JP2787963B2 - 反応槽 - Google Patents

反応槽

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、反応槽に関する。更に
詳しくは、ペプチド合成やＤＮＡ合成などの簡易連続合
成装置などに使用される反応槽に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ペプチド合成などの連続合成装置
においては、グラスフィルターを充填したガラス製の反
応槽が用いられている。通常の固相法によるペプチド合
成では、今日各種の装置が市販されているが、いずれも
正しくはペプチドの合成装置ではなく保護ペプチドレジ
ン（レジンに側鎖が保護されたアミノ酸がペプチド結合
を介して伸張している状態）の製造装置である。通常、
この段階までは自動的に装置内で合成されるが、最後に
ペプチドとして取り出すためには、脱保護を含むクリー
ベイジが必要であり、この工程は手動で行われているの
が現状である。即ち、製造された保護ペプチドレジンを
反応器より取り出し、通常グラスフィルターを充填した
ガラス製の反応槽でクリーベイジがなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、このようなガ
ラス製容器にグラスフィルターを装着した反応槽ではガ
ラス壁面への吸着あるいはフィルターの目詰まりを起こ
しやすいため、ペプチド合成の前にクロム混酸液処理や
約６００℃の加熱処理等の前処理が必要という問題点が
指摘されている。しかもこのような従来のガラス製の反
応槽は高価であるため経済的に有利なものとはいえな
い。また、ガラス製の反応槽では、特に固相レジンを用
いる場合、静電気等によりレジンが上部器壁に付着し、
反応を均一に行う事ができず、その結果不完全合成の原
因となることから、反応前にシリコンコーティング処理
を要するなど煩雑さの問題も指摘されている。
【０００４】また、特にレジン（合成したペプチドレジ
ン）の量が少ない小スケールの合成時には、クリーベイ
ジ時に反応容器よりレジンを別のクリーベイジ容器へ移
すことはメカニカルロスの原因であり、収量の低下を招
くことになる。また、このようなロスを防ぐためにクリ
ーベイジ後の共洗いの目的で反応容器の洗浄を行うと、
クリーベイジ反応後に濃縮などの操作が必要となる。一
方スカベンジャーを用いてもクリーベイジ反応後の混合
物を濃縮したりすると、アシドリシスの時に生じるアミ
ノ酸側鎖保護基由来のアルキルカチオンの攻撃がおこ
り、副反応生成物が増加し、目的物の収量を著しく減少
させるほか精製が不可能になる事さえ起こる。
【０００５】クリーベイジの際生成するカチオンを捕捉
する目的で、スカベンジャーを用いるのが一般的である
が、通常、最適条件を検討した後に再度クリーベイジを
行うことが多い。さらに保護ペプチドレジンが効率よく
製造されていてもクリーベイジ中に副反応がおきて目的
物が得られなかったり、また収量が著しく悪いというこ
とが広く知られており、このクリーベイジは試行錯誤も
含めた経験が極めて重要である。従って、当業界ではこ
れらの問題の生じない反応槽の開発が要望されている
が、いまだ満足するものは得られていないのが実情であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記のよう
な問題点、即ち、グラスフィルターを使用することによ
る問題点およびガラス製であることから生起する問題点
を有しない反応槽について鋭意検討を行った結果、本発
明を完成するに到った。即ち、本発明の要旨は、固相レ
ジンを用いる合成反応用の反応槽であって、ポリアルキ
レンフィルターを反応槽内の槽底部に充填してなる合成
用反応槽に関する。
【０００７】本発明の反応槽におけるフィルターに使用
する高分子材としては、ポリアルキレンが用いられる。
具体的にはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリ
デンフルオライド等が例示され、中でもポリプロピレン
が好ましい。フィルターの繊維の太さ、反応槽内に充填
するフィルター層の厚さ等は、特に制限されるものでは
なく、通常の範囲のものでよく例えば、レジンは２００
〜４００メッシュ（１２５〜６３μｍ）なので、これを
通過しないものならよく、通常５〜１０μｍ程度のもの
が使用される。反応槽本体の素材としては、固相レジン
に対して静電気などをおこしにくい素材であればよく、
特に安価で、生成したペプチドの不特異的吸着の少ない
ポリプロピレンが好ましい。
【０００８】本発明の反応槽は使い捨てとして用いるこ
とができ、また本発明において用いるフィルターは前記
のような目詰まりを起こしやすいという問題はないた
め、反応槽の使用時にフィルターを前処理する必要はな
い。従って、自動的同時多種品目の合成にも適してお
り、ペプチド合成やＤＮＡ合成などの簡易連続合成装置
などにおける反応槽として用いることができる。
【０００９】以下、本発明の反応槽を利用した合成装置
の使用例について、図１をもって説明する。図１は適当
にカットした本発明のポリプロピレンフィルターを装着
した反応槽を使用した反応装置の概略を示す図である。
反応槽１内にはフィルターとしてカットしたポリプロピ
レンフィルター２が充填され、その上に固相レジン３が
入れられている。この反応槽の入口には流路Ａと流路Ｂ
が存在し、流路Ａは窒素ガス流によって、流路Ｂは手動
によって反応槽内に注入される。流路Ａからは反応液、
緩衝液等が適宜反応槽内に注入され、合成が行われる。
流路Ｂは排気のために用いる他、クリーベイジカクテル
等を適宜反応槽内に注入する事ができる。反応槽出口に
は未反応物や洗浄液等の廃液を回収する流路と生成物回
収の流路とが三方コックにて結ばれ、廃液は廃液貯め４
に回収される。
【００１０】例えば、Ｃ端より順次アミノ酸を縮合反応
によって付加し、ペプチド鎖を伸長するペプチド固相合
成では、反応液としてＮ保護基の脱保護剤、ペプチド結
合形成のためのアシル化剤などが入れられており、洗浄
液としてはメチレンクロライド、ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリ
ドン、メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテルなどが使
用される。固相レジンのＮ保護基の脱保護、アシル成分
であるＮ保護アミノ酸の取込みの反応の間には、未反応
物、生成物などを除去するために、各々に適した洗浄液
をバルブを適当に切り換えながら順次反応槽に送る。ま
た、反応・洗浄の間は攪拌または混合の操作が入る。本
発明の反応槽は、前処理を要することなく、そのまま使
用され、ペプチドレジンが合成されたところで窒素気流
にて乾燥させたまま反応槽ごと上下にキャップ等の封を
して保存しておく事が可能である。更にクリーベイジを
行う場合は、クリーベイジカクテル（例えばＴＦＡとス
カベンジャーの混合物）を流路Ｂより導入し、流路Ｂを
一部開いたまま反応槽下部より窒素ガスを少しづつ（あ
るいは時々）流してバブリング状とし１時間ないし数時
間放置したのち下部の窒素を止め、流路Ａより窒素を流
して加圧しカクテル液（レジンサポートより切断された
ペプチドを含む）を回収する。なお、共洗いで少量のＴ
ＦＡを再度Ｂより投入し、Ａより窒素圧で回収液と併
す。残ったレジンは反応槽とともに廃棄できる。
【００１１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。
【００１２】実施例１ stepwise法によるヒトエンドセリンフラグメント（３−
１３位）ウンデカペプチドの合成 ヒトエンドセリンは分子内に２個のジスルフィド結合を
有し、２１個のアミノ酸からなるペプチドである。この
中央部分のジスルフィド結合１個を有し、１１個のアミ
ノ酸からなる３位から１３位のフラグメントを本発明の
反応槽を用いて合成した。即ち、 Fmoc-Tyr(Brz)-OH を
常法によりベンジルオキシベンジルアルコールレジンに
導入し、出発物質とした。本発明の反応槽を用いてマニ
ュアルで図１の流路Ｂより stepwise に、Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Lys(Z)-OH,
Fmoc-Asp(02Ada)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmo
c-Ser(Bzl)-OH, Fmoc-Ser(Bzl)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH
の順に BOP-HOBt を用いて、Ｎ−メチルモルホリン存在
下で縮合させた。反応はすべてＤＭＦ中で行い、Ｎα−
Fmocの除去には３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用い
た。なお、反応槽にはポリプロピレンフィルターを槽底
部に充填したポリプロピレン製のものを使用した。
【００１３】各縮合反応の効率はカイザーテストによっ
て９９％以上の収率を確認した。各縮合反応は本発明の
反応槽内ですべて３０分以内に完結した。ここに得られ
た側鎖保護ウンデカペプチドレジンを９５％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）アニソールで処理し、ジエチルエーテ
ルで固化して側鎖の保護ペプチド、即ち、H-Cys(Acm)-S
er(Bzl)-Ser(Bzl)-Leu-Met-Asp(02Ada)-Lys(Z)-Glu(OBz
l)-Cys(Acm)-Val-Tyr(BrZ)-OH をほぼ定量的に得た。本
発明の反応槽は、ペプチドがレジンより切断され回収レ
ジンのみが残ったまま廃棄した。
【００１４】ここに得た側鎖保護ウンデカペプチド（５
００ｍｇ）を常法によってＨＦ処理した。即ち−５℃
下、ＨＦ反応装置によってアニソール（０．５ｍｌ）、
メチルエチルスルフィド（０．１ｍｌ）、ＨＦ（７ｍ
ｌ）で保護ペプチドを６０分間反応させた後、ＨＦを減
圧で除去、残渣にジエチルエーテルを加えて固化した。
得られた粗ペプチドは減圧下、Ｐ2 Ｏ5 ／ＫＯＨ上で乾
燥の後、ＴＦＡ（２ｍｌ）に溶解し、不溶物を濾去後、
ジエチルエーテルで固化し濾過した。濾過物を８０％酢
酸に溶解し、水で希釈して凍結乾燥させ、１９５ｍｇの
S-Acmウンデカペプチドを得た。
【００１５】ここに得られたペプチドをメチオニン（３
５５ｍｇ）存在下で１００ｍｌの４０％酢酸に溶解し、
１Ｎ塩酸１．５ｍｌを加え、激しい攪拌下、０．１Ｍヨ
ードメタノール溶液（１３．５ｍｌ）を加えた。４０分
反応後５００ｍｇのアスコルビン酸のクエン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）１００ｍｌでクエンチングした後、水で
希釈し９００ｍｌとした。得られた混合物を０．５％の
アンモニア水でｐＨ４．０とし、ダイアイオンＨＰ−２
０（１５０ｍｌ）のカラムに吸着させた。カラムは３５
０ｍｌの水で洗浄した後、０．１％ＴＦＡ−アセトニト
リル（１：８ｖ／ｖ）で洗い、ペプチドを溶出（ＵＶ２
８０ｎｍでモニター）した。得られたペプチド分画を凍
結乾燥させ、フリーの粗ペプチド１００ｍｇを得た。粗
ペプチドをプレパラティブＣ１８逆層クロマトグラフィ
ーで精製し、高純度ペプチド５０ｍｇを得た。
【００１６】得られた高純度ウンデカペプチドはＨＰＬ
Ｃで単一ピークを与え、酸加水分解によるアミノ酸組成
は理論値と一致した。即ち、 Asp 1.00 (1), Glu 1.13 (1), Ser 1.56 (2),
Tyr 0.92 (1),Val 0.93 (1), Met 0.78 (1),
Leu 0.96 (1), Lys 1.00 (1) ( ) 内は理論値、Cys は検定せず。 また、気相プロテインシーケンサーによって目的の一次
構造を確認し、さらに目的のジスルフィド結合も証明し
た。ＦＡＢ−ＭＳによる検定でも質量数Ｍ＋Ｈ1275.4
を得、計算値Ｃ52Ｈ83Ｎ12Ｏ19Ｓ3 ＝1275.5と一致し
た。
【００１７】実施例２ フラグメント法によるヒトのαＡＮＰ（３−２８）の合
成 ヒトαＡＮＰは１個の分子内ジスルフィド結合を有する
２８個のアミノ酸からなる心房ホルモンである。そのフ
ラグメント３位から２８位の２６個のアミノ酸よりなる
フラグメントペプチドはその全活性を有していることが
知られている。このペプチドを本発明の反応槽を用いて
合成した。
【００１８】まず、本発明の反応槽を用いる前に、常法
によって、ＡＮＰ２１〜２８位−ＰＡＭ−レジン、ＡＮ
Ｐ１７〜２０位の側鎖保護フラグメント、ＡＮＰ１１〜
１６位の側鎖保護フラグメントおよびＡＮＰ３〜１０位
の側鎖保護フラグメントを合成した。なお、これらは一
部本発明の反応槽を用い前述の様に合成できた。各フラ
グメントはＮαFmocＣ末端カルボキシル基フリー、さら
に側鎖官能基はすべて保護した。２１位から２８位を含
むＣ末フラグメントペプチドレジンは、別途ＨＦ処理を
行い遊離したペプチドの逆相ＨＰＬＣ（単一ピーク）、
ＦＡＢ−ＭＳによる質量分析気相シーケンス分析アミノ
酸分析により高純度目的物であることを確認した。ま
た、側鎖保護フラグメント（１７−２０）、（１１−１
６）、（３−１０）は各々 stepwise 法による市販のペ
プチド自動合成装置又は本発明の反応槽を手動で用いて
Fmoc-Bzl ストラテジーにて合成し、ＴＦＡを用いてレ
ジンよりペプチドを切出し、沈澱法によって逆相ＨＰＬ
Ｃで単一ピークを与える高純度ＮαFmoc側鎖保護ペプチ
ドとし、さらにアミノ酸分析ＦＡＢ−ＭＳにより目的物
であることを確認した。市販のガラス製反応装置を用い
るよりも本発明の反応槽を用いた方が、反応の確実性お
よび収量において有利であり、より高効率であった。２
１−２８位のペプチドレジンを出発物質とし、ここに得
た３種のフラグメントを本発明の反応槽内で順次縮合さ
せ、ペプチド鎖を延長させた。フラグメント縮合に際
し、アミノ酸成分のＮαFmoc基は３０％ピペリジンＤＭ
Ｆ溶液で処理し、アシル成分である各々保護フラグメン
トペプチドを縮合させた。
【００１９】カップリングはＤＭＦ中に溶解した２倍当
量のフラグメントペプチドによるアシル成分をＢｏｐ−
ＨＯＢｔで活性化したのち、アミノ酸成分に加えた。カ
イザーテストでアシル化をモニターし、４〜７時間の反
応の後、一部を取り出したレジンのカイザーテストよっ
て９９％以上の反応収率を確認した。さらに念の為０．
５ｍｌの１ＭアセチルイミダゾールのＮ−メチルピロリ
ドン溶液で未反応の−ＮＨ2 基をキャッピングし、次の
カップリングを行った。レジンの洗浄はすべてＤＭＦを
用いた。ピペリジンでＮαFmocを除去したペプチドレジ
ンをＤＭＦ、メチレンクロライド、メタノール、ｔ−ブ
チルメチルエーテルの順で、洗浄し乾燥した。収量はほ
ぼ定量的であった。
【００２０】ここに得られた側鎖保護（３−２８）ペプ
チド−ＰＡＭレジン（４７８ｍｇ）をＨＦ反応装置を用
い、アニソール０．５ｍｌ、メチルエチルスルフィド
０．５ｍｌ、ＨＦ１０ｍｌで脱保護と同時にレジンから
ペプチドの切離しを行った（０℃、６０分）。ＨＦを留
去後、残渣を酢酸エチルで固化し、沈澱を濾過、Ｐ2 Ｏ
5 ／ＫＯＨ上で減圧下１時間乾燥した後、２Ｎ酢酸５０
ｍｌに溶かして凍結乾燥し、１６５ｍｇのＳ−Acm αｈ
ＡＮＰ（３−２８）を得た。これを１Ｍ酢酸を溶出液と
した Sephadex G-25 fine(２６φ×７７０ｍｍ）で処理
し、得られた主フラクションを凍結乾燥してＳ保護粗ペ
プチド１４０ｍｇを得た。さらに逆相ＨＰＬＣで精製
し、ＦＡＢ−ＭＳ、アミノ酸分析、気相シーケンサーに
よる分析により目的物であることが確認された。
【００２１】実施例３ 並行に複数のペプチドを合成し、同時に並行してクリー
ベイジを行った例 H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OHとH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH
の２種のエンケファリンを同時合成した。即ち、ＮαFm
ocアミノ酸を用いスタートレジンとしてそれぞれFmoc-M
et- ベンジルオキシベンジルアルコールレジンおよびFm
oc-Leu- ベンジルオキシベンジルアルコールレジンを用
い、順次、ピペリジン処理によりＮα保護の Fmoc 基を
外した２当量の Fmoc アミノ酸を、３当量のＮメチルモ
ルホリン存在下各２当量のBop およびHOBtを作用させて
結合した。１位のTyr は Fmoc-Tyr(tBu)OHで導入し、ピ
ペリジン処理の後、乾燥させた本発明の反応槽の下を閉
じた状態でアニソール、エタンジチオールのスカベンジ
ャーを混合したＴＦＡを流路Ｂより加え、時々窒素ガス
を下から通じてバブリングさせ、レジンとＴＦＡを混和
した。６０分後に下から回収したものを遠心チューブに
うけ、反応槽の上部流路Ｂより窒素ガスを通じて加圧
し、ＴＦＡをすべて遠心チューブに流した。残留レジン
と反応槽は廃棄した。チューブ内には、クリーベイジさ
れたペプチドがスカベンジャー混合ＴＦＡに溶解してい
る（この操作は２本並行して同時に行った）。ここにジ
エチルエーテルを加えると白濁した。チューブを３５０
０rpm で遠心して沈澱を得、上清を除去した。沈澱物を
乾燥後これを１０％の酢酸に溶解し、凍結乾燥して目的
物を得た。なお、反応槽にはポリプロピレンフィルター
を槽底部に充填したポリプロピレン製のものを使用し
た。
【００２２】実施例４ 活性エステル法によるロイシンエンケファリンの合成 ロイシンエンケファリンはH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OHで
表されるペンタペプチドである。Fmoc-Leu- ベンジルア
ルコールレジンを出発物質とし、ＮαＦmoc の除去には
３０％のピペリジン−ＤＭＦを用い、１０倍当量の活性
エステル、即ち、各々Fmoc-Phe-OPfP 、Fmoc-Gly-OPfP
、Fmoc-Gly-OPfP 、Fmoc-Tyr(But)OH をＤＭＦを溶媒
として室温で３０分の反応により順次縮合させ、ＮαFm
oc-Tyr(But)-Gly-Gly-Phe-Leu-レジンを定量的に得た。
このペプチドレジンをＤＭＦ、メチレンクロライド、メ
タノール、t-ブチルメチルエーテルの順で洗浄後乾燥さ
せた。
【００２３】得られたペプチドレジンを本発明の反応槽
に入れたまま下部および上部を封じ、５％アニソール、
２．５％エタンジチオール入りＴＦＡで室温６０分間放
置した後、窒素ガスを加圧してペプチドが溶解した液相
をシリンジ下部より取り出し、遠心管に受けた。残留レ
ジンと反応槽は廃棄した。得られたＴＦＡ溶液に冷ジエ
チルエーテルを加えて得た沈澱を遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ×５分）で集めた。沈澱はジエチルエーテルで洗っ
た後、窒素雰囲気下で乾燥した。粗ペプチドを５０％酢
酸に溶解し、そのまま５倍に希釈して凍結乾燥し目的物
を得た。得られたペンタペプチド（ロイシンエンケファ
リン）は逆相ＨＰＬＣで鋭い単一ピークを示し、アミノ
酸分析、気相シーケンス分析、ＦＡＢ−ＭＳともに理論
値とよく一致し、目的物であることを確認するとともに
ディレーションペプチドの混在は認められなかった。な
お、反応槽にはポリプロピレンフィルターを槽底部に充
填したポリプロピレン製のものを使用した。
【００２４】
【発明の効果】本発明の反応槽は使い捨ての反応槽とし
て用いることができ、従来のようなガラス製と異なり反
応槽内に固相レジンを充填する際に槽壁に付着すること
もなく、またグラスフィルターと異なり高分子樹脂を使
用することから、目詰まりの心配がなくそのため酸処理
などの前処理を必要としない。本発明の反応槽を用いる
と、同時に複数の合成がパラレルに行いうるため、同一
のあるいは異なったペプチドを複数個の反応槽で行い、
同一のペプチドの場合クリーベイジの最適条件を決める
（スカベンジャーの量や種類、組み合わせ等を変えて）
ためにも適している。また数種の異なったペプチドを異
なった方法で並行に合成し、合成方法を評価するために
も適している。
【００２５】従って、本発明の反応槽を用いた操作をコ
ンピュータ制御可能な状態で利用すれば、一部あるいは
全体に自動的連続的にペプチドやＤＮＡなどの合成が可
能となる。また、本発明の反応槽は、ペプチド合成、Ｄ
ＮＡ合成のみならず液／固反応、気／液反応、気／固反
応等における反応槽として広く応用できる。また、本発
明の反応槽で合成を行った場合には、この容器から合成
した保護ペプチドレジンを取り出すことなくそのままこ
の反応槽内でクリーベイジを行いうるという利点があ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリプロピレンフィルターを反応槽内に充填し
た反応槽を使用した合成装置の概略を示す図である。
【符号の説明】
１ 反応槽 ２ ポリプロピレンフィルター ３ 固相レジン ４ 排液貯め

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 固相レジンを用いる合成反応用の反応槽
    であって、ポリアルキレンフィルターを反応槽内の槽底
    部に充填してなる合成用反応槽。
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