾收集固體，以約5 0毫升水洗滌。產物風乾，產生 32.(^(65.4%)Fmoc-AA(27-35)-OH，HPLC^U95%0 以2 X 250毫升1% TFA之DCM溶液處理樹脂後，以100 毫升DCM洗滌。於吡啶上（與TFA呈1:1體積比）收集裂解 溶離份。合併溶出液與洗液，濃縮至約5 0毫升體積。在 溶液中添加100毫升乙醇，然後添加150毫升水。產物漿 物眞空過濾，產生第二份10.7克（21.9%)(HPLC純度 95%)，合併之產率爲87.3%。以1°/。TFA/DCM裂解法較 佳，因爲其效率較高，體積較低。 管柱：Phenomenox Jupiter C5，300A，5# 流速：0.75毫升/分鐘 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.05% TFA水溶液 B : 0.1% ΊΤΑ 之 1:1 IPA:MeOH 溶液，於 1 0 分 鐘内，自70% B至97% B之梯度 滯留時間：約2 5分鐘 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（37 ) 8.實例：肽片段之溶液相合成法 下文第8.1-8.11節中出示表1、2及/或3所列肽中間物之 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 溶液相合成法實例。 8.1 由麩醯胺之對硝苄基酯（OPNB)與Fmoc-AA9_150H 偶合製備Fmoc-AA9-160PNB片段之方法 結構式：
Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-
Gln(trt)-Gln-OPNB C129H141N13O22 MW 2227.65 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 FmocAA9-15 OH 1963.39 1 9.7 19 — HBrGlnOPNB (BaChem，#509709) 362.19 1.1 10.6 3.85 HOAT 136 1.1 10.6 1.45 — HBTU 379.25 1.1 10.6 4.04 — EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.1 20.3 2.62 3.48 NMP — — — — 200 0.5NHC1 — — — — 250 乙酸乙酯 — — — — 250 己燒 — — — — 250 理論收量；21.5克 期望收率：90-105% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 方法 · 於含磁鐵攪摔棒之1升圓底燒瓶中合併FmocAA9-150H (如上文第7·2節所述合成），HBrGlnOPNB，HOAT及 EtPr2N，添加NMP ( 200毫升）。所得溶液置於氮大氣下， 攪拌冷卻至0_5°C。在冷卻溶液中添加HBTU。溶液於0至5 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 1233931 五、發明說明（38 ) C下攪掉1 5分鐘，離開冰浴，續檀拌2.5小時（註1 )。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 反應混合物冷卻至〇至5 °C，添加〇. 5 N HC1水溶液（250 亳升），使受保護之肽沈澱。眞空過濾收集固體，於過濾 瓶中乾燥，產生24克粗產物FmocAA9-160PNB。此固體溶 於乙酸乙酯（250毫升）中，經硫酸鎂（1 0克）脱水，過濾及 濃縮至100毫升體積。溶液冷卻至0-5°C，添加己烷（250毫 升），使產物沈澱。眞空過濾收集固體，及乾燥，產生 21.5 克 FmocAA9-160PNB，收率 100%，HPLC 純度 9卜94% (註2)。 註： 1 以薄層層析法（TLC )控制反應過程。 90/10氯仿/乙醇 U V，碘檢測法 Rt FmocAA9'150H，0.46 Rt FmocAA9-160PNB，0·57 2 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ ? 300A 0·75毫升/分鐘，260 nm
A H20/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 0分鐘内7 0至97% B，97% B 8分鐘。 檢測時間：13.3分鐘 8.2 HC1 HAA9-160PNB 片段之製法 結構式： HC1 H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)- -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（39
Gln(trt)-Gln-OPNB C144H131CIN13O20 MW 2041.02 材料: FmocAA9-160PNB 六氫p比淀 THF 甲基第三丁基醚(MTBE) 己烷 甲醇 0.5NHC1 2-丙醇 分子量當量毫莫耳£ 2227.65 1 9.43 21 毫升 10 190 250 350 150 100 50 理論收量 方法： 19.2 克 期望收率:85-105% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在含磁鐵攪拌棒之1升圓底燒瓶中，添加FmocAA9-160PNB (依上述第8.1節之方法合成）及20:1四氫呋喃/六 氫吡啶。所得溶液於室溫及氮大氣下攪拌6 0分鐘（註1 )。 添加己烷（350毫升），使肽沈澱。自黏稠固體中傾析溶 劑。固體與MTBE ( 200毫升）於室溫下研磨1 8小時。眞空 過濾收集固體及乾燥，產生18.9克HAA9-160PNB (註2)。 固體溶於甲醇（150毫升）中，攪拌冷卻至0-5°C。添加0.5 N鹽酸水溶液（100毫升），使肽沈澱。眞空過濾收集固 體，以水（5 0毫升）洗滌後，以2-丙醇（5 0毫升）洗滌，乾 燥，產生 17.7 克 HC1 HAA9-160PBN，收率 92%，HPLC 純 度 92A% (註 3)。 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------^----裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（40 ) 1 以HPLC控制反應過程 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0·75毫升/分鐘，260 nm A H2O/0.05°/〇 TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於1 0分鐘内70-97% B，97% B 8分鐘。 滯留時間：FmocAA9-160PNB，13.3 分鐘；ΗΑΑ9-160ΡΝΒ，10.7 分鐘 2 此時分離之ΗΑΑ9-160ΡΝΒ含有微量六氫吡啶及苄基 富烯六氫吡啶加合物。此二者均在與RAA1-80H偶合 之前排除。 3 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0.75毫升/分鐘，260 nm A H20/0.05% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於10分鐘内由80至100% B，100% B 5分鐘。 滯留時間：HAA9-160PNB，7.2分鐘 TLC條件： 90/10二氯甲烷/乙醇 U V，碘檢測法 Rf : HAA9-160PNB，0.64 8.3由片段AcAAl-80H與HAA9-160PNB之溶液相偶合法 製備AcAAl_160PNB之方法 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂---------線_ 1233931 A7 B7 五、發明說明（41 ) 結構式： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-OPNB C194H246N23O34 MW 3427.43 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 AcAAl-80H 1440.86 1.3 0.13 0.186 — HC1HAA9-160PNB 2041.02 1 0.10 0.204 — HBTU 379.25 1.1 0.11 0.042 — HOAT 136.1 1.1 0.11 0.015 — EtPr2N 129.25 2.1 0.21 0.027 0.036 DMF — -- — — 4.5 DMSO -- — — — 0.5 水 — — 7 MTBE 賴· __ — 3.5 理論收量；0.38 期望收率：85-105% 方法 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在含磁鐵攪拌棒之25毫升圓底燒瓶中，添加AA1-80H (依上文第7.1節所述合成），HC1 HAA9-160PNB (依上文 第8.2節所述合成）及HOAT。固體溶於含EtPr2N之9:1 DMF:DMSO ( 5毫升）中，然後於氮大氣下冷卻至〇-5°C (註 1 )。在冷溶液中添加HTBU。反應混合物於0-5 °C下攪拌 1 5分鐘後，回升至室溫，再攪拌6 0分鐘（註2 )。添加水 (7毫升），使肽自溶液中沈澱。眞空過濾收集固體，以水 (10毫升）洗滌，乾燥，產生0.36克粗產物AcAAl- -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1233931 A7 B7 五、發明說明（42 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 160PBN。此固體於室溫下與MTBE (3.5毫升）研磨1.5小 時，眞空過濾收集，乾燥，產生 0.33 5 克AcAAl-16OPNB， 收率 88%，HPLC 純度 82A% (註3)。 1 應注意，所有固體於冷卻至0至5°C及添加HBTU之前 均含在溶液中。 2 以TLC，HPLC控制反應過程 Phenomenex Jupiter，C5，5#，300A 0·75毫升/分鐘，260 nm
A H2O/0.05°/〇 TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於10分鐘内80至100% B，100% B 5分鐘。 滯留時間：HAA9-160PNB，7.2 分鐘（Acl-80H 於 260 nm下無吸光）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 滯留時間：AcAAl-160PNB，12.45 TLC條件 90/10氯仿/乙醇 U V，碘檢測法 Rf : HAA9-160PNB，0.64 Rf : Acl-80H，0.35 Rf : Acl-160H，0.48
3 Phenomenex Jupiter, C5? 5 μ , 300Α 0.75毫升/分鐘，260 nm A H20/0.05% TFA -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（43 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於10分鐘内70至97% B，97% B 8分鐘。 滯留時間：Acl-160PNB，16.4。 8.4 由片段FmocAAl-80H與HC1 HAA9-160PNB 之溶液相偶 合法製備FmocAAl-160PNB片段之方法 結構式:
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-
Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-
Gln(trt)-Gln-OPNB C207H253N23O34 MW 3607.49 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 FmocAAl-80H 1620.92 1 7.84 12.7 — HC1HAA9-160PNB 2041.02 1 7.84 16.0 — HBTU 379.25 1.2 9.42 3.57 — HOAT 136.1 1.2 9.42 1.28 EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.5 19.6 2.55 3.36 DMF _ — 250 10%氯化鈉/水(重量/體積） ~ — —— 450 甲醇 — — — — 200 水 __ __ 100 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 理論收量；28.3克 期望收率：85-100% 方法： 在含磁鐵攪拌棒之1升圓底燒瓶中添加Fm〇cAAl-80H (依上述第7.1節所述合成），HC1 HAA9-160PNB (依上述 第8.2節所述合成），HOAT及DMF (250毫升）。在溶液中 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 Α7 Β7 五、發明說明（44 ) 添加EtPr2N。溶液冷卻至〇-5°C，添加HBTU。反應混合物 於〇至5°C下攪拌15分鐘，然後回升至室溫，再攪拌70分 鐘（註1 )。反應混合物冷卻至〇-5°C，添加10%氯化鈉/水 (200毫升），使肽沈澱。眞空過濾收集固體，以水（5 0毫 升）洗滌，乾燥，產生2 7克粗產物FmocAAl-160PNB。固 體溶於甲醇（200毫升）中，加至含氯化鈉之水（10%重量/ 體積，300毫升）攪拌溶液中。眞空過濾收集固體，以水 (50毫升）洗滌，乾燥，產生26克FmocAAl-160PNB，收率 92%，HPLC 純度90A%(註1)。 註： 1 以HPLC控制反應過程
Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ ? 300Α 0.75毫升/分鐘，260 nm A H20/0.05% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於1 0分鐘内80-100% B，100% B 5分鐘。 滯留時間：HAA9-160PNB，7.2 分鐘，FmocAAl-80H，7.9 分鐘 滯留時間：FmocAAl-160PNB，14.5 分鐘 8.5 H-AA1-160PNB片段之製法 結構式： H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln- ΟΡΝΒ -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) ----------^------------訂---------線泰 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（45 ) C194H243N23032 MW 3384.41 材料： 分子量當量 毫莫耳克 毫升 FmocAAl -160PNB 3607.49 1 0.28 1.0 — 六氫吡啶 — — — 一· 0.6 二氯甲燒 — — — — 11.4 己烷 理論收量；0.94克 方法： 期望收率 :90-105% 45 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在含磁鐵攪;拌棒之50毫升圓底燒瓶中添加FmocAAl-160PNB (依上述第8.4節所述合成）、二氯甲烷（11.4毫 升），及六氫吡啶（0.6毫升）、溶液於室溫及氮大氣下攪摔 9 0分鐘（註1 )。添加己烷（4 5毫升）至反應混合物中，眞空 蒸餾減少溶劑體積至2 5毫升。眞空過濾收集所得固體， 乾燥，產生0.96克HAA1-160PNB，收率102%。固體之 HPLC分析顯示，含有72A%HAA1-160PNB及18A%富烯與 六氫p比淀-冨晞力p合物。 生： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1. Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ ? 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm A H2O/O.O5% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於10分鐘内80至100% B，100% B 5分鐘 滯留時間：FmocAAl-160PNB，14.1 分鐘 滯留時間：HAA1-160PNB，11.6分鐘 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（46 ) 滯留時間富烯與六氫吡啶-富烯加合物，5.5及4. 8分 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鐘。 8.6 由HAA1-160PNB之N-末端之乙醯化作用製備Ac-AA1-160PNB片段之方法 結構式:
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln- ΟΡΝΒ C194H246N23O34 MW 3427.43 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 HAAM60PNB 3384.41 1 0.28 0.95 — 乙酸肝（d=1.08) 102.09 3 0.84 0.086 0.080 吡啶（d=0.978) 79.1 3 0.84 0.67 0.068 DMF — — — — 10 水 — — — — 30 MTBE — — ~ —— 10 己燒 — 一 __ 10 理論收量；0.96克 期望收率：80-100% 方法 ： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在含磁鐵攪捽棒之5 0毫升圓底燒瓶中添加HAA1-160PNB (依上述第8.5節所述合成），DMF ( 1 0毫升），乙 酸酐及吡啶。反應混合物於室溫及氮大氣下攪拌6 0分鐘 (註1 )。加水（2 0毫升）使產物沈澱。眞空過濾收集固體， 以水（10毫升）洗滌，乾燥，產生0.87克AcAAl_160PNB。 爲了排除殘留之富烯及六氫吡啶-富烯加合物，使固體與 -49- P氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明說明（47 ) 1:1 MTBE /己烷（20毫升）於室溫下研磨4.5小時。眞空過 濾收集固體，乾燥，產生〇·82克AcAAl-160PNB，收率 85%，HPLC 測得純度 >90Α% (註 1 )。 註： 1 以HPLC控制反應過程
Phenomenex Jupiter, C5? 5 μ , 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm
A H2O/0.05°/〇 TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於10分鐘内80至100% B，100% B 15分鐘 滯留時間HAA卜160PNB，11.6分鐘 滞留時間AcAAl-160PNB，12.1分鐘 TLC，10%乙醇之二氣甲烷溶液 U V，碘檢測法
Rf AcAAl-160PNB，0.69 8.7 由His(trt)之存在下，選擇性排除AcAAl-160PNB之 對硝芊基保護基團製備AcAAl-160H片段之方法 結構式：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-OH C187H241N22O32 MW 3276.4 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------^-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 B7 五、發明說明（48 ) 材料: AcAAl-160PNB 10%Pd/C，狄古賽公司(Degussa) 50%水 甲酸銨 DMF 水 乙酸乙酯 己烷 甲醇 飽和NaCl水溶液 MTBE 理論收量；0.76克 方法： 分子量當量毫莫耳A 3424.86 1 0.23 0.80 毫升 63.06 15 3.5 0.30 0.22 15 120 100 44 10 5 4 期望收率:70-85% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在含磁鐵攪拌棒之2 5毫升圓底燒瓶中添加AcAAl-160PNB (依上文第8.6節所述合成）與DMF ( 1 0毫升）。在 此溶液中依序添加甲酸銨之水溶液（〇. 5毫升），及濕Pd/C (狄古賽公司，10%，50%水）。漿物於氮氣及室溫下攪拌 1 20分鐘（註1 )。漿物經緊密之寅式鹽床過濾至9 0毫升水 中。濾塊以DMF ( 5毫升）洗滌。水性懸浮液經乙酸乙酯 (100毫升）洗滌。濃縮乙酸乙酯至2 0毫升體積（註2 )。添 加己烷（4 0毫升）使之完全沈澱，自固體傾析溶劑。固體 溶於甲醇（1 0毫升）中，添加4:1水/飽和氯化納水溶液（2 5 毫升），使肽沈澱。眞空過濾收集固體，以水（1 〇毫升）洗 滌，乾燥，產生0.62克AcAAl-160H。固體與50% MTBE/ 己烷（8毫升）於室溫下研磨1 5小時，收集及乾燥，產生 0.59 克 AcAAl_160H，收率77%，HPLC測得純度 90A% (註 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----^---^------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（49 ) 註： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 以TLC控制反應過程 80/20二氯甲烷/乙醇 U V，碘檢測法
Rf : AcAAl-160PNB，0.90 Rf : Acl_160H，69 2 當減少溶劑體積時，AcAAl-160H開始沈澱。 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ ? 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm A H2〇/〇.〇5°/〇 TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 在10分鐘内由80至100% B，100% B 5分鐘 滯留時間：AcAAl-160H，10.73分鐘。 8.8 由FmocAA27-3 50H與HPheNH2之溶液相偶合法製備 FmocAA27-36NH。片段之方法 結構式：
Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-
Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2
Ci3〇Hi59Ni6〇24 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 MW 2329.64 材料·· 分子量當量毫莫耳£ Ml
FmocAA27-350H 2182.61 1 18.4 40.2 HPheNH2 162.21 1.2 22.1 3.6 HBTU 379.25 1.2 22.1 8.4 HOAT 136.1 1.2 22.1 3.0 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 Δ7 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（5Q )
EtPr2N (d=0.755) DMF 水 理論收量 42·8克 方法： 129.25 2.1 38.7 5.0 6.6 500 600 期望收率· 90-105% 在含磁鐵攪摔棒之2升圓底燒瓶中添加FmocAA27-350H (依上文第7.6節所述合成），HOAT，HpheNH2及DMF ( 500 毫升）。添加EtPr2N，溶液冷卻至0-5Ό後，添加HBTU。 反應混合物於0-5°C下攪捽1 5分鐘後，回升至室溫，再攪 拌70分鐘（註1)。溶液冷卻至0-5°C，加水（ 500毫升），使 肽沈澱。眞空過濾收集固體，以水（100毫升）洗滌，乾 燥，產生 4 3 克 FmocAA27-36NH2，收率 100%，HPLC 純度 93A% (註 2” 註： 1 以TLC控制反應過程 88/12二氯甲烷/甲醇 U V，碘檢測法 Rf : FmocAA27-350H，0.49 Rf : FmocAA27-36NH2，0.63 2 Phenomenex Jupiter，Cl8，5 μ，300A 1.0毫升/分鐘，260 nm A H20/〇.l% TFA B ACN 2 0 分鐘内 75-99% B，99% B 5 分鐘。 滞留時間：29.4分鐘 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明說明（51 ) 8.9 H-AA(27-36VNH，片段之製法 結構式： H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-
Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2 材料： Ci 15H149N16O22 MW 2106.56 分子量當量 毫莫耳 A 毫升 FmocAA(27-36)-NH2 2328.8 1.0 9.3 21.7 — 六氫p比淀 85.15 5.0 46.6 4.0 4.6 二氯甲烷(DCM) — — — — 100 水 — — — ~ 2X100 甲基第三丁基醚(MTBE) — — — — 100 + 30 理論收量 19.6克 方法： 期望收率：85_95% 在含磁鐵攪摔棒與附有氮氣套之250毫升圓底燒瓶中添 加上述第8.8節所合成之Fmoc-片段，二氯甲烷（約5倍體積） 及六氫吡啶。所得溶液於室溫下攪捽1.5小時（註1 )。 以2 X 100毫升水洗滌溶液。分層，有機層眞空濃縮至 原體積之約1/2。分批添加MTBE (2 X 50毫升），同時繼續 濃縮排除DCM至沈澱點，最終體積約150毫升。 攪拌漿物產物，於〇至5°C之冰浴中冷卻約1小時。眞空 過濾分離固體，以2X15毫升MTBE洗滌。產物風乾，產 生 17.6 克（89.6%) H-AA(27-36)NH2，HPLC 純度 95% (註 2)。 註： 1) 以HPLC追踪反應是否完成： -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------VI—----裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（52 ) 管柱：Phenomenox Jupiter C18 ； 30〇A ； 5 μ 流速^ 1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 B : 0.1% TFA乙腈溶液 於20分鐘内，75% B至99% B之梯度 滯留時間：約1 8分鐘 2) 在操作時，Fmoc副產物，二苯幷富晞及其六氫p比淀加 合物均可有效排除，然而在繼續操作該物質之前，應 進行使用試驗。若該物質無法通過使用試驗時，則重 複操作過程，使固體溶於DCM (5倍體積）中，續依上 述方法操作。 8.10 由 FmocAA17_260H 與 HAA27-36NH2之溶液相偶合 法製備FmocAA17-36NH2片段之方法 結構式：
Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-
Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-
Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe- NH2 C242H313N29O46 MW 4364.38 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^.—yl-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（53 ) 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 FmocAA17-260H 2275.82 1 9.5 21.6 HAA27-36NH2 2106.56 1 9.5 20 HOAT 136.1 1.2 11.4 1.55 HBTU 379.25 1.2 11.4 4.33 EtPr2N 129.25 2 19.0 2.46 3.25 DMF 水 400 600 2-丙醇 1100 理論收量；41.5克 期望收率 •80-85% 方法： 在含磁鐵攪拌棒之2升圓底燒瓶中添加FmocAA17-260H (依上文第7.5節合成），HAA27-36NH2 (依上文第8.9節合 成），HOAT及DMF ( 400毫升）。添加EtPr2N，於氮氣下攪 拌溶液冷卻至0至5°C，添加HBTU。反應混合物於0至5°C 下攪拌1 5分鐘，然後冷卻至室溫，再攪拌2.5小時（註 1 )。加水（500毫升）至反應混合物中，使肽沈澱（註2 )。 所得漿物攪摔4 5分鐘，眞空過濾收集固體，以水（100毫 升）洗滌。固體送回含有磁鐵攪拌棒及60°C之2升圓底燒瓶 中，添加2_丙醇（1.1升）。漿物於氮大氣下攪拌，同時冷 卻至室溫（一夜）。眞空過濾收集固體，乾燥，產生37.5克 FmocAA17_36NH2，收率 90%，HPLC 純度爲 95·5A% (註 1)。 註： 1 以HPLC控制反應過程
Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0·75毫升/分鐘，260 nm -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------—--------訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 Λ7 Α7 Β7 五、發明說明（54 )
A H2O/O.I% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 在10分鐘内，80至100% B，100% B 25分鐘。 滯留時間：FmocAA17-260H，8.2 分鐘，HAA26-36NH2， 8.4分鐘 滞留時間：FmocAA17-36NH2，13.3 分鐘 2 添加水時，反應混合物加溫至38°C。 8.11 Η-ΑΑΠ7-361ΝΗ，片段之製法 H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2 C227H303N29O44 HC1 材料: FmocAA17-(17-36)-NH2 5NNaOH (水溶液） 四氫呋喃(THF) 1NHC1 飽和NaCl (水溶液） 庚烷 分子量當量毫莫耳 A 毫升 4364.36 1.0 5.2 22.5 -- - — -- -- 55 __ — — 170 — — — — 2 X 55 -- 一 一 3 X 25 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) + 50， 200 + 50 理論收量 21.6克 期望收率：95-100% 方法: 在含空氣攪拌器及氮氣套之250毫升圓底燒瓶中添加上 文第8.10節所合成之Fmoc-片段，THF (約7·5倍體積）及5 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931
發明說明（55 N NaOH (約2.5倍體積）。得到兩相溶液，於室溫下攪摔 10至15分鐘（註1)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分層，以1 N HC1調整有機相至pH 2_3，以2 χ 55毫升 (2.5倍體積）飽和鹽水溶液洗滌溶液（註2)。分層，有機層 於15至20°C下眞空濃縮至約原體積之1/2。分批添加庚烷 (3 X 2 5毫升），同時繼續濃縮排除THF至沈澱點，最終總 體約100毫升（註2)。 " 產物漿物於皇溫下攪;拌約2小時。眞空過濾、分離固體， 以約50毫升庚烷洗滌。產物風乾，產生21 〇克（97 5%) H_ AA (17_36)NH2 〇 再度操作以排除殘留之二苯幷富烯副產物。產物於室溫 下，於200毫升庚烷中攪和成漿物3小時。物質過濾，以 約50毫升庚烷洗滌，風乾，產生20.8克（96.6%)產物， HPLC 純度 > 9 5 %。 註： 1) 以HPLC追踪反應是否完成： 管柱：Zorbax LP C8 ; 1 OOA ; 2011流速：1毫升/分鐘 檢測：UV 260 nm 移動相：A : 0.1% TFA水溶液 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B : 0.05%TFA 之 1:1ACN:IPA 溶液 於20分鐘内，80% B至99% B之梯度 滯留時間：約1 8分鐘 2) 固體先呈仍可攪摔與研磨之蠟狀膠狀物沈澱，再進一 步濃縮成可過濾之固體。 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） A7 B7 1233931 五、發明說明（56 ) 9.實例：全長度T-20肽之合成法 下文第9.1至9.5節出示利用肽中間物片段來生產全長度 T-20肽之實例。 本節所出示之實例證實固相與溶液相合成技術之成功偶 合法，以便由肽中間物片段產生全長度T-20肽。 9.1 由AcAAl-160H與HAA17_36NH2之溶液相偶合法製 備AcAA1_36NH2片段之方法 本文説明之合成途徑代表圖1與3圖解説明之T_20四片 段合成法之最後結果。若利用固相技術合成AcAAl-160H 時，則依照圖1之方法，若利用溶液相技術合成AcAAl-160H時，則依照圖3之方法。應注意，本文所合成之T-20 全長度肽具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，其胺基末端（亦 即π X ")具有乙醯基修飾，其羧基末端（亦即” Ζ π )具有醯胺 基修飾。 結構式：
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-
Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-
Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe- NH2 C414H543N51O74 MW 7411.95 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---j----裝--------訂---------線赢 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（57 ) 材料： 分子量 當量 毫莫耳 A 毫升 AcAAl-lOH 3276.4 1 0.24 0.79 HC1HAA17-36NH2 4178.56 1 0.24 1.0 HOAT 136.1 1.1 0.26 0.036 HBTU 379.25 1.0 0.95 0.25 EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.8 0.67 0.087 0.115 DMF 水 20 25 飽和NaCl 5 MTBE 10 己烷 10 理論收量 1.77克 期望收率 ：85-100% 方法： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在含磁鐵攪拌棒之100毫升圓底燒瓶中添加AcAA卜160H (依上文第7.4節，利用固相技術合成，或依上文第8.7 節，利用溶液相技術合成），HO AT，DMF ( 2 0毫升）及 EtPr2N (0.074毫升）。溶液於氮大氣下冷卻至0-5°C，添加 HBTU。溶液於0-5 °C下攪拌1 5分鐘，添加HC1 HAA17-36NH2 (依上文第8.11節合成），然後添加0.041毫升 EtPr2N。離開冷卻槽，反應混合物攪拌2小時（註1 )。添加 水（2 5毫升）及飽和氯化鈉水溶液（5毫升），使肽沈澱。眞 空過濾收集固體，以水（1 〇毫升）洗滌，乾燥，產生1.74克 粗產物AcAA1-3 6NH2 (註2)。固體與50% MTBE/己烷於室 溫下研磨2.5小時，眞空過遽收集，乾燥，產生1.70克， 收率 96%，HPLC 純度 92A%。 註： 1 以HPLC控制反應過程
Phenomenex Jupiter, C5? 5 μ , 300Α -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 訂---------線f· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 «Ί 1233931 A7 B7 五、發明說明（58 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0.8毫升/分鐘，260 nm A H2O/O.O5% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於1 0 分鐘内，8 0-100% B，100〇/〇 B 15 分鐘 滯留時間：AcAAl-160H，11.8分鐘。 滯留時間：HC1 HAA17_36NH2，12.7 分鐘。 滯留時間：AcAA1_36NH2，22.9分鐘。 2 . 水產物產生極細沈殿。需要雙重過濾。 9.2 由FmocAAl-160H與ΗΑΑ17_36ΝΗ2之溶液相偶合法 製備FmocAAl-36NH2 (Τ-20)片段之方法 本段所示實例説明由肽中間物片段使用固相與液體相合 成技術產生T-20肽之成功偶合法。特定言之，本文所述之 合成途徑代表圖4圖解説明之Τ·20三片段合成法中合成 FmocAAl-36NH2之圖解。 結構式：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-
Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-
Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-
Lys(Boc)_Trp(Boc)_Ala_Ser(tBu)-Leu_Trp(Boc)_Asn(trt)_
Trp(Boc)-Phe-NH2 C427H551N51O15 MW 7593.01 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（59 ) 材料· FmocAAl-160H HC1HAA17-36NH2 HOAT HBTU EtPr2N (d=0.755) DMF 水 2-丙醇 理論收量 0·91克 方法： 分子量 當量 毫莫耳 A 3453.89 1 0.12 0.41 4174.88 1 0.12 0.50 136.1 1.25 0.15 0.020 379.25 1.25 0.15 0.057 129.25 2.5 0.30 0.039 毫升 10 18 14 期望收率:85-100% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
在含磁鐵撗:捽棒之25毫升圓底燒瓶中添加FmocAAl-160H (依上文第7.3節所述合成），HC1 HAA17_36NH2 (依 上文第8.11節所述合成），HOAT，DMF ( 1 0毫升）及 EtPr2N。溶液於氮大氣下冷卻至0-5°C，添加HBTU。反應 混合於0-5°C下攪捽1 5分鐘後，回升至室溫，攪拌1.5小時 (註1 )。加水使肽沈澱，眞空過濾收集固體，乾燥。固體 於室溫下與2-丙醇（1 4毫升）研磨1 5小時，然後加水（3毫 升），使溶液析出所需沈澱。眞空過濾收集固體，乾燥， 產生 0.80 克 FmocAAl-36NH2，收率 88%，HPLC 純度 85A%。 註： 1) 以HPLC控制反應過程 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm A H20/0.05% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—M-----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（60 ) 於1 0 分鐘内，80-100% B，100% B 15 分鐘 滯留時間：FmocAAl-160H，11.4 分鐘。 滯留時間：HC1 HAA17_36NH2，12分鐘。 滯留時間：FmocAAl-36NH2，20,4 分鐘。 TLC，9/1二氯甲烷/乙醇 U V，碘檢測法
Rft : FmocAAl-36NH2，0.71。 9.3 HAA1-36NH，（T_20)片段之製法 本節所示實例證明由肽中間物片段利用固相與液相合成 技術生產Τ-20肽之成功偶合法。特定言之，本文説明之合 成途徑代表圖4圖解説明之三片段合成法中合成Η-ΑΑ1-36-NH2i方法。 結構式： H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-
Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-
Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe- NH2 C412H541N51O13 MW 7370.94 -63- $&尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） --------^ I ^----裝--------訂---------線赢 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233931 A7 分子量當量毫莫耳A Ml 7593.01 1 0.105 0.80 0.5 9.5 20 5 5 5 期望收率:85-95% B7 五、發明說明（61 ) 材料:
FmocAAl-36NH2 六氫p比淀 DMF 水
飽和NaCl水溶液 MTBE 己烷 理論收量 .77克 方法 ： 在含磁鐵攪拌棒之2 5毫升圓底燒瓶中添加FmocAAl-36NH2 (依上文第9·2節所述合成），DMF (9.5毫升）及六氫 吡啶（0.5毫升）。溶液於室溫及氮大氣下攪拌2小時（註1， 2 )。加水（2 0毫升）及飽和氯化鋼水溶液（5毫升），使受保 護之肽沈澱。眞空過濾收集固體，乾燥，產生0.77克 HAA1-36NH2，其含有富晞及六氫吡啶富晞加合物雜質。 固體於室溫下與50% MTBE /己烷研磨1 5小時，以排除富 烯及六氫吡啶富烯加合物。眞空過濾收集固體，乾燥，產 生 0.73 克 ΗΑΑ1·36ΝΗ2，收率 95%，HPLC 純度 90A%。 註： 1) 以HPLC控制反應過程
Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm
A H20/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於 1 0 分鐘内，8 0-100% B，100% B 15 分鐘 滯留時間：FmocAAl-360H，20.4 分鐘。 - 64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
--------訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 A7 B7 五、發明說明（62 ) 滯留時間：HC1 HAA1_36NH2，19.9 分鐘。 滯留時間：富烯與六氫吡啶-富烯加合物，5分鐘。 TLC，9/1二氯甲烷/乙醇 U V，碘檢測法
Rft : FmocAAl-36NH2，0.71。 2) 由TLC或逆相HPLC可知，產物與起始物未完全分 離。觀察㊄婦及穴鼠？比淀·适婦加合物可追踪產物之 形成。 9.4 由HAA1-3 6NH2之N-末端乙醯化作用製備AcAAI-36NH，（T-20)片段之方法 本節所示實例説明由肽中間物片段利用固相與液相合成 技術生產T-20肽之成功偶合法。特定言之，本文説明之合 成途徑代表圖4圖解説明之T-20三片段合成法中合成Ac· ΑΑ1-36_ΝΗ2之方法。 結構式=
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-
Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-
Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-
Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-
Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe- NH2 C414H543N51O74 MW 7411.95 65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線赢 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 再填寫太 材料· HAA1-36NH2 乙酸酐(d=1.08) 吡啶 Cd=0.978) DMF 水 飽和NaCl水溶液 理論收量 0.71克 1233931 A7 B7 五、發明說明（63 ) 分子量當量毫莫耳克 毫升 7370.94 1 0.096 0.71 102.09 3 0.29 0.029 0.027 79.1 6 0.58 0.046 0.046 10 17.5 7.5 期望收率:85-100% 方法: 在含磁鐵攪摔棒之25毫升圓底燒瓶中添加HAA1-36NH2 (依上文第9.3節所述合成），DMF ( 1 0毫升），六氫吡啶 (0.046毫升）及乙酸酐（0.027毫升）（註1)。溶液於室溫及 氮大氣下攪拌4小時（註2 )。加水（7.5毫升）及飽和氯化鈉 水溶液（7.5毫升），使受保護之肽沈澱。眞空過濾收集固 體，以水（1 0毫升）洗滌，乾燥，產生0.65克AcAAl-36NH2，收率91%，HPLC 純度 90A% (註3)。 註： 1) 此反應亦可使用二氯甲烷作爲溶劑。 2) 以HPLC控制反應過程 Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ , 300Α 0.8毫升/分鐘，260 nm A H20/0.05% TFA B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA 於1 0 分鐘内，80_100% B，100% B 15 分鐘 滯留時間：HAA1-360H，23.3分鐘。 滯留時間：AcAA1-36NH2，22.7分鐘。 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
--------訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233931 Δ7 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（64 ) 3) 由TLC及逆相HPLC可見，產物與起始物未完全分離0 9.5 由AcAA卜3 6NH2脱除側鏈保護基團製備T-20側鏈 本節所示實例説明由肽中間物片段利用固相與液相合成 技術生產T-20肽之成功偶合法。特定言之，本文説明之合 成途徑代表圖4所示之T-20三片段合成法。 結構式： Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln- Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu- Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2 C414H543N51O74 MW 4492.1 材料· AcAA1-36NH2 三氟乙酸 水 二硫異赤蘚糖醇 MTBE 乙腈 理論收量 157毫克 方法： 分子量當量毫莫耳克 7411.95 1 0.035 0.26 0.12 毫升 2.25 15.1 170 15 -------Ί丨-^----裝--------訂---------線赢 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 期望收率· 25-50% 使用氮氣爲90:5:5 (v/v/wt %)三氟乙酸/水/二硫異赤蘚醇 溶液脱氣，冷卻至0-5 °C。在冷卻溶液中添加AcAA1-36NH2 (依上文第9·4節所述合成）。漿物於0至5°C下攪拌 漿物至固體溶解（約5分鐘）後，回升至室溫，攪拌2.5小 67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931 A7 B7 五、發明說明（65 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 時。溶液加至0-5°C之MTBE ( 7 0毫升）中，使肽沈澱。漿 物於2200 rpm旋轉離心5分鐘，自固體中傾析MTBE。固 體再懸浮於MTBE ( 5 0毫升），於2200 rpm旋轉離心5分 鐘，傾析MTBE。再重複此方法一次，然後使固體溶於含 1體積％乙酸之1:1水/乙腈（3 0毫升）中，於室溫下保存2 4 小時（註1 )。溶液利用凍乾機冷凍乾燥，產生155毫克粗 產物T-20。經製備性HPLC純化，產生5 5毫克全長度T-20 肽，HPLC 純度 95A% (註 2)。 註： 1) 迅速排除Trp(Boc)之tBu側鏈，留下TrpCOOH。 TrpCOOH之脱複基化需要於室溫下，在乙酸水溶液中 至少2 4小時。
2) 製備性HPLC 2” YMC，120A，10//，C18 220 nm，5 0毫升/分鐘 A H2O/0-l% TFA B ACN/0.1% TFA 39-49% B/4 0 分鐘 10.實例：T-20肽之純化法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文所示實例説明在大幅提高肽純化物料通過料之條件 下純化T-20及似T-20肽之方法。 材料 採用管柱：20 X 30公分，填充Amberchrom CG-300S (特 索豪斯公司（Tosohaus; Montgomeryville，PA))，3 5 微米粒 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233931
五、發明說明（66 ) 子。 緩衝液之製法緩衝液A = 100 mM乙醯銨，以νη4〇η調至pH 8.5。 緩衝液B =乙腈。 1 以約6倍管柱體積之20% B通過管柱。 取T_20溶於85% A/15% B中，每克肽5〇至1〇〇毫升。 以2 Μ ΚΑ〇3調至pH 8_10。τ·2〇樣本中乙腈濃度不超 過 15-20% 〇 在官柱壓力追踪下，依5〇〇毫升/分鐘添加τ_2〇溶液。 添加Τ·20落液後，添加3倍管柱體積（〗〇升） A/15% Β溶液沖洗。 糸303 nm下追踪管柱溶出液，在整個添加過程中收集 /谷出液。操作期間調整波長或減弱光線，使波峯保持 在偵測尺度内。吸光度爲波長與管柱長度之函數。 依下列万式開始梯度操作（每小時變化1.6❶/。B )，操 作全程追踪壓力變化。 2. 3. 4. 5. 6. 時間（分鐘） 0 788 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 7. % B 流速（毫升/分鐘） 15 330 36 330 當開始溶離主波峯時，收集10分鐘溶離份（3.3升）。 所有T_20均應被35%B溶離出。平均收集”至…個溶 離份。溶離份保存在〇至5〇C下，直到決定收集哪一個 溶離份爲止。 8 ·收集溶離份直到檢測器吸光値小於〇 ·丨AU或直到主要 本紙張尺度適用中國國冢標準（CNS)A4是格（21〇 X 297公釐· 訂---------線i 1233931 A7 B7 五、發明說明（67 ) 屈折點落在主波峯溶出液之後爲止。 9· 各溶離份之純度係採用分析級逆相HPLC追踪。 T-20肽之溶解度在大於7之pH範圍下大得多。常用於純 化肽之管柱擔體爲以矽石爲主，因此僅可在p Η小於7之範 圍下使用，因爲矽石擔體容易在較高pH範圍下溶解。 本文説明之方法利用以聚苯乙烯爲主之樹脂擔體，其在 較寬之pH範圍下（pH 1_14)安定。此方法大幅提高管柱之 容量’使T-20物料通過量由1〇克提高至250-450克（8，，直 徑X 3 0公分管柱）。 本發明並未以本文説明之明確具體實施例限制本發明， 其僅説明本發明之個別觀點，且功能上同等之方法及成份 均在本發明範圍内。除了本文所示及説明外，相關技藝專 家們顯然可由前述説明及附圖進行本發明之各種修飾。這 些修飾法均仍在附錄之申請專利範圍内。 -----------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 準 標 國 國 中 用 適 度 尺 張 紙 _I本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Claims (1)
- 123 ^^^04562號專利申 中文申請專利範圍替換 六、申請專利範圍 1. 一種合成如下式肽之方法， Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF- nh2， 其包括： (a) 由側鏈受保護之如下式肽： Fmoc-EKNEQELLEL-COOH 與側鏈受保護之如下式肽反應： nh2-dkwaslwnwf-nh2 產生側鏈受保護之如下式肽： Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ; (b) 為（a)所製成之肽之胺基末端脫除保護基團； (c) 由（b)所製成之肽與側鏈受保護之如下式肽反應： Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH 產生側鏈受保護之如下式肽： Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ； (d) 修飾（c)所製成之肽之胺基末端，形成乙醯基修 飾；及 (e) 為側鏈受保護之（d)之肽之側鏈脫除保護基團，產 生如下式肽： Ac-YTSLIHSLffiESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF.NH2 ° 2. —種合成如下式肽之方法： Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-nh2， 其包括： (a)由侧鏈受保護之如下式肽： Fmoc-EKNEQELLEL-COOH 57764-931220.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1233931 Λβ Β8 C8 D8 穴、申請專利範圍 與側鏈受保護之如下式肽反應： nh2-dkwaslwnwf-nh2 產生側鏈受保護之如下式肽： Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ; (b) 為（a)所製成之肽之胺基末端脫除保護基團； (c) 由（b)所製成之肽與側鏈受保護之如下式肽反應： Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH 產生侧鏈受保護之如下式肽： Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ;及 (d) 由側鏈受保護之（C)之肽之側鏈脫除保護基團，產 生如下式肽： Ac-YTSLIHSLffiESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 ° 3. —種用於實施如申請專利範圍第1或2項之方法之一組肽 片段，其包含選自以下所組成之群之一組： (a) YTSLIHSLIEESQNQQ， EKNEQELLELDKWASLWNWF ； (b) YTSLIHSLIEESQNQQ， EKNEQELLEL， DKWASLWNWF ； (c) YTSLIHSLIEESQNQQ EKNEQELLEL， DKWASLWNW ； (d) YTSLIHSL IEESQNQ， 57764-931220.DOC ~ - 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1233931 々、申請專利範圍 EKNEQELLELDKWASLWNWF ； (e) YTSLIHSL IEESQNQ， EKNEQELLEL， DKWASLWNWF ； (f) YTSLIHSL IEESQNQ， EKNEQELLEL， DKWASLWNW ； (g) YTSLIHSL IEESQNQQ， EKNEQELLELDKWASLWNWF ； (h) YTSLIHSL IEESQNQQ， EKNEQELLEL， DKWASLWNWF ； (i) YTSLIHSL IEESQNQQ， EKNEQELLEL， DKWASLWNW ； (j) YTSLIHSLIEESQNQ QEKNEQELLELDKWASLWNW ； (k) YTSLIHSLIEESQNQ QEKNEQELLELDKWASLWNWF。 57764-931220.DOC — _ 3 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)
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