CN113801200A - 一种卡贝缩宫素的制备方法 - Google Patents

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CN113801200A CN202111145314.7A CN202111145314A CN113801200A CN 113801200 A CN113801200 A CN 113801200A CN 202111145314 A CN202111145314 A CN 202111145314A CN 113801200 A CN113801200 A CN 113801200A
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Abstract

本申请公开了一种卡贝缩宫素的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：获得带有Rx‑linker的氨基树脂，将连接单元I通过其侧链羧基偶联i于氨基树脂的linker上，得到肽树脂I，接着在肽树脂I的连接单元I上依次偶联ii连接单元II～V，得到肽树脂V，切割，环化，得到所述卡贝缩宫素。所述制备方法工艺路线简单、反应过程稳定性更好，副反应更少。

Description

一种卡贝缩宫素的制备方法
技术领域
本申请涉及一种卡贝缩宫素的制备方法，属于医药合成技术领域。
背景技术
在专利CN201510897369.1中，技术路线如图1所示：此工艺路线中采用了Pro的wang树脂的方法，氨基酸Pro本身并不适合采用wang树脂作为第一个氨基酸，因为非常容易发生DKP关环的副反应。另外，在此路线中，采用了固相脱除Cys上的MTT方法，并通过固相的方法让Cys与4-溴丁酸反应得到相应的Cys衍生物，从而实现固相的环化工作。但在此方法中，采用了酸碱混用的方法，先是一个碱性的合成条件，然后用一个酸性的MTT脱除条件，后又转化成一个碱性的合成条件，涉及到非常多的酸碱中和反应，在工艺放大中，酸碱反应风险较高，容易出现安全风险。
在专利CN201610728294.9中，技术路线如图2所示，在该技术路线中，使用了非常规树脂MOBHA树脂，在固相脱除tBu的时候不能判断反应程度，存在较大风险，并且较高浓度的TFA会导致MOBHA树脂的裂解，降低肽树脂收率。
在专利CN201110001400.0中，技术路线如图3所示，在该技术路线中，使用了非常规原料Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOBzl)-OH，需要自己合成，如此工艺路线中便涉及到如何脱除保护基Bzl的问题。一般在该保护基保护巯基的情况下不太好脱除，需要用到比较苛刻的切割条件，苛刻的切割条件会导致多肽序列中的Gln以及Asn分解成Glu和Asp，导致最终收率降低。所以，该方法是存在技术理论风险的。放大是否适应需要深究。
在专利CN201410461695.3中，技术路线如图4所示，在该技术路线中，使用了Pam树脂，但这个对提高产能和优化工艺并没有多大的效果。而在工艺的关键部分还是选择了采用Cys(MMT)与卤代丁酸的关环反应来获得最终产品。在MMT脱除反应中，不易判断是否脱除干净，若有残留，极易出现不能环化上的中间体杂质，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Asn-OH均使用侧链未保护的氨基酸，易引发副反应。反应本身存在的风险以及中途过程中的酸碱转化操作就导致该工艺并不适合放大。
在专利CN201210255959.0中，技术路线如图5所示，在该技术路线中，采用了Fmoc-Cys-OH作为了连接氨基酸，难以实现大量生产。该技术方案不可采取。
在专利CN201610328262.X中，技术路线如图6所示，
在该技术路线中，进行了两次纯化，耗时较长，不便于放大。并且是通过了一个很复杂的途径获得了一个原料。不适合放大生产。
在专利CN201610189424.6中，技术路线如图7所示，在该技术路线中，使用的Fmoc-Cys(Alloc)-OH的脱保护较为昂贵，并且在本工艺路线中采用了四三苯基磷钯和苯硅烷为Alloc的脱除试剂，可能会存在钯催化剂中毒的问题。放大过程中不知道如何避免。
在专利CN10201900676760中，技术路线如图8所示，在该工艺路线中，固相合成策略显然是比较成熟的，生产简单明了，但是原料四肽Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-OH的合成相对就比较困难。但如果可以克服，将可以适合公斤级的线性肽的生产。
在专利CN201110001400.0中，技术路线如图9所示，本工艺采用了Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOBzl)-OH代替了Fmoc-Cys
(CH2CH2CH2COOtBu)-OH的方案来合成卡贝缩宫素，但是从原料易得程度和脱保护的容易程度以及合成副反应程度来讲，均不如使用原料Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOtBu)-OH。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种卡贝缩宫素的制备方法，所述制备方法中，以Asn或Gln为关环合成位点，所述制备方法工艺路线简单、反应过程稳定性更好，副反应更少。
一种卡贝缩宫素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
获得带有Rx-linker的氨基树脂，将连接单元I通过其侧链羧基偶联i于氨基树脂的linker上，得到肽树脂I，接着在肽树脂I的连接单元I上依次偶联ii连接单元II～V，得到肽树脂V，切割，环化，得到所述卡贝缩宫素；
所述连接单元I为Ri-Asp-OR1，所述连接单元II～V依次为Rii-Gln(Ra)-OH、Riii-Ile-OH、Riv-Tyr(Rb)-OH、Rv-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2；
或；
所述连接单元I为RI-Glu-OR2，所述连接单元II～V依次为RII-Ile-OH、RIII-Tyr(RA)-OH、RIV-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2、RV-Asn(RB)-OH；
所述R1和R2为氨基酸主链羧基的保护基团，独立地选自羧基保护基团中的任一种；
所述linker含有氨基，所述Rx为linker上的氨基保护基团，所述Ri、Rii、Riii、Riv、Rv、RI、RII、RIII、RIV和RV为氨基酸主链氨基的保护基团；
所述Rx、Ri、Rii、Riii、Riv、Rv、RI、RII、RIII、RIV和RV独立地选自氨基保护基团中的任一种；
所述Ra、Rb、RA、RB为氨基酸侧链的保护基团，其中，Ra选自Gln侧链保护基团中的任一种，Rb、RA独立地选自Tyr侧链保护基团中的任一种，RB选自Asn侧链保护基团中的任一种。
本申请用Asp或Glu代替常规的Asn或Gln作为起始，在氨基树脂上合成线性肽树脂，当线性肽树脂从氨基树脂上切割下来的同时，Asp或Glu就会变成Asn或Gln。之后进行酰胺键环化关环。而以Asp或Glu代替常规的Asn或Gln作为起始氨基酸连接于氨基树脂，最终以Asn或Gln为关环合成位点的制备方法工艺路线简单、反应过程稳定性更好，副反应更少。
可选地，所述氨基树脂选自AM树脂、MBHA树脂中的至少一种；
所述linker包括4-[(2,4-二甲氧基苯基)(氨基)甲基]苯氧乙酸；
所述羧基保护基团选自烷基、取代烷基、烯基、苄基、取代苄基、脂类中的任一种；
所述氨基保护基团包括Fmoc；
所述Gln侧链保护基团包括Trt；
所述Tyr侧链保护基团包括Me；
所述Asn侧链保护基团包括Trt；
可选地，所述烷基选自甲基、乙基、叔丁基中的任一种；
可选地，所述取代烷基选自取代甲基或取代乙基，所述烯基选自烯丙基，所述取代苄基选自2，2-二甲基苄基或对甲氧基苄基，所述脂类为2-(三甲基硅基)乙酯；
可选地，所述取代甲基为氰甲基。
可选地，所述偶联i为：
(S1)将带有Rx-linker的氨基树脂脱氨基保护基团得到中间体I，
(S2)将含有连接单元I、缩合剂、溶剂的原料活化，和中间体I混合，反应，得到肽树脂I。
所述偶联ii为：
(Sa)将肽树脂n脱氨基酸主链氨基的保护基团得到中间体n+I，
(Sb)将含有连接单元n+I、缩合剂、溶剂的原料活化，和中间体n+I混合，反应，得到树脂肽n+I；
所述n为I、II、III或IV。
本申请中，偶联连接单元II～V时，每个连接单元的偶联步骤独立地适用偶联ii所描述的步骤，当n为I时，肽树脂n为肽树脂I，连接单元n+I为连接单元II，即此时偶联ii为在肽树脂I上偶联连接单元II的步骤。其他连接单元的偶联以此类推。
可选地，(S1)或(Sa)中氨基保护基团的脱除包括：将带有Rx-linker的氨基树脂或肽树脂n与脱保护液混合，非活性气体条件下脱保护30～35min；
可选地，所述脱保护液包括脱保护剂和溶剂；
所述脱保护剂包括哌啶；
所述溶剂包括DMF、DMSO、NMP、DCM中的至少一种；
可选地，所述脱保护剂和所述溶剂的体积比为300∶1000～1200；。
可选地，(S2)或(Sb)中所述缩合剂选自以下缩合剂组合中的任一种：DIC/HOBt、DIC/HOAt、DIC/HOOBt、DIC/Oxyma、HBTU/NMM/DIEA。
可选地，(S2)或(Sb)中所述活化的条件包括：活化温度为2～8℃，活化时间为5～20min。
可选地，(S2)或(Sb)中所述反应的条件包括：非活性气体条件下，反应时间为45～100min。
可选地，所述切割为将肽树脂V和切割液混合，在28～32℃条件下，切割2.5～3h；
可选地，所述切割液含有TFA∶Tis∶EDT∶PhOH∶H2O的体积比为87.5∶5∶2.5∶2.5∶2.5。
可选地，所述肽树脂V和所述切割液的比例比为1g∶8～10ml。
可选地，所述环化选自固相环化或液相环化中的任一种；
可选地，当所述羧基保护基团选自甲基、乙基、烯丙基、2,2-二甲基苄基、对甲氧基苄基、氰甲基、2-(三甲基硅基)乙酯中的任一种时，所述环化为固相环化；
当所述羧基保护基团为叔丁基时，所述环化为液相环化。
在本申请所提供的方案中，卡贝缩宫素中的氨基酸基团Asn与Gln采用主链氨基与主链羧基被不同官能团保护的Asp以及Glu的衍生物进行反应得到，例如Fmoc-Asp-OR1以及Fmoc-Glu-OR2，其中R1和R2可以是叔丁基，烯丙基，苄基，取代苄基，2，2-二甲基苄基，对甲氧基苄基，甲基，乙基，取代甲基和取代乙基等。
当R1和R2为固相易脱除保护基时，例如甲基，乙基(固相水解脱除)，烯丙基(钯催化和水解脱除)，2,2-二甲基苄基(1％TFA脱除)，对甲氧基苄基(1％TFA脱除)，氰甲基(Na2S脱除)，2-(三甲基硅基)乙酯(氟离子脱除)等时，卡贝缩宫素的环化可以采用固相环化的方法，从而节省大量的溶剂成本和提高生产效率；当R1和R2为叔丁基等适用高浓度TFA脱除的保护基时，则可以采用树脂切割后再进行环化的合成方案，采用液相环化的方法。
当采用Asn为关环合成位点时，其依次连接的氨基酸为Fmoc-Linker，Fmoc-Asp-OR1，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(Me)-OH，Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2；当采用Gln为关环合成位点时，其依次连接的氨基酸为Fmoc-Linker，Fmoc-Glu-OR2，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(Me)-OH，Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2，Fmoc-Asn(Trt)-OH。
氨基酸连接与环化方式为DIC/HOBt、HOAt，Oxyma等组合，HBTU/HATU等与DIEA或NMM组合等常规缩合剂组合。
本合成方案以Fmoc-Asp-OR1或Fmoc-Glu-OR2的侧链羧基与树脂上的Linker连接为起点，通过改变氨基酸Asp以及氨基酸Glu不同的主链保护基，并将其余的多肽片段氨基酸化，形成独立的固相连接合成单元，然后通过常规的固相合成操作，得到与之对应的液相或者是固相环化的卡贝缩宫素中间体或者树脂中间体，之后在酸性条件下裂解即可得到卡贝缩宫素中的Asn和Gln氨基酸。
本发明以固相合成为主要合成方法，以酰胺键环化的方式来获得卡贝缩宫素产品的工艺设计路线。其中的固相合成周期短，液相自制原料放大容易，成本低，并且对卡贝缩宫素产品中的缺失Gly杂质容易控制，使得分离纯化容易。液相关环为多肽常规反应，效率高，收率高。
在本发明举例中，以Asp侧链羧基作为连接氨基树脂的位点进行固相合成，卡贝缩宫素中间体从树脂上切割下来之后通过液相合成的方法进行酰胺键关环反应。
以酰胺键为环化位点的收率高于以巯基和卤代丁酸的亲核取代反应的环化反应，副产物也明显少于亲核取代反应。
在一般固相合成中，出现缺失了Gly的杂质的情况非常多，且缺失Gly的杂质多肽一般情况下难以分离；在本发明中，采用了偶连Gly片段的方案，Gly片段可以通过液相合成及重结晶的方法有效地控制缺失Gly杂质的含量。
本发明中，随着Asp与Glu主链保护基的不同，可以采用不同的环化方式。其中固相环化经济效益最高，也是最方便的。固相环化与液相环化相比，可以大大的节省溶剂的使用，并且不需要浓缩液相环化所需要的溶剂，大大节省生产周期。
固相环化批量化生产所需购买的设备比较少，厂房占地小，溶剂使用量相对较少；并且固相环化放大生产过程的控制点少，操作环节简单，固相环化完成后可以直接获得所需要的粗肽产品，生产周期短。
液相环化的优点为前期工作相对简单。
在本发明专利中，所有原料起始物料均为廉价易得原料。
本发明从卡贝缩宫素结构中的Asn以及Gln作为起始氨基酸出发，利用Fmoc-Asp-OR1以及Fmoc-Glu-OR2与Linker连接为起点通过改变氨基酸Asp以及氨基酸Glu不同的主链保护基，并将其余的多肽片段氨基酸化，形成独立的固相连接合成单元，然后通过普通的固相合成操作，得到与之对应的液相或者是固相环化的卡贝缩宫素中间体或者树脂中间体，之后在酸性条件下裂解即可得到卡贝缩宫素中的Asn和Gln氨基酸。
本申请提供一种卡贝缩宫素的制备方法，以酰胺键环化获得卡贝缩宫素，包括以下步骤：
1)以氨基树脂为树脂载体，其树脂有AM树脂，MBHA树脂等；连接Linker，常用Linker有Fmoc-Linker。
2)连接首个氨基酸：连接首个氨基酸有Fmoc-Asp-OR1；Fmoc-Glu-OR2。
3)逐个连接其余氨基酸：Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(Me)-OH，Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2；Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(Me)-OH，Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2，Fmoc-Asn(Trt)-OH。
4)主链连接脱保护Fmoc：5-30％Pip/DMF，1-5％DBU/DMF。
5)连接过程使用的缩合剂：DIC/HOBt，DIC/HOAt，DIC/HOOBt，DIC/Oxyma，HBTU/NMM/DIEA等。
6)连接过程使用的溶剂：DMF/DMSO/NMP/DCM的单一溶剂或者混合溶剂。
7)脱除R1或R2方法：当R1和R2为固相易脱除保护基例如甲基，乙基(固相水解脱除)，烯丙基(钯催化和水解脱除)，2,2-二甲基苄基(1％TFA脱除)，对甲氧基苄基(1％TFA脱除)，氰甲基(Na2S脱除)，2-(三甲基硅基)乙酯(氟离子脱除)等时，卡贝缩宫素的环化可以采用固相环化的方法，从而节省大量的溶剂成本和提高生产效率；当R1和R2为叔丁基等适用高浓度TFA脱除的保护基时，则可以采用树脂切割后再进行环化的合成方案，采用液相环化的方法。
8)环化条件：氨基酸连接与环化方式为DIC/HOBt、HOAt，Oxyma等组合，HBTU/HATU等与DIEA或NMM组合等常规缩合剂组合。
9)切割条件：一定比例的TFA/Tis/EDT/PhOH/H2O。
本申请中，英文/缩写说明如下：
Asp：天冬氨酸
Gln：谷氨酰胺
Ile：异亮氨酸
Tyr：酪氨酸
Cys：半胱氨酸
Pro：脯氨酸
Leu：亮氨酸
Gly：甘氨酸
Asn：天冬酰胺
AM树脂：氨甲基聚苯乙烯树脂
MBHA树脂：4-甲苯氢胺树脂
Fmoc：9-芴甲氧羰基
Trt：三苯甲基
Me：甲基
Trt：三苯甲基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DCM：二氯甲烷
DIC：N,N’-二异丙基二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：1-羟基7-偶氮苯并三氮唑
HOOBt：3-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪
Oxyma：2-肟氰乙酸乙酯
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
NMM：N-甲基吗啉
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
TFA：三氟乙酸
Tis：三异丙基硅烷
PhOH：苯酚
EDT：1,2-乙二硫醇
本申请能产生的有益效果包括：
(1)本申请所提供的卡贝缩宫素的制备方法，以Asn或Gln为关环合成位点：通过将Asp或Glu的保护氨基酸的侧链羧基与氨基树脂上的Linker缩合为起点，从Asp或Glu的C端向N端进行依次偶联其他连接单元合成，之后经过酸性条件下裂解即可得到卡贝缩宫素中的Asn和Gln氨基酸。采用该工艺路线进行卡贝缩宫素制备，相比于采用其他氨基酸和其他树脂偶联作为起点，本申请反应过程稳定性更好，反应过程控制更容易，有利于扩大化生产。
(2)本申请所提供的卡贝缩宫素的制备方法，通过起始氨基酸主链氨基酸保护基团的调整，可以灵活选择固相环化或液相环化的方式进行关环反应。
(3)本申请所提供的卡贝缩宫素的制备方法，通过以(Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2)的形式引入Cys片段，形成独立的固相连接合成单元，用于肽树脂的制备，可以有效控制缺失Gly杂质的含量。
附图说明
图1为CN201510897369.1中的技术路线。
图2为CN201610728294.9中的技术路线。
图3为CN201110001400.0中的技术路线。
图4为CN201410461695.3中的技术路线。
图5为CN201210255959.0中的技术路线。
图6为CN201610328262.X中的技术路线。
图7为CN201610189424.6中的技术路线。
图8为CN10201900676760中的技术路线。
图9为CN201110001400.0中的技术路线。
图10为本申请实施例1制备得到的卡贝缩宫素HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请实施例中所用的linker为4-[(2,4-二甲氧基苯基)(氨基)甲基]苯氧乙酸。
实施例1卡贝缩宫素的合成
具体操作步骤：
(1)AM树脂溶胀
称取1.0mmol/g AM Resin(60mmol，60g)，加入反应器中，加入20％哌啶/DMF溶液(2.0L)，溶胀0.5h。溶胀结束，抽滤，使用DMF洗涤5次，每次1.5L。
(2)Fmoc-Linker偶联
1)称取Fmoc-Linker(120mmol，64.68g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，0.5h后，加入NMM(60mmol，6.7ml)，继续反应2.5h，茚三酮检测判定反应终点，反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Linker-AM Resin。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后，将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L，得到H-Linker-AM Resin。
(3)Fmoc-Asp-OtBu偶联
1)称取Fmoc-Asp-OtBu(120mmol，49.3g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，茚三酮检测判定反应终点，1.5h后反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后，将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L，得到H-Asp(Linker-AMResin)-OtBu。
(4)Fmoc-Gln(Trt)-OH偶联
1)称取Fmoc-Gln(Trt)-OH(120mmol，73.3g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，茚三酮检测判定反应终点，1.5h后反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后，将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h(即30min)，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L，得到H-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
(5)Fmoc-Ile-OH偶联
1)称取Fmoc-Ile-OH(120mmol，42.4g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，茚三酮检测判定反应终点，1.5h后反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后。将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L，得到H-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
(6)Fmoc-Tyr(Me)-OH偶联
1)称取Fmoc-Tyr(Me)-OH(120mmol，50.1g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，茚三酮检测判定反应终点，1.5h(即90min)后反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后。将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L。之后用MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，溶剂每次用量1.5L，抽干，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu。
(7)Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2偶联
1)称取Fmoc-Cys(CH 2 CH 2 CH 2 COOH)-Pro-Leu-Gly-NH 2 (120mmol，83.4g)，HOBt(120mmol，16.2g)，加入活化杯中，加入DMF(200ml)，溶清，降温至4℃，缓缓加入DIC(120mmol，18.9ml)，边加边搅拌，控制温度保持在2～8℃，加入完成后，保持在2～8℃活化5min，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，茚三酮检测判定反应终点，1.5h后反应完全，抽滤，使用DMF洗涤3次，每次1.5L，得到Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu)-Pro-Leu-Gly-NH2。
2)配制脱保护液：量取哌啶(300ml)，加入DMF(1200ml)，混合均匀后。将脱保护液加入反应器中，鼓氮气脱保护0.5h，抽滤，DMF洗涤5次，每次1.5L。之后用MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，溶剂每次用量1.5L，抽干，得到H-Cys(CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asp(Linker-AM Resin)-OtBu)-Pro-Leu-Gly-NH2。
(8)切割
1)称量肽树脂量，计算切割液用量(切割液：肽树脂＝8ml∶1g)，配制切割液，体积比(TFA∶Tis∶EDT∶PhOH∶H2O＝87.5∶5∶2.5∶2.5∶2.5)，搅拌均匀后，将肽树脂加入切割液中，控制切割温：28～32℃，切割3h，过滤，切割液使用乙醚(0℃)沉降(乙醚∶切割液＝5ml∶1ml)，过滤，滤饼使用乙醚打浆过滤洗涤3次(乙醚∶粗品＝3ml∶1ml)，真空干燥，得到H-Cys(CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-OH)-Pro-Leu-Gly-NH2。
(9)环化
1)称量粗品中间体，计算粗品中间体规模。得到粗品50.3g。
2)环化：称取粗品(47.4mmol，50.3g)，用DMF(125ml)溶解粗品，配制成溶液1；称取HBTU(71.1mmol，26.95g)，加入DMF(75ml)，搅拌，加入DIEA(189.6mmol，31.4ml)，搅拌配制成溶液2，冰浴降温值3℃，搅拌下，将溶液1缓慢滴加至溶液2中(滴加速度5～6ml/min)，滴加过程中控制反应液温度3℃，滴加完成后，继续搅拌10min，测MS检测反应程度。
3)浓缩：将DMF溶液浓缩1/2。
(10)纯化
将浓缩液进行纯化处理，冻干得成品20.5g，收率39.7％。
(11)检测结果
检测方法：A液：0.1％TFA/水溶液
B液：0.1％TFA/乙腈溶液
检测梯度：28％-38％in 20min。
检测结果：纯度99.5734％，最大单杂0.154％，表明纯度好。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
获得带有Rx-linker的氨基树脂，将连接单元I通过其侧链羧基偶联i于氨基树脂的linker上，得到肽树脂I，接着在肽树脂I的连接单元I上依次偶联ii连接单元II～V，得到肽树脂V，切割，环化，得到所述卡贝缩宫素；
所述连接单元I为Ri-Asp-OR1，所述连接单元II～V依次为Rii-Gln(Ra)-OH、Riii-Ile-OH、Riv-Tyr(Rb)-OH、Rv-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2；
或；
所述连接单元I为RI-Glu-OR2，所述连接单元II～V依次为RII-Ile-OH、RIII-Tyr(RA)-OH、RIV-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2、RV-Asn(RB)-OH；
所述R1和R2为氨基酸主链羧基的保护基团，独立地选自羧基保护基团中的任一种；
所述linker含有氨基，所述Rx为linker上的氨基保护基团，所述Ri、Rii、Riii、Riv、Rv、RI、RII、RIII、RIV和RV为氨基酸主链氨基的保护基团；
所述Rx、Ri、Rii、Riii、Riv、Rv、RI、RII、RIII、RIV和RV独立地选自氨基保护基团中的任一种；
所述Ra、Rb、RA、RB为氨基酸侧链的保护基团，其中，Ra选自Gln侧链保护基团中的任一种，Rb、RA独立地选自Tyr侧链保护基团中的任一种，RB选自Asn侧链保护基团中的任一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基树脂选自AM树脂、MBHA树脂中的至少一种；
所述linker包括4-[(2,4-二甲氧基苯基)(氨基)甲基]苯氧乙酸；
所述羧基保护基团选自烷基、取代烷基、烯基、苄基、取代苄基、脂类中的任一种；
所述氨基保护基团包括Fmoc；
所述Gln侧链保护基团包括Trt；
所述Tyr侧链保护基团包括Me；
所述Asn侧链保护基团包括Trt；
优选地，所述烷基选自甲基、乙基、叔丁基中的任一种；
优选地，所述取代烷基选自取代甲基或取代乙基，所述烯基选自烯丙基，所述取代苄基选自2，2-二甲基苄基或对甲氧基苄基，所述脂类为2-(三甲基硅基)乙酯；
优选地，所述取代甲基为氰甲基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联i为：
(S1)将带有Rx-linker的氨基树脂脱氨基保护基团得到中间体I；
(S2)将含有连接单元I、缩合剂、溶剂的原料活化，和中间体I混合，反应，得到肽树脂I；
所述偶联ii为：
(Sa)将肽树脂n脱氨基酸主链氨基的保护基团得到中间体n+I；
(Sb)将含有连接单元n+I、缩合剂、溶剂的原料活化，和中间体n+I混合，反应，得到树脂肽n+I；
所述n为I、II、III或IV。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(S1)或(Sa)中氨基保护基团的脱除包括：将带有Rx-linker的氨基树脂或肽树脂n与脱保护液混合，非活性气体条件下脱保护30～35min；
优选地，所述脱保护液包括脱保护剂和溶剂；
所述脱保护剂包括哌啶；
所述溶剂包括DMF、DMSO、NMP、DCM中的至少一种；
优选地，所述脱保护剂和所述溶剂的体积比为300∶1000～1200。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(S2)或(Sb)中所述缩合剂选自以下缩合剂组合中的任一种：DIC/HOBt、DIC/HOAt、DIC/HOOBt、DIC/Oxyma、HBTU/NMM/DIEA。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(S2)或(Sb)中所述活化的条件包括：活化温度为2～8℃，活化时间为5～20min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(S2)或(Sb)中所述反应的条件包括：非活性气体条件下，反应时间为45～100min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切割为将肽树脂V和切割液混合，在28～32℃条件下，切割2.5～3h。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述肽树脂V和所述切割液的比例为1g：8～10ml。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化选自固相环化或液相环化中的任一种；
优选地，当所述羧基保护基团选自甲基、乙基、烯丙基、2,2-二甲基苄基、对甲氧基苄基、氰甲基、2-(三甲基硅基)乙酯中的任一种时，所述环化为固相环化；
当所述羧基保护基团为叔丁基时，所述环化为液相环化。
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