KR102432748B1 - 펩티드 합성 방법 및 펩티드의 고상 합성을 위한 방법을 실행하기 위한 장치 - Google Patents

펩티드 합성 방법 및 펩티드의 고상 합성을 위한 방법을 실행하기 위한 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩티드 합성 방법으로, 상기 방법이 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 α-아민 보호된 제2 아미노산과 반응시키는 단계, 및 α-아민 보호기를 탈보호 용액으로 제거하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 보호 제제, 이들의 용도 및 펩티드의 고상 합성 방법을 실행하기 위한 장치에 관한 것이다.

Description

펩티드 합성 방법 및 펩티드의 고상 합성을 위한 방법을 실행하기 위한 장치{METHOD FOR PEPTIDE SYNTHESIS AND APPARATUS FOR CARRYING OUT A METHOD FOR SOLID PHASE SYNTHESIS OF PEPTIDES}
본 발명은 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서의 펩티드 합성을 위한 방법, 이 방법에서 사용되는 화합물 및 펩티드의 고상 합성을 위한 방법을 실행하기 위한 장치에 관한 것이다.
펩티드는 아미노산의 연결된 쇄(chain)이고 단백질의 전구체를 나타낸다. 펩티드 및 단백질은 모든 생명 시스템의 기본 성분(component)이고 생명의 여러 과정에 포함된다. 이는 의학 및 생명과학에서 많은 응용예를 갖는다. 따라서, 펩티드 및 단백질을 합성하는 능력은 인간 생활에 매우 중요하다.
따라서, 펩티드의 합성 제조는 중요한 관심사이다. 펩티드는 하나의 아미노산의 카르복실기(C-말단)를 다른 아미노산의 아미노기 또는 N-말단에 결합(coupling)시키는 것에 의하여 합성된다. 고상 펩티드 합성 (Solid-phase peptide synthesis: SPPS)은 용액 중에서 펩티드와 연관된 중간체 정제 문제를 극복하기 위한 목적으로 1963년에 Merrifield와 그의 동료들에 의해 도입되었다 (Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed., 1984), Chan and White, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000)를 참조). 고상 합성에서, 아미노산은 연속적으로 결합되어(coupled) 원하는 시퀀스를 가지는 펩티드가 야기되고 이때 C-말단은 불용성 고분자성 지지체 (고체 상)에 고정된다.
이러한 합성 전략(scheme)에서는 자가-중합을 피하기 위해 도입되는 아미노산의 α-아미노기의 보호가 요구된다. α-아미노 관능에 대한 표준 보호기는 산-분해성(acid-labile) tert-부틸옥시카르보닐 (Boc)기, 염기-분해성 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)기, 및 알릴 시스템에 대한 스캐빈저로서의 PhSiH3의 존재 하에서의 Pd 촉매의 중성 조건 하에서 제거되는 알릴옥시카르보닐 (Alloc)기가 있다.
전술된 3가지의 α-아미노 보호 전략 중 어느 것에 따른 고상 펩티드 합성 방법은 일반적으로 원치 않는 화학 변형으로부터의 구성 아미노산의 반응성 측쇄의 별도의 보호를 요구한다. 따라서, 이러한 보호기는 커플링 사이클 동안 사용되는 시약에 대하여 저항성이어야 할 것이 필요하다. 게다가, 고상 지지체로의 성장하는 펩티드의 연결은 α-아미노 탈보호 및 쇄 조립 조건에 대하여 안정하여야 한다.
Fmoc-기반 α-아미노 보호의 경우, 측쇄기는 Fmoc 성분(moiety)을 제거하는 데 사용되는 염기성 시약에 대하여 저항성이어야 한다. 측쇄 보호기는 일반적으로 펩티드 쇄가 조립된 이후 온건한 산성 시약에 의해 제거된다. 이러한 측쇄 보호기는 일반적으로 소정의 펩티드 쇄가 조립된 이후 무수 HF, 트리플루오로메탄설폰산 또는 트리플루오로아세트산 (TFA)에 의해 절단된다.
물에 불용성이고 SPPS에서 종종 사용되는 α-아미노 보호기 Fmoc 및 Boc의 강한 소수성 특성으로 인하여, 펩티드 조립 절차는 일반적으로 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸피롤리돈 (NMP), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 디클로로메탄 (DCM) 또는 이러한 유기 용매의 혼합물과 같은 극성 비양성자성 유기 용매 중에서 수행된다. 게다가, SPPS에서 통상적으로 사용되는 측쇄 보호기는 대개 소수성이고 아미노산을 물에 불용성으로 만든다.
Fmoc 및 Boc 보호를 적용하는 SPPS 접근법은 광범위하게 사용되나 고가이고 독성인 앞서 언급된 유기 용매를 필요로 하는 어려움을 겪는다. 예를 들어, DMF는 상당한 건강 및 환경 위험이 따르게 되고; 이는 인간 내 암과 연관되고, 선천성 결함을 야기하는 것으로 의심된다. 따라서, 이러한 독성 용매의 사용은, 예를 들어 흄후드 하에서의 반응의 수행 및 고도로 숙련된 인력에 의한 취급과 같은 특별한 기술적 설비 및 주의를 요한다. 게다가, 사용된 용매의 폐기도 문제이고 비용이 많이 든다. 그 결과, 유기 용매를 사용하는 SPPS는 고가이고 유기 화학 합성을 위한 특별한 설비를 수반하는 특화된 실험실 내로 제한된다.
따라서, 앞서 언급된 문제를 피하기 위하여 펩티드 합성, 특히 SPPS를 위한 물 기반의 전략이 고도로 소망된다.
이러한 문제를 극복하기 위한 시도로서, Hojo 등은 수용성 보호기의 사용을 제안하였다(Chem.Pharm. Bull. 2004, 52, 422-427 and 테트라hedron Lett. 2004, 45, 9293.). 이들은 이러한 목적을 위한 여러 보호기, 그 중에서도 2-(페닐(메틸)설포닐)에틸옥시카르보닐 테트라티오보레이트 (Pms), 에탄설포닐에톡시카르보닐 (Esc) 및 2-(4-설포페닐설포닐)에톡시 카르보닐 (Sps)을 개발하였다. WO　2013　115813 A1에서 CEM Corporation은 물 또는 수성 시스템 중에서의 α,β-불포화 설폰의 탈보호 및 수-기반 SPPS에서의 이들의 사용을 청구한다.
하지만, 전술된 보호기는 이들의 제한된 안정성 (예를 들어 Pms에 대한), 이들의 완만한 가용성 (Esc) 및 이들의 고비용 및 복잡한 합성 및 제한된 유용성, 예를 들어 이들 황 기의 자가 산화 발생 (Sps)으로 인한 시스테인 및 메티오닌을 배제하는 여러 주요 단점을 갖는다. 이차적인 고려로서, 이러한 α-아민 보호기는 결합된 아미노산의 양을 검출하거나 탈보호가 진행된 정도의 표시를 제공하는 데 사용될 수 있는 선택적인 흡수, UV 또는 형광 신호를 나타내지 않는다. 통상의 Fmoc기와는 달리, Pms 및 Esc는 통상의 UV 모니터링으로 추적될 수 없다. Sps는 UV로 모니터링할 수 있으나, Sps의 어렵고 비용이 많이 드는 합성은 그의 사용을 좌절시키는 경향이 있다. 그 결과, 이러한 화합물의 증가된 수-용해도는 전체적인 관점에서 물 기반 SPPS의 문제에 대한 충분한 해결책이 아니다.
따라서, 본 발명의 목적은 일반적으로 펩티드 합성을 위한 수 적합성 반응 시스템 특히 고상(solid-phase) 펩티드 합성을 위한 개선된 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 물 기반 펩티드 합성시 펩티드 및/또는 아미노산 상의 관능기 상에 보호기를 형성하기에 적절한 보호 제제에 관한 것이고, 이때 보호될 관능기는 바람직하게는 아민, 알코올, 티올 및 카르복실기로부터 선택되며, 보호 제제는:
I. 백본 구조,
II. 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기(water-solubility enhancing functional group ), 및
III. 적어도 하나의 반응기(reactive group),
를 포함하고,
- 상기 백본 구조는 9-메틸플루오렌, t-부탄 및/또는 모노-, 디(di)- 또는 트리(tri)-페닐메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함, 바람직하게는 이러한 성분들로 구성되며,
- 상기 수-용해도 향상 관능기는 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, CN, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 및
- 상기 수-용해도 향상 관능기와 상기 반응기는 적어도 하나의 공유결합을 통하여 백본 구조에 부착된다.
본 발명은 또한 화학 반응에서 관능기를 보호하기 위한 상기 화합물의 사용에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서 제제는 물 기반 펩티드 합성시 펩티드 및/또는 아미노산 상의 관능기에 보호기를 형성하는 데 사용된다. 바람직하게는, 보호될 관능기는 바람직하게는 아민, 알코올, 티올 및 카르복실기로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 수-용해도 향상 관능기는 하전된 관능기 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 N(CH3)3 +에서 선택된다. 수-용해도 향상 관능기로서 하전된 관능기의 사용은 하전되지 않은 관능기에 비하여 보다 효율적으로 수용해도를 증가시키는 데 유용하다는 것이 입증되었다. 보호 제제는 하나 이상의 수-용해도 향상 관능기를 포함할 수 있고, 바람직한 구현예에서 보호 제제는 하나 이상의 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서 보호 제제는 적어도 2개의 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서 보호 제제는 1 내지 8개, 2 내지 7개 또는 3 내지 4개의 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 본 발명자들은 수용해도가 보다 큰 정도까지 증가되기 때문에 보호 제제 분자 중의 하나 이상의 수-용해도 향상 관능기를 갖는 것이 유용할 수 있다는 것을 발견하였다. 백본 구조가 t-부탄 또는 페닐메탄인 구현예에서는 하나의 수-용해도 향상 관능기가 충분할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 보호 제제는 전부 동일한 종류의, 특히 전부 SO3 - 종류인, 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 보호 제제는 서로 다른 종류의 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 수-용해도 향상 관능기가 SO3 -인 한에서는, 보호 제제가 적어도 2개의 이러한 관능기를 포함하는 것이 바람직하다. 수-용해도 향상 관능기가 전부 동일한 종류인 경우, 보호 제제의 합성은 보다 효율적이고 보다 용이할 수 있다.
백본 구조는 9-메틸플루오렌, t-부탄 및/또는 모노-, 디(di)- 또는 트리페닐메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 백본 구조는 9-메틸플루오렌 및 t-부탄으로부터 선택된다.
반응기(reactive group)는 보호될 관능기와 화학 반응을 수행하기에 적절한, 즉 소정의 화학 반응성을 갖는다. 옥시카르보닐 할로겐화물(halogenide), 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 백본 구조가 9-메틸플루오렌인 경우, 반응기는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르 및 옥시카르보닐 O-숙신이미드로부터 선택된다. 백본 구조가 t-부탄인 경우 반응기는 바람직하게는 하이드록사이드, 할로겐화물, 티올, 옥시카르보닐 O-숙신이미드 및 옥시카르보닐 무수물로부터 선택된다. 백본 구조가 모노-페닐메탄, 디-페닐메탄 및 트리-페닐메탄으로부터 선택되는 경우, 반응기는 바람직하게는 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물 및 옥시카르보닐 할로겐화물로부터 선택된다.
본 발명의 9-메틸플루오렌 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제는 하기 일반식 1로 묘사될 수 있다:
[일반식 1]
Figure 112017042035477-pct00001
상기 식에서,
R1 내지 R8은 독립적으로 수소, SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R8 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 또는 CN이 아닌 R1 내지 R8는 전부 수소이다.
R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르 및 옥시카르보닐 O-숙신이미드로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R7은 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R7은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3 내지 R6 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R6은 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R6은 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
본 발명의 9-메틸플루오렌 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제를 하기 표 1에 나타내었다. 표에 나열된 화합물은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 이들은 본 발명에 따른 예시적이고 바람직한 보호 제제를 구성한다.
[표 1]
Figure 112017042035477-pct00002
Figure 112017042035477-pct00003
Figure 112017042035477-pct00004
본 발명의 t-부탄 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제는 하기 일반식 2에 의해 예시될 수 있다:
[일반식 2]
Figure 112017042035477-pct00005
상기 식에서,
R1은 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다. R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 R99는 보다 바람직하게는 하이드록사이드, 할로겐화물, 티올, 옥시카르보닐 O-숙신이미드 및 옥시카르보닐 무수물로부터 선택된다.
본 발명의 t-부탄 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제를 하기 표 2에 나타내었다. 표에 나열된 화합물은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 이들은 본 발명에 따른 예시적이고 바람직한 보호 제제를 구성한다.
[표 2]
Figure 112017042035477-pct00006
Figure 112017042035477-pct00007
본 발명의 모노-, 디- 또는 트리-페닐메탄 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제는 각각 하기 일반식 3, 4 또는 5로 묘사될 수 있다:
[일반식 3]
Figure 112017042035477-pct00008
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 이때 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 R99는 보다 바람직하게는 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물 및 옥시카르보닐 할로겐화물로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 4]
Figure 112017042035477-pct00009
상기 식에서,
R1 내지 R10은 바람직하게는 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R10 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R10 전부는 수소이다.
R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 R99는 보다 바람직하게는 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물 및 옥시카르보닐 할로겐화물로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R8은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R8은 SO3 -로부터 선택된다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 및 R10은 수소이다.
[일반식 5]
Figure 112017042035477-pct00010
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 R99는 보다 바람직하게는 할로겐화물, 옥시메틸 할로겐화물 및 옥시카르보닐 할로겐화물로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13이 SO3 -인 경우, R99는 할로겐화물이 아니다. 다른 특히 바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13이 SO3 -인 경우, R99는 클로라이드가 아니다. 바람직한 구현예에서 R99는 바람직하게는 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 옥시메틸 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서 R99는 할로겐화물이 아니고, 특히 클로라이드가 아니다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
본 발명의 모노-, 디- 또는 트리-페닐메탄 백본 구조를 갖는 바람직한 보호 제제를 하기 표 3에 나타내었다. 표에 나열된 화합물은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 이들은 본 발명에 따른 예시적이고 바람직한 보호 제제를 구성한다.
[표 3]
Figure 112017042035477-pct00011
Figure 112017042035477-pct00012
본 발명은 또한 화학 반응에서 관능기를 보호하기 위한 보호 제제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는, 관능기는 아미노산, 펩티드 또는 단백질 상에 존재하고 화학 반응은 물, 알코올 또는 물과 알코올의 혼합물 중에서의 펩티드 또는 단백질 합성이다.
방법
본 발명은, 물, 알코올 또는 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 α-아민 보호된(α-amine protected) 제2 아미노산 또는 제2 펩티드와 반응시키는 단계, 및 α-아민 보호기(amine protecting group)를 탈보호 용액으로 제거하는 단계를 포함하는 펩티드 합성 방법으로, 상기 α-아민 보호기가 본원에서 기술되는 보호 제제 중의 하나의 제2 아미노산 또는 제2 펩티드의 α-아민 관능기와의 반응 생성물임을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, α-아민 보호기는 하기 식 6 내지 10 중의 적어도 하나이다. 각 경우에서 하기 일반식에 나타낸 질소는 보호되는 아민기(protected amine group)에 속한다:
[일반식 6]
Figure 112017042035477-pct00013
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
[일반식 7]
Figure 112017042035477-pct00014
상기 식에서,
R1 내지 R8은 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 R1 내지 R8 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 -, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R8 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R7은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R7은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3 내지 R6 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R6은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R6은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
[일반식 8]
Figure 112017042035477-pct00015
상기 식에서, R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 9]
Figure 112017042035477-pct00016
상기 식에서, R1 내지 R10은 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, R1 내지 R10 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R10 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R8은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R8은 SO3 -로부터 선택된다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 및 R10은 수소이다.
[일반식 10]
Figure 112017042035477-pct00017
상기 식에서,R1은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다.
특히 바람직한 구현예에서 α-아민 보호기(α-amine protecting group)는 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기, 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기 또는 tert-부틸-(2-설포네이트)옥시카르보닐기 (Sboc)이다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Smoc"는 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기 또는 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기이다.
본 발명에 따른 보호되는 아미노산 및 펩티드의 구조, 특히 Smoc 및 Sboc 보호 아미노산은 선행기술에서의 보호되는 아미노산 또는 펩티드, 특히 Fmoc 및 Boc 보호된 아미노산에 비하여 물에 더 가용성이다. 그 이유는 본 발명 수-용해도 향상 관능기, 특히 설포 (SO3 -)기가 보호 제제에 첨가되기 때문이다. 따라서, 본 발명의 이점 중 하나는 보호된 형태로 물에 가용성인 아미노산 및/또는 펩티드의 활용 및 다른 용해도-향상 첨가제 없이 그리고 독성의 용매를 사용할 필요 없이 펩티드 합성을 위하여 단지 물, 단지 알코올 또는 단지 물-알코올 혼합물을 사용할 수 있는 능력이다. 비-독성 물 및/또는 알코올 중에서 펩티드 합성을 수행하는 것은 약제학 및 생물학적 응용에서의 사용을 위한 여러 이점을 제공한다.
바람직한 용매는 물 및 물-알코올 혼합물이고 물이 가장 바람직한 용매이다. 바람직한 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 2-프로판올, n-프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올 또는 이들의 혼합물이다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보호된 형태로의 물에의 가용성"은 수성 용매 시스템 중에서 조성물이 소정의 반응을 진행하는 데 필요한 정도의 용해도를 갖는다는 것을 의미한다. 임의의 조성물에 대한 경우에서와 같이, 용어 "가용성"은 임의 또는 전량으로의 무제한의 용해도를 함축하는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 탈보호 용액은 바람직하게는 산 또는 염기, 바람직하게는 수성 산 또는 염기를 포함하고, 즉, 산 및/또는 염기는 바람직하게는 수용성이다. 바람직한 산은 인산, 염산 또는 트리플루오로아세트산이다. 바람직한 염기는 아민 및 암모니아이다. 바람직한 탈보호 용액은 아민 및/또는 암모니아 용액이다. 염기는 관능기를 탈보호하기에 충분한 양으로 그리고 그 정도까지 사용된다. 특정한 유기 염기의 용해도는 물, 알코올 또는 물과 알코올의 혼합물 중에 용해될 수 있는 양을 한정할 수 있다. 적절한 염기는 선택된 용매 중에서 탈보호를 실행하기에 충분한 양을 용해하는 것을 허용하는 용해도를 갖는 것이다.
Sboc기를 탈보호하기 위한 탈보호 용액은 바람직하게는 인산, 염산 또는 트리플루오로아세트산 등과 같은 수성 산을 포함한다.
Smoc기를 탈보호하기 위한 탈보호 용액은 바람직하게는 아민 또는 암모니아 등과 같은 수용성 염기를 포함한다. 수용성 염기는 펩티드를 탈보호하기에 필요한 양으로 그리고 그 정도까지 사용된다. 특정한 유기 염기의 용해도는 물, 알코올 또는 물과 알코올의 혼합물 중에 용해될 수 있는 양을 한정할 수 있다. 적절한 염기는 선택된 용매 중에서 탈보호를 실행하기에 충분한 양을 용해하는 것을 허용하는 용해도를 갖는 것이다.
탈보호 이후, 추가의 아미노산 및/또는 추가의 펩티드의 α-아미노기가 바람직하게는 본 발명에 따른 보호기, 특히 Smoc기 또는 Sboc기로 보호되는 추가의 아미노산 또는 추가의 펩티드를 사용하여 소정의 표적 펩티드가 수득될 때까지 추가의 반응 및 탈보호 단계가 반복될 수 있음은 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 제1 아미노산 또는 제1 펩티드 및/또는 상기 제2 아미노산 또는 제2 펩티드의 임의의 반응성 측쇄 관능기(reactive side chain functional group)는 측쇄 보호기(side chain protecting group)로 보호되고, 상기 측쇄 보호기는 바람직하게는 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기를 포함한다. 측쇄 보호기는 설폰기 또는 설폰산 에스테르를 포함할 수 있다. 본 방법은 바람직하게는 측쇄 보호기를 제거하는 단계를 포함한다. 측쇄 보호기의 수-용해도 향상 관능기는 측쇄 보호된 아미노산 또는 펩티드에 수용해도를 제공한다. 전술된 하나의 보호 제제과 아미노산 또는 펩티드의 개개 측쇄 관능기의 반응 생성물이 적절한 측쇄 보호기이다.
측쇄 보호기와 관련하여, 바람직한 아민 보호기는 하기 식 11 내지 15에 나타낸 것들이며, 여기에서 질소는 보호되는 아미노기(protected amino group)에 속한다.
[일반식 11]
Figure 112017042035477-pct00018
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
[일반식 12]
Figure 112017042035477-pct00019
상기 식에서,
R1 내지 R8은 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R8 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R8 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R7은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R7은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3 내지 R6 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R6은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
바람직한 구현예에서 R2 및 R6은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2 및 R6은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R3, R4, R5, R7 및 R8은 수소이다.
[일반식 13]
Figure 112017042035477-pct00020
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3는 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 14]
Figure 112017042035477-pct00021
상기 식에서,
R1 내지 R10은 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R10 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R10 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3 및 R8은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3 및 R8은 SO3 -로부터 선택된다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 및 R10은 수소이다.
[일반식 15]
Figure 112017042035477-pct00022
상기 식에서, R1은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다.
특히 바람직한 구현예에서, 측쇄 아민 보호기(side chain amine protecting group)는 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기, 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기, 트리(4-설포페닐)메틸기 (SulfoTrt), tert-부틸-(2-설포네이트)옥시카르보닐기 (Sboc) 및 4-설포-카르보벤질옥시기 (SulfoCBz)로부터 선택된다.
바람직한 알코올 보호기(alcohol protecting group)를 하기 식 16 내지 19에 나타내었다:
[일반식 16]
Figure 112017042035477-pct00023
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 17]
Figure 112017042035477-pct00024
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 18]
Figure 112017042035477-pct00025
상기 식에서, R1은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다.
[일반식 19]
Figure 112017042035477-pct00026
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
특히 바람직한 구현예에서 알코올 보호기는 4-설포벤질기 (BzS), 4-설포-벤질옥시메틸기 (BOMS), 트리(4-설포페닐)메틸기 (SulfoTrt) 및 tert-부틸-1-설포네이트기 (tBuS)로부터 선택된다.
바람직한 티올 보호기(thiol protecting group)를 하기 식 20 및 21에 나타내었다:
[일반식 20]
Figure 112017042035477-pct00027
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
[일반식 21]
Figure 112017042035477-pct00028
상기 식에서, R1은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다.
특히 바람직한 구현예에서 티올 보호기는 트리(4-설포페닐)메틸기 (SulfoTrt) 및 1-설포-2-메틸-2-프로판티올기 (StBuS)로부터 선택된다.
바람직한 카르복실 보호기(carboxyl protecting group)를 하기 식 22 내지 25에 나타내었다:
[일반식 22]
Figure 112017042035477-pct00029
상기 식에서,
R1 내지 R15는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R15 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R15 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3, R8 및 R13은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3, R8 및 R13은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 내지 R7, R9 내지 R12, R14 및 R15는 수소이다.
[일반식 23]
Figure 112017042035477-pct00030
상기 식에서, R1은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R1은 SO3 -이다.
[일반식 24]
Figure 112017042035477-pct00031
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때 상기 R1 내지 R5 중의 적어도 하나 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
[일반식 25]
Figure 112017042035477-pct00032
상기 식에서,
R1 내지 R5는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R5 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R5 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
특히 바람직한 구현예에서 카르복실 보호기는 4-설포벤질기 (BzS), 4-설포-벤질옥시메틸기 (BOMS), 트리(4-설포페닐)메틸 (SulfoTrt)기 및 tert-부틸-1-설포네이트기 (tBuS)로부터 선택된다.
하기는 가장 바람직한 보호기에 대한 개괄이다.
Figure 112017042035477-pct00033
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 방법은 제1 아미노산 또는 제1 펩티드의 C-말단이 바람직하게는 중합체성인 불용성 지지체에 고정되는 고상 펩티드 합성의 개선이다. 불용성 지지체를 사용하는 것에 의하여, 성장 중인 펩티드의 중간체 정제 노력이 최소화된다. 바람직하게는 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서의 각 반응 단계 이후 고정된 펩티드를 세척하는 것에 의하여 정제가 용이하게 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 펩티드가 완결된 경우 중합체성 지지체로부터 그 결과의 펩티드를 절단 조성물로 절단시키는 단계를 추가로 포함한다.
적절한 절단 조성물(cleaving composition) 및 방법은 숙련된 자에게는 잘 알려져 있다. 전형적으로, 트리플루오로아세트산 및 불화수소산 (HF) 등과 같은 산이 절단 단계를 수행하는 데 사용된다. 바람직하게는, 중합체성 지지체로부터 소정의 펩티드를 절단시키기에 적절한 산은 동시적으로 표적 펩티드 중의 아미노산에 부착된 측쇄 보호기를 제거한다.
바람직하게는, 절단은 스캐빈저 조성물 (예를 들어, 물, 페놀, DTT, 트리에틸실란 및 아니솔)의 존재 중에서 실행되며, 이는 절단 단계 동안 및 그 이후 원치 않는 부반응으로부터 펩티드를 보호한다. 숙련된 자는 존재하는 보호기에 대하여 적절한 스캐빈저를 선택할 수 있다.
절단된 펩티드는 여과에 의하여 절단된 지지체 (예를 들어 수지)로부터 분리될 수 있고 계속해서 펩티드는 증발 또는 용매-구축 침강(solvent-driven precipitation) 등과 같은 통상적인 단계에 의하여 여액으로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, α-아민 보호기는 형광 구조, 특히 9-메틸플루오렌 백본 구조를 포함하고, 본 방법이 제1 아미노산 또는 제1 펩티드에 결합된 α-아민 보호기에 의해 발생되는 형광을 측정함으로써 α-아민 보호기의 제거의 정도를 모니터링 하고 및/또는 펩티드 결합의 형성의 정도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서 9-메틸플루오렌 백본 구조를 포함하는 보호기는 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기 또는 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기이다.
고상 펩티드 합성에서, 펩티드 결합의 형성의 정도를 모니터링하고/하거나 형광 보호기 (예를 들어 Smoc)의 제거의 정도를 모니터링하는 것은 지지체를 UV 광으로 조사하고 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 통하여 불용성 지지체 재료에 결합된 형광 보호기에 의해 발생되는 형광을 측정한 후 형광 세기의 변화를 모니터링하는 것에 의하여 달성된다.
놀랍게도 9-메틸플루오렌 함유 보호기, 예를 들어 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기 및 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기가 고유의 형광 특성(intrinsic fluorescent properties)을 갖는다는 것이 관측되었다. 이러한 보호기의 형광 특성은 탈보호 및 커플링 반응 중의 어느 하나 또는 둘 다의 완료 이후 모니터링의 기회를 제공한다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 보호 제제 및 개개 보호기는 방향족 플루오레닐 고리 시스템에 부착되는 둘 이상의 설포기를 포함한다, 예를 들어 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기 및 9-(2,7-다설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기. 이러한 화합물에서 방향족 플루오레닐 고리 시스템에 부착되는 둘 이상의 설포 (SO3 -)기는, SPPS 동안의 펩티드의 단계적 조립 동안 사용되는 통상의 시약과 비교하여 독특하다. Smoc 등과 같은 이러한 화합물은 그들 고유 형광에 의해 모니터링되어 각 반응 단계의 종점에서 존재하는 화합물의 정량적인 양을 결정할 수 있다.
지지체 상의 형광 (예를 들어 Smoc)기의 흔적(evidence)은 실질적으로 펩티드 결합의 형성을 완료하기 위하여 커플링 단계가 반복되어야 할 지 여부를 결정하기 위하여 형광적으로 보호된 아미노산의 성공적인 커플링을 결정하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 지지체 상의 형광기의 흔적은 실질적으로 형광 보호기의 제거를 완료하기 위하여 탈보호 단계가 반복되어야 할 지의 여부를 결정하기 위하여 탈보호 단계의 종점에서 형광기의 불완전한 제거를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일반적으로, 제1 아미노산 또는 제1 펩티드가 α-아민 보호된 제2 아미노산 또는 제2 펩티드와 반응하는 커플링 단계는 커플링제의 첨가를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 커플링제에 관한 것이다. 전형적인 커플링제는 카르보디이미드 및 트리아졸로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 카르보디이미드는, 디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), 2-(((에틸이미노)메틸렌)아미노)-2-메틸프로판-1-설포네이트 (ESC) 및 2,2'-(메탄디일리덴비스(아자닐릴리덴))비스(2-메틸프로판-1-설포네이트) (DSC)이다. 바람직한 트리아졸은 O-벤조트리아졸릴-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-]-일)-1.1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), Boc-히스티딘(토실); B01' 및 B01'-Cl, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOB) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 커플링제는 설폰기(sulfonic group)를 포함한다. 설폰기는 물 함유 용매 중에서의 커플링제의 용해도를 증가시키고 음이온 교환에 의한 커플링제의 후속의 분리를 허용한다.
바람직한 커플링제를 하기 식 26 내지 30에 나타내었다:
[일반식 26]
Figure 112017042035477-pct00034
상기 식에서,
R1은 바람직하게는 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R1은 SO3 -이다. R2는 바람직하게는 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R2는 SO3 -이다. R1 및 R2는 동일하거나 다를 수 있다.
[일반식 27]
Figure 112017042035477-pct00035
상기 식에서,
R1은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R1은 SO3 -이다. R66은 바람직하게는 단쇄(short chain) 알킬, 바람직하게는 C1 내지 C8 알킬, 보다 바람직하게는 C1 내지 C4 알킬로부터 선택된다.
[일반식 28]
Figure 112017042035477-pct00036
상기 식에서, R1은 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R1은 SO3 -이다.
[일반식 29]
Figure 112017042035477-pct00037
상기 식에서, R1은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R1은 SO3 -이다.
[일반식 30]
Figure 112017042035477-pct00038
상기 식에서,
R1 내지 R4는 독립적으로 수소, SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 이때, 상기 R1 내지 R4 중의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개가 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 + 또는 CN이 아닌 R1 내지 R4 전부는 수소이다.
바람직한 구현예에서 R3은 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 + 및 CN으로부터 선택되고, 특히 R3은 SO3 -이다. 바람직하게는, R1, R2, R4 및 R5는 수소이다.
바람직한 구현예에서, R50은 하나 이상의 하이드록실 또는 하기 식 30.1 내지 30.4에 주어진 하나의 치환기로부터 선택되고, 여기에서 B는 일반식 30의 구조를 나타낸다:
[일반식 30.1]
Figure 112017042035477-pct00039
[일반식 30.2]
Figure 112017042035477-pct00040
[일반식 30.3]
Figure 112017042035477-pct00041
[일반식 30.4]
Figure 112017042035477-pct00042
특히 바람직한 커플링제는 2-(((에틸이미노)메틸렌)아미노)-2-메틸프로판-1-설포네이트 (ESC), 2,2'-(메탄디일리덴비스(아자닐릴리덴))비스(2-메틸프로판-1-설포네이트) (DSC), 2-((((3-(디메틸아미노)프로필)이미노)메틸렌)아미노)-2-메틸프로판-1-설포네이트 (MPSC)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, N-하이드록시설포숙신이미드 (설포-NHS) 및 2-(2-시아노-2-(하이드록시이미노)아세톡시)-2-메틸프로판-1-설포네이트 (Cyms)이다.
[일반식 31]( ESC )
Figure 112017042035477-pct00043
상기 식에서, R은 C1 내지 C8 알킬, 바람직하게는 C1 내지 C4 알킬로부터 선택된다.
[일반식 32] ( DSC )
Figure 112017042035477-pct00044
[일반식 33] ( MPSC )
Figure 112017042035477-pct00045
[일반식 34] ( Cyms )
Figure 112017042035477-pct00046
상기 커플링 단계는 캡핑 제제를 추가하는 것을 더 포함할 수 있다. 기술되는 캡핑 제제 및 펩티드 합성법에서의 유리 아민을 캡핑하기 위한 이들의 사용은, 본 발명의 독립적인 부분을 형성한다. 캡핑 제제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으나 이들은 또한 다른 펩티드 합성법에서도 사용될 수 있다. 캡핑 제제는, 수득되는 생성물 조성물의 쉽고(easy), 확실하고(secure), 비용-효과적인 정제를 용이하게 하는 이점을 갖는다. 캡핑 제제는 커플링 단계 이후에 부산물의 형성을 방지하도록 유리 아민의 캡핑을 허용하며, 여기에서 캡핑 제제는 하기를 포함한다:
I. 백본 구조,
II. 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기, 및
III. 적어도 하나의 반응기,
- 상기 백본 구조는 단쇄(short chain) 알킬, 바람직하게는 C1 내지 C8 알킬, 고리형 알킬쇄 또는 방향족 화합물, 보다 바람직하게는 C1 내지 C4 알킬 또는 벤질로부터 선택되는 군으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함하고,
- 상기 수-용해도 향상 관능기는 SO3 -, PO3 2-, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, N(CH3)2, N(CH3)3 +, CN 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
- 상기 수-용해도 향상 관능기와 상기 반응기는 적어도 하나의 공유결합을 통하여 백본 구조에 부착된다.
반응기는 바람직하게는 카르복실산, 카르복실산 할로겐화물, 카르복실산 O-숙신이미드, 카르복실산 옥시마 에스테르, 카르복실산 무수물, 할로겐화물 및 티올기로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 캡핑 제제는 본 발명에 따른 펩티드 합성법에 첨가된다. 대안의 구현예에서, 캡핑 제제는, 펩티드 합성의 대안의 방법에 첨가되며, 이 대안의 방법은 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 용매 중에서 α-아민 보호된 제2 아미노산 또는 제2 펩티드와 반응시키는 단계 및 α-아민 보호기를 탈보호 용액으로 제거하는 단계를 포함하고, 유리 아민을 캡핑하기 위하여 캡핑 제제가 반응 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 한다. 캡핑 제제는 전술된 것들로부터 선택된다. 반응의 완결 이후 반응 혼합물을 친화도 컬럼을 통과시켜 반응 혼합물을 정제하였다. 친화도 컬럼은 바람직하게는 음이온 또는 양이온 교환 컬럼으로부터 선택된다.
수 용해도 향상 관능기는 커플링 후 용이한 정제를 허용한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 캡핑 제제는 설폰기를 포함한다.
바람직한 캡핑 제제는 2-설포아세트산 또는 4-설포벤조산이다.
Figure 112017042035477-pct00047
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매를 사용하는 적어도 하나의 세척 단계 및 세척 단계에서 수득되는 폐용액을 수집하고, 상기 폐용액을 친화도 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 고체 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체와 접촉시키켜, 그에 따라 수 용해도 향상 관능기 특히 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르, PO3 2- 및 N(CH3)3 + 같은 하전된 관능기를 포함하는 폐 화합물을 보류시키는 단계를 포함한다. 음이온 교환 지지체를 사용하는 것은 적어도 하나의 설폰기를 포함하는 화합물의 제거하는 데에 특히 효과적이었다. 후속하여, 친화도 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 고체 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체의 재생에 의하여 폐 화합물이 수집될 수 있고, 폐기될 수 있다. 대안으로, 폐 화합물을 포함하는 친화도 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체 재료가 폐기될 수 있다.
커플링 단계 이후 그리고 탈보호 단계 이후 세척 단계가 전형적으로 실행된다. 음이온 및/또는 양이온 교환 단계는 세척 용액으로부터 미반응되거나 절단된 보호기 및 시약, 예를 들어 여기에서 기술되는 바와 같은 커플링 제제 및 캡핑 제제 등과 같은 모든 설포-함유 화합물을 제거하는 것을 허용한다. 폐 화합물은 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 상에 보류되고 정제된 용매가 수득된다. 보류된 화합물은 음이온 또는 양이온 교환 재료와 함께 폐기될 수 있거나 용리 후 단지 최소량의 화학 폐기물이 폐기되어야 한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 절단 단계 이후에 탈보호되고 절단된 표적 단백질 또는 펩티드를 포함하는 용액이 친화도 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 고체 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체와 접촉되고, 그에 의하여 설폰기를 포함하는 것 등과 같은 폐 화합물이 보류되고 정제된 표적 단백질이 수집되는 정제 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서 폐 화합물은 보호기 및 다른 시약의 일부로서 적어도 하나의 설폰기를 포함한다. 설포-함유 보호기 및 설포-함유 시약으로 인하여 실질적으로 과량의 화학약품 및 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서 커플링, 탈보호 및 절단 반응 동안 생성되는 부산물의 전부를 친화도 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 이온 교환법으로 제거하는 것이 가능하다. 물론, 이는 또한 다른 하전된 관능기에 대하여도 작용된다. 단지 표적 펩티드만이 이온 교환 컬럼을 통하여 통과할 수 있는 반면에 펩티드 부산물, 보호기 잔사 및 과량의 시약은 컬럼 상에 보류된다. 컬럼의 재생 이후, 단지 최소량의 화학 폐기물이 폐기되어야 한다. 이는 SO3 -, OSO3 - 에스테르, OPO3 2 - 에스테르, PO3 2- 및 N(CH3)3 + 등과 같은 하전된 관능기를 사용하는 이로운 효과이다. 그러나 심지어 하나 이상의 하전되지 않은 관능기가 사용되는 경우에서도, 공정은 여전히 물에서 수행되고, 그에 의하여 선행 기술 공정에 비하여 폐 화학약품의 양을 감소시키는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는, 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 할로겐화물 (Smoc 할로겐화물), 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 N-하이드록시숙신이미드 (Smoc-NHS), 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 O-숙신이미드 (Smoc OSu), 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 할로겐화물 (Smoc 할로겐화물), 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 N-하이드록시숙신이미드 (Smoc-NHS), 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐 O-숙신이미드 (Smoc OSu), 트리(4-설포페닐)메틸 할로겐화물 (SulfoTrt 할로겐화물), tert-부틸-(2-설포네이트)옥시카르보닐 무수물 (Sboc2O), tert-부틸-(2-설포네이트)옥시카르보닐 O-숙신이미드 (Sboc-OSu), 4-설포-카르보벤질옥시 할로겐화물 (SulfoCBz 할로겐화물), 2-하이드록시-2-메틸프로판-1-설포네이트 (tBuS), 2-브로모-2-메틸프로판-1-설포네이트 (tBuS), 2-머캅토-2-메틸프로판-1-설포네이트 (StBuS), 4-설포벤질 할로겐화물 (BzS 할로겐화물) 및 4-설포-벤질옥시메틸 할로겐화물 (BOMS 할로겐화물)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 보호 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 할로겐화물은 염화물(chloride) 및 브롬화물(bromide)이다. 상기 화합물은 유기 화학에서 화학 반응 중에 관능기, 예를 들어 아민기, 알코올기, 티올기 또는 카르복실기를 보호하기 위한 유용한 시약이다.
본 발명의 다른 양태는 상기 식 6 내지 25로 나타낸 것들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 보다 바람직하게는 식 6 내지 10으로 나타낸 것들로부터 선택되는 보호기를 포함하는 변성 아미노산, 펩티드 및 이들의 염에 관한 것이다. 특히 바람직한 구현예에서 이러한 보호기에는 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기, 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시-카르보닐기, 트리(4-설포페닐)메틸기 (SulfoTrt), tert-부틸-(2-설포네이트)옥시카르보닐기 (Sboc), 4-설포-카르보벤질옥시기 (SulfoCBz), tert-부틸-1-설포네이트기 (tBuS), 1-설포-2-메틸-2-프로판티올기 (StBuS), 4-설포벤질기 (BzS) 및 4-설포-벤질옥시메틸기 (BOMS)가 포함된다.
본 발명의 추가의 양태는 펩티드의 고상 합성 방법을 실행하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 불용성 (예를 들어 중합체성) 지지체 재료를 수령하기 위한 반응 용기 및 불용성 지지체 재료에 결합된 보호기에 의해 발생되는 형광 세기에서의 변화를 모니터링 하도록 배치된 형광측정기를 포함한다. 본 발명의 보호 제제 (예를 들어 Smoc)의 고유 형광으로 인하여, 불용성 지지체 재료의 형광 세기의 정량 분석이 전술된 SPPS법에서의 커플링 반응 또는 탈보호 반응의 진전에 관한 정보를 제공한다. 펩티드 합성 장치 내로의 형광측정기의 포함은 가속 자동화 방법(accelerated automated synthesis)을 허용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 장치는 폐 화합물을 분리하도록 배치되는 적어도 하나의 고체 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체를 추가로 포함한다. 고체 음이온 및/또는 양이온 교환 지지체는 설포-함유 펩티드 부산물, 보호기 잔사 및 과량의 시약 등과 같은 폐 화합물로부터 표적 단백질을 분리하기 위하여 생성물 흐름 내에 배치될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로 고체 음이온 교환 지지체는 과량의 시약 및 커플링 및 탈보호 단계 이후 수득되는 폐 용액으로부터의 부산물 등과 같은 폐 화합물을 분리하기 위하여 폐기물 흐름 내에 배치될 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 따른 장치의 모식도를 나타내는 첨부되는 도 1을 참조하여, 예시적인 방법에 의해 추가적으로 기술될 것이다.
도 1은 상기 기술된 바와 같은 바람직한 방법을 실행하는 데 사용하기 위한 자동 고상 펩티드 합성기 장치의 전체 배치를 모식적으로 묘사한다. 상기 장치는 불용성 중합체성 지지체에 고정된 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 포함하는 반응 용기(reaction vessel) (1), 커플링제, 캡핑 제제, 절단제 등을 제공하기 위한 다중의 저장기를 포함하는 시약 용기(reagent container) (2), 용매 용기(solvent container) (3) 및 보호 아미노산 및/또는 펩티드를 제공하기 위한 다중의 저장소(resorvoir)를 포함하는 아미노산 및/또는 펩티드 용기(amino acids and/or peptide container) (4)를 포함한다.
상기 반응 용기 (1) 및 용기 (2, 3, 4)는 특정한 양의 특정한 시약, 아미노산 및/또는 펩티드가 통상적인 방법으로 제어 수단 (도시하지 않음)의 제어 하에 특정된 순서로 반응 용기 (1) 로 전달될 수 있도록 하는 방법으로 배치된 관 및 밸브를 통하여 연결된다.
상기 장치는 반응 용기 (1)의 내용물의 형광 세기에서의 변화를 측정 모니터링하기 위하여 배치되는 형광측정기 (5)를 포함한다. 대안으로, 반응 용기 (1)는 통합된 형광측정기 (5)를 포함할 수 있다.
반응 용기에는 각 세척 단계 이후 폐기물 흐름(stream)을 제거하기 위한 폐기물 출구 (6) 및 절단 단계 이후 생성물 흐름을 제거하기 위한 생성물 출구 (7)가 구비된다. 폐기물 출구 (6)는 폐기물 관 (8)을 통하여 챔버 (9)에 연결되고 여기에서 후속의 분리를 위하여 흐름의 pH가 조정되고 제1 이온 교환 컬럼 (10)에 연결된다. 생성물 출구 (7)는 생성물 관 (11)을 통하여 제2 이온 교환 컬럼 (12)에 연결된다.
이온 교환 컬럼 (10, 11)은 후속하여 폐기되어야 하는 부산물, 과량의 시약 및 보호기 잔사 등과 같은 설포화 폐 화합물을 보류시키도록 배치된다. 제1 이온 교환 컬럼 (10)으로부터의 정제된 용매 흐름은 하수 시스템으로 안내되거나 재생될 수 있다. 제2 이온 교환 컬럼 (12)로부터의 정제된 생성물 흐름은 표적 단백질을 수득하는 데 사용된다.
본 발명은 하기 실시예로 비제한적으로 예시된다.
실시예 :
실시예 1: 9-(3,6-디설포)플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드 (Smoc-Cl)의 합성
2　g (7.73　mmol)의 Fmoc-클로라이드를 20　㎖의 농황산으로 처리하였다. 반응의 완결 이후 조(crude)생성물 Smoc-클로라이드의 혼합물 2.96　g (7.07　mmol, 91.4%)을 약한 황색 고체의 형태로 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00048
Smoc-클로라이드의 분석 데이터:
1H NMR (500 ㎒, D2O) δ = 7.80 (s, 2H), 7.69 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.84 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.45 (t, J = 4.7 Hz, 1H).
13C NMR (126 ㎒, D2O) δ = 145.57, 142.54, 141.65, 125.16, 121.61, 120.90, 62.54, 49.65.
실시예 2: 9-(2,7-디설포)플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드 (Smoc-Cl)의 합성
2　g (7.73　mmol)의 Fmoc-클로라이드를 20　㎖의 농황산으로 처리하고 100℃까지 가열시켰다. 황산을 NaOH (pH9.5)로 중화시키고 용매를 감압 하에서 제거하고 NMR 분석으로 표적 중간체의 형성을 확인하였다. 중간체를 다시 물 중의 20% 황산에 다시 용해시키고, 6시간 동안 교반시켜 9-(2,7-디설포)플루오레닐메탄올을 형성시켰다. 황산을 NaOH (pH 6.7)로 중화시키고 용매를 감압 하에서 제거하였다. 25 ㎖의 DCM 중의 1.2 당량 포스겐의 용액을 0℃까지 냉각시키고 9-(2,7-디설포)플루오레닐메탄올을 교반 하에서 천천히 첨가하였다 (Carpino and Han, The Journal of Organic Chemistry 1972,37,(22), 3404-3409). 용액을 1 시간 동안 빙욕조 내에서 교반시키고 계속해서 4시간 동안 빙-욕조 온도에서 방치시켰다. 용매 및 과량의 포스겐을 감압 하에서 제거하여 대응하는 생성물을 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00049
NMR 중간체:
1H NMR (300 ㎒, D2O) δ: 6.09 (s, 2H), 7.23 내지 7.40 (m, 2H), 7.72 (s, 2H), 7.95 (d, J = 6.2 Hz, 2H).
13C NMR (75 ㎒, D2O) δ: 142.61, 132.99, 131.74, 130.23, 129.28, 127.22, 125.57, 124.69.
9-(2,7-디설포)-플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드에 대한 LC-APCI-MS:
LC-APCI-MS C15H9ClO22ㆍ에 대한 이론값 m/z: 256.03. 실험값 m/z: 256.94 [M-H-2xSO3]-.
실시예 3: Smoc-Gly-OH (Smoc-글리신)의 합성
2.5 g (8.41 mmol)의 Fmoc-글리신을 30 ㎖의 농황산으로 처리하였다. 반응의 완결 이후 조생성물 Smoc-글리신의 혼합물 3.7 g (8.09 mmol, 96.2%)을 약한 황색 분말의 형태로 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00050
Smoc-글리신의 분석 데이터:
LC-APCI-MS C17H14NO10S2 -에 대한 이론값 m/z: 456.01. 실험값 m/z: 455.85 [M-H]-.
1H NMR (500 ㎒, D2O) δ = 8.01 (s, 2H), 7.87 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.95 (s, NH), 4.41 (d, J　=　6.2 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.67 (s, 2H).
13C NMR (126 ㎒, D2O) δ = 158.21, 144.94, 142.41, 141.88, 125.51, 122.09, 121.09, 65.75, 46.95, 44.39.
실시예 4: Smoc-L-Ala-OH (Smoc-알라닌)의 합성
2.5　g (8.03　mmol)의 Fmoc-L-알라닌을 30　㎖의 농황산으로 처리하였다. 반응의 완결 이후 조생성물 Smoc-L-알라닌의 혼합물 3.8　g (7.64　mmol, 95.1%)을 백색 분말의 형태로 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00051
Smoc-알라닌의 분석 데이터:
LC-APCI-MS C18H16NO7Sㆍ에 대한 이론값 m/z: 390.06. 실험값 m/z: 389.96 [M-HSO3]-.
1H NMR (500 ㎒, MeOD) δ = 7.78 (d, J = 19.6 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (dd, 2H), 5.94 (s, NH), 3.95 (m, OH+2H), 3.85 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 2.93 (t, J = 1.64 Hz, 1H), 1.01 (d, J = 7.3 Hz, 3H).
13C NMR (126 ㎒, MeOD) δ = 175.11, 158.10, 146.21, 145.89, 145.44, 143.54, 127.09, 124.04, 123.90, 121.40, 67.23, 51.05, 48.51, 17.58.
실시예 5: Smoc-L-Ile-OH (Smoc-이소류신)의 합성
2.5　g (7.07　mmol)의 Fmoc-L-이소류신을 30　㎖의 농황산으로 처리하였다. 반응의 완결 이후 조생성물 Smoc-L-이소류신의 혼합물 3.8　g (6.82　mmol, 96.4%)을 백색 분말의 형태로 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00052
Smoc-이소류신의 분석 데이터:
LC-APCI-MS C21H22NO7Sㆍ에 대한 이론값 m/z: 432.11. 실험값 m/z: 432.06 [M-HSO3]-.
1H NMR (500 ㎒, MeOD) δ = 7.79 (d, J = 16.5 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 2H), 4.15 내지 3.89 (m, OH+2H), 3.77 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 2.93 (t, J = 1.6　Hz, 1H), 1.50 (dtd, J = 13.2, 10.1, 6.7 Hz, 1H), 1.20 내지 1.05 (m, 1H), 0.97 내지 0.81 (m, 1H), 0.55 (d, J = 6.86 Hz, 3H), 0.54 (t, J = 7.43 Hz, 3H).
13C NMR (126 ㎒, MeOD) δ = 173.98, 158.49, 146.15, 145.45, 143.48, 127.09, 124.02, 123.95, 121.38, 67.33, 60.30, 48.55, 38.31, 26.30, 15.98, 11.66.
실시예 6: Smoc-L-Leu-OH (Smoc-류신)의 합성
2.5　g (7.07　mmol)의 Fmoc-L-류신을 30　㎖의 농황산으로 처리하였다. 반응의 완결 이후 조생성물 Smoc-L-류신의 혼합물 3.6　g (7.01　mmol, 99.1%)을 백색 분말의 형태로 수득하였다.
Figure 112017042035477-pct00053
Smoc-류신의 분석 데이터:
LC-APCI-MS C21H22NO7Sㆍ에 대한 이론값 m/z: 432.11. 실험값 m/z: 432.06 [M-HSO3]-.
1H NMR (500 ㎒, , MeOD) δ = 7.80 (d, J = 18.0 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.57 (dd, J = 8.3, 4.1 Hz 2H), 4.11 내지 3.93 (m, OH+2H), 3.86 (dd, J = 9.9, 5.3 Hz, 1H), 2.94 (t, 1H), 1.41 내지 1.31 (m, 1H), 1.30 내지 1.17 (m, 2H), 0.57 (dd, J = 14.7, 6.5 Hz, 6H).
13C NMR (126 ㎒, MeOD) δ = 175.08, 158.41, 146.18, 145.95, 145.38, 143.52, 127.10, 124.07, 123.97, 121.40, 67.27, 53.99, 48.54, 41.47, 25.86, 23.27, 21.78.
실시예 7: 설포-Trt의 합성
가열된 둥근 바닥 플라스크 내에서 질소 분위기 하에서, 237　mg (9.75　mmol, 3.0　당량)의 마그네슘을 10　㎖ THF 중에 현탁시켰다. 이 혼합물에 15　㎖ THF 중의 1.878　g (9.75　mmol, 3　당량) 4-클로로벤젠설폰산의 용액 1/10을 격렬한 교반 하에서 첨가하였다. Grignard 반응을 개시하기 위하여, 혼합물을 가열 환류시키고 한 방울의 브롬을 첨가하였다. 그 후 4-클로로벤젠설폰산 용액의 잔여부를 적가하고 혼합물을 추가의 30 분 동안 환류시키고 그 후 실온까지 냉각을 허용하였다.
제2 단계에서, Kochi의 커플링법을 채용하였다. 이 목적을 위하여, 3구 플라스크를 질소 분위기 하에 위치시키고 메탄올 중의 드라이아이스의 현탁액을 사용하는 것에 의하여 -78℃까지 냉각시켰다. 그 후 50　㎖의 THF를 첨가하고, 후속하여 0.361　㎖ (3.25　mmol, 1　당량) 사염화탄소 및 0.325　㎖ (0.03　mmol, 0.01　당량, THF 중의 0.1　mol/ℓ 용액) 디리튬테트라클로로큐프레이트(II)를 첨가하였다. 그 후 50　㎖의 THF를 첨가하고, 후속하여 0.361　㎖ (3.25　mmol, 1　당량) 사염화탄소 및 0.325　㎖ (0.03　mmol, 0.01　당량, THF 중의 0.1　mol/ℓ 용액) 디리튬테트라클로로큐프레이트(II)를 첨가하였다. 이 용액에 앞서 제조된 Grignard 시약을 적가하였다. 1시간 동안 -78℃에서 그리고 6시간 동안 0℃에서 교반한 후, 혼합물이 실온까지 가온되도록 허용하고 추가 18시간 동안 교반시켰다. 용액을 20　㎖의 물을 첨가하는 것에 의하여 퀀칭시켰다. 휘발성 성분을 감압 하에서 제거하여 그 결과로 1.69　g의 조생성물 4,4',4''-(하이드록시메탄트리일)트리벤젠설포네이트 (Sulfo-Trt)를 갈색 고체의 형태로 수득하였다. 생성물을 반-제조용 RP-HPLC로 단리시켰다. 4,4',4''-(하이드록시메탄트리일)트리벤젠설포네이트의 티오닐클로라이드 (SOCl2)로의 처리로 트리(4-설포페닐)메틸클로라이드 (Sulfo-Trt 클로라이드)가 형성되었다. 용매를 감압 하에서 제거하였다.
Figure 112017042035477-pct00054
Sulfo-Trt의 분석 데이터:
1H NMR (500 ㎒, D2O) δ = 7.68 (d, J = 8.6 Hz, 6H), 7.44 (d, J = 8.6 Hz, 6H).
13C NMR (126 ㎒, D2O) δ = 140.99, 136.88, 128.96, 127.02, 75.45.
실시예 8: 2-하이드록시-2-메틸프로판-1-설포네이트 (tBuS-OH)의 합성.
6,00　g 2-메틸-2-프로펜-1-설폰산 나트륨염을 50　㎖ 물 중에 희석시켰다. 10　㎖ 황산을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반시켰다. CaCO3 침강에 의하여 황산을 제거하였다. 용매를 감압으로 제거하였다. 백색 분말로서 생성물을 수득하였다. LC-MS 및 NMR 분석으로 표적 화합물을 확인하였다.
Figure 112017042035477-pct00055
tBuS-OH의 분석 데이터:
ESI-MS C4H9O4S-에 대한 이론값 m/z: 153.18, 실험값 m/z: 152.9[M-H]-.
1H NMR (500 ㎒, DMSO-d 6) δ: 1.18 (s, 6H), 2.67 (s, 2H), 5.20 (s, 1H).
13C NMR (126 ㎒, DMSO) δ: 67.84, 61.81, 39.52, 29.65.
실시예 9: 2-브로모-2-메틸프로판-1-설포네이트 (tBuS-Br)의 합성.
6,00　g 2-메틸-2-프로펜-1-설폰산 나트륨염을 20　㎖ HBr (48%w/w) 중에 희석시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 백갈색(whitebrown) 분말로서 생성물을 수득하였다. LC-MS 및 NMR 분석으로 표적 화합물을 확인하였다.
Figure 112017042035477-pct00056
tBuS-Br의 분석 데이터:
ESI-MS C4H8BrO3S-에 대한 이론값 m/z: 216,07, 실험값 m/z: 216,8[M-H]-.
실시예 10: 2-머캅토-2-메틸프로판-1-설포네이트 (StBuS)의 합성.
3,00　g 2-메틸-2-프로펜-1-설폰산 나트륨염을 25　㎖ 진한 HCl 중에 희석시키고 반응 용액을 밤새도록 교반시켰다. 그 후 산을 NaOH (pH　=　6.8)로 중화시키고 용매를 감압 하에서 제거하였다. 가열된 둥근 바닥 플라스크 내에서 질소 분위기 하에서, 233,67　㎎ 마그네슘을 20　㎖ THF 중에 현탁시켰다. 15　㎖ THF 중의 1,5g tBuS-Cl의 현탁액을 격렬한 교반 하에서 첨가하였다. Grignard 반응을 개시하기 위하여, 혼합물을 환류되도록 가열 (70℃)시키고 한 방울의 브롬을 첨가하고 혼합물을 추가 90 분 동안 환류시킨 후 실온까지 냉각되도록 방치하였다. 4　당량의 황을 Grignard 시약에 첨가하고 8시간 동안 교반시켰다. 그 후 200　㎖ 물을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 후속하여, 용매를 감압 하에서 제거하고 그 결과의 백색 분말을 NMR로 분석하였다.
Figure 112017042035477-pct00057
StBuS의 분석 데이터:
1H NMR (500 ㎒, 산화 중수소) δ: 1.56 (s, 6H), 2.18 (s, J = 1.3 Hz, 1H), 3.67 (s, 2H).
13C NMR (126 ㎒, D2O) δ: 61.66, 32.13, 28.48.
실시예 11: (9-BBN)-Lys(SBoc)의 합성.
1,68　g 라이신을 건조 THF 중에 현탁시키고 THF 중의 24.28　㎖ 9-Borabicyclo(3.3.1)nonan (9-BBN) (0.5　mol/ℓ)를 비활성 가스 하에서 첨가하였다. 그 결과의 현탁액을 18시간 동안 100℃에서 환류시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. (9-BBN)-Lys를 20　㎖ THF 중에 희석시키고 1.97　g 1,1'-카르보닐디이미다졸 및 2.54　g tBuS-OH를 비활성 가스 하에서 첨가하였다. 그 결과의 용액을 5시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고 그 결과의 조 생성물을 DCM으로 3회 세척하여 이미다졸 잔사를 제거하였다.
Figure 112017042035477-pct00058
(9-BBN)-Lys(SBoc)의 분석 데이터:
ESI-MS C19H33BN2O7S2 -에 대한 이론값 m/z: 444.35, 실험값 m/z: 443.2[M-H]-.
실시예 12: (9-BBN)-Tyr(tBus)의 합성.
2.00　g 티로신을 건조 THF 중에 현탁시키고 THF 중의 25　㎖ 9-BBN (0.5　mol/ℓ)을 비활성 가스 하에서 첨가하였다. 그 결과의 현탁액을 18시간 동안 100℃에서 환류시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. (9-BBN)Tyr을 20　㎖ THF 중에 현탁시키고 2.39　g tBuS-Br을 비활성 가스 하에서 첨가하였다. 그 결과의 용액을 2일 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고 그 결과의 조 생성물을 THF로 3회 세척하여 브롬화물 잔사를 제거하였다.
Figure 112017042035477-pct00059
(9-BBN)-Tyr(tBuS)의 분석 데이터:
ESI-MS C21H31BNO6S-에 대한 이론값 m/z: 436.35, 실험값 m/z: 436.2[M+H]+, 453.2[M+H2O]+.
실시예 13: Smoc-보호 아미노산의 안정성 시험
수성 환경 중에서의 Smoc-보호 아미노산의 안정성을 결정하기 위하여, Smoc-글리신 및 Smoc-L-류신을 물에 용해시키고 주변 온도에서 8일 동안 배양시켰다. 3, 6 및 8일 후 분석 RP-HPLC를 사용하여 아미노산의 상태를 확인하였다. 화합물은 수성 환경에서 상당한 시간 동안 안정하여야 한다. 이 안정성을 입증하기 위하여, Smoc-글리신 및 Smoc-류신을 소량의 물에 용해시키고 주변 온도에 방치하였다. 실험의 결과를 RP-HPLC로 모니터링하였고, 3, 6 및 8일 후에 수행하였다. 그 결과, 아미노산의 조성에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 14: Smoc-보호 아미노산의 N-말단 탈보호
SPPS에서의 사용을 위하여, 보호기는 안전한 조건 하에서 용이하게 그리고 효과적으로 탈보호가능하여야 한다. Smoc-보호 아미노산의 탈보호 조건을 결정하기 위하여, 1　㎖의 물 또는 에탄올 중에 1　㎎의 Smoc-글리신을 용해시키는 것에 의하여 일련의 실험을 수행하였다. 이 용액에, 하기 염기들
암모니아 (10% 수용액),
에탄올아민 (50% 수용액),
에틸렌디아민 (50% 수용액) 또는
피페리딘 (50% 수용액)
중의 하나를 첨가하고 혼합물을 교반 하에서 5 분 동안 실온에서 배양시켰다. 결과를 분석 RP-HPLC 및 ESI-MS로 분석하였다.
그 결과 암모니아 또는 아민의 수용액이 실온에서 Smoc 탈보호에 충분한 것으로 나타났다.
게다가 Fmoc-SPPS에 사용된 표준 염기인 피페리딘에 대하여 암모니아, 에탄올아민 및 에틸렌디아민 등과 같은 수용성 염기를 사용하는 탈보호가 가능한 것으로 나타났다. 이는 피페리딘-기반 탈보호와 비교하여 유의미하게 경제적이고 용이한 절차로의 접근을 허용한다.
실시예 15: 친화도 크로마토그래피에 의한 정제
Smoc-알라닌을 인공 불순물로서의 미보호 알라닌과 혼합하고, 1M 포름산에 용해시키고 DEAE Sephadex A-25 이온 교환 컬럼에 적하시켰다. 컬럼을 추가의 포름산으로 세척한 후, Smoc-알라닌을 포름산암모늄 4M 용액으로 용리시켰다. 적하 전 용액, 적하 후 용액 및 용리된 분획은 RP-HPLC로 분석하였다.
그 결과는 미보호 알라닌은 이온 교환 컬럼을 장애받지 않고 통과한 반면에 Smoc-보호 알라닌은 컬럼에 결합되었다는 것을 나타내고 있다. 포름산암모늄 4M 용액으로의 이동상의 변경으로, 어떠한 불순물도 남김 없이 Smoc-알라닌이 컬럼으로부터 용리되었다. 그에 의하여 정제 목적을 위한 친화도 크로마토그래피에서 Smoc-기가 성공적으로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
실시예 16: Smoc 접근 후의 시험 펩티드 H-V-G-G-V-G-OH의 합성
Smoc-보호 아미노산의 커플링을 다음과 같이 수행하였다. 따라서, 3 당량의 개개 Smoc-보호 아미노산, 2.8 당량의 활성화제 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), 3.0 당량의 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 일반 염기로서 6 당량의 탄산수소나트륨을 소량의 물에 용해시키고 3 분 동안 사전활성화시켰다. 전형적인 커플링에는 주변 온도에서 60 분이 소요되었다. 10 % 암모니아 수용액으로의 이중 탈보호 단계로 펩티드 수지의 N-말단 탈보호가 수행되었다. 지지체로부터의 절단 이후, 시험 펩티드를 RP-HPLC 및 ESI-MS로 분석하였다.
펩티드 H-V-G-G-V-G-OH의 분석 데이터:
RP-HPLC, 1060% MeCN, tR= 19.1 분.
ESI-MS C16H29N5O6에 대한 이론값 m/z: 387.21 실험값 387.0 [M+H]+
[표 4] 펩티드 H-V-G-G-V-G-OH의 형광-모니터링된 SPPS
Figure 112017042035477-pct00060
각 커플링 단계 및 후속 탈보호 단계 이후, 물, 고체 지지체 (PEGA 수지) 및 PEGA 수지-펩티드의 형광을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다. 따라서, 각 커플링 단계 이후, 결합된(coupled) Smoc기로 인하여 형광 값이 증가되고, 각 탈보호 단계 이후, 형광 값이 다시 감소되어 반응 진척의 실-시간 모니터링이 가능한 것으로 나타났다.

Claims (17)

  1. 물, 알코올 및 물과 알코올의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매 중에서 제1 아미노산 또는 제1 펩티드를 α-아민 보호된(α-amine protected) 제2 아미노산 또는 제2 펩티드와 반응시키는 단계, 및 α-아민 보호기(α-amine protecting group)를 탈보호 용액으로 제거하는 단계를 포함하는 펩티드 합성 방법으로,
    상기 제1 아미노산 또는 제1 펩티드의 C-말단이 불용성 지지체에 고정되고, 상기 방법이 중합체성 지지체에서 절단 조성물(cleaving composition)을 이용하여 수득된(resulting) 펩티드 또는 단백질을 절단하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 α-아민 보호기는 보호 제제의 반응에 의해 형성되며,
    상기 보호 제제가 하기를 포함하고:
    I. 백본 구조;
    II. 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기(water-solubility enhancing fuctional group); 및
    III. 적어도 하나의 반응기,
    - 상기 백본 구조는 9-메틸플루오렌, t-부탄 및/또는 모노-, 디(di)- 또는 트리(tri)페닐메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함하며,
    - 상기 수-용해도 향상 관능기는 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, CN, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    - 상기 수-용해도 향상 관능기와 상기 반응기는 적어도 하나의 공유결합을 통하여 백본 구조에 부착되는, 펩티드 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 아미노산 또는 제1 펩티드 및 상기 제2 아미노산 또는 제2 펩티드의 임의의 반응성 측쇄 관능기가 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기를 포함하는 측쇄 보호기로 보호되고, 상기 방법이 측쇄 보호기를 제거하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    α-아민 보호기가 형광 구조를 포함하고, 상기 방법이 제1 아미노산 또는 제1 펩티드에 결합된(coupled) α-아민 보호기에 의해 발생되는 형광을 측정함으로써 펩티드 결합의 형성의 정도를 모니터링 하고/하거나 α-아민 보호기의 제거 정도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    보호 제제가 적어도 두 개의 수-용해도 향상 관능기를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    반응기(reactive group)가 옥시카르보닐 할로겐화물(halogenide), 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    수-용해도 향상 관능기가 SO3 -인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    유리 아민을 캡핑하기 위하여 캡핑 제제가 반응 혼합물에 첨가되고, 반응의 완결 이후 반응 혼합물이 친화도 컬럼에 통과되며,
    상기 캡핑 제제는,
    I. 백본 구조,
    II. 적어도 하나의 수-용해도 향상 관능기(water-solubility enhancing functional group ), 및
    III. 적어도 하나의 반응기(reactive group),를 포함하며,
    - 상기 백본 구조는 단쇄 알킬 또는 방향족 화합물으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함하고,
    - 상기 수-용해도 향상 관능기는 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, CN, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    - 상기 수-용해도 향상 관능기와 상기 반응기는 적어도 하나의 공유결합을 통하여 백본 구조에 부착되는, 방법.
  8. 물 기반 펩티드 합성(water-based peptide synthesis)시 펩티드 및/또는 아미노산 상의 관능기에 보호기를 형성하기에 적절한, 보호 제제로,
    - 상기 보호 제제가 하기를 포함하고:
    I. 백본 구조;
    II. 적어도 두개의 수-용해도 향상 관능기; 및
    III. 적어도 하나의 반응기,
    - 상기 백본 구조는 9-메틸플루오렌, t-부탄 및/또는 모노(mono)-, 디(di)- 또는 트리(tri)페닐메탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분(moiety)을 포함하며,
    - 수-용해도 향상 관능기는 SO3 -, PO3 2-, N(CH3)2, N(CH3)3 +, CN, OSO3 - 에스테르, OPO3 2- 에스테르 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    - 상기 수-용해도 향상 관능기와 상기 반응기는 적어도 하나의 공유결합을 통하여 백본 구조에 부착되는, 보호 제제.
  9. 제8항에 있어서,
    반응기가 옥시카르보닐 할로겐화물, 옥시카르보닐 옥시마 에스테르, 옥시카르보닐 O-숙신이미드, 옥시카르보닐 무수물, 할로겐화물, 하이드록사이드 및 티올 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 보호 제제.
  10. 제8항에 있어서,
    수-용해도 향상 관능기가 SO3 -인, 보호 제제.
  11. 아미노산, 펩티드 또는 단백질의 관능기와 제8항의 보호 제제 중 어느 하나와의 반응에 의하여 형성되는 보호기를 포함하는, 변성(modified) 아미노산, 펩티드, 단백질 또는 이들의 염으로, 상기 관능기가 α-아미노, 측쇄 아미노, 티올, 카르복실 및 하이드록시로부터 선택되는 것인, 변성 아미노산, 펩티드, 단백질 또는 이들의 염.
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