JPH06256384A - クリーベイジ装置 - Google Patents
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- JPH06256384A JPH06256384A JP5063337A JP6333793A JPH06256384A JP H06256384 A JPH06256384 A JP H06256384A JP 5063337 A JP5063337 A JP 5063337A JP 6333793 A JP6333793 A JP 6333793A JP H06256384 A JPH06256384 A JP H06256384A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、ペプチド鎖合成後のレジン−保護ペ
プチド結合体を有するカラム内に、クリーベイジカクテ
ルを輸送するラインであると同時に該カラムへ輸送され
たクリーベイジカクテルを回収するラインである、クリ
ーベイジカクテル輸送ラインを有することを特徴とする
クリーベイジ装置に関する。 【効果】本発明のクリーベイジ装置が提供されることに
より、大量のペプチドのクリーベイジを、容易・安全・
迅速かつ確実に行うことが可能となった。さらに、本発
明のクリーベイジ装置は低コストで作製することができ
るうえ、各操作は、コンピュータ等を用いて自動化して
行なうことが可能である。
プチド結合体を有するカラム内に、クリーベイジカクテ
ルを輸送するラインであると同時に該カラムへ輸送され
たクリーベイジカクテルを回収するラインである、クリ
ーベイジカクテル輸送ラインを有することを特徴とする
クリーベイジ装置に関する。 【効果】本発明のクリーベイジ装置が提供されることに
より、大量のペプチドのクリーベイジを、容易・安全・
迅速かつ確実に行うことが可能となった。さらに、本発
明のクリーベイジ装置は低コストで作製することができ
るうえ、各操作は、コンピュータ等を用いて自動化して
行なうことが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、固相法によるペプチド
鎖合成後のクリーベイジ装置に関する。
鎖合成後のクリーベイジ装置に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡおよびペプチドの合成（以下、単にペプチ
ド合成と略す）においては、ガラスビーズやレジン粉体
を用いてこれらを固相支持体とし、フィルターの装填さ
れた反応槽内で、洗浄・カップリング・洗浄・脱保護の
一連の反応を繰り返し行い、該合成法により得られたレ
ジン−保護ペプチド結合体からペプチドを取り出す際
は、さらに後処理としてクリーベイジを行う必要があっ
た。ところで、化学合成により製造されるペプチドは、
幅広い知識とテクニックが要求される高付加価値物質で
あり、化学合成によるペプチドを用いた試薬あるいは治
療検査用予防薬は、時として莫大な利潤をもたらしてい
る。ところで、試薬として用いるのに十分な量のペプチ
ドを合成するには、研究に用いる場合は１０〜２０ｍｇ
程度、市販・臨床用に用いる場合は少なくとも１００ｇ
以上の量のペプチドの合成が最低限必要と考えられてお
り、ラージスケールまたはセミラージスケールの合成が
不可欠となっている。
ＮＡ、ＲＮＡおよびペプチドの合成（以下、単にペプチ
ド合成と略す）においては、ガラスビーズやレジン粉体
を用いてこれらを固相支持体とし、フィルターの装填さ
れた反応槽内で、洗浄・カップリング・洗浄・脱保護の
一連の反応を繰り返し行い、該合成法により得られたレ
ジン−保護ペプチド結合体からペプチドを取り出す際
は、さらに後処理としてクリーベイジを行う必要があっ
た。ところで、化学合成により製造されるペプチドは、
幅広い知識とテクニックが要求される高付加価値物質で
あり、化学合成によるペプチドを用いた試薬あるいは治
療検査用予防薬は、時として莫大な利潤をもたらしてい
る。ところで、試薬として用いるのに十分な量のペプチ
ドを合成するには、研究に用いる場合は１０〜２０ｍｇ
程度、市販・臨床用に用いる場合は少なくとも１００ｇ
以上の量のペプチドの合成が最低限必要と考えられてお
り、ラージスケールまたはセミラージスケールの合成が
不可欠となっている。
【０００３】しかし、従来の方法（Ｂｏｃ化学合成法）
により合成を行う場合、最終段階（後処理）のクリーベ
イジの際に大容量のフッ化水素やトリフルオロメタンス
ルホン酸（ＴＦＭＳＡ）など極めて危険な試薬を大量に
使用するといった問題点を有しているので、特殊な反応
装置が必要であったり危険な作業を伴っていた。また、
近年Ｆｍｏｃ化学合成法がペプチド化学の分野において
かなり広まっているが、この方法では先述の従来法に比
べ、より温和な条件におけるクリーベイジが可能であ
る。この方法でクリーベイジを行う場合は主にＴＦＡ
（トリフルオロ酢酸）を使用するが、この物質も十分安
全とは言いがたいので、取り扱いに注意を要すると共
に、大容量使用時の危険性が当業界において問題となっ
ていたのが現状である。従って、大量のペプチドのクリ
ーベイジを、容易・安全・迅速かつ確実に行うことがで
きるクリーベイジ装置の開発が望まれていた。すなわ
ち、本発明は、前記課題を解決したクリーベイジ装置を
提供することを課題とする。
により合成を行う場合、最終段階（後処理）のクリーベ
イジの際に大容量のフッ化水素やトリフルオロメタンス
ルホン酸（ＴＦＭＳＡ）など極めて危険な試薬を大量に
使用するといった問題点を有しているので、特殊な反応
装置が必要であったり危険な作業を伴っていた。また、
近年Ｆｍｏｃ化学合成法がペプチド化学の分野において
かなり広まっているが、この方法では先述の従来法に比
べ、より温和な条件におけるクリーベイジが可能であ
る。この方法でクリーベイジを行う場合は主にＴＦＡ
（トリフルオロ酢酸）を使用するが、この物質も十分安
全とは言いがたいので、取り扱いに注意を要すると共
に、大容量使用時の危険性が当業界において問題となっ
ていたのが現状である。従って、大量のペプチドのクリ
ーベイジを、容易・安全・迅速かつ確実に行うことがで
きるクリーベイジ装置の開発が望まれていた。すなわ
ち、本発明は、前記課題を解決したクリーベイジ装置を
提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、クリーベイジ
を行うにあたり、クリーベイジカクテルを閉鎖系で循環
させて用いることが有用であることを見出し、本発明を
完成するに至った。
解決するために鋭意検討した。その結果、クリーベイジ
を行うにあたり、クリーベイジカクテルを閉鎖系で循環
させて用いることが有用であることを見出し、本発明を
完成するに至った。
【０００５】即ち、本発明の要旨は、ペプチド鎖合成後
のレジン−保護ペプチド結合体を有するカラム内に、ク
リーベイジカクテルを輸送するラインであると同時に該
カラムへ輸送されたクリーベイジカクテルを回収するラ
インである、クリーベイジカクテル輸送ラインを有する
ことを特徴とするクリーベイジ装置に関する。
のレジン−保護ペプチド結合体を有するカラム内に、ク
リーベイジカクテルを輸送するラインであると同時に該
カラムへ輸送されたクリーベイジカクテルを回収するラ
インである、クリーベイジカクテル輸送ラインを有する
ことを特徴とするクリーベイジ装置に関する。
【０００６】本発明においてクリーベイジ装置とは、ペ
プチド合成により得られたレジン（固相支持体）とペプ
チドの結合体から目的のペプチドを取り出す操作を行う
装置を意味し、例えば、図１に示される装置が具体例と
して挙げられる。該クリーベイジ装置は、ペプチド鎖合
成後のレジン−保護ペプチド結合体を有するカラム内
に、クリーベイジカクテルを輸送するラインであると同
時に該カラムへ輸送されたクリーベイジカクテルを回収
するラインであるクリーベイジカクテル輸送ラインを有
する。このクリーベイジカクテル輸送ラインを用いて、
該ライン内を通過するクリーベイジカクテルの流れる方
向を変えることにより、クリーベイジカクテルの撹拌・
輸送が行われ、この撹拌・輸送を繰り返すことによりク
リーベイジカクテルの循環が行われる。一定時間の循環
を行った後、クリーベイジカクテルは、クリーベイジカ
クテル輸送ラインを通じて回収される。この時クリーベ
イジカクテルは、レジンから切り離され側鎖保護基が外
れたフリーペプチドが溶解した状態で回収される。
プチド合成により得られたレジン（固相支持体）とペプ
チドの結合体から目的のペプチドを取り出す操作を行う
装置を意味し、例えば、図１に示される装置が具体例と
して挙げられる。該クリーベイジ装置は、ペプチド鎖合
成後のレジン−保護ペプチド結合体を有するカラム内
に、クリーベイジカクテルを輸送するラインであると同
時に該カラムへ輸送されたクリーベイジカクテルを回収
するラインであるクリーベイジカクテル輸送ラインを有
する。このクリーベイジカクテル輸送ラインを用いて、
該ライン内を通過するクリーベイジカクテルの流れる方
向を変えることにより、クリーベイジカクテルの撹拌・
輸送が行われ、この撹拌・輸送を繰り返すことによりク
リーベイジカクテルの循環が行われる。一定時間の循環
を行った後、クリーベイジカクテルは、クリーベイジカ
クテル輸送ラインを通じて回収される。この時クリーベ
イジカクテルは、レジンから切り離され側鎖保護基が外
れたフリーペプチドが溶解した状態で回収される。
【０００７】本発明において用いられるクリーベイジカ
クテルとは、通常の固相法によるペプチド合成により得
られるレジン−保護ペプチド結合体のクリーベイジにお
いて用いられる試薬であるＴＦＡ、アニソール、チオア
ニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド（Ｄ
ＭＳ）、エチルメチルスルフィド（ＥＭＳ）、フェノー
ル、チオフェノールなどの試薬の混合カクテルであり、
目的のペプチドを得るために適した１種以上の試薬の混
合液を指し、特に限定されるものではない。
クテルとは、通常の固相法によるペプチド合成により得
られるレジン−保護ペプチド結合体のクリーベイジにお
いて用いられる試薬であるＴＦＡ、アニソール、チオア
ニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド（Ｄ
ＭＳ）、エチルメチルスルフィド（ＥＭＳ）、フェノー
ル、チオフェノールなどの試薬の混合カクテルであり、
目的のペプチドを得るために適した１種以上の試薬の混
合液を指し、特に限定されるものではない。
【０００８】次に、本発明のクリーベイジ装置の代表例
として図１を用いた場合の、ペプチド合成により得られ
た固相支持体（レジン）と保護ペプチドの結合体から目
的のペプチドを取り出す操作（クリーベイジ）について
詳述する。
として図１を用いた場合の、ペプチド合成により得られ
た固相支持体（レジン）と保護ペプチドの結合体から目
的のペプチドを取り出す操作（クリーベイジ）について
詳述する。
【０００９】１．固相法によるペプチド合成を終了し
〔アシル化（カップリング）とそれにつづいてＮα保護
基の除去〕、該ペプチド合成が連続フロー合成により行
われた場合は、合成に用いたカラムをそのまま合成反応
カラム１として図１に示されるクリーベイジ装置に取り
付ける。また、該ペプチド合成がバッチ式により合成さ
れた場合は、得られたレジンとペプチドの結合体を合成
反応カラム１に充填する。
〔アシル化（カップリング）とそれにつづいてＮα保護
基の除去〕、該ペプチド合成が連続フロー合成により行
われた場合は、合成に用いたカラムをそのまま合成反応
カラム１として図１に示されるクリーベイジ装置に取り
付ける。また、該ペプチド合成がバッチ式により合成さ
れた場合は、得られたレジンとペプチドの結合体を合成
反応カラム１に充填する。
【００１０】２．ラインより洗浄液として、メタノー
ル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテルの順
で、これらを合成反応カラム１に流入し固相支持体（レ
ジン）とペプチドの結合体の洗浄を行なう。あるいは、
ろうと２から各洗浄液をフラスコ３へ流入させ、さらに
合成反応カラム１に流入させて洗浄を行ってもよい。洗
浄後の廃液は、ラインより排出される。窒素ガス８を
ラインより合成反応カラム１内に加圧流入してライン
よりパージすることにより、合成反応カラム１内の固
相支持体（レジン）とペプチドの結合体の乾燥が行われ
る。また、窒素ガス８のかわりに窒素ガス７を、ライン
、、さらにより合成反応カラム１内に加圧流入
してラインよりパージすることにより乾燥を行うこと
も可能である。但し、バッチ式によりペプチド合成が行
われ、乾燥レジンを合成反応カラム１に充填した場合に
はこの操作を行う必要はなく、省略することができる。
ル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテルの順
で、これらを合成反応カラム１に流入し固相支持体（レ
ジン）とペプチドの結合体の洗浄を行なう。あるいは、
ろうと２から各洗浄液をフラスコ３へ流入させ、さらに
合成反応カラム１に流入させて洗浄を行ってもよい。洗
浄後の廃液は、ラインより排出される。窒素ガス８を
ラインより合成反応カラム１内に加圧流入してライン
よりパージすることにより、合成反応カラム１内の固
相支持体（レジン）とペプチドの結合体の乾燥が行われ
る。また、窒素ガス８のかわりに窒素ガス７を、ライン
、、さらにより合成反応カラム１内に加圧流入
してラインよりパージすることにより乾燥を行うこと
も可能である。但し、バッチ式によりペプチド合成が行
われ、乾燥レジンを合成反応カラム１に充填した場合に
はこの操作を行う必要はなく、省略することができる。
【００１１】３．窒素ガス８をラインより合成反応カ
ラム１内に加圧流入し、ラインより排出されることに
より、合成反応カラム１内の乾燥が行われる。
ラム１内に加圧流入し、ラインより排出されることに
より、合成反応カラム１内の乾燥が行われる。
【００１２】４．ろうと２からクリーベイジカクテルを
フラスコ３（好ましくは、ナス型のもの）内に流入す
る。フラスコ３（ナス型）内のクリーベイジカクテル
は、ライン、を経由して合成反応カラム１内に入
る。このライン、は該クリーベイジ装置において、
クリーベイジカクテル輸送ラインとして機能する。尚、
クリーベイジを行うペプチドの種類や側鎖保護基の種類
により、フラスコ３内の温度調節が必要となる場合があ
る。この場合、マイクロプロセッサーにより温度調節が
可能な外浴バス６を用いて、必要に応じた冷却・加温を
行う。例えば、ペプチドの構成アミノ酸が酸に不安定で
ある場合は、副反応を回避するためクリーベイジカクテ
ルを合成反応カラム１内に注入する前に、４℃程度に冷
却することが好ましい。また、このような温度調整は反
応の初期段階と中期段階等の時間経過により変化させる
ことが好ましい場合もあるが、これらの条件は全てクリ
ーベイジを行うペプチドの種類や側鎖保護基の種類に依
存するものであり、各好適条件は当業界において既に知
られている。通常、初期段階には冷却したクリーベイジ
カクテルが一般的に用いられる。
フラスコ３（好ましくは、ナス型のもの）内に流入す
る。フラスコ３（ナス型）内のクリーベイジカクテル
は、ライン、を経由して合成反応カラム１内に入
る。このライン、は該クリーベイジ装置において、
クリーベイジカクテル輸送ラインとして機能する。尚、
クリーベイジを行うペプチドの種類や側鎖保護基の種類
により、フラスコ３内の温度調節が必要となる場合があ
る。この場合、マイクロプロセッサーにより温度調節が
可能な外浴バス６を用いて、必要に応じた冷却・加温を
行う。例えば、ペプチドの構成アミノ酸が酸に不安定で
ある場合は、副反応を回避するためクリーベイジカクテ
ルを合成反応カラム１内に注入する前に、４℃程度に冷
却することが好ましい。また、このような温度調整は反
応の初期段階と中期段階等の時間経過により変化させる
ことが好ましい場合もあるが、これらの条件は全てクリ
ーベイジを行うペプチドの種類や側鎖保護基の種類に依
存するものであり、各好適条件は当業界において既に知
られている。通常、初期段階には冷却したクリーベイジ
カクテルが一般的に用いられる。
【００１３】５．窒素ガス８をラインより合成反応カ
ラム１内に加圧流入し、工程４．によって合成反応カラ
ム１内に流入していたクリーベイジカクテルを、先述の
クリーベイジカクテル輸送ライン（即ち、ライン、
）を通じて、フラスコ３に戻す。
ラム１内に加圧流入し、工程４．によって合成反応カラ
ム１内に流入していたクリーベイジカクテルを、先述の
クリーベイジカクテル輸送ライン（即ち、ライン、
）を通じて、フラスコ３に戻す。
【００１４】６．フラスコ３のクリーベイジカクテルを
クリーベイジカクテル輸送ライン（即ち、ライン、
）を経由させて合成反応カラム１内に再度注入する。
クリーベイジカクテル輸送ライン（即ち、ライン、
）を経由させて合成反応カラム１内に再度注入する。
【００１５】７．前記５．および６．の操作を通常９〜
１８回程度（５〜１０分程度のインターバルで９０分程
度）繰り返すことにより、目的のペプチドのクリーベイ
ジ処理を完全に行う。但し、目的のペプチド中にＡｒｇ
（Ｍｔｒ）やＡｒｇ（Ｐｍｃ）残基がある場合、インタ
ーバルを通常の場合より長め（２０〜３０分程度のイン
ターバルで５〜８時間程度）にする必要がある。
１８回程度（５〜１０分程度のインターバルで９０分程
度）繰り返すことにより、目的のペプチドのクリーベイ
ジ処理を完全に行う。但し、目的のペプチド中にＡｒｇ
（Ｍｔｒ）やＡｒｇ（Ｐｍｃ）残基がある場合、インタ
ーバルを通常の場合より長め（２０〜３０分程度のイン
ターバルで５〜８時間程度）にする必要がある。
【００１６】８．クリーベイジ完了後、必要に応じてラ
インを通じて窒素ガス８から加圧し、クリーベイジカ
クテルをフラスコ３へ完全に戻す。さらに、とも洗いの
操作を行う。即ち、ろうと４よりラインを経て洗い用
のＴＦＡまたは酢酸を合成反応カラム１内に少量流した
後、窒素ガス８をラインより合成反応カラム１内に加
圧流入し、該カラム内のレジンに残存しているクリーベ
イジカクテルを前記ＴＦＡまたは酢酸と共にフラスコ３
へ流す。次に、窒素ガス７をライン、よりフラスコ
３内に流入して、冷却下（１０℃以下）でバブリングを
行う。この時バルブＡを閉めてラインａより排気を行
う。以上の操作によりクリーベイジカクテル中のペプチ
ド濃度を高めることができる。尚、この操作によりペプ
チドの収量が上がることがある。
インを通じて窒素ガス８から加圧し、クリーベイジカ
クテルをフラスコ３へ完全に戻す。さらに、とも洗いの
操作を行う。即ち、ろうと４よりラインを経て洗い用
のＴＦＡまたは酢酸を合成反応カラム１内に少量流した
後、窒素ガス８をラインより合成反応カラム１内に加
圧流入し、該カラム内のレジンに残存しているクリーベ
イジカクテルを前記ＴＦＡまたは酢酸と共にフラスコ３
へ流す。次に、窒素ガス７をライン、よりフラスコ
３内に流入して、冷却下（１０℃以下）でバブリングを
行う。この時バルブＡを閉めてラインａより排気を行
う。以上の操作によりクリーベイジカクテル中のペプチ
ド濃度を高めることができる。尚、この操作によりペプ
チドの収量が上がることがある。
【００１７】９．ろうと２から乾燥ジエチルエーテルを
フラスコ３に投入し（またはラインを経て、フラスコ
３へジエチルエーテルを流して）、さらに窒素ガス８を
ライン、、を通じてフラスコ３に送り、バブリン
グをしながら撹拌を行う。この時フラスコ３は外浴バス
６を用いて冷却することが好ましい。この操作は０．５
時間程度行えばよいが、この後、一夜程度冷却下に放置
するとペプチドの収量が上がることがある。操作後、フ
ラスコ３を取り外し、フラスコ３内に生じた沈澱を濾過
することにより集める。これを乾燥させることにより目
的のペプチドの粗生成ペプチドが得られる。
フラスコ３に投入し（またはラインを経て、フラスコ
３へジエチルエーテルを流して）、さらに窒素ガス８を
ライン、、を通じてフラスコ３に送り、バブリン
グをしながら撹拌を行う。この時フラスコ３は外浴バス
６を用いて冷却することが好ましい。この操作は０．５
時間程度行えばよいが、この後、一夜程度冷却下に放置
するとペプチドの収量が上がることがある。操作後、フ
ラスコ３を取り外し、フラスコ３内に生じた沈澱を濾過
することにより集める。これを乾燥させることにより目
的のペプチドの粗生成ペプチドが得られる。
【００１８】１０．該粗生成ペプチドを常法により適宜
精製する。以上の工程１．〜１０．の各操作において、
各バルブの開閉、圧力の調整および試薬の投入等はコン
ピュータ等を用いて自動化することができる。
精製する。以上の工程１．〜１０．の各操作において、
各バルブの開閉、圧力の調整および試薬の投入等はコン
ピュータ等を用いて自動化することができる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。 実施例１ ニューロキンＡのセミプレパラティブ合成 目的ペプチドとして、 His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 （配列
番号：１） を、以下のようにして合成した。 出発レジン：テンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）ＳＲＡＭ
TM（Rapp Polymer社） 置換量： ０．２１ｍｅｑ／ｇ、２０ｇ を出発物質とし、また、ＮαＦｍｏｃの除去には２０％
ピペリジンＤＭＦを用いて通常の連続フロー合成を行っ
た。使用したアミノ酸誘導体（４倍量過剰）は次の通り
である。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。 実施例１ ニューロキンＡのセミプレパラティブ合成 目的ペプチドとして、 His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 （配列
番号：１） を、以下のようにして合成した。 出発レジン：テンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）ＳＲＡＭ
TM（Rapp Polymer社） 置換量： ０．２１ｍｅｑ／ｇ、２０ｇ を出発物質とし、また、ＮαＦｍｏｃの除去には２０％
ピペリジンＤＭＦを用いて通常の連続フロー合成を行っ
た。使用したアミノ酸誘導体（４倍量過剰）は次の通り
である。
【００２０】 Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ ６．２４ｇ Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ ５．９４ｇ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ ４．９９ｇ Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ ５．７０ｇ Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ ６．５１ｇ Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ ６．４４ｇ Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ ６．９１ｇ Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ ６．６８ｇ Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ７．８７ｇ Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ １０．４１ｇ
【００２１】各反応にはＢＯＰ試薬、ＨＯＢｔおよびＮ
ＭＭを用い、反応溶媒はＤＭＦを用いたＮαＦｍｏｃ脱
離後のレジン−保護ペプチド結合体を、図１に示される
本発明のクリーベイジ装置を用いて、ペプチド合成によ
り得られた固相支持体とペプチドの結合体のクリーベイ
ジを行った。
ＭＭを用い、反応溶媒はＤＭＦを用いたＮαＦｍｏｃ脱
離後のレジン−保護ペプチド結合体を、図１に示される
本発明のクリーベイジ装置を用いて、ペプチド合成によ
り得られた固相支持体とペプチドの結合体のクリーベイ
ジを行った。
【００２２】即ち、まずペプチド合成に用いたカラムを
そのまま合成反応カラム１として図１に示されるクリー
ベイジ装置に取り付けた（前記工程１．）。次に、洗浄
液としてメタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジエ
チルエーテルをラインより合成反応カラム１へ流入さ
せる代わりに、メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテ
ル、ジエチルエーテルの順で、ろうと２から各洗浄液を
フラスコ３（ナス型）へ流入させ、さらに各洗浄液を合
成反応カラム１に流入させてレジン−保護ペプチド結合
体の洗浄を行った。洗浄後の廃液は、ラインを通じて
廃棄した（前記工程２．）。さらに、次の工程を行う前
にフラスコ３に残存するエーテルを廃棄する目的で、フ
ラスコ３を新しいものに付け替えた。
そのまま合成反応カラム１として図１に示されるクリー
ベイジ装置に取り付けた（前記工程１．）。次に、洗浄
液としてメタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジエ
チルエーテルをラインより合成反応カラム１へ流入さ
せる代わりに、メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテ
ル、ジエチルエーテルの順で、ろうと２から各洗浄液を
フラスコ３（ナス型）へ流入させ、さらに各洗浄液を合
成反応カラム１に流入させてレジン−保護ペプチド結合
体の洗浄を行った。洗浄後の廃液は、ラインを通じて
廃棄した（前記工程２．）。さらに、次の工程を行う前
にフラスコ３に残存するエーテルを廃棄する目的で、フ
ラスコ３を新しいものに付け替えた。
【００２３】次いで、窒素ガス７をラインより加圧流
入し、該窒素ガス７はライン、さらにを通過した
後、ラインより排出することにより、合成反応カラム
１内の乾燥を行った（前記工程３．）後、ろうと４から
クリーベイジカクテル（ＴＦＡ；９４％、アニソール；
５％、エタンジチオール；１％、混合カクテル；１００
ｍｌ）をフラスコ３内に流入した。さらに、窒素ガス７
をラインより加圧流入し、フラスコ３内のクリーベイ
ジカクテルを、クリーベイジカクテル輸送ライン（ライ
ン、）を経由させて合成反応カラム１内に満たした
（前記工程４．）。
入し、該窒素ガス７はライン、さらにを通過した
後、ラインより排出することにより、合成反応カラム
１内の乾燥を行った（前記工程３．）後、ろうと４から
クリーベイジカクテル（ＴＦＡ；９４％、アニソール；
５％、エタンジチオール；１％、混合カクテル；１００
ｍｌ）をフラスコ３内に流入した。さらに、窒素ガス７
をラインより加圧流入し、フラスコ３内のクリーベイ
ジカクテルを、クリーベイジカクテル輸送ライン（ライ
ン、）を経由させて合成反応カラム１内に満たした
（前記工程４．）。
【００２４】さらに、窒素ガス８をラインより合成反
応カラム１内に加圧流入し、合成反応カラム１内に流入
していたクリーベイジカクテルを、クリーベイジカクテ
ル輸送ライン（ライン、）を経由させて１０００ｍ
ｌのフラスコ３に戻した（前記工程５．）。次に、フラ
スコ３のクリーベイジカクテルをクリーベイジカクテル
輸送ライン（ライン、）を経由させて合成反応カラ
ム１内に再度注入し（前記工程６．）、前記工程５．お
よび６．の操作を５〜１０分程度のインターバルで９０
分程度繰り返して行うことにより、目的のぺプチドのク
リーベイジ処理を完全に行った（前記工程７．）。
応カラム１内に加圧流入し、合成反応カラム１内に流入
していたクリーベイジカクテルを、クリーベイジカクテ
ル輸送ライン（ライン、）を経由させて１０００ｍ
ｌのフラスコ３に戻した（前記工程５．）。次に、フラ
スコ３のクリーベイジカクテルをクリーベイジカクテル
輸送ライン（ライン、）を経由させて合成反応カラ
ム１内に再度注入し（前記工程６．）、前記工程５．お
よび６．の操作を５〜１０分程度のインターバルで９０
分程度繰り返して行うことにより、目的のぺプチドのク
リーベイジ処理を完全に行った（前記工程７．）。
【００２５】クリーベイジ完了後、ラインより窒素ガ
ス８をパージし、クリーベイジカクテルをフラスコ３に
回収した（前記工程８．）。さらに窒素ガス７をライン
、を通じてフラスコ３に送り、バブリングをしなが
ら一部のクリーベイジカクテルを除去し容積を減らした
（前記工程９．）。この時、フラスコ３は外浴バス６を
用いて冷却した。なお、本実施例において、以上の各操
作はコンピュータを用いて自動化して行った。
ス８をパージし、クリーベイジカクテルをフラスコ３に
回収した（前記工程８．）。さらに窒素ガス７をライン
、を通じてフラスコ３に送り、バブリングをしなが
ら一部のクリーベイジカクテルを除去し容積を減らした
（前記工程９．）。この時、フラスコ３は外浴バス６を
用いて冷却した。なお、本実施例において、以上の各操
作はコンピュータを用いて自動化して行った。
【００２６】次にろうと２から乾燥ジエチルエーテルを
フラスコ３に８５０ｍｌ加えて冷却下のまま３時間放置
した。その後、ペプチドが沈澱したフラスコ３を取り外
し、この沈澱を濾過して乾燥させることにより目的のペ
プチドの粗ペプチド４．８ｇを得た。この粗ペプチドの
シーケンス分析を行い、目的のアミノ酸配列を確認し
た。更に、Ｋｒａｔｏｓ ＭＳ５０によるＦＡＢ−ＭＳ
において、質量数〔Ｍ＋Ｈ〕+ ＝１１３４．５を確認し
た。尚、この粗ペプチドの逆相ＨＰＬＣにおける結果を
図示する（図２）。 条件； ＹＭＣ ＯＤＳ Ｃ１８カラム（４．６φ×１
５０ｍｍ） 溶離液：０．０１Ｎ ＨＣｌ／アセトニトリル ＝８５／１５→５５／４５（３０分） 流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ ＵＶ：２１０ｎｍ検出
フラスコ３に８５０ｍｌ加えて冷却下のまま３時間放置
した。その後、ペプチドが沈澱したフラスコ３を取り外
し、この沈澱を濾過して乾燥させることにより目的のペ
プチドの粗ペプチド４．８ｇを得た。この粗ペプチドの
シーケンス分析を行い、目的のアミノ酸配列を確認し
た。更に、Ｋｒａｔｏｓ ＭＳ５０によるＦＡＢ−ＭＳ
において、質量数〔Ｍ＋Ｈ〕+ ＝１１３４．５を確認し
た。尚、この粗ペプチドの逆相ＨＰＬＣにおける結果を
図示する（図２）。 条件； ＹＭＣ ＯＤＳ Ｃ１８カラム（４．６φ×１
５０ｍｍ） 溶離液：０．０１Ｎ ＨＣｌ／アセトニトリル ＝８５／１５→５５／４５（３０分） 流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ ＵＶ：２１０ｎｍ検出
【００２７】
【発明の効果】本発明のクリーベイジ装置が提供される
ことにより、大量のペプチドのクリーベイジを、容易・
安全・迅速かつ確実に行うことが可能となった。さら
に、本発明のクリーベイジ装置は低コストで作製するこ
とができるうえ、各操作は、コンピュータ等を用いて自
動化して行なうことが可能である。
ことにより、大量のペプチドのクリーベイジを、容易・
安全・迅速かつ確実に行うことが可能となった。さら
に、本発明のクリーベイジ装置は低コストで作製するこ
とができるうえ、各操作は、コンピュータ等を用いて自
動化して行なうことが可能である。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：modified site 存在位置：10 他の情報：Met-NH2
【図１】図１は、本発明のクリーベイジ装置の概略構成
図である。
図である。
【図２】図２は、本発明のクリーベイジ装置を用いて得
られた粗ペプチドの、逆相ＨＰＬＣにおける結果を示
す。
られた粗ペプチドの、逆相ＨＰＬＣにおける結果を示
す。
１ 合成反応カラム ２ ろうと ３ フラスコ ４ ろうと ５ 容器 ６ 外浴バス ７ 窒素ガス ８ 窒素ガス ライン ライン ライン ライン ライン ライン ライン ライン ライン ａ ライン Ａ バルブ
Claims (1)
- 【請求項１】 ペプチド鎖合成後のレジン−保護ペプチ
ド結合体を有するカラム内に、クリーベイジカクテルを
輸送するラインであると同時に該カラムへ輸送されたク
リーベイジカクテルを回収するラインである、クリーベ
イジカクテル輸送ラインを有することを特徴とするクリ
ーベイジ装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5063337A JPH06256384A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | クリーベイジ装置 |
| US08/193,393 US5460786A (en) | 1993-02-26 | 1994-02-07 | Cleavage apparatus |
| DE4406491A DE4406491A1 (de) | 1993-02-26 | 1994-02-28 | Spaltvorrichtung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5063337A JPH06256384A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | クリーベイジ装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256384A true JPH06256384A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13226329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5063337A Pending JPH06256384A (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | クリーベイジ装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5460786A (ja) |
| JP (1) | JPH06256384A (ja) |
| DE (1) | DE4406491A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5514789A (en) * | 1994-04-21 | 1996-05-07 | Barrskogen, Inc. | Recovery of oligonucleotides by gas phase cleavage |
| JPH11513300A (ja) * | 1995-09-29 | 1999-11-16 | ファーマコピア，インク． | 固相合成反応容器およびそれを用いる方法 |
| SG11201506885UA (en) | 2013-03-21 | 2015-09-29 | Sanofi Aventis Deutschland | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
| AU2014234400B2 (en) | 2013-03-21 | 2017-11-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of hydantoin containing peptide products |
| CN111939854B (zh) * | 2020-08-26 | 2024-10-18 | 广州市锐博生物科技有限公司 | 固相合成产物切割脱保护系统及方法 |
| WO2024137514A1 (en) * | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Synthego Corporation | Systems and method for automated oligonucleotide synthesis |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59161398A (ja) * | 1983-03-02 | 1984-09-12 | Mitsui Toatsu Chem Inc | デオキシリボ核酸の切断処理方法及び装置 |
| US4517338A (en) * | 1983-06-20 | 1985-05-14 | Chiron Corporation | Multiple reactor system and method for polynucleotide synthesis |
| US4746490A (en) * | 1983-09-22 | 1988-05-24 | Saneii Hossain H | Solid phase peptide synthesizer |
| US5223435A (en) * | 1986-06-06 | 1993-06-29 | Genetech, Inc. | Amino acid sequence determination with mobile peptide |
| US5039488A (en) * | 1986-06-06 | 1991-08-13 | Genentech, Inc. | Devices for amino acid sequence determination |
| JP2787963B2 (ja) * | 1991-08-24 | 1998-08-20 | 株式会社島津製作所 | 反応槽 |
-
1993
- 1993-02-26 JP JP5063337A patent/JPH06256384A/ja active Pending
-
1994
- 1994-02-07 US US08/193,393 patent/US5460786A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-02-28 DE DE4406491A patent/DE4406491A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5460786A (en) | 1995-10-24 |
| DE4406491A1 (de) | 1994-09-01 |
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