CN114249801A - 一种环肽化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种环肽化合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114249801A
CN114249801A CN202111511299.3A CN202111511299A CN114249801A CN 114249801 A CN114249801 A CN 114249801A CN 202111511299 A CN202111511299 A CN 202111511299A CN 114249801 A CN114249801 A CN 114249801A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conh
compound
formula
cyclic peptide
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111511299.3A
Other languages
English (en)
Inventor
陈弓
李博
王岚
陈祥祥
何刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN202111511299.3A priority Critical patent/CN114249801A/zh
Publication of CN114249801A publication Critical patent/CN114249801A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种环肽化合物及其制备方法和应用。本发明以带有二甲醛的芳香族环系前体作为连接子，在温和条件下，快速高效的以头‑侧链和侧链‑侧链两种方式对无保护肽链上的两个氨基进行成环标记，形成的异吲哚啉亚胺的结构较为稳定，同时还可以利用缺电子的亲电试剂进行后续修饰，得到更为复杂的结构。本发明所需样品用量少，反应体系干净，产物结构稳定；可适用于除半胱氨酸外所有含两个氨基肽链的环化反应。本发明为后续进行环肽分子库的构建以及高通量药物筛选提供了非常有利的支撑。

Description

一种环肽化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多肽化学合成领域，具体涉及一种环肽化合物及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白-蛋白相互作用(PPI)在生物体的生命活动中起着十分重要的作用。大部分蛋白-蛋白相互作用(PPIs)发生在短肽和球状蛋白之间；参与表面相互作用的多肽发挥着重要作用，利用多肽修饰干扰蛋白-蛋白相互作用有很大的应用前景。与线性肽相比，环肽化合物显示出更强的刚性，同时具有更高的酶解稳定性、膜通透性以及较高的口服利用率。目前，已经发展了许多构建环肽的策略，如利用Cu催化的炔基[3+2]环加成、Ru催化的烯烃复分解、Pd催化的半胱氨酸Cys-SH和赖氨酸Lys-NH2的芳基化、无金属催化二硫键的形成、恶二唑的形成和 Petasis-borono-Mannich反应构建环肽。这些策略的弊端在于：需要引入非天然氨基酸；需要过渡金属催化；需要非水溶剂等。因此，发展无金属催化剂在温和条件下对无保护肽链进行大环化策略仍亟待发展。
邻苯二甲醛(OPA)作为一种荧光试剂已被广泛应用于多肽的量化和蛋白质硫醇基团的检测中。最近，李学臣(J.Am.Chem.Soc.2019,141,12274)和Perrin(Angew.Chem.Int.Ed. 2019,58,14120)课题组分别报道了利用邻苯二甲醛(OPA)对无保护肽链上的半胱氨酸(Cys) 和赖氨酸(Lys)进行环化连接。其利用OPA与Cys的巯基与Lys的氨基形成异吲哚硫醚结构，但是这种结构在光和氧气的条件下会发生分解从而使装订断开。目前对肽链的大环化策略大多基于Cys，但是由于其在蛋白中丰度较低，因此通过探索其它氨基酸的亲核残基作为另一锚定位点能够拓展目前的多肽装订策略。
发明内容
鉴于以上所述现有的技术缺点，本发明的目的在于提供一种环肽化合物及其制备方法和应用。本发明以带有二甲醛的芳香族环系前体作为连接子，在温和条件下，快速高效的以头- 侧链和侧链-侧链两种方式对无保护肽链上的两个氨基进行成环标记，形成的异吲哚啉亚胺的结构较为稳定，同时还可以利用缺电子的亲电试剂进行后续修饰，得到更为复杂的结构。
邻苯二甲醛是商业可以买到的、价格便宜的用于检测氨基结构、蛋白和肽类化合物的衍生化试剂，衍生物产物通过高效液相色谱法进行检测。利用邻苯二甲醛作为连接子合成环肽，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的之一是提供一种环肽化合物，具有如下结构通式：
Figure BDA0003393114390000021
AA1至AAn代表氨基酸脱水缩合形成的肽链，且所述肽链的AAn为肽链C端；所述肽链AAn与-NH2之间通过酰胺键连接；n代表肽链的长度，n≤33；
所述肽链的原料选用的氨基酸为除半胱氨酸(Cys)和/或硒代半胱氨酸外的任意天然氨基酸；
所述肽链中AY对应于AA1至AAn-1中的任意位置；
当AY对应于肽链中AA1的位置时，AY-N对应的氨基酸中至少含有一处裸露的氨基；
当AY对应于肽链中AA2至AAn-1中的任意位置时，AY-N对应的氨基酸中仅含有一处裸露的氨基；
AX-N对应的氨基酸中仅含有一处裸露的氨基；
Ar选自芳香族环系。
优选地，当AY对应于肽链中AA1的位置时，AY-N对应的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸；
当AY对应于肽链中AA2至AAn-1中的任意位置时，AY-N对应的氨基酸选自赖氨酸(Lys) 或鸟氨酸(Orn)中的一种；
所述AX任意地选自赖氨酸或鸟氨酸中的一种。
优选地，所述芳香族环系Ar选自苯环、被卤素取代的苯环、被叠氮取代的烷基取代的苯环、萘环或噻吩中一种；优选所述芳香族环系Ar为以下基团的任意一种：
Figure BDA0003393114390000022
优选地，所述的环肽化合物具体为：
Figure BDA0003393114390000031
Figure BDA0003393114390000041
Figure BDA0003393114390000051
Figure BDA0003393114390000061
或化合物22-35对应的区域异构体；
所述区域异构体对应的结构为：
Figure BDA0003393114390000062
本发明的目的之二是提供本发明的目的之一所述的环肽化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
式I化合物、芳香族环系前体的原料在搅拌作用下在溶剂中进行分子内环化反应构建环肽，生成式II化合物；
所述式I化合物的结构式为：
Figure BDA0003393114390000063
所述芳香族环系前体为：
Figure BDA0003393114390000064
优选地，所述式I化合物对应的氨基酸序列选自H-AWGK-CONH2、H-IK-CONH2、H-GGK-CONH2、H-FLGKN-CONH2、H-MGFKR-CONH2、H-ESYK-CONH2、H-AVGK-CONH2、 H-RGDfK-CONH2、H-WQGGHK-CONH2、H-ALGEGFMK-CONH2、 H-EATGYMGQSGWK-CONH2、H-DEGPYRMEHFRWGSPPKD-CONH2、H-HAEGTFTSDVSSYLEGQA-AKEFIAWLVRGRG-COOH、H-HADGSFSDEMNTILDNL- CONH2、ATRDFINWLIQTKITD-COOH、H-AWGK-CONH2、H-ALGECYK-CONH2、 Ac-KWALK-CONH2、Ac-GKK-CONH2、Ac-AKLKP-CONH2、H-PPMKFEKT-CONH2、 Ac-YFLKAVK-CONH2、Nac-AKLMk-CONH2、Biotin-Orn-NGR-Orn-CONH2、 PA-KALLTFK-CONH2、Ac-EWAEKAAAKFLAAHA-CONH2、 Ac-LTF-Orn-EYWAQ-Cba-Orn-SAA-CONH2或
Figure BDA0003393114390000071
所述芳香族环系选自前体Ar I-Ar V中的一种，具体为：
Figure BDA0003393114390000072
优选地，所述式I化合物在溶剂中的浓度为5uM-50mM；
所述式Ⅰ化合物：芳香族环系前体的摩尔比为1:1；
反应时间为1-5min；
反应温度为室温；
所述溶剂为：PBS缓冲液/MeOH的混合溶液、H2O/MeOH和DIPEA的混合溶液、H2O /TFE和DIPEA的混合溶液、或TFE和DIPEA的混合溶液中的一种，优选PBS缓冲液/MeOH 的体积比为1:1；H2O/MeOH的体积比为1:1；H2O/TFE的体积比为1:1；
DIPEA的加入量为式I化合物加入量的三倍。
本发明的目的之三是提供本发明的目的之一所述的环肽化合物的应用，通过式II化合物与标记化合物在溶剂中进行二次成环标记，生成式III化合物；
Figure BDA0003393114390000073
优选，式II化合物在溶剂中的浓度为5uM-50mM，所述式II化合物：R1a-R1f的摩尔比为1:2-1:10。反应时间为15min-1h。
所述式II化合物的二次成环标记位点如下：
Figure BDA0003393114390000081
所述标记化合物为：
Figure BDA0003393114390000082
本发明的目的之四是提供本发明的目的之三所述的环肽化合物的应用制备的二次成环标记的环肽化合物，所述式III化合物的结构通式为：
Figure BDA0003393114390000083
所述R1为以下基团R1A-R1F的任意一种：
Figure BDA0003393114390000084
本发明的目的之五是提供本发明的目的之四所述的二次成环标记的环肽化合物的应用，其特征在于，
将式III化合物、甲氧胺在溶剂中进行三次次成环标记，生成式IV化合物；
更优选，式III化合物在溶剂中的浓度为5uM-50mM，所述式III化合物：甲氧胺的摩尔比为1:10。反应时间为10h。
Figure BDA0003393114390000091
所述式IV化合物的结构通式为：
Figure BDA0003393114390000092
式IV中-R1-R2为如下结构：
Figure BDA0003393114390000093
本发明与现有技术相比，至少具有以下有益效果：
1、该反应速度快，十分高效；
2、由邻苯二甲醛和两个氨基形成的异吲哚啉亚胺结构十分稳定，不对光、氧气敏感；
3、引入的异吲哚啉亚胺结构在波长为254nm下有较强的紫外吸收，在环化的同时可以实现荧光标记；
4、形成的异吲哚啉亚胺结构可以在同一位点发生二次标记和三次标记；
5、对除半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸外任意天然氨基酸均兼容。
6.、本发明优点在于反应迅速，在5mM浓度下，10s即可反应完全；在50uM浓度下，2min即可反应完全。
附图说明
图1为Lys自身OPA环化结构确证化合物1a的13C NMR谱图；
图2为实施例2-12制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图3为实施例13-15制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图4为实施例16-20制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图5为实施例21利用固相方法制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图6为实施例22-32制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图7为实施例33-35制备的环肽化合物对应的具体结构式
图8为实施例33制备的环肽化合物的LC-MS图；
图9为有保护基团合成的实施例33制备的环肽化合物的LC-MS图；
图10为实施例36-43制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图11为实施例44-45制备的环肽化合物对应的具体结构式；
图12为实施例8制备的环肽化合物的254nm下LC-MS测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
一、关环前体线性肽(即式I化合物)的制备如下式示意：
Figure BDA0003393114390000101
i)Fmoc保护基脱除；ii)氨基酸缩合；iii)Rink树脂的裂解。
i)Fmoc保护基的脱除：将20wt％哌啶/DMF加入到固相合成管中振摇反应10分钟，随后抽掉反应溶剂，以DMF，DCM分别洗两遍；再将上述操作重复一遍完成Fmoc保护基的脱除。
ii)氨基酸缩合：将Fmoc-AA-OH(包括Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH)(3.0equiv),2- 肟氰乙酸乙酯(3.0equiv)溶解到N-甲基吡咯烷酮(NMP)中并制成澄清溶液，随后向其中加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、(3.3equiv)并于冰水浴下反应5min，随后再将反应溶液加入到固相合成管中，室温下反应1.5小时。再将反应溶剂抽干，分别以DMF，DCM洗两遍，进行下一步脱保护反应。
iii)Rink树脂的裂解：将三氟乙酸、三异丙基硅烷和水按照95:2.5:2.5体积比制得裂解液，随后将其加入到固相合成管中，室温下反应1小时，随后将裂解液收集，除去溶剂，向残留物中加入冷乙醚将多肽沉淀出来，随后通过离心得到C-端为酰胺键的多肽粗品，即式I化合物。
本发明式I化合物均按照上述方法制得。
二、本发明的环肽化合物及其对应的制备方法
实施例1
以Lys自身OPA环化为例确定结构
Figure BDA0003393114390000111
将Lys(1.0equiv,0.02mmol,2.9mg)室温下溶于2mL PBS缓冲液(pH＝8.0)和2mLMeOH 中，随后称取2.68mg(1.0equiv)邻苯二甲醛(OPA)加入到溶液中，室温搅拌5min，得到Lys 自身环化的产物。通过HPLC进行纯化分离。Lys自身环化产物的1H-NMR、13C-NMR、 DEPT-135、HSQC和NOESY谱图列于图1.
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J＝7.8Hz,1H),7.77-7.70(m,2H),7.63-7.60(m, 1H),5.09–4.88(m,2H),4.51–4.40(m,2H),3.77–3.68(m,1H),2.35-2.26(m,1H),2.08-1.98(m, 1H),1.94-1.85(m,1H),1.75-1.59(m,2H),1.49-1.38(m,1H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ 170.3,157.8,141.2,132.9,129.2,128.6,123.3,121.6,58.8,55.1,45.7,34.2,28.6,21.7.
实施例2-15
以线性肽S2为例介绍头-侧链的环化过程
Figure BDA0003393114390000112
条件[A]:将线性肽(S2)(TFA salt,0.02mmol,13.1mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL PBS缓冲液(pH＝8.0)和2mL MeOH使线性肽完全溶解。随后称取2.68mg(1.0equiv)邻苯二甲醛加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
条件[B]:将线性肽(S2)(TFA salt,0.02mmol,13.1mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL H2O和2mL MeOH使线性肽完全溶解，随后加入3equiv DIPEA中和线性肽的TFA。随后称取2.68mg(1.0equiv)邻苯二甲醛加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
条件[C]:将线性肽(S2)(TFA salt,0.02mmol,13.1mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL H2O和2mL TFE使线性肽完全溶解，随后加入3equiv DIPEA中和线性肽的TFA。随后称取2.68mg(1.0equiv)邻苯二甲醛加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
条件[D]:将线性肽(S2)(TFA salt,0.02mmol,13.1mg)称重于8mL反应瓶中，加入4mL TFE使线性肽完全溶解，随后加入3equiv DIPEA中和线性肽的TFA。随后称取2.68mg(1.0 equiv)邻苯二甲醛加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
实施例2-15对应的反应条件和产率如表1所示。
表1
Figure BDA0003393114390000121
(实施例2-12的式Ⅰ化合物均在5mM浓度下完成，实施例13-15的式Ⅰ化合物均在1mM浓度下完成)
头-侧链OPA环化产物的表征，实施例2-15对应的反应物和表征结果如表2所示，实施例2-15对应的产物的结构式如图2和图3所示。
表2
Figure BDA0003393114390000122
Figure BDA0003393114390000131
实施例2中反应浓度对反应时间的影响
将线性肽S2(TFA salt,0.02mmol,13.1mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL PBS缓冲液 (pH＝8.0)和2mL MeOH使线性肽完全溶解，配成浓度为5mM溶液。随后称取2.68mg(1.0equiv)邻苯二甲醛(OPA)加入溶液中，搅拌10s后，取出50ul反应体系放入1.5ml EP管中，并加5ul HCOOH将反应体系淬灭。通过LC-MS进行监测，10s原料即可完全反应。
同样，对线性肽S2在50uM浓度下进行反应，2min原料即可反应完全。因此可说明该反应十分迅速，并且反应浓度越低，所需反应时间越长。
实施例16-20
以实施例17为例，线性肽S7与4-Br-OPA(Ar II)环化为例介绍利用OPA衍生物环化的过程：
Figure BDA0003393114390000132
将线性肽(S8)(三氟醋酸盐,0.02mmol,11.3mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL H2O和2mL TFE(三氟乙醇)使线性肽完全溶解，随后加入3equiv DIPEA中和线性肽的TFA。随后称取4.3mg(1.0equiv)Br-OPA(Ar II)加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
实施例16，18,19,20与17基本相同，区别仅在于所用OPA衍生物(Ar I-Ar V)不同，具体的反应条件和产率如表3和表4所示，实施例16-20对应的产物的结构式如图4所示。
Figure BDA0003393114390000141
以S8(H-AVGK-CONH2)为底物利用OPA衍生物进行头-侧链环化产物的表征
表3
实施例编号 16 18 19 20
环肽编号 16 18 19 20
条件 D D D D
分离收率％ 75 57 80 76
表4
Figure BDA0003393114390000142
实施例21
以环肽21的合成为例阐述固相合成环肽的制备方法
1)脱除Fmoc保护基：将树脂置于固相管中，加入20％哌啶/DMF(v/v)(即哌啶是DMF的体积分数为20％)，置于摇床摇10min，过滤掉液体，用DMF、CH2Cl2各清洗两次，该过程重复两次。
2)脱除Dde保护基：将树脂置于固相管中，加入5％N2H4·H2O/DMF(即N2H4·H2O是DMF的体积分数为5％)，置于摇床摇10min，过滤掉液体，用DMF、CH2Cl2各清洗两次，该过程重复两次。
3)在树脂上环化：先用CH2Cl2处理使树脂膨胀，过滤掉溶剂，加入TFE，将OPA(1.2equiv) 加入到树脂中，搅拌10min。
4)裂解：用TFA/TIPS/H2O(95/2.5/2.5,v/v/v)处理MBHA树脂2h。将溶剂在N2或Ar气下进行干燥，然后加入冷乙醚使环化肽链析出，离心后保留白色固体21，采用半制备高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。
通过此类固相环化的方式可以使得该OPA环化策略对半胱氨酸兼容。
实施例21具体的反应条件和产率如表5所示，实施例21对应的产物的结构式如图5所示。
固相合成环肽21的表征
表5
Figure BDA0003393114390000151
实施例22-32
实施例22-32的制备步骤同实施例2-15相同，区别在于反应对于两个侧链-NH2没有选择性，因此反应会得到一对异构体，无法利用半制备高效液相色谱对一对异构体进行分离。
实施例22-32具体的反应条件和产率如表6和表7所示，实施例22-32对应的产物的结构式如图6所示。
表6
Figure BDA0003393114390000152
(实施例22-29的式Ⅰ化合物均在5mM浓度下完成，实施例30-32的式Ⅰ化合物均在1mM 浓度下完成)
表7
Figure BDA0003393114390000161
实施例33-35
以线性肽S33为例阐述当底物N端-NH2和侧链-NH2同时存在时环化的选择性
Figure BDA0003393114390000162
将线性肽(S33)(TFA salt,0.02mmol,21.0mg)称重于8mL反应瓶中，加入2mL H2O和 2mL MeOH使线性肽完全溶解，随后加入3equiv DIPEA中和线性肽的TFA。随后称取2.68mg (1.0equiv)邻苯二甲醛加入溶液中，搅拌5min，通过HPLC纯化得到环化产物。
实施例34-35具体的反应条件与实施例33相同，区别仅在于反应原料不同，实施例33-35 具体的反应原料和产率如表8所示，实施例33-35对应的产物的结构式如图7所示。
当底物N端-NH2和侧链-NH2同时存在时环化产物的表征
表8
Figure BDA0003393114390000171
实施例33环化产物结构通过LC-MS进行表征，具体谱图如图8所示。
Figure BDA0003393114390000172
环化产物结构的确证：
Figure BDA0003393114390000173
通过固相合成线性肽Fmoc-Ala-Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Lys-NH2。首先通过OPA对侧链Lys 的两个-NH2进行环化。在此基础上脱除N端Fmoc保护基团，得到只有侧链-侧链环化产物(ss)。通过对比环肽化合物33质谱分子量、保留时间、峰形确定主要环化产物为侧链-侧链环化而非头-侧链环化(es)，具体谱图如图9所示。
实施例36-43
以实施例43为例阐述二次标记产物的合成步骤
Figure BDA0003393114390000174
将线性肽S9(1.0equiv)溶于H2O/TFE(1/1)中，加入OPA(1.0equiv)，室温搅拌5min，得到环肽产物9。之后加入1.5equiv Malemide-5-FITC，室温搅拌1h以65％的分离收率得到二次标记产物43。所得产物经HPLC进行纯化。实施例36-42的区别在于所加二次标记前体化合物的量以及反应时间不同。
实施例36-43具体的反应条件和产率如表9和表10所示，实施例36-43对应的产物的结构式如图10所示。
表9
Figure BDA0003393114390000181
二次标记环化产物的表征
表10
Figure BDA0003393114390000182
Figure BDA0003393114390000191
实施例44-45
以实施例45为例阐述二次标记产物的合成步骤
Figure BDA0003393114390000192
将线性肽S8(1.0equiv)溶于H2O/TFE(1/1)中，加入OPA(1.0equiv)，室温搅拌5min，得到环肽产物8。之后加入2.0equiv 4-Br-OPA，室温搅拌30min，以得到二次标记产物37。接着加入10.0equiv甲氧胺，室温搅拌10h，以63％的分离收率得到三次标记产物。所得产物经HPLC进行纯化。实施例44的区别在于所加二次标记前体化合物为OPA。
实施例44-45具体的反应条件和产率如表11和表12所示，实施例44-45对应的产物的结构式如图11所示。
表11
环肽编号 44 45
二次标记前体化合物 OPA 4-Br-OPA
分离收率％ 65 63
三次标记环化产物的表征
表12
Figure BDA0003393114390000193
注解：本发明表格中，序列中的第一个“H”均指氢元素。
以上述制备的环肽化合物为例测试其稳定性
不同pH下的稳定性测试：从头-侧链和侧链-侧链的环化产物中随意抽取环肽化合物2a,9, 22,23,26，分别在PBS(pH＝7.3)，0.01M NaOH(pH＝12.0)和0.1M HCl(pH＝1.0)条件下室温处理12h。测试结果如表13所示，结果显示此环肽化合物在强酸强碱条件下均有较好的稳定性。
表13
Figure BDA0003393114390000201
加热条件下稳定性测试：将所选环肽化合物置于PBS(pH＝7.3)缓冲溶液中，分别在60℃和100℃条件下加热，其稳定性结果测试结果如表14所示，结果显示整体来看，侧链-侧链环化产物的稳定性要较头-侧链环化产物的稳定性更高一些。
表14
Figure BDA0003393114390000202
表中上表中上标a，代表化合物不稳定有分解，表中数值代表分解的比例。
将实施例8中的线性肽S8、环肽产物8进行紫外吸收测试，结果发现线性肽S8在220nm 和254nm紫外下是无紫外吸收的，环肽产物8形成了异吲哚啉亚胺结构，该环肽化合物在 254nm波长下具有较强的紫外吸收，环肽产物8的LC数据见图12；这说明本发明的环肽化合物可以实现荧光标记，在荧光标记方面具有潜在的应用。
上述事例仅例示性说明本发明原理，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种环肽化合物，其特征是，具有如下结构通式：
Figure FDA0003393114380000011
AA1至AAn代表氨基酸脱水缩合形成的肽链，且所述肽链的AAn为肽链C端；所述肽链AAn与-NH2之间通过酰胺键连接；n代表肽链的长度，n≤33；
所述肽链的原料选用的氨基酸为除半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸外的任意天然氨基酸；
所述肽链中AY对应于AA1至AAn-1中的任意位置；
当AY对应于肽链中AA1的位置时，AY-N对应的氨基酸中至少含有一处裸露的氨基；
当AY对应于肽链中AA2至AAn-1中的任意位置时，AY-N对应的氨基酸中仅含有一处裸露的氨基；
AX-N对应的氨基酸中仅含有一处裸露的氨基；
Ar选自芳香族环系。
2.根据权利要求1所述的环肽化合物，其特征在于，
当AY对应于肽链中AA1的位置时，AY-N对应的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或组氨酸；
当AY对应于肽链中AA2至AAn-1中的任意位置时，AY-N对应的氨基酸选自赖氨酸或鸟氨酸中的一种；
所述AX任意地选自赖氨酸或鸟氨酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的环肽化合物，其特征在于，
所述芳香族环系Ar选自苯环、被卤素取代的苯环、被叠氮取代的烷基取代的苯环、萘环或噻吩中一种；优选所述芳香族环系Ar为以下基团的任意一种：
Figure FDA0003393114380000012
4.根据权利要求1所述的环肽化合物，其特征在于，
所述的环肽化合物具体为：
Figure FDA0003393114380000021
Figure FDA0003393114380000031
Figure FDA0003393114380000041
Figure FDA0003393114380000051
或化合物22-35对应的区域异构体；
所述区域异构体对应的结构为：
Figure FDA0003393114380000052
5.根据权利要求1-4任一所述的环肽化合物的制备方法，其特征在于，
所述制备方法包括以下步骤：
式I化合物、芳香族环系前体的原料在搅拌作用下在溶剂中进行分子内环化反应构建环肽，生成式II化合物；
所述式I化合物的结构式为：
Figure FDA0003393114380000053
所述芳香族环系前体为：
Figure FDA0003393114380000054
6.根据权利要求5所述的环肽化合物的制备方法，其特征在于，
所述式I化合物对应的氨基酸序列选自H-AWGK-CONH2、H-IK-CONH2、H-GGK-CONH2、H-FLGKN-CONH2、H-MGFKR-CONH2、H-ESYK-CONH2、H-AVGK-CONH2、H-RGDfK-CONH2、H-WQGGHK-CONH2、H-ALGEGFMK-CONH2、H-EATGYMGQSGWK-CONH2、H-DEGPYRMEHFRWGSPPKD-CONH2、H-HAEGTFTSDVSSYLEGQA-AKEFIAWLVRGRG-COOH、H-HADGSFSDEMNTILDNL-CONH2、ATRDFINWLIQTKITD-COOH、H-AWGK-CONH2、H-ALGECYK-CONH2、Ac-KWALK-CONH2、Ac-GKK-CONH2、Ac-AKLKP-CONH2、H-PPMKFEKT-CONH2、Ac-YFLKAVK-CONH2、Nac-AKLMk-CONH2、Biotin-Orn-NGR-Orn-CONH2、PA-KALLTFK-CONH2、Ac-EWAEKAAAKFLAAHA-CONH2、Ac-LTF-Orn-EYWAQ-Cba-Orn-SAA-CONH2或
Figure FDA0003393114380000061
所述芳香族环系选自前体Ar I-Ar V中的一种，具体为：
Figure FDA0003393114380000062
7.根据权利要求5所述的环肽化合物的制备方法，其特征在于，
所述式I化合物在溶剂中的浓度为5uM-50mM；
所述式Ⅰ化合物：芳香族环系前体的摩尔比为1:1；
反应时间为1-5min；
反应温度为室温；
所述溶剂为：PBS缓冲液/MeOH的混合溶液、H2O/MeOH和DIPEA的混合溶液、H2O/TFE和DIPEA的混合溶液、或TFE和DIPEA的混合溶液中的一种，优选PBS缓冲液/MeOH的体积比为1:1；H2O/MeOH的体积比为1:1；H2O/TFE的体积比为1:1；
DIPEA的加入量为式I化合物加入量的三倍。
8.根据权利要求1-4任一所述的环肽化合物的应用，其特征在于，
通过式II化合物与标记化合物在溶剂中进行二次成环标记，生成式III化合物；
所述式II化合物的二次成环标记位点如下：
Figure FDA0003393114380000071
所述标记化合物为：
Figure FDA0003393114380000072
9.根据权利要求8所述的环肽化合物的应用制备的二次成环标记的环肽化合物，其特征在于，所述式III化合物的结构通式为：
Figure FDA0003393114380000073
所述R1为以下基团R1A-R1F的任意一种：
Figure FDA0003393114380000074
10.根据权利要求9所述的二次成环标记的环肽化合物的应用，其特征在于，
将式III化合物、甲氧胺在溶剂中进行三次次成环标记，生成式IV化合物；
所述式IV化合物的结构通式为：
Figure FDA0003393114380000075
式IV中-R1-R2为如下结构：
Figure FDA0003393114380000081
CN202111511299.3A 2021-12-06 2021-12-06 一种环肽化合物及其制备方法和应用 Pending CN114249801A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111511299.3A CN114249801A (zh) 2021-12-06 2021-12-06 一种环肽化合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111511299.3A CN114249801A (zh) 2021-12-06 2021-12-06 一种环肽化合物及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114249801A true CN114249801A (zh) 2022-03-29

Family

ID=80794791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111511299.3A Pending CN114249801A (zh) 2021-12-06 2021-12-06 一种环肽化合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114249801A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1344663A (en) * 1970-11-10 1974-01-23 Erba Carlo Spa Isoindoline compounds
US5569742A (en) * 1994-06-22 1996-10-29 The Salk Institute For Biological Studies Centrally truncated NPY cyclic peptides
US20110111424A1 (en) * 2001-06-21 2011-05-12 Cell Signaling Technology, Inc. Analysis of ubiquitinated polypeptides
CN104803905A (zh) * 2015-04-17 2015-07-29 复旦大学 一种合成异吲哚啉-1-酮衍生物的方法
EP2902420A1 (en) * 2014-01-29 2015-08-05 Lanxess Elastomers B.V. Metal complex with a cyclic amidine ligand
CN104877982A (zh) * 2015-05-11 2015-09-02 香港大学深圳研究院 制备肽/蛋白缀合物的方法和试剂
CN107778238A (zh) * 2016-08-29 2018-03-09 中山大学 一种3,4‑二氢异喹啉‑1‑酮及异吲哚啉‑1‑酮衍生物的合成新方法
CN108148115A (zh) * 2018-01-30 2018-06-12 中国药科大学 一种环肽合成新方法及其在药物开发中的应用
WO2020201816A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 University Of Hong Kong Cyclic compounds and methods of making and using

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1344663A (en) * 1970-11-10 1974-01-23 Erba Carlo Spa Isoindoline compounds
US5569742A (en) * 1994-06-22 1996-10-29 The Salk Institute For Biological Studies Centrally truncated NPY cyclic peptides
US20110111424A1 (en) * 2001-06-21 2011-05-12 Cell Signaling Technology, Inc. Analysis of ubiquitinated polypeptides
EP2902420A1 (en) * 2014-01-29 2015-08-05 Lanxess Elastomers B.V. Metal complex with a cyclic amidine ligand
CN104803905A (zh) * 2015-04-17 2015-07-29 复旦大学 一种合成异吲哚啉-1-酮衍生物的方法
CN104877982A (zh) * 2015-05-11 2015-09-02 香港大学深圳研究院 制备肽/蛋白缀合物的方法和试剂
CN107778238A (zh) * 2016-08-29 2018-03-09 中山大学 一种3,4‑二氢异喹啉‑1‑酮及异吲哚啉‑1‑酮衍生物的合成新方法
CN108148115A (zh) * 2018-01-30 2018-06-12 中国药科大学 一种环肽合成新方法及其在药物开发中的应用
WO2020201816A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 University Of Hong Kong Cyclic compounds and methods of making and using

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张泱泱;申剑冰;姚成;: "一种新型亚酞菁荧光探针的合成、表征及动物活体成像研究", 生物加工过程, no. 02 *
郝云鹏;解正峰;包万睿;王馨;石伟;: "一种新型比色荧光增强型CN~-探针的合成与性能研究", 有机化学, no. 08 *
高芬;马利平;乔雄梧;郝变青;: "枯萎菌拮抗芽孢杆菌BC98-I抗菌多肽的纯化", 植物病理学报, no. 04 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6713983B2 (ja) ペプチド合成方法
DK2757107T3 (en) A process for the solid phase synthesis of liraglutide
WO2017101810A1 (zh) 一种利那洛肽的合成方法
WO2017097194A1 (zh) 一种全固相制备卡贝缩宫素的方法
US8377891B2 (en) Process for synthesis of cyclic octapeptide
JP4625603B2 (ja) テンプレートを固定したβヘアピンループ類似物の合成
TW201024316A (en) Process for the preparation of Pramlintide
CN108218957B (zh) 一种固液相结合制备amg416的方法
WO2011011342A9 (en) Synthesis of desmopressin
CN113121673A (zh) 一种固液结合法制备依降钙素的方法
CN114249801A (zh) 一种环肽化合物及其制备方法和应用
CN108047323B (zh) 一种固相片段法合成GpTx-1及其类似物和合成方法
CN113801200B (zh) 一种卡贝缩宫素的制备方法
JP4580928B2 (ja) ソマトスタチンペプチドの製造
CN103450346B (zh) 一种依替巴肽的液相合成方法
Morris et al. A microwave enhanced cross-metathesis approach to peptidomimetics
WO2006105199A2 (en) Compositions and methods for synthesis of peptide and related conjugate
RU2458066C1 (ru) Способ получения пептида эксенатида
CN117820421A (zh) 一种环肽化合物及其制备方法和应用
CN115340472B (zh) 一种谷氨酸衍生物及其合成方法和应用
CN113651875B (zh) 一种寡肽-34的合成方法
CN115368437A (zh) 一种固相合成环状多肽的方法
CN112538103B (zh) 制备生长激素释放抑制素的方法
CN110498841B (zh) 一种含丙氨酸的首尾环肽合成方法
CN116655765A (zh) 一种芋螺毒素的液相合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination