JP2000327700A - ペプチドの合成法 - Google Patents
ペプチドの合成法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来成功率が低かった、固相合成法のみを使
用する５０残基以上の長鎖ペプチドの化学合成を、高い
成功率で簡便に行うための新規な方法を提供する。 【解決手段】 ペプチドを固相合成法により化学合成す
る方法において、合成しようとするペプチドのＣ末端ア
ミノ酸誘導体が予め結合している担体樹脂を処置する方
法であって、該担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程を含むことを特徴と
する方法。
用する５０残基以上の長鎖ペプチドの化学合成を、高い
成功率で簡便に行うための新規な方法を提供する。 【解決手段】 ペプチドを固相合成法により化学合成す
る方法において、合成しようとするペプチドのＣ末端ア
ミノ酸誘導体が予め結合している担体樹脂を処置する方
法であって、該担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程を含むことを特徴と
する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、ペプチドの化学
合成方法の改良に関する。
合成方法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】人工ペプチドを調製する主な方法には、
化学的にアミノ酸を連結していく化学合成法と、目的の
ペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
を調製して宿主細胞等に発現させる遺伝子組換え法があ
る。化学合成法用の自動機器が発達・普及したことによ
り、オリゴペプチドの合成については、その迅速性から
化学合成法による合成が日常的に行われるようになって
いる。しかしながら、全自動合成機による化学合成１回
で通常の使用に耐えるポリペプチドを合成できる長さは
５０残基程度までであった（蛋白質・核酸・酵素 39, 3
56-363 (1994)）。それ以上の長いポリペプチドを合成
しようとする場合は、全自動合成機による通常の化学合
成では成功率が低く効率が悪いため、手間がかかるのを
承知で初めから遺伝子組換え法が選択されるか、もしく
はまず短い部分ペプチド（セグメント）を合成してか
ら、それらを側鎖保護基が付いた状態でカップリングさ
せることにより結合させていく、セグメント縮合法（蛋
白質・核酸・酵素40, 304-316 (1995)およびTetrahedron
Lett. 38, 3293-3296）が用いられる。しかしながら、
遺伝子組換え法で天然に存在しない５０残基以上の長さ
のポリペプチドを調製するためには、まずそれをコード
する１５０ヌクレオチド以上のＤＮＡを人工合成しなけ
ればならず、そのうえＤ体のアミノ酸や天然に存在しな
いアミノ酸誘導体を含むペプチドなどは、遺伝子組換え
法では調製不可能である。また、セグメント融合法も、
前述したように複数の工程を必要とするうえ、各セグメ
ントのＣ末端アミノ酸がGly, Proなど特定のアミノ酸に
なるようにセグメントを設計するなどの工夫をしないと
セグメント同士の縮合時にラセミ化が起こりやすいとい
う欠点を有するため、そのようなセグメントの設計が困
難なペプチドの場合には効率の高い方法とはいえない。
それゆえ、全自動合成機で５０残基以上の長さのポリペ
プチドを合成するための簡便な方法の開発が望まれてい
た。
化学的にアミノ酸を連結していく化学合成法と、目的の
ペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
を調製して宿主細胞等に発現させる遺伝子組換え法があ
る。化学合成法用の自動機器が発達・普及したことによ
り、オリゴペプチドの合成については、その迅速性から
化学合成法による合成が日常的に行われるようになって
いる。しかしながら、全自動合成機による化学合成１回
で通常の使用に耐えるポリペプチドを合成できる長さは
５０残基程度までであった（蛋白質・核酸・酵素 39, 3
56-363 (1994)）。それ以上の長いポリペプチドを合成
しようとする場合は、全自動合成機による通常の化学合
成では成功率が低く効率が悪いため、手間がかかるのを
承知で初めから遺伝子組換え法が選択されるか、もしく
はまず短い部分ペプチド（セグメント）を合成してか
ら、それらを側鎖保護基が付いた状態でカップリングさ
せることにより結合させていく、セグメント縮合法（蛋
白質・核酸・酵素40, 304-316 (1995)およびTetrahedron
Lett. 38, 3293-3296）が用いられる。しかしながら、
遺伝子組換え法で天然に存在しない５０残基以上の長さ
のポリペプチドを調製するためには、まずそれをコード
する１５０ヌクレオチド以上のＤＮＡを人工合成しなけ
ればならず、そのうえＤ体のアミノ酸や天然に存在しな
いアミノ酸誘導体を含むペプチドなどは、遺伝子組換え
法では調製不可能である。また、セグメント融合法も、
前述したように複数の工程を必要とするうえ、各セグメ
ントのＣ末端アミノ酸がGly, Proなど特定のアミノ酸に
なるようにセグメントを設計するなどの工夫をしないと
セグメント同士の縮合時にラセミ化が起こりやすいとい
う欠点を有するため、そのようなセグメントの設計が困
難なペプチドの場合には効率の高い方法とはいえない。
それゆえ、全自動合成機で５０残基以上の長さのポリペ
プチドを合成するための簡便な方法の開発が望まれてい
た。
【０００３】ところで、固相法でペプチドを合成する場
合、固相合成用担体樹脂に導入されているアミノ酸誘導
体の量が多いと、ペプチド鎖が相互に接近して生長する
確率が高くなり、互いに絡み合って末端アミノ基の反応
性が次第に低下するため、合成しようとするペプチドの
分子量と、樹脂に導入すべきアミノ酸のモル数は反比例
するという理論が開示されている（生化学実験講座 蛋
白質の化学IV ｐ421、日本生化学会編、東京化学同人
（1977））。しかしながら、この理論が知られて既に２
０年以上経過しているにもかかわらず、実際に担体樹脂
に導入するアミノ酸誘導体の比率を低くしたり、または
アミノ酸誘導体が導入された担体樹脂上の一部アミノ酸
誘導体を不活性化するなどして、５０残基以上のペプチ
ド合成を簡便に行うことに成功した例は知られていな
い。
合、固相合成用担体樹脂に導入されているアミノ酸誘導
体の量が多いと、ペプチド鎖が相互に接近して生長する
確率が高くなり、互いに絡み合って末端アミノ基の反応
性が次第に低下するため、合成しようとするペプチドの
分子量と、樹脂に導入すべきアミノ酸のモル数は反比例
するという理論が開示されている（生化学実験講座 蛋
白質の化学IV ｐ421、日本生化学会編、東京化学同人
（1977））。しかしながら、この理論が知られて既に２
０年以上経過しているにもかかわらず、実際に担体樹脂
に導入するアミノ酸誘導体の比率を低くしたり、または
アミノ酸誘導体が導入された担体樹脂上の一部アミノ酸
誘導体を不活性化するなどして、５０残基以上のペプチ
ド合成を簡便に行うことに成功した例は知られていな
い。
【０００４】一方、ペプチドの化学合成時に、あるアミ
ノ酸の結合反応が不完全だったアミノ酸誘導体に次のア
ミノ酸が結合してしまうと、目的のアミノ酸配列とは似
て非なる（１乃至数残基だけ欠失したような）ペプチド
が合成される確率が高くなり、後の精製の妨げとなる。
それを防止するため、化学合成法においては、それぞれ
のアミノ酸誘導体を連結させる工程の後に、連結反応の
起こらなかったα―アミノ基を過剰量の無水酢酸等を用
いて不活性化（ブロッキング）することにより、該不活
性化α−アミノ基からはそれ以上ペプチド伸長反応が進
まないようにする、という工程が含まれている（Athert
on, E. and Sheppard, R. C. (1989) Solid phase pept
ide synthesis ; a practical approach. IRL Press, O
xford.および生化学実験講座 蛋白質の化学IV ｐ44
9、日本生化学会編、東京化学同人（1977））。しかし
ながら、このブロッキング操作を、アミノ酸誘導体を連
結させる工程の前に行って、予め担体樹脂上の伸長反応
が可能なアミノ酸誘導体の一部を不活性化した例は知ら
れていない。
ノ酸の結合反応が不完全だったアミノ酸誘導体に次のア
ミノ酸が結合してしまうと、目的のアミノ酸配列とは似
て非なる（１乃至数残基だけ欠失したような）ペプチド
が合成される確率が高くなり、後の精製の妨げとなる。
それを防止するため、化学合成法においては、それぞれ
のアミノ酸誘導体を連結させる工程の後に、連結反応の
起こらなかったα―アミノ基を過剰量の無水酢酸等を用
いて不活性化（ブロッキング）することにより、該不活
性化α−アミノ基からはそれ以上ペプチド伸長反応が進
まないようにする、という工程が含まれている（Athert
on, E. and Sheppard, R. C. (1989) Solid phase pept
ide synthesis ; a practical approach. IRL Press, O
xford.および生化学実験講座 蛋白質の化学IV ｐ44
9、日本生化学会編、東京化学同人（1977））。しかし
ながら、このブロッキング操作を、アミノ酸誘導体を連
結させる工程の前に行って、予め担体樹脂上の伸長反応
が可能なアミノ酸誘導体の一部を不活性化した例は知ら
れていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】 本発明の第一の目的
は、従来成功率が低かった、固相合成法のみを使用する
長鎖ペプチドの化学合成を、高い成功率で簡便に行うた
めの新規な方法を提供することにある。
は、従来成功率が低かった、固相合成法のみを使用する
長鎖ペプチドの化学合成を、高い成功率で簡便に行うた
めの新規な方法を提供することにある。
【０００６】本発明の第二の目的は、上記方法を含むペ
プチドの合成方法を提供することにある。
プチドの合成方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】 本発明は、（１） ペ
プチドを固相合成法により化学合成する方法において、
合成しようとするペプチドのＣ末端アミノ酸誘導体が予
め結合している担体樹脂を処置する方法であって、該担
体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の
一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性化す
る処置を施す工程を含むことを特徴とする方法、（２）
担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導
体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性
化する処置を施す工程が、合成しようとするペプチドの
Ｃ末端から２番目のアミノ酸誘導体を結合させる反応の
前に行われることを特徴とする、（１）記載の方法、
（３） 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ
酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加により
不活性化する処置を施す工程が、該α−アミノ基のアセ
チル化であることを特徴とする、（１）または（２）記
載の方法、（４） 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可
能なアミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の
付加により不活性化する処置を施す工程が、該担体樹脂
を無水酢酸を含む溶液に接触させる工程であることを特
徴とする、（３）記載の方法、（５） 担体樹脂上のペ
プチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の一部のα−ア
ミノ基を、保護基の付加により不活性化する処置を施す
工程が、該担体樹脂を無水酢酸を含む溶液に０乃至３０
℃で１０乃至３０分間接触させる工程であることを特徴
とする、（３）または（４）に記載の方法、（６） 担
体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の
一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性化す
る処置を施す工程が、該担体樹脂を無水酢酸を含む溶液
に室温で３０分間接触させる工程であることを特徴とす
る、（３）乃至（５）のいずれか一つに記載の方法、
（７） （１）乃至（６）のいずれか一つに記載の方法
を含むことを特徴とする、ペプチドの合成方法、に関す
る。
プチドを固相合成法により化学合成する方法において、
合成しようとするペプチドのＣ末端アミノ酸誘導体が予
め結合している担体樹脂を処置する方法であって、該担
体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の
一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性化す
る処置を施す工程を含むことを特徴とする方法、（２）
担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導
体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性
化する処置を施す工程が、合成しようとするペプチドの
Ｃ末端から２番目のアミノ酸誘導体を結合させる反応の
前に行われることを特徴とする、（１）記載の方法、
（３） 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ
酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加により
不活性化する処置を施す工程が、該α−アミノ基のアセ
チル化であることを特徴とする、（１）または（２）記
載の方法、（４） 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可
能なアミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の
付加により不活性化する処置を施す工程が、該担体樹脂
を無水酢酸を含む溶液に接触させる工程であることを特
徴とする、（３）記載の方法、（５） 担体樹脂上のペ
プチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の一部のα−ア
ミノ基を、保護基の付加により不活性化する処置を施す
工程が、該担体樹脂を無水酢酸を含む溶液に０乃至３０
℃で１０乃至３０分間接触させる工程であることを特徴
とする、（３）または（４）に記載の方法、（６） 担
体樹脂上のペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の
一部のα−アミノ基を、保護基の付加により不活性化す
る処置を施す工程が、該担体樹脂を無水酢酸を含む溶液
に室温で３０分間接触させる工程であることを特徴とす
る、（３）乃至（５）のいずれか一つに記載の方法、
（７） （１）乃至（６）のいずれか一つに記載の方法
を含むことを特徴とする、ペプチドの合成方法、に関す
る。
【０００８】本発明者らは、固相合成に用いられている
担体樹脂に予め導入されているＣ末端アミノ酸のα−ア
ミノ基を一部アセチル基でブロックし、樹脂上に合成さ
れるペプチドの割合を減らしてから長鎖ペプチドを合成
することを試みた結果、従来の方法よりも高い成功率で
効率よく長鎖ペプチドを合成することに成功し、本発明
を完成させた。
担体樹脂に予め導入されているＣ末端アミノ酸のα−ア
ミノ基を一部アセチル基でブロックし、樹脂上に合成さ
れるペプチドの割合を減らしてから長鎖ペプチドを合成
することを試みた結果、従来の方法よりも高い成功率で
効率よく長鎖ペプチドを合成することに成功し、本発明
を完成させた。
【０００９】本発明において「アミノ酸誘導体」とは、
ペプチドの化学合成用原料として使用される、保護基が
付加されたアミノ酸分子をいう。例えば、Fmoc法用のア
ミノ酸誘導体としては、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pmc)、Fmo
c-Asn(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gl
n(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)、F
moc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Met、Fmoc-P
he、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-T
rp(Boc)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Val（（ ）内は残基部
分の反応基を保護する保護基を表す）等が挙げられる。
ペプチドの化学合成用原料として使用される、保護基が
付加されたアミノ酸分子をいう。例えば、Fmoc法用のア
ミノ酸誘導体としては、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pmc)、Fmo
c-Asn(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gl
n(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)、F
moc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Met、Fmoc-P
he、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-T
rp(Boc)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Val（（ ）内は残基部
分の反応基を保護する保護基を表す）等が挙げられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】 本発明の方法は、当該技術分野
における通常のペプチド合成方法である固相合成法の初
期の工程において、目的とするペプチドが合成されてい
く基礎となる担体樹脂に、予め該樹脂上に合成されるペ
プチドの密度が通常よりも実質的に低くなるように前処
置を施しておくことを特徴とするものである。
における通常のペプチド合成方法である固相合成法の初
期の工程において、目的とするペプチドが合成されてい
く基礎となる担体樹脂に、予め該樹脂上に合成されるペ
プチドの密度が通常よりも実質的に低くなるように前処
置を施しておくことを特徴とするものである。
【００１１】本発明の方法は、本発明の技術分野におい
て通常用いられている固相合成法であればいずれの方法
にも適用できるが、特にFmoc法およびBoc法に好ましく
適用でき、Fmoc法に最も好ましく適用できるが、これら
に限定されない。さらにFmoc法の合成方法としては、樹
脂とアミノ酸を容器に入れて攪拌して反応させるバッチ
法と、樹脂をカラムに詰めてアミノ酸を流して反応させ
る連続フロー法があり、いずれの場合にも本発明の方法
を適用することが可能であるが、バッチ法が好適であ
る。
て通常用いられている固相合成法であればいずれの方法
にも適用できるが、特にFmoc法およびBoc法に好ましく
適用でき、Fmoc法に最も好ましく適用できるが、これら
に限定されない。さらにFmoc法の合成方法としては、樹
脂とアミノ酸を容器に入れて攪拌して反応させるバッチ
法と、樹脂をカラムに詰めてアミノ酸を流して反応させ
る連続フロー法があり、いずれの場合にも本発明の方法
を適用することが可能であるが、バッチ法が好適であ
る。
【００１２】これら固相合成法において用いられる担体
樹脂としては、予めＣ末端アミノ酸誘導体が導入された
形態で市販されている固相合成法用の担体樹脂であれば
いずれも好ましく使用できる。それら既製の市販担体樹
脂に導入されているアミノ酸誘導体の量（導入率）は、
合成法や樹脂の特性および粒径等の要因によりそれぞれ
異なっている（樹脂１ｇあたり０．０７乃至１ｍｍｏ
ｌ）が、いずれも自動合成機で通常容易に合成される５
０残基未満のペプチドを合成するために最適化されたも
のである。そのような担体樹脂については、例えば、Fm
oc法に用いられる担体樹脂としてWang樹脂および２−ク
ロロトリチル樹脂（以上バッチ法用）；ＫＡ樹脂および
ＰＡ樹脂（以上連続フロー法用）；ＴＧＴ樹脂およびＴ
ＧＡ樹脂（以上バッチ法および連続フロー法用）を挙げ
ることができるが、これらに限定されない。また、Boc
法に用いられる樹脂としては、メリフィールド樹脂およ
びＰＡＭ樹脂等を挙げることができるが、これらに限定
されない。なお、上記に例示した担体樹脂についてはい
ずれも、合成しようとする任意のペプチドに適用できる
ように、種々のアミノ酸誘導体が導入されたものが、例
えばカルビオケム−ノバビオケムジャパン（株）社より
入手可能である。
樹脂としては、予めＣ末端アミノ酸誘導体が導入された
形態で市販されている固相合成法用の担体樹脂であれば
いずれも好ましく使用できる。それら既製の市販担体樹
脂に導入されているアミノ酸誘導体の量（導入率）は、
合成法や樹脂の特性および粒径等の要因によりそれぞれ
異なっている（樹脂１ｇあたり０．０７乃至１ｍｍｏ
ｌ）が、いずれも自動合成機で通常容易に合成される５
０残基未満のペプチドを合成するために最適化されたも
のである。そのような担体樹脂については、例えば、Fm
oc法に用いられる担体樹脂としてWang樹脂および２−ク
ロロトリチル樹脂（以上バッチ法用）；ＫＡ樹脂および
ＰＡ樹脂（以上連続フロー法用）；ＴＧＴ樹脂およびＴ
ＧＡ樹脂（以上バッチ法および連続フロー法用）を挙げ
ることができるが、これらに限定されない。また、Boc
法に用いられる樹脂としては、メリフィールド樹脂およ
びＰＡＭ樹脂等を挙げることができるが、これらに限定
されない。なお、上記に例示した担体樹脂についてはい
ずれも、合成しようとする任意のペプチドに適用できる
ように、種々のアミノ酸誘導体が導入されたものが、例
えばカルビオケム−ノバビオケムジャパン（株）社より
入手可能である。
【００１３】本発明の好ましい態様においては、まず、
Ｃ末端アミノ酸誘導体が予め導入された形態で市販され
ているこれら固相合成法用の担体樹脂の該Ｃ末端アミノ
酸誘導体の全てのα−アミノ基の保護基を通常の方法で
はずしておいてから、次に該担体樹脂上のペプチド伸長
反応が可能なアミノ酸誘導体の密度を実質的に低下させ
る処置が施される。この処置は、結果的にペプチド伸長
の初期の段階、すなわち数残基伸長されるまでに行われ
ればよいが、好ましくは最初のペプチド伸長反応開始前
に行われる。また、ペプチド伸長反応が可能なアミノ酸
誘導体の密度を実質的に低下させる処置は、ペプチド伸
長反応が可能なアミノ酸誘導体の数が、未処置の場合と
比較して５乃至５０％、好ましくは１０乃至４０％、よ
り好ましくは１５乃至３０％となるようなもので、か
つ、その後の伸長反応の諸段階において、伸長反応が不
可能となったアミノ酸誘導体と伸長反応用の試薬とが相
互に影響を与えないようなものであればよい。このう
ち、最も好適なのは、Ｃ末端アミノ酸誘導体のα−アミ
ノ基を保護して不活性化する方法（以下「ブロッキン
グ」という）である。
Ｃ末端アミノ酸誘導体が予め導入された形態で市販され
ているこれら固相合成法用の担体樹脂の該Ｃ末端アミノ
酸誘導体の全てのα−アミノ基の保護基を通常の方法で
はずしておいてから、次に該担体樹脂上のペプチド伸長
反応が可能なアミノ酸誘導体の密度を実質的に低下させ
る処置が施される。この処置は、結果的にペプチド伸長
の初期の段階、すなわち数残基伸長されるまでに行われ
ればよいが、好ましくは最初のペプチド伸長反応開始前
に行われる。また、ペプチド伸長反応が可能なアミノ酸
誘導体の密度を実質的に低下させる処置は、ペプチド伸
長反応が可能なアミノ酸誘導体の数が、未処置の場合と
比較して５乃至５０％、好ましくは１０乃至４０％、よ
り好ましくは１５乃至３０％となるようなもので、か
つ、その後の伸長反応の諸段階において、伸長反応が不
可能となったアミノ酸誘導体と伸長反応用の試薬とが相
互に影響を与えないようなものであればよい。このう
ち、最も好適なのは、Ｃ末端アミノ酸誘導体のα−アミ
ノ基を保護して不活性化する方法（以下「ブロッキン
グ」という）である。
【００１４】このブロッキングに用いられる試薬は、ア
ミノ酸誘導体のフリーのα−アミノ基のみと反応してこ
れを保護し、かつその保護基が以後の合成反応で除去さ
れないようなものであればよい。本発明においては、そ
のような試薬としては、α−アミノ基をアセチル基で保
護する無水酢酸が最も好適であり、また他のアミノ保護
基を与えるもの、例えばフルオレサミン、塩化メタンス
ルホニル、３−ニトロフタル酸無水物等も使用可能であ
るが、これらに限定されない。
ミノ酸誘導体のフリーのα−アミノ基のみと反応してこ
れを保護し、かつその保護基が以後の合成反応で除去さ
れないようなものであればよい。本発明においては、そ
のような試薬としては、α−アミノ基をアセチル基で保
護する無水酢酸が最も好適であり、また他のアミノ保護
基を与えるもの、例えばフルオレサミン、塩化メタンス
ルホニル、３−ニトロフタル酸無水物等も使用可能であ
るが、これらに限定されない。
【００１５】ブロッキングの際の温度は、使用される担
体樹脂や試薬の種類によって変化しうるが、０乃至３０
℃の範囲であればよく、好適には２０乃至３０℃の範囲
内であり、通常は室温である。また、ブロッキング反応
の時間も使用される担体樹脂や試薬の種類、反応温度等
によって変化しうるが、Fmoc法用担体樹脂上のＣ末端ア
ミノ酸誘導体のα−アミノ基を、室温中、無水酢酸を含
有するブロッキング反応液でアセチル化する場合は、１
０乃至３０分間が好適であり、３０分間が最も好適であ
る（さらにこの場合、ブロッキング反応液はｐＨ７以上
の弱アルカリであることが好ましい）。
体樹脂や試薬の種類によって変化しうるが、０乃至３０
℃の範囲であればよく、好適には２０乃至３０℃の範囲
内であり、通常は室温である。また、ブロッキング反応
の時間も使用される担体樹脂や試薬の種類、反応温度等
によって変化しうるが、Fmoc法用担体樹脂上のＣ末端ア
ミノ酸誘導体のα−アミノ基を、室温中、無水酢酸を含
有するブロッキング反応液でアセチル化する場合は、１
０乃至３０分間が好適であり、３０分間が最も好適であ
る（さらにこの場合、ブロッキング反応液はｐＨ７以上
の弱アルカリであることが好ましい）。
【００１６】ブロッキング処理はブロッキング反応液を
洗浄除去することにより終了させることができる。例え
ば、担体樹脂を、ブロッキング反応液に対して安定なろ
過膜（ポリテトラフルオロエチレン膜等）を用いてろ過
後、溶媒（ジクロロメタン等）で十分に洗浄する。この
ようにして得られた担体樹脂をペプチド合成用の反応容
器に移し、以後は通常の方法でペプチド合成を行う。
洗浄除去することにより終了させることができる。例え
ば、担体樹脂を、ブロッキング反応液に対して安定なろ
過膜（ポリテトラフルオロエチレン膜等）を用いてろ過
後、溶媒（ジクロロメタン等）で十分に洗浄する。この
ようにして得られた担体樹脂をペプチド合成用の反応容
器に移し、以後は通常の方法でペプチド合成を行う。
【００１７】ブロッキング処理を施した担体樹脂上で実
際にペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の密度が
低下しているか否かは、例えばGisin法（ピクリン酸を
加えて塩をつくり、第三級アミンで洗い流して比色定量
する方法）や、Kaiser-Test法（ニンヒドリン試薬を反
応させると、フリーのアミノ基があれば青く着色する）
またはＴＮＢＳテスト（ＴＮＢＳ試薬を反応させると、
フリーのアミノ基があれば黄あるいは赤に着色する）を
行なって、ブロッキング処理前後の樹脂の発色を目視で
比較する方法等でも確認され得るが、最も確実な方法と
して、ブロッキング処理後の担体樹脂を用いて実際にペ
プチド合成を行ない、一定量の樹脂上に合成されたペプ
チドの量を、ブロッキング処理していない樹脂を用いて
合成を行なった場合と比較する（樹脂に結合しているア
ミノ酸の量を、樹脂を加水分解して定量する）ことによ
り確認することができる。例えば、Fmoc法用担体樹脂上
のＣ末端アミノ酸誘導体のα−アミノ基を、室温中、Ｃ
末端アミノ酸誘導体の当量を上回らない無水酢酸を含有
する弱アルカリ性のブロッキング反応液で３０分間アセ
チル化する場合は、約８０％のα−アミノ基がブロック
され、ペプチド合成は残りの約２０％のα−アミノ基か
らのみ進行する。具体的には、１００μｍｏｌのＣ末端
アミノ酸誘導体のα−アミノ基に対し、９６μｍｏｌの
無水酢酸を含有する弱アルカリ性のブロッキング反応液
で３０分間アセチル化したところ、約８０％のα−アミ
ノ基がブロックされ、ペプチド合成は残りの約２０％の
α−アミノ基からのみ進行した。
際にペプチド伸長反応が可能なアミノ酸誘導体の密度が
低下しているか否かは、例えばGisin法（ピクリン酸を
加えて塩をつくり、第三級アミンで洗い流して比色定量
する方法）や、Kaiser-Test法（ニンヒドリン試薬を反
応させると、フリーのアミノ基があれば青く着色する）
またはＴＮＢＳテスト（ＴＮＢＳ試薬を反応させると、
フリーのアミノ基があれば黄あるいは赤に着色する）を
行なって、ブロッキング処理前後の樹脂の発色を目視で
比較する方法等でも確認され得るが、最も確実な方法と
して、ブロッキング処理後の担体樹脂を用いて実際にペ
プチド合成を行ない、一定量の樹脂上に合成されたペプ
チドの量を、ブロッキング処理していない樹脂を用いて
合成を行なった場合と比較する（樹脂に結合しているア
ミノ酸の量を、樹脂を加水分解して定量する）ことによ
り確認することができる。例えば、Fmoc法用担体樹脂上
のＣ末端アミノ酸誘導体のα−アミノ基を、室温中、Ｃ
末端アミノ酸誘導体の当量を上回らない無水酢酸を含有
する弱アルカリ性のブロッキング反応液で３０分間アセ
チル化する場合は、約８０％のα−アミノ基がブロック
され、ペプチド合成は残りの約２０％のα−アミノ基か
らのみ進行する。具体的には、１００μｍｏｌのＣ末端
アミノ酸誘導体のα−アミノ基に対し、９６μｍｏｌの
無水酢酸を含有する弱アルカリ性のブロッキング反応液
で３０分間アセチル化したところ、約８０％のα−アミ
ノ基がブロックされ、ペプチド合成は残りの約２０％の
α−アミノ基からのみ進行した。
【００１８】このようにしてブロッキング処理した担体
樹脂は、未処理の担体樹脂を使用する場合と何ら変わる
ことなく、ペプチド合成に使用可能である。さらに、長
鎖ペプチドを合成する際の常套手段として、通常よりも
アミノ酸を結合させる反応を十分に行う目的で、該反応
を２回繰り返すダブルカップリング法を用いたり、反応
時間を延長したりすることにより、より確実に長鎖ペプ
チドを合成することが可能である。本発明により、従来
は自動合成機を用いた方法では成功率の低かった５０残
基以上のペプチド合成が簡便に行えるようになった。
樹脂は、未処理の担体樹脂を使用する場合と何ら変わる
ことなく、ペプチド合成に使用可能である。さらに、長
鎖ペプチドを合成する際の常套手段として、通常よりも
アミノ酸を結合させる反応を十分に行う目的で、該反応
を２回繰り返すダブルカップリング法を用いたり、反応
時間を延長したりすることにより、より確実に長鎖ペプ
チドを合成することが可能である。本発明により、従来
は自動合成機を用いた方法では成功率の低かった５０残
基以上のペプチド合成が簡便に行えるようになった。
【００１９】
【実施例】 以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらによりその技術的範囲が限
定されるものではない。
説明するが、本発明はこれらによりその技術的範囲が限
定されるものではない。
【００２０】［実施例１］ ペプチド１ ペプチド１（配列表の配列番号１）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
【００２１】１） Ｃ末端にProを有するペプチドの合
成に、Ｆｍｏｃ法で汎用されるWang樹脂を用いると、ペ
プチド鎖が樹脂から欠落しやすいことが知られているの
で、ペプチド１の固相合成法用の樹脂としては２−クロ
ロトリチル（2-Cl-Trt）樹脂（以下「Cl-Trt樹脂」とい
う）を用いた。
成に、Ｆｍｏｃ法で汎用されるWang樹脂を用いると、ペ
プチド鎖が樹脂から欠落しやすいことが知られているの
で、ペプチド１の固相合成法用の樹脂としては２−クロ
ロトリチル（2-Cl-Trt）樹脂（以下「Cl-Trt樹脂」とい
う）を用いた。
【００２２】ペプチド１のＣ末端残基に相当するアミノ
酸（Pro）が導入されているPro-Cl-Trt樹脂（アミノ酸
誘導体導入率０．７ｍｍｏｌ／ｇ、島津製作所（株）社
製）の１００μｍｏｌ相当を１５ｍｌ容ポリプロピレン
製コニカルチューブに入れ、９６μｍｏｌの無水酢酸を
含むブロッキング反応液（ジメチルホルムアミド：Ｎ−
メチルモルホリン：無水酢酸＝５２０：１：１（体積
比）。以下「ＣＡＰ液」という）５ｍｌを加えて室温で
３０分間静置した。この操作により、樹脂に導入されて
いる多数のＣ末端アミノ酸のα−アミノ基の一部がアセ
チル基で保護され、後のペプチド合成は保護を免れたα
−アミノ基からのみ進行するので、樹脂上に合成される
ペプチドの最大数が減少する。
酸（Pro）が導入されているPro-Cl-Trt樹脂（アミノ酸
誘導体導入率０．７ｍｍｏｌ／ｇ、島津製作所（株）社
製）の１００μｍｏｌ相当を１５ｍｌ容ポリプロピレン
製コニカルチューブに入れ、９６μｍｏｌの無水酢酸を
含むブロッキング反応液（ジメチルホルムアミド：Ｎ−
メチルモルホリン：無水酢酸＝５２０：１：１（体積
比）。以下「ＣＡＰ液」という）５ｍｌを加えて室温で
３０分間静置した。この操作により、樹脂に導入されて
いる多数のＣ末端アミノ酸のα−アミノ基の一部がアセ
チル基で保護され、後のペプチド合成は保護を免れたα
−アミノ基からのみ進行するので、樹脂上に合成される
ペプチドの最大数が減少する。
【００２３】樹脂を洗浄後、反応容器に移し、ペプチド
合成機（モデル４３０Ａ、アプライドバイオシステムズ
社製）を用いFmoc固相合成法（同装置のファストモック
法（FastMoc Chemistry））に従って合成を行なった。
まずＣ末側から２番目のアミノ酸の誘導体であるFmoc-A
sp(OtBu）１ｍｍｏｌに、アクチベーター溶液｛２Ｍジ
イソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）／Ｎ−メチルピ
ロリドン（以下「ＮＭＰ」という）１ｍｌと０．４５Ｍ
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，
１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロ
ホスフェート（ＨＢＴＵ）／１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール（ＨＯＢｔ）／ジメチルホルムアミド ２．２
ｍｌおよびＮＭＰ １ｍｌ｝を加えて活性化したもの
（結合アミノ酸に対して１０倍等量）と、先のアセチル
基でブロックした樹脂を室温で反応させるが、その際、
アミノ酸の結合を十分に行なわせる目的で、この反応を
２回繰り返すダブルカップリング法を用いた。またこの
とき、Pro-Cl-Trt樹脂にアミノ酸が結合しにくいため、
反応時間を１２０分（通常は３０分）とした。
合成機（モデル４３０Ａ、アプライドバイオシステムズ
社製）を用いFmoc固相合成法（同装置のファストモック
法（FastMoc Chemistry））に従って合成を行なった。
まずＣ末側から２番目のアミノ酸の誘導体であるFmoc-A
sp(OtBu）１ｍｍｏｌに、アクチベーター溶液｛２Ｍジ
イソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）／Ｎ−メチルピ
ロリドン（以下「ＮＭＰ」という）１ｍｌと０．４５Ｍ
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，
１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロ
ホスフェート（ＨＢＴＵ）／１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール（ＨＯＢｔ）／ジメチルホルムアミド ２．２
ｍｌおよびＮＭＰ １ｍｌ｝を加えて活性化したもの
（結合アミノ酸に対して１０倍等量）と、先のアセチル
基でブロックした樹脂を室温で反応させるが、その際、
アミノ酸の結合を十分に行なわせる目的で、この反応を
２回繰り返すダブルカップリング法を用いた。またこの
とき、Pro-Cl-Trt樹脂にアミノ酸が結合しにくいため、
反応時間を１２０分（通常は３０分）とした。
【００２４】ここで生成したFmoc-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Tr
t樹脂をＮＭＰ ７ｍｌで７回洗浄後、脱保護溶液（ピ
ペリジン／ＮＭＰ）７ｍｌを３分間、１２分間と２回反
応させ、樹脂に結合しているアミノ酸のFmoc基を除き、
ＮＭＰ液７ｍｌで５回洗浄した。次にＣ末側から３番目
のアミノ酸の誘導体である活性化Fmoc-Tyr(tBu)溶液を
ダブルカップリング反応させた。以下、同様の操作を繰
り返した。ただし、Fmoc基の脱保護溶液のピペリジン濃
度は、２３％（１サイクル目）から３６％（２０サイク
ル目）へと、合成するペプチドの長さに従って漸次上昇
させた。
t樹脂をＮＭＰ ７ｍｌで７回洗浄後、脱保護溶液（ピ
ペリジン／ＮＭＰ）７ｍｌを３分間、１２分間と２回反
応させ、樹脂に結合しているアミノ酸のFmoc基を除き、
ＮＭＰ液７ｍｌで５回洗浄した。次にＣ末側から３番目
のアミノ酸の誘導体である活性化Fmoc-Tyr(tBu)溶液を
ダブルカップリング反応させた。以下、同様の操作を繰
り返した。ただし、Fmoc基の脱保護溶液のピペリジン濃
度は、２３％（１サイクル目）から３６％（２０サイク
ル目）へと、合成するペプチドの長さに従って漸次上昇
させた。
【００２５】上記の方法でＣ末端から２１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(T
rt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-As
p(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反
応後、合成を中断した。
ペプチド：Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(T
rt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-As
p(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反
応後、合成を中断した。
【００２６】１ｍｇの上記樹脂を採取し、６Ｎ 塩酸に
て１１０℃で２４時間加水分解を行なってから、遊離し
たアミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００型、日立製
作所（株）社製）にて測定した。その結果、樹脂に結合
しているペプチドは、樹脂置換量の２０％程度であるこ
とが判明した。
て１１０℃で２４時間加水分解を行なってから、遊離し
たアミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００型、日立製
作所（株）社製）にて測定した。その結果、樹脂に結合
しているペプチドは、樹脂置換量の２０％程度であるこ
とが判明した。
【００２７】さらに一部樹脂を採取し、樹脂に０．５ｍ
ｌのクリベージ溶液（トリフロロ酢酸（以下「ＴＦＡ」
という）：エタンジチオール：水：トリイソプロピルシ
ラン＝９２．５：２．５：２．５：２．５）を加え１時
間クリベージ反応を行い、得られたペプチド溶液にエー
テルを加えペプチドを沈殿させた［１９９７／９８ペプ
チド合成ハンドブック S 48；Novabiochem社］。得られ
たペプチドについて質量分析計（ＶＧプラットフォー
ム、ＶＧバイオテック社製）を用いてエレクトロスプレ
ーイオナイゼーション（electrospray ionisation、以
下「ＥＳＩ」という）法にて分子量を測定し、合成産物
の確認を行なった。
ｌのクリベージ溶液（トリフロロ酢酸（以下「ＴＦＡ」
という）：エタンジチオール：水：トリイソプロピルシ
ラン＝９２．５：２．５：２．５：２．５）を加え１時
間クリベージ反応を行い、得られたペプチド溶液にエー
テルを加えペプチドを沈殿させた［１９９７／９８ペプ
チド合成ハンドブック S 48；Novabiochem社］。得られ
たペプチドについて質量分析計（ＶＧプラットフォー
ム、ＶＧバイオテック社製）を用いてエレクトロスプレ
ーイオナイゼーション（electrospray ionisation、以
下「ＥＳＩ」という）法にて分子量を測定し、合成産物
の確認を行なった。
【００２８】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から３１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly
-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(B
oc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(t
Bu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成
された時点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。一部樹脂
を取り出し、クリベージ反応を行い、上記１）と同様の
方法で合成産物の確認を行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から３１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly
-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(B
oc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(t
Bu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成
された時点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。一部樹脂
を取り出し、クリベージ反応を行い、上記１）と同様の
方法で合成産物の確認を行なった。
【００２９】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-
Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-
Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-G
lu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-G
ly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成され
た時点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。一部樹脂を取
り出し、クリベージ反応を行い、上記１）と同様の方法
で合成産物の確認を行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-
Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-
Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-G
lu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-G
ly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成され
た時点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。一部樹脂を取
り出し、クリベージ反応を行い、上記１）と同様の方法
で合成産物の確認を行なった。
【００３０】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys
(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-P
he-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Asn(Trt)-Phe
-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-
Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Al
a-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr
(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(T
rt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-As
p(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反
応後、合成を中断した。なお、Ｃ末端から６９残基目の
Fmoc-Ser(tBu)、７０残基目のFmoc-Trp(Boc)および７１
残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応効率
が良くないことが予測されていたため、脱保護溶液によ
る反応をさらに３回繰り返し、ペプチドに結合している
Fmoc基が十分にはずれるようにした後、アミノ酸を結合
させる反応時間を１２０分間にして行なった。一部樹脂
を採取し、クリベージ反応を行って、上記１）と同様の
方法で合成産物の確認を行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys
(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-P
he-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Asn(Trt)-Phe
-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-
Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Al
a-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr
(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(T
rt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-As
p(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反
応後、合成を中断した。なお、Ｃ末端から６９残基目の
Fmoc-Ser(tBu)、７０残基目のFmoc-Trp(Boc)および７１
残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応効率
が良くないことが予測されていたため、脱保護溶液によ
る反応をさらに３回繰り返し、ペプチドに結合している
Fmoc基が十分にはずれるようにした後、アミノ酸を結合
させる反応時間を１２０分間にして行なった。一部樹脂
を採取し、クリベージ反応を行って、上記１）と同様の
方法で合成産物の確認を行なった。
【００３１】５） 上記４）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から８１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Tr
t)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met
-Lys(Boc)-Val--Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(T
rt)-Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Asn(Tr
t)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-
Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gl
y-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile
-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala
-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-H
is(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tB
u)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂を合成した。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から８１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Tr
t)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met
-Lys(Boc)-Val--Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(T
rt)-Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Asn(Tr
t)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-
Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gl
y-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile
-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala
-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-H
is(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tB
u)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂を合成した。
【００３２】ここで、合成に使用されたアミノ酸誘導体
は以下の通りである：Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pmc)、Fmoc-
Asn(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gln
(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)、Fm
oc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Met、Fmoc-Ph
e、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Tr
p(Boc)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Val（（ ）内は残基部
分の反応基を保護する保護基を表す；（株）パーキンエ
ルマージャパンアプライドバイオシステムズ事業部
製）。
は以下の通りである：Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pmc)、Fmoc-
Asn(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gln
(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)、Fm
oc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Met、Fmoc-Ph
e、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Tr
p(Boc)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Val（（ ）内は残基部
分の反応基を保護する保護基を表す；（株）パーキンエ
ルマージャパンアプライドバイオシステムズ事業部
製）。
【００３３】上記のようにして得られた保護ペプチド樹
脂に脱保護溶液を反応させてＮ末端のFmoc基を脱保護し
た。次に７ｍｌのＮＭＰにて６回洗浄後、ジクロロメタ
ンにて３回洗浄し、さらにアルゴンガスを吹き付けるこ
とにより１５分間乾燥させた。樹脂を取り出し、クリベ
ージ溶液を３０ｍｌ加え、室温で２時間反応させること
により、樹脂からのペプチドの切断およびアミノ酸側鎖
保護基の除去を行い、ペプチド溶液を得た。
脂に脱保護溶液を反応させてＮ末端のFmoc基を脱保護し
た。次に７ｍｌのＮＭＰにて６回洗浄後、ジクロロメタ
ンにて３回洗浄し、さらにアルゴンガスを吹き付けるこ
とにより１５分間乾燥させた。樹脂を取り出し、クリベ
ージ溶液を３０ｍｌ加え、室温で２時間反応させること
により、樹脂からのペプチドの切断およびアミノ酸側鎖
保護基の除去を行い、ペプチド溶液を得た。
【００３４】このペプチド溶液をポリテトラルフルオロ
エチレン（以下「ＰＴＦＥ」という）フィルター（３．
０μｍ、アドバンテック東洋株式会社製）を用いて濾過
し、濾液を遠心管に回収した。これをアスピレーターを
用いて濃縮した後、８０ｍｌの冷エーテルを加えてペプ
チドを沈殿させた。しばらく冷却後、このものを遠心分
離して（３０００ｒｐｍ、１０分間）沈殿を回収し、再
び冷エーテルを加えて分散させては回収する操作を３回
繰り返すことにより沈殿を洗浄した。得られた沈殿を乾
燥させ、粗ペプチド２５２ｍｇを得た。
エチレン（以下「ＰＴＦＥ」という）フィルター（３．
０μｍ、アドバンテック東洋株式会社製）を用いて濾過
し、濾液を遠心管に回収した。これをアスピレーターを
用いて濃縮した後、８０ｍｌの冷エーテルを加えてペプ
チドを沈殿させた。しばらく冷却後、このものを遠心分
離して（３０００ｒｐｍ、１０分間）沈殿を回収し、再
び冷エーテルを加えて分散させては回収する操作を３回
繰り返すことにより沈殿を洗浄した。得られた沈殿を乾
燥させ、粗ペプチド２５２ｍｇを得た。
【００３５】この粗ペプチド７５ｍｇを０．１％ＴＦＡ
を含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、以下の条
件で高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と
いう）に供した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ、粒径５μｍ、孔径１２０Å、カラムサイズφ２１．
５ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー（株）社製） 移動相：３５−３７％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２３〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１１．５ｍｇを得
た。
を含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、以下の条
件で高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と
いう）に供した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ、粒径５μｍ、孔径１２０Å、カラムサイズφ２１．
５ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー（株）社製） 移動相：３５−３７％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２３〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１１．５ｍｇを得
た。
【００３６】ここで得られたペプチドはまだ不純物を含
んでいたため、さらに以下の条件でＨＰＬＣ精製を行な
った： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ、カラムサイズφ
１０ｍｍ×２５０ｍｍ、センシュー（株）社製） 移動相：３０−３１％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ３２〜３４分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド２．５ｍｇを得た。
んでいたため、さらに以下の条件でＨＰＬＣ精製を行な
った： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ、カラムサイズφ
１０ｍｍ×２５０ｍｍ、センシュー（株）社製） 移動相：３０−３１％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ３２〜３４分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド２．５ｍｇを得た。
【００３７】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。さらにこのペプチ
ド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列分析装置（Ｐ
ＰＳＱ−１０型、島津製作所（株）社製）を用いて、Ｎ
末端から１０残基までのアミノ酸配列分析を行なった結
果、配列表の配列番号１のうち、アミノ酸番号１から１
０に示されるアミノ酸配列と一致していることが確認さ
れた。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。さらにこのペプチ
ド１００ｐｍｏｌについて、アミノ酸配列分析装置（Ｐ
ＰＳＱ−１０型、島津製作所（株）社製）を用いて、Ｎ
末端から１０残基までのアミノ酸配列分析を行なった結
果、配列表の配列番号１のうち、アミノ酸番号１から１
０に示されるアミノ酸配列と一致していることが確認さ
れた。
【００３８】［実施例２］ ペプチド２ ペプチド２（配列表の配列番号２）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように４段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように４段階に分けて行なっ
た。
【００３９】１） ペプチド２のＣ末端残基に相当する
アミノ酸（Glu）が導入されているFmoc-Glu(OtBu)-Wang
樹脂（アミノ酸誘導体導入率０．６１ｍｍｏｌ／ｇ、ア
ロカ（株）社製）の１００μｍｏｌ相当に、６ｍｌの２
０％ピペリジンを加え３０分室温で反応させることによ
りFmoc基を脱離した。樹脂を洗浄後、ＣＡＰ液５ｍｌを
室温で３０分間反応させた。この操作により、実施例１
と同様、樹脂に導入されているＣ末端アミノ酸のα−ア
ミノ基のうち、約８０％がアセチル基でブロックされ、
後のペプチド合成はブロックを免れたα−アミノ基から
のみ進行するので、樹脂上に合成されるペプチドの最大
数が減少する。
アミノ酸（Glu）が導入されているFmoc-Glu(OtBu)-Wang
樹脂（アミノ酸誘導体導入率０．６１ｍｍｏｌ／ｇ、ア
ロカ（株）社製）の１００μｍｏｌ相当に、６ｍｌの２
０％ピペリジンを加え３０分室温で反応させることによ
りFmoc基を脱離した。樹脂を洗浄後、ＣＡＰ液５ｍｌを
室温で３０分間反応させた。この操作により、実施例１
と同様、樹脂に導入されているＣ末端アミノ酸のα−ア
ミノ基のうち、約８０％がアセチル基でブロックされ、
後のペプチド合成はブロックを免れたα−アミノ基から
のみ進行するので、樹脂上に合成されるペプチドの最大
数が減少する。
【００４０】樹脂を洗浄後、反応容器に移し、まず、Ｃ
末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(OtBu)-P
ro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gl
y-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)
-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂
が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。
一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行って、実施例
１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(OtBu)-P
ro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gl
y-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)
-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂
が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。
一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行って、実施例
１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００４１】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成
を中断した。一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行
って、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認
を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成
を中断した。一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行
って、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認
を行った。
【００４２】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val
-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行って、実
施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行っ
た。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val
-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を取り出し、クリベージ反応を行って、実
施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行っ
た。
【００４３】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７９残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から６８残基目の
Fmoc-Trp(Boc)および６９残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合
させる反応は、反応効率が良くないことが予測されたた
め、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、ペプ
チドに結合しているFmoc基が十分にはずれるようにした
後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に延ば
して行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７９残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から６８残基目の
Fmoc-Trp(Boc)および６９残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合
させる反応は、反応効率が良くないことが予測されたた
め、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、ペプ
チドに結合しているFmoc基が十分にはずれるようにした
後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に延ば
して行なった。
【００４４】以上の方法により、Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala
-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-T
rp(Boc)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn
(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-A
sn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Tr
t)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(t
Bu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr
(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が得られた。このも
のに脱Fmoc反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペ
プチド１９４ｍｇを得た。
-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-T
rp(Boc)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn
(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-A
sn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Tr
t)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(t
Bu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr
(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe
-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が得られた。このも
のに脱Fmoc反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペ
プチド１９４ｍｇを得た。
【００４５】この粗ペプチドのうち９７ｍｇを０．１％
ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、
以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ） 移動相：３５−３８％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２７〜２８分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド７ｍｇを得た。
ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、
以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ） 移動相：３５−３８％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２７〜２８分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド７ｍｇを得た。
【００４６】ここで得られたペプチドはまだ不純物を含
んでいたため、さらに下記の条件でＨＰＬＣ精製を行な
った： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ） 移動相：３１−３２％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２０〜２２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド２．３ｍｇを得た。
んでいたため、さらに下記の条件でＨＰＬＣ精製を行な
った： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ） 移動相：３１−３２％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２０〜２２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド２．３ｍｇを得た。
【００４７】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号２の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号２の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
【００４８】［実施例３］ ペプチド３ ペプチド３（配列表の配列番号３）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
【００４９】１） まず、実施例１に記載した方法で、
Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Lys(Boc)-
Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-
Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が
合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一
部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の
１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Lys(Boc)-
Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-
Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が
合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一
部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の
１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００５０】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr
(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)
-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-A
la-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-P
ro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合
成を中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行
って、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認
を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr
(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)
-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-A
la-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-P
ro-Cl-Trt樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合
成を中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行
って、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認
を行った。
【００５１】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-
Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-
Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-G
lu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-G
ly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成され
た時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂を
採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記
載した方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-
Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-
Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-G
lu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-G
ly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn
(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が合成され
た時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂を
採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記
載した方法で合成産物の確認を行った。
【００５２】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基めまでの
ペプチド：Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Gl
u(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys
(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu
(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(T
rt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Tr
t樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断
した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実
施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行っ
た。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基めまでの
ペプチド：Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Gl
u(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys
(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu
(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(T
rt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Tr
t樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断
した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実
施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行っ
た。
【００５３】５） 上記４）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７９残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から６８残基目の
Fmoc-Trp(Boc)および６９残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合
させる反応は、反応効率が良くないことが予測されたた
め、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、ペプ
チドに結合しているFmoc基が十分にはずれるようにした
後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に延ば
して行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７９残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から６８残基目の
Fmoc-Trp(Boc)および６９残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合
させる反応は、反応効率が良くないことが予測されたた
め、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、ペプ
チドに結合しているFmoc基が十分にはずれるようにした
後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に延ば
して行なった。
【００５４】以上の方法により、Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala
-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-T
rp(Boc)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn
(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-A
sn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Tr
t)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(t
Bu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Tr
t)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtB
u)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu
-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-T
yr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が得られた。このも
のに脱Fmoc反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペ
プチド３８０ｍｇを得た。このうち１９０ｍｇを、０．
１％ ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解
後、下記の条件でＨＰＬＣ精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ） 移動相：３５−３７％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２５〜２７分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１５．６ｍｇを得
た。
-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-T
rp(Boc)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn
(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-A
sn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Tr
t)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys
(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(t
Bu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Tr
t)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtB
u)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu
-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-T
yr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Cl-Trt樹脂が得られた。このも
のに脱Fmoc反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペ
プチド３８０ｍｇを得た。このうち１９０ｍｇを、０．
１％ ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解
後、下記の条件でＨＰＬＣ精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ-１２０
Ｔ） 移動相：３５−３７％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２５〜２７分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１５．６ｍｇを得
た。
【００５５】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号３の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号３の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
【００５６】［実施例４］ ペプチド４ ペプチド４（配列表の配列番号４）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
【００５７】１） まず、実施例２に記載した方法で、
Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂を合成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。
一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１
の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂を合成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。
一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１
の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００５８】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基めまでの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成
を中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から４１残基めまでの
ペプチド：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(t
Bu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成
を中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
【００５９】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val
-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施
例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から６１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Phe-A
la-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln
(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr
(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(T
rt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val
-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)
-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-
Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Bo
c)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹
脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施
例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００６０】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から８１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Tr
t)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met
-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Tr
t)-Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-
Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tB
u)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile
-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-L
eu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr
(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)
-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc
反応後、合成を中断した。ただし、Ｃ末端から６９残基
目のFmoc-Ser(tBu)、７０残基目のFmoc-Trp(Boc)および
７１残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応
効率が良くないことが予測されたため、脱保護溶液によ
る反応をさらに３回繰り返し、ペプチドに結合している
Fmoc基が十分にはずれるようにした後、アミノ酸を結合
させる反応時間を１２０分間に延ばして行なった。一部
樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の
１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から８１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Tr
t)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met
-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Tr
t)-Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-
Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tB
u)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile
-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-L
eu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)
-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr
(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr
(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)
-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc
反応後、合成を中断した。ただし、Ｃ末端から６９残基
目のFmoc-Ser(tBu)、７０残基目のFmoc-Trp(Boc)および
７１残基目のFmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応
効率が良くないことが予測されたため、脱保護溶液によ
る反応をさらに３回繰り返し、ペプチドに結合している
Fmoc基が十分にはずれるようにした後、アミノ酸を結合
させる反応時間を１２０分間に延ばして行なった。一部
樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の
１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００６１】５） 上記４）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９３残基目までの
ペプチドを合成した。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９３残基目までの
ペプチドを合成した。
【００６２】以上の方法により、Fmoc-Gln(Trt)-Phe-Al
a-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-G
ly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-
Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Va
l-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-P
ro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)
-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-
Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tB
u)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が得られた。このものに脱Ｆｍｏｃ反応、
およびクリベージ反応を行って、粗ペプチド４７．４ｍ
ｇを得た。その全量を、０．１％ ＴＦＡを含む２０％
アセトニトリル水溶液に溶解後、下記の条件でＨＰＬＣ
精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ−１２０
Ｔ） 移動相：３９−４９％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２２〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド４．４ｍｇを得た。
a-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-G
ly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-
Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Va
l-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-P
ro-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)
-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-
Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tB
u)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His
(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-
Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(O
tBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo
c)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtB
u)-Wang樹脂が得られた。このものに脱Ｆｍｏｃ反応、
およびクリベージ反応を行って、粗ペプチド４７．４ｍ
ｇを得た。その全量を、０．１％ ＴＦＡを含む２０％
アセトニトリル水溶液に溶解後、下記の条件でＨＰＬＣ
精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ−１２０
Ｔ） 移動相：３９−４９％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｎｍ ２２〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド４．４ｍｇを得た。
【００６３】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号４の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号４の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
【００６４】［実施例５］ ペプチド５ ペプチド５（配列表の配列番号５）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように４段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように４段階に分けて行なっ
た。
【００６５】１） まず、実施例２に記載した方法によ
り、Ｃ末端から１１残基目までのペプチド：Fmoc-Ile-T
yr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-P
he-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を合成した時点
で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂を採取
し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記載し
た方法で合成産物の確認を行った。
り、Ｃ末端から１１残基目までのペプチド：Fmoc-Ile-T
yr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-P
he-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を合成した時点
で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂を採取
し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記載し
た方法で合成産物の確認を行った。
【００６６】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から３１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Tr
t)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tB
u)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Tr
t)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtB
u)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成さ
れた時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂
を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に
記載した方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から３１残基目までの
ペプチド：Fmoc-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Tr
t)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tB
u)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Tr
t)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtB
u)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成さ
れた時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹脂
を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に
記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００６７】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-
His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-L
eu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)
-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Tr
t)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp
(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtB
u)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)
-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)
-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を
中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-
His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-L
eu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)
-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Tr
t)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp
(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtB
u)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)
-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)
-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を
中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
【００６８】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９５残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から７０残基目の
Fmoc-Ser(tBu)、７１残基目のFmoc-Lys(Boc)、７２残基
目のFmoc-Trp(Boc)および７３残基目のFmoc-Ser(tBu)を
結合させる反応は、反応効率が良くないことが予測され
たため、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、
ペプチドに結合しているFmoc基が十分にはずれるように
した後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に
延ばして行なった。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９５残基目までの
ペプチドを合成した。ただし、Ｃ末端から７０残基目の
Fmoc-Ser(tBu)、７１残基目のFmoc-Lys(Boc)、７２残基
目のFmoc-Trp(Boc)および７３残基目のFmoc-Ser(tBu)を
結合させる反応は、反応効率が良くないことが予測され
たため、脱保護溶液による反応をさらに３回繰り返し、
ペプチドに結合しているFmoc基が十分にはずれるように
した後、アミノ酸を結合させる反応時間を１２０分間に
延ばして行なった。
【００６９】以上の方法により、Fmoc-Gln(Trt)-Phe-Al
a-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-G
ly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-
Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Met-Ly
s(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-
Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Bo
c)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn
(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-
Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gl
y-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(T
rt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-T
yr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Th
r(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Tr
t)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を得た。このものに脱Ｆｍ
ｏｃ反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペプチド
１３４ｍｇを得た。その全量を、０．１％ ＴＦＡを含
む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、下記の条件で
ＨＰＬＣ精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ−１２０
Ｔ） 移動相：３８−５０％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２３０ｎｍ ２０〜２３分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１４ｍｇを得た。
a-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-G
ly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-
Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Met-Ly
s(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-
Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Bo
c)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn
(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-
Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gl
y-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(T
rt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-T
yr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Th
r(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Tr
t)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を得た。このものに脱Ｆｍ
ｏｃ反応、およびクリベージ反応を行って、粗ペプチド
１３４ｍｇを得た。その全量を、０．１％ ＴＦＡを含
む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、下記の条件で
ＨＰＬＣ精製を実施した： カラム：ＯＤＳカラム（ＴＳＫ−ゲル ＯＤＳ−１２０
Ｔ） 移動相：３８−５０％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：５ｍｌ／分 検出波長：２３０ｎｍ ２０〜２３分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って、目的とするペプチド１４ｍｇを得た。
【００７０】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号５の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号５の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
【００７１】［実施例６］ ペプチド６ ペプチド６（配列表の配列番号６）の合成を、合成状況
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
を確認する目的、および合成機に試薬を追加する目的の
ために、以下に記載するように５段階に分けて行なっ
た。
【００７２】１） まず、実施例２に記載した方法によ
り、Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(O
tBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-
Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ly
s(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wa
ng樹脂を合成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施
例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
り、Ｃ末端から２１残基目までのペプチド：Fmoc-Asp(O
tBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-
Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ly
s(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wa
ng樹脂を合成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断し
た。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施
例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００７３】２） 上記１）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-
His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-L
eu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)
-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Tr
t)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp
(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtB
u)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)
-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)
-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を
中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から５４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-
His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-L
eu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)
-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Tr
t)-Val-Ala-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp
(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtB
u)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)
-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)
-Wang樹脂が合成された時点で、脱Fmoc反応後、合成を
中断した。一部樹脂を採取し、クリベージ反応を行っ
て、実施例１の１）に記載した方法で合成産物の確認を
行った。
【００７４】３） 上記２）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser
(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Tr
t)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe-Ala-Ser
(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-
Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-As
n(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gl
y-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile
-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala
-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成された時
点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。ただし、Ｃ末端か
ら７０残基目のFmoc-Ser(tBu)、７１残基目のFmoc-Lys
(Boc)、７２残基目のFmoc-Trp(Boc)および７３残基目の
Fmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応効率が良くな
いことが予測されたため、脱保護溶液による反応をさら
に３回繰り返し、ペプチドに結合しているFmoc基が完全
にはずれるようにした後、アミノ酸を結合させる反応時
間を１２０分間に延ばして行なった。一部樹脂を採取
し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記載し
た方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から７４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser
(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-Phe-Asn(Tr
t)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe-Ala-Ser
(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-
Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)
-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn(Trt)-As
n(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gl
y-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Ile
-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala
-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂が合成された時
点で、脱Fmoc反応後合成を中断した。ただし、Ｃ末端か
ら７０残基目のFmoc-Ser(tBu)、７１残基目のFmoc-Lys
(Boc)、７２残基目のFmoc-Trp(Boc)および７３残基目の
Fmoc-Ser(tBu)を結合させる反応は、反応効率が良くな
いことが予測されたため、脱保護溶液による反応をさら
に３回繰り返し、ペプチドに結合しているFmoc基が完全
にはずれるようにした後、アミノ酸を結合させる反応時
間を１２０分間に延ばして行なった。一部樹脂を採取
し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）に記載し
た方法で合成産物の確認を行った。
【００７５】４） 上記３）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-P
he-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tB
u)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys
(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-P
he-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe
-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-G
ln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Se
r(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-
Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn
(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser
(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn
(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu
(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を合
成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹
脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）
に記載した方法で合成産物の確認を行った。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９４残基目までの
ペプチド：Fmoc-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-P
he-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tB
u)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Lys
(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-P
he-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Phe
-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-G
ln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Se
r(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-
Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-Asn
(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser
(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn
(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu
(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を合
成した時点で、脱Fmoc反応後、合成を中断した。一部樹
脂を採取し、クリベージ反応を行って、実施例１の１）
に記載した方法で合成産物の確認を行った。
【００７６】５） 上記４）の残りの樹脂を用いて引き
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９９残基目までの
ペプチドを合成した。
続きペプチド合成を行い、Ｃ末端から９９残基目までの
ペプチドを合成した。
【００７７】以上の方法により、Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-P
ro-Arg-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-
Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(t
Bu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ly
s(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-
Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Ph
e-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-
Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-S
er(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-As
n(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Se
r(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn
(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu
(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を得
た。このものに脱Ｆｍｏｃ反応、およびクリベージ反応
を行って、粗ペプチド７０６ｍｇを得た。このうち４３
ｍｇを、０．１％ ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル
水溶液に溶解後、下記の条件でＨＰＬＣ精製を実施し
た： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ） 移動相：３２−３６％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２３０ｎｍ ２３〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って目的とするペプチド３．２ｍｇを得た。
ro-Arg-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-
Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(t
Bu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Ly
s(Boc)-Ser(tBu)-Met-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Val-Ala-
Phe-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Phe-Gly-Pro-Asp(OtBu)-Ile-Ph
e-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-
Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-S
er(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu
-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Val-His(Trt)-Val-Ala-As
n(Trt)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Se
r(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Asn
(Trt)-Ile-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu
(OtBu)-Ala-Phe-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂を得
た。このものに脱Ｆｍｏｃ反応、およびクリベージ反応
を行って、粗ペプチド７０６ｍｇを得た。このうち４３
ｍｇを、０．１％ ＴＦＡを含む２０％アセトニトリル
水溶液に溶解後、下記の条件でＨＰＬＣ精製を実施し
た： カラム：Ｃ２２カラム（ドコシル−Ｂ） 移動相：３２−３６％ アセトニトリル／０．１％ Ｔ
ＦＡ、３０分（直線濃度勾配） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２３０ｎｍ ２３〜２５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結
乾燥を行って目的とするペプチド３．２ｍｇを得た。
【００７８】この精製ペプチドについて、質量分析計を
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号６の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
用いＥＳＩ法にて分子量を確認した。また精製ペプチド
１００ｐｍｏｌについて、Ｎ末端から１０残基までのア
ミノ酸配列分析を行なった結果、配列表の配列番号６の
うち、アミノ酸番号１から１０に示されるアミノ酸配列
と一致していることが確認された。
【００７９】
【発明の効果】 以上のごとく、本発明の方法により、
従来自動合成機での成功率が低かった５０残基を超える
長鎖ペプチドの合成を簡便に行うことが可能となった。
本発明を利用して、長鎖ペプチドの合成を、セグメント
縮合法や遺伝子操作を経ずに簡便に行うことができる。
従来自動合成機での成功率が低かった５０残基を超える
長鎖ペプチドの合成を簡便に行うことが可能となった。
本発明を利用して、長鎖ペプチドの合成を、セグメント
縮合法や遺伝子操作を経ずに簡便に行うことができる。
【００８０】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：設計されたペプ
チド 配列番号２：設計されたペプチド 配列番号３：設計されたペプチド 配列番号４：設計されたペプチド 配列番号５：設計されたペプチド 配列番号６：設計されたペプチド
チド 配列番号２：設計されたペプチド 配列番号３：設計されたペプチド 配列番号４：設計されたペプチド 配列番号５：設計されたペプチド 配列番号６：設計されたペプチド
【００８１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sankyo Company, Limited <120> Method for Solid-phase Peptide Synthesis <130> 2000005SS <140> <141> <150> JP H11-67917 <151> 1999-03-15 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 1 Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Ser Met Lys Val 1 5 10 15 Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro Phe Ala Ser Lys Asn Phe His 20 25 30 Leu Gln Lys Asn Thr Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala 50 55 60 Phe Asn Val Glu Tyr Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Pro <210> 2 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 2 Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Met Lys Val Thr 1 5 10 15 Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln 20 25 30 Lys Asn Thr Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Tyr 35 40 45 Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Ser Gly Lys Tyr 50 55 60 Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu 65 70 75 <210> 3 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 3 Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Met Lys Val Thr 1 5 10 15 Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln 20 25 30 Lys Asn Thr Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Ser 35 40 45 Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn 50 55 60 Val Glu Tyr Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro 65 70 75 <210> 4 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 4 Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly Gly Ile Ile Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe 20 25 30 Asn Gln Phe Gly Pro Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys Asn 35 40 45 Thr Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Tyr Gly Leu 50 55 60 Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Ser Gly Lys Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu 85 90 <210> 5 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 5 Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly Gly Ile Ile Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala 20 25 30 Phe Asn Gln Phe Gly Pro Asp Ile Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu 35 40 45 Gln Lys Asn Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Tyr 50 55 60 Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Ser Gly Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu 85 90 95 <210> 6 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide <400> 6 Gly Asp Pro Arg Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly 1 5 10 15 Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Ser Met Lys 20 25 30 Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro Asp Ile Phe Ala Ser Lys 35 40 45 Asn Phe His Leu Gln Lys Asn Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser 50 55 60 Cys Leu Asn Tyr Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro 65 70 75 80 Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe 85 90 95 Asn Val Glu
Claims (7)
- 【請求項１】 ペプチドを固相合成法により化学合成す
る方法において、合成しようとするペプチドのＣ末端ア
ミノ酸誘導体が予め結合している担体樹脂を処置する方
法であって、該担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程を含むことを特徴と
する方法。 - 【請求項２】 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程が、合成しようとす
るペプチドのＣ末端から２番目のアミノ酸誘導体を結合
させる反応の前に行われることを特徴とする、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程が、該α−アミノ基
のアセチル化であることを特徴とする、請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項４】 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程が、該担体樹脂を無
水酢酸を含む溶液に接触させる工程であることを特徴と
する、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程が、該担体樹脂を無
水酢酸を含む溶液に０乃至３０℃で１０乃至３０分間接
触させる工程であることを特徴とする、請求項３または
４に記載の方法。 - 【請求項６】 担体樹脂上のペプチド伸長反応が可能な
アミノ酸誘導体の一部のα−アミノ基を、保護基の付加
により不活性化する処置を施す工程が、該担体樹脂を無
水酢酸を含む溶液に室温で３０分間接触させる工程であ
ることを特徴とする、請求項３乃至５のいずれか一つに
記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１乃至６のいずれか一つに記載の
方法を含むことを特徴とする、ペプチドの合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000069661A JP2000327700A (ja) | 1999-03-15 | 2000-03-14 | ペプチドの合成法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-67917 | 1999-03-15 | ||
| JP6791799 | 1999-03-15 | ||
| JP2000069661A JP2000327700A (ja) | 1999-03-15 | 2000-03-14 | ペプチドの合成法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000327700A true JP2000327700A (ja) | 2000-11-28 |
Family
ID=26409129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000069661A Pending JP2000327700A (ja) | 1999-03-15 | 2000-03-14 | ペプチドの合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000327700A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024013784A1 (ja) * | 2022-07-11 | 2024-01-18 | 千代田化工建設株式会社 | ペプチド製造装置およびペプチド製造方法 |
-
2000
- 2000-03-14 JP JP2000069661A patent/JP2000327700A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024013784A1 (ja) * | 2022-07-11 | 2024-01-18 | 千代田化工建設株式会社 | ペプチド製造装置およびペプチド製造方法 |
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