BR102019024426A2 - Método de obtenção de dendrímeros peptídicos dirigidos para a doença de chagas - Google Patents

Abstract

método de obtenção de dendrímeros peptídicos dirigidos para a doença de chagas. a presente invenção refere-se a síntese de dendrímero peptídico potencialmente ativo na doença de chagas. o transportador dendrimérico é formado por um ácido succínico como foco central e ramificações dipeptídidicas contendo resíduos de lisina e arginina. dois procedimentos sintéticos ou rotas foram explorados (1 e 2), sendo o 1 descrito abaixo sido desdobrado em dois ramos que levou a dois precursores do dendrímero-alvo. ditos resíduo de aminoácidos são reconhecidos pela cruzaína, enzima específica do tripanossoma cruzi, a qual cliva a ligação peptídica, tornando possível obter um transportador dendrimérico dirigido ao parasita.

Description

MÉTODO DE OBTENÇÃO DE DENDRÍMEROS PEPTÍDICOS DIRIGIDOS PARA A DOENÇA DE CHAGAS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à síntese de dendrímero peptídico potencialmente ativo na doença de Chagas. O transportador dendrimérico é formado por um ácido succínico como foco central e ramificações dipeptídicas envolvendo resíduos de lisina e arginina.

[002] Esses resíduos de aminoácidos são reconhecidos pela cruzaína, enzima específica do Tripanossoma cruzi (T. cruzi) que catalisa a hidrólise da ligação peptídica, tornando possível obter um transportador dendrimérico dirigido ao parasita. Portanto, a invenção poderá ser utilizada na área da Medicina, especialmente saúde pública, e Química fina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Doenças negligenciadas representam um grande problema de saúde pública em muitos países e regiões. Em particular, a doença de Chagas, classificada como extremamente negligenciada, é causada pelo protozoário T. cruzi. O ciclo de vida compreende hospedeiro vertebrado (mamífero) e hospedeiro invertebrado (inseto triatomíneo). A transmissão inicia com a entrada do parasita no organismo durante o repasto sanguíneo. Neste momento, o vetor deposita suas fezes e/ou urina na pele ou mucosa do hospedeiro vertebrado, começando a contaminação.

[004] Esta parasitose é endêmica em 21 regiões da América Latina, sendo intimamente relacionada com o desenvolvimento econômico e social de um país. No entanto, com a migração de indivíduos de áreas endêmicas para outras regiões do mundo, a doença passou de seus limites tradicionais de distribuição, como Europa, Estados Unidos e Austrália. Como outras formas de contágio têm-se: transfusão sanguínea, transplante de órgãos, alimentos contaminados com o parasita, transmissão vertical (de mãe para filho) e acidentes laboratoriais. No Brasil, a contaminação oral vem recebendo destaque nos últimos anos. Importante mencionar que as transmissões vetoriais têm sido controladas em diversos países, assim como as por transfusões de sangue. Estima-se que cerca 6 a 7 milhões de indivíduos estão infectados com o T. cruzi, com 12 mil mortes anualmente. No Brasil, aproximadamente 2 milhões de indivíduos estão na fase crônica, e apenas aproximadamente 0,5% recebem tratamento. O número de óbitos foi de 53.930, no período de 1999 a 2007.

[005] Atualmente, existem apenas dois fármacos para tratamento da doença de Chagas: o nifurtimox e o benznidazol, ambos descobertos nos anos de 1960 e 1970, respectivamente. Eles são mais eficazes na fase aguda da doença e há diferenças de eficácia em relação às cepas. Adicionalmente, o nifurtimox, por exemplo, não é utilizado no Brasil, em razão de sua baixa eficácia e de seus efeitos adversos.

[006] É, portanto, extremamente necessário, diante dessa grave situação, que se fortaleçam as pesquisas por novos candidatos a fármacos tripanomicidas, sobretudo, para a fase crônica da doença que compromete, expressivamente, a qualidade de vida dos infectados, podendo levá-los a morte.

[007] Dentro desse contexto, pró-fármacos e fármacos dirigidos dendriméricos podem ser úteis. Em particular, os fármacos dirigidos são planejados para serem seletivos para determinados alvos biológicos através da ligação reversível do fármaco a transportadores específicos. Seu objetivo é aumentar a eficácia e reduzir os efeitos adversos por ação inespecífica do fármaco no organismo. Sabe-se que é inviável planejar novos compostos bioativos sem que se tenham possibilidades sintéticas de obtê-los para testes, estudos ou uso prático. O planejamento da rota sintética a ser usada na preparação de dendrímeros peptídicos é passo delicado, porém decisivo para o estabelecimento de suas obtenções em laboratório com qualidades e rendimentos satisfatórios. Geralmente, o planejamento demanda verificação prática (exploração) com vistas à comprovação de sua efetividade ou necessidade de revisão (replanejamento). Assim, o caráter inovador dessa invenção residiu no planejamento, na exploração prática e consequente estabelecimento de rotas sintéticas que, pela primeira vez, permitirão obter o composto de interesse de maneira eficiente e ágil. Para uso dessa abordagem é extremamente necessário o conhecimento do alvo de interesse.

[008] Já os dendrímeros são polímeros sintéticos versáteis, bem definidos, extremamente ordenados, globulares, de tamanhos nanométricos, com um grande número de grupos funcionais reativos, podendo apresentar espaços interiores protegidos. Referidas características estruturais os tornam interessantes para inúmeras aplicações no campo farmacêutico e biomédico, com destaque para o transporte de fármacos.

[009] Quanto aos dendrímeros peptídicos, como o próprio nome diz, são macromoléculas com ligações peptídicas em sua estrutura. Além disso, podem ter dimensões próximas às de proteínas (ZHONGWEI et al., 2010, SANTOS et al., 2017). Eles podem ser sintetizados em solução ou em fase sólida (LOFFREDO et al, 2009; ZHONGWEI et al., 2010). A síntese em fase sólida foi inicialmente proposta por R. B. Merrifield para produzir peptídeos; ela consiste na construção de cadeia peptídica de sequência de aminoácidos específica ligada covalentemente a uma resina através do aminoácido-C-terminal. Esta resina é insolúvel em todos os solventes empregados nas etapas sintéticas, facilitando a sua lavagem e filtração, para eliminar o excesso de reagentes, e os subprodutos solúveis gerados (MERRIFIELD, 1963). Resumidamente, a síntese em fase sólida compreende: 1) intumescer e, quando necessário, desproteger a resina de partida; 2) ligar o derivado de aminoácido inicial à resina, obtendo-se um aminoacil-resina; 3) desproteger o aminoacil-resina, deixando livre a porção que irá reagir na próxima etapa (grupo amina); 4) acoplar o novo derivado de aminoácido; 5) repetir essas etapas até concluir a sequência peptídica desejada; 6) clivar o peptídeo da resina e desprotegê-lo totalmente; 7) analisar e purificar o produto final; 8) caracterizar o produto final. Hoje, a maior parte dos laboratórios que trabalham com este método utiliza estratégia química diferente da criada por Merrifield: a estratégia Fmoc (MACHADO et al., 2004).

[0010] Os dendrímeros podem prolongar o tempo de ação de fármacos, aumentar a estabilidade e proteger contra degradação no meio biológico. Adicionalmente, seus grupos funcionais periféricos permitem que o fármaco seja direcionado a um tecido específico.

[0011] Tendo em vista o caráter promissor e relevante dos fármacos dirigidos dendriméricos, o presente pedido de patente apresenta uma nova rota sintética de um transportador dirigido por dendrímero peptídico potencialmente antichagásico. A referida rota sintética é realizada em fase sólida.

[0012] A cruzaína, enzima do protozoário T. cruzi, mostra-se um alvo promissor no planejamento de novos antichagásicos (MARTINEZ-MAYORGA et al., 2015), por possuir a habilidade de catalisar a hidrólise de ligações peptídicas envolvendo resíduos de arginina e lisina (CAZZULO et al., 1990). Por essa razão, Chung e colaboradores (1997) sintetizaram os pró-fármacos peptídicos de primaquina (PQ): lisil-arginina-PQ, fenilalanil-alanil-PQ e fenilalanilarginina-PQ. O composto Lys-Arg-PQ foi o mais promissor da série. Estudos de modelagem molecular, utilizando parâmetros físico-químicos e estéricos, comprovaram este resultado (TROSSINI, et al., 2010).

ESTADO DA TÉCNICA

[0013] Alguns documentos do estado da técnica tratam do uso de fármacos dirigidos dendriméricos potencialmente ativos em doenças negligenciadas.

[0014] O documento “Caracterização, purificação e estudos de estabilidade química e enzimática de intermediários de síntese e de fármaco dirigido dendrimérico potencialmente ativo em doença de Chagas” refere-se ao pedido de auxílio à pesquisa, o qual tem como objetivo caracterizar, assim como desenvolver estudos de estabilidade química e enzimática de intermediários de síntese e de fármaco dendrimérico potencialmente ativo em doença de Chagas. Os experimentos de estabilidade, mais especificamente, têm como finalidade avaliar o perfil de hidrólise no organismo, uma vez que as formas latentes devem ser clivadas em ambiente fisiológico. Já a presente invenção refere-se à síntese do dendrímero peptídico potencialmente ativo na doença de Chagas. Dita síntese não é abordada no referido documento, nem tampouco poderia ser deduzida a partir deste, uma vez que foi necessário que os inventores do presente pedido elaborassem e explorassem experimentalmente quais blocos construtores (tipo de resina, sua funcionalização, grau de substituição, tipo de foco central, entre outros) levariam a rotas sintéticas efetivas, robustas e reprodutíveis.

[0015] O documento “Estudo da síntese de pró-fármacos dendriméricos potencialmente cardiovasculares contendo rosuvastatina e ácido acetilsalicílico” descreve a importância dos dendrímeros como transportadores de fármacos. Adicionalmente, dito estudo teve como objetivo desenvolver o pró-fármaco dendrimérico potencialmente ativo em doenças cardiovasculares contendo rosuvastatina e ácido acetilsalicílico. Dito pró-fármaco dendrimérico foi composto por mio-inositol ou etilenoglicol como foco central, ácido L(-)-málico e etilenoglicol como espaçantes e rosuvastatina e ácido acetilsalicílico como compostos bioativos, o que difere da presente invenção em que o dendrímero é composto por um ácido succínico como foco central, ramificações de aminoácidos com potencial de dirigir fármacos para doença de Chagas.

[0016] O documento “Planejamento de fármacos na área de doença de Chagas: avanços e desafios” descreve que dendrímeros se constituem em importante grupo de transportadores de fármacos, entre outras aplicações. Prófármacos dendriméricos ou fármacos dirigidos dendriméricos, cujo dendron é constituído de ácido málico, composto bioativo e inositol como centro vêm sendo sintetizados e a liberação estudada por meio de modelagem molecular. Apesar da semelhança do tema, nesta anterioridade não são descritos dendrímeros peptídicos antichagásicos ou sua síntese. Além disso, os parâmetros e componentes apresentados na referida anterioridade, não permitem que seja possível obter a rota proposta, uma vez que os componentes e suas ligações/reações definidos são específicas para catalisar a hidrólise de ligações peptídicas contendo resíduos de arginina e lisina.

[0017] Já o documento “Dendrimer Prodrugs” apresenta um levantamento da literatura sobre o tema, o qual revela, em um dos achados, o uso de dendrímero de PAMAM G1 para melhorar o perfil farmacocinético da terfenadina. Os pró-fármacos foram desenhados utilizando G1 PAMAM, ácido succínico ou succinil-dietilenoglicol como espaçador e o fármaco. Diferentemente da presente invenção, esse documento não aborda qualquer aplicação de dendrímeros peptídicos dirigidos para doença de Chagas.

[0018] Portanto, diferente do estado da técnica, a presente invenção refere-se à síntese de dendrímero peptídico potencialmente ativo na doença de Chagas, cujo dendrímero é formado por um ácido succínico (AS), como foco central, e ramificações dipeptídidicas contendo resíduos de lisina e arginina.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção refere-se à síntese química em fase sólida de dendrímero peptídico potencialmente ativo na doença de Chagas. O transportador dendrimérico é formado por um ácido succínico, como foco central, e ramificações dipeptídicas contendo resíduos de lisina e arginina. Dois procedimentos sintéticos ou rotas foram explorados (1 e 2), sendo o 1, descrito abaixo, desdobrado em dois ramos que levou a dois precursores do dendrímero-alvo.

[0020] Em cada ramificação, é possível ligar o composto ativo específico, desde que exista o grupo quimicamente capaz de reagir para formar ligações éster e/ou amida, especialmente. Uma vez acoplados, obtém-se o pró-fármaco dendrimérico, que pode ter a liberação do composto no organismo controlada, assim como ter a toxicidade reduzida.

[0021] Sabe-se que a enzima cruzaína, específica do T. cruzi, é capaz de reconhecer a ligação química específica no composto e catalisar sua hidrólise tornando, portanto, transportador dendrimérico dirigido ao parasita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022] Para total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue:
Figura 1. Subprodutos 1 e 2 não foram formados pelos procedimentos e rotas sintéticas da presente invenção, pois foram protegidos os grupos guanido da Arg-Resina e as aminas α e ε da Lys durante a reação; portanto, somente o grupo amino α da Arg-Res reagiu com a carboxila da Lys protegida.
Figura 2. Subprodutos 3 a 7 não foram formados, pois foram protegidos os grupos guanido da Arg e a amina α durante a reação; portanto somente o grupo ε da Lys reagiu em pH mais básico com AS. Tais proteções foram estáveis neste pH.
Figura 3. Subprodutos 8 a 10 não foram formados, porque foram protegidos os grupos guanido de Arg e amina α da Lys de Lys(AS)-Arg-Resina e amina α da Lys de Lys-Arg-NH2 durante a reação feita em pH de ~8; portanto, somente o grupo amino ε de Lys-Arg-NH2 reagiu com o AS. As proteções foram estáveis no pH de reação.
Figura 4. Subprodutos 11 a 13 não foram formados, pois foram protegidos os grupos guanido de Arg e amina α da Lys de Lys(AS)-Arg-Resina e amina α da Lys de Lys-Arg-NH2 durante a reação; portanto, somente o grupo ε de Lys-Arg-NH2 reagiu em pH mais básico com o AS. As proteções foram estáveis no pH de reação.
Figura 5. Apresenta o Resumo do procedimento sintético ou rota 1 referente à preparação de dendrímeros peptídicos em fase sólida a 60ºC assistida por micro-ondas e, resumo do procedimento sintético ou rota 2 referente à preparação de dendrímero peptídico em fase sólida convencional à temperatura ambiente.
Figura 6. Apresenta a Primeira geração do transportador dendrimérico potencialmente dirigido para doença de Chagas.
Figura 7. Sequência de etapas do procedimento sintético ou rota 1, síntese do precursor 1 [Boc-Lys(SucArg(Pbf)-Rink amida]e condições experimentais empregadas, em que i) é Fmoc-Arg(Pbf)-OH, resina Rink amida, DIC, HOBt, solventes polares apróticos a 60ºC, até 20 minutos, 20 W, T.N; ii) é solução de até 25% de 4-metil-piperidina, até 5 minutos a 60ºC, 20 W. T;N; iii) é Boc-Lys(Fmoc)-OH, DIC, HOBt, até 20 minutos, 60ºC, 20 W, T.N e iv) ácido succínico, DIPEA até 20 minutos, 60ºC, 20 W, T.N. T.N = teste de ninidrina.
Figura 8. Sequência de etapas do procedimento sintético ou rota 1, síntese do precursor 2 [Fmoc-Lys-ArgRink amida]e condições experimentais empregadas, em que i) é Fmoc-Arg(Pbf)-OH, resina Rink amida, DIC, HOBt, solventes polares apróticos a 60ºC, até 20 minutos, 20 W, T.N; ii) é solução de até 25% de 4-metil-piperidina, até 5 minutos a 60ºC, 20 W. T;N; iii) é Fmoc-Lys(Boc)-OH, DIC, HOBt, até 20 minutos, 60ºC, 20 W, T.N e iv) TFA/scavengers, até 3h, 37ºC, 300 rpm, T.N = teste de ninidrina.
Figura 9. Sequência das etapas do procedimento sintético ou rota 1, acoplamento entre os precursores 1 e 2 para obter o dendrímero H-Lys[Suc-(Fmoc-Lys-Arg-NH2)]-ArgNH2, e condições empregadas, em que i) precursores 1 e 2,DIC, HBOt, em solventes polares apróticos, até 20 minutos, 60ºC, 20 W, T.N; ii) TFA/scavengers, até 3h, a 37ºC, 300 rpm. T.N = teste de ninidrina.
Figura 10. Mostra cromatograma obtido na análise por LC-MS de H-Lys(Suc)-Arg-NH2 bruto. Análise por LC: solvente A = 0,1%TFA/H2O, solvente B = 60%ACN/0,09%TFA/H2O, gradiente de 5 a 95% de B em 30 min, 5 L de amostra. Condições de Análise por MS: Voltagem no capilar (4500 V) e Temperatura (220°C).
Figura 11. Mostra Cromatograma obtido na análise por LC-MS de Fmoc-Lys-Arg-NH2 bruto, síntese 2. Condições de Análise por LC: solvente A = 0,1% TFA/H2O, solvente B = 60% de ACN/0,09%de TFA/H2O, gradiente de 5 a 95% de B em 30 min, 5 L de amostra. Condições de Análise por MS: Voltagem no capilar (4500 V) e Temperatura (220°C).
Figura 12. Mostra Cromatograma obtido na análise por LC-MS do dendrímero peptídico Boc-Lys[Suc(Fmoc-Lys-ArgNH2)]-Arg-NH2 bruto. Condições de Análise por LC: solvente A = 0,1%TFA/H2O, solvente B = 60%ACN/0,09%TFA/H2O, gradiente de 5 a 95% de B em 30 min, 5 L de amostra. Condições de Análise por MS: Voltagem no capilar (4500 V) e Temperatura (220°C).
Figura 13. Sequência das etapas do procedimento sintético ou rota 2 e condições experimentais empregadas, em que i) é: Fmoc-Arg(Pbf-NH2), resina Rink amida, TBTU, DIPEA, HOBt, DMF, até 2 h, em temperatura ambiente (T.A), ii) solução de até 25% de 4-metil-piperidina, até 15 minutos, T.A, iii) Fmoc-Lys(Boc)-OH, TBTU, DIPEA, HBOt, até 2 h, T.A, iv) TFA/scavengers, até 3 h, a 37ºC, v)solução de até 50% de TFA em solventes apróticos, até 1h, t.a; vi) anidrido succínico em solvente polares apróticos; vii) Fmoc-Lys-OH, TBTU, DIPEA, HBOt, DMF, até 2h, T.A, viii) Arg(Pbf)-OH, TBTU, DIPEA, HOBt, até 2h, T.A.
Figura 14. Cromatograma obtido na análise por RPHPLC de Fmoc-Lys-Arg-NH2. Solvente A (água:0,1% TFA, v/v) e solvente B (60% ACN:40% água:0,09% TFA, v/v/v), gradiente de 5 a 95% de B em 30 minutos. Comprimento de onda 210 nm, 30 L de amostra.
Figura 15. Cromatograma obtido na análise por RPHPLC do Fmoc-Lys(Suc)-Arg-NH2 bruto em vermelho. Em cinza: branco controle. Condições analíticas: solvente A (água:0,1% TFA, v/v) e solvente B (60% ACN:40% água:0,09% TFA, v/v/v), gradiente de 5 a 95% de B em 30 minutos. Comprimento de onda 210 nm, 5 L de amostra.
Figura 16. Cromatograma obtido na análise por RPHPLC do Fmoc-Lys(Suc)-Arg-NH2 purificado em vermelho. Em cinza: branco para controle. Condições analíticas: solvente A (água:0,1% TFA), solvente B (60% ACN:40% água:0,09% TFA) e solvente C (99,91% MeOH:0,09% TFA). Comprimento de onda 210 nm, 5 L de amostra.
Figura 17. Cromatograma obtido na análise por LCMS do dendrímero peptídico bruto Fmoc-Lys(Suc-Lys-Arg-NH2)- Arg-NH2. Condições analíticas: solvente A (água:0,1% TFA) e solvente B (60% ACN:40% água:0,09% TFA), gradiente de 5 a 95% de B em 30 minutos. Condições de Análise no MS: Voltagem no capilar (4500 V) e Temperatura (220°C). Comprimento de onda 210 nm, 5 L de amostra.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] A presente invenção refere-se à síntese de um transportador dirigido peptídico dendrimérico potencialmente ativo na doença de Chagas. O transportador dendrimérico é formado por um ácido succínico, como foco central, e ramificações dipeptídicas contendo resíduos de lisina e arginina.

[0024] Dois procedimentos sintéticos ou rotas 1 e 2 principais foram estabelecidos, sendo que ambos fazem uso do método de síntese em fase sólida e de protocolos específicos desenvolvidos, que serão descritos a seguir. Entretanto, elas usam condições experimentais e geram precursores diferentes para chegar ao dendrímero alvo e variações (Figura 5).

[0025] Como mostram as Figuras 1-5 os procedimentos sintéticos ou rotas foram especialmente desenhados/planejados para otimizar a construção dos dendrímeros-alvo. Vale mencionar que, sínteses de dendrímeros dirigidos para a doença de Chagas ainda não foram relatadas e que o composto da invenção tem potencial de ser efetivo na terapêutica da doença, a qual é classificada como tropical negligenciada, segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2018).

[0026] As reações envolvidas nos referidos procedimentos sintéticos e reações desenhadas/exploradas para a obtenção dos intermediários e produtos de interesse foram realizadas com os compostos ligados na resina polimérica (suporte sólido).

[0027] Nos dendrímeros da presente invenção, os acoplamentos entre os aminoácidos lisina e arginina podem acontecer: (1) entre os grupos C-terminal da arginina e o αamino grupo da lisina, ou (2) entre o C-terminal da arginina com ε-amino grupo da cadeia lateral da lisina, dentre outras possibilidades. Por esta razão, o planejamento da rota sintética se baseia no conhecimento geral da síntese em fase sólida, mas apresenta características particulares relacionadas ao planejamento da sequência de etapas, proteções e condições experimentais, os quais nunca foram usados de forma combinada para esse tipo de fármacos.

[0028] Em adição, para que os referidos procedimentos sintéticos fossem obtidos com sucesso, é importante destacar que os aminoácidos lisina e arginina, utilizados na construção das ramificações do dendrímero da presente invenção, possuem grupos funcionais que podem ser envolvidos em reações indesejadas, gerando subprodutos e não o produto final desejado. Assim, foi essencial para o sucesso sintético o uso dos grupos protetores específicos (Fmoc e Boc) com estabilidades químicas diferentes, os quais foram obtidos a partir do trabalho intelectual dos inventores que definiram parâmetros/condições que levaram à síntese proposta.

[0029] Nesse sentido, é possível verificar nas Figuras 1- 4, uma série de possibilidades de formação de subprodutos (1-13) que seriam observados caso as rotas sintéticas não tivessem sido devidamente desenhadas/planejadas para obtenção daqueles produtos desejados. Ressalta-se, inclusive, que estes subprodutos não se formaram. Duas rotas sintéticas (procedimentos sintéticos) foram planejadas para testar as suas viabilidades e adequações na obtenção dos produtos finais desejados, conforme Resumo apresentado na Figura 5. O procedimento sintético ou rota 1 emprega alta temperatura de 60ºC e as micro-ondas para atingi-la; o procedimento sintético ou rota 2 usa o método convencional, já que emprega a temperatura ambiente.

[0030] Ambas podem ser utilizadas para obter outros produtos similares vindos de uma ou mais modificações da estrutura, mostrada na Figura 6.

Síntese química Procedimento sintético ou rota 1: preparação do dendrímero peptídico em fase sólida a 60°C assistida por micro-ondas.

[0031] As sínteses de dois precursores (ramos 1 e 2), o acoplamento entre os seus produtos e todas as etapas, excetuando a que inclui a clivagem da resina, foram realizadas no Sintetizador Biotage Semi-automático SP Wave (Marca: Biotage Sweden, Uppsala, Suíça). Este procedimento sintético foi escolhido pela possibilidade de agilização das etapas na temperatura e condições escolhidas com manutenção da quiralidade dos aminoácidos (LOFFREDO et al., 2009).

[0032] O procedimento ou rota 1 refere-se à preparação do dendrímero peptídico em fase sólida (resina polimérica) a 60ºC, assistida por micro-ondas, cujo fluxograma é apresentado na Figura 5, e envolve as seguintes etapas que podem ser feitas em equipamentos dedicados à síntese em fase sólida assistida pelas micro-ondas. Todas elas usaram a temperatura de 60ºC, mas outras podem ser usadas e as potências podem variar de equipamento para equipamento (em geral superior a 15 W):

• 1. Intumescimento e desproteção da resina amidada e lavagem do sistema;
• 2. Remoção do grupo protetor Fmoc (fluorenilmetoxicarbonil) e lavagem do sistema;
• 3. Reação de acoplamento e lavagem do sistema (Loffredo et al., 2009);
• 4. Clivagem do peptídeo da resina e desproteção total.

[0033] A síntese em fase sólida é baseada no crescimento, resíduo por resíduo, da cadeia peptídica presa covalentemente pelo seu aminoácido carboxi-terminal a sítios reativos existentes em um suporte sólido (resina).

[0034] O referido suporte sólido é um polímero ou copolímero insolúvel em todos os solventes orgânicos que deve ser permeável quando solvatado ou intumescido previamente ao processo sintético.

[0035] Nesse sentido, como suporte polimérico foi utilizado um copolímero de poliestireno com 1% divinilbenzeno aminado, preferivelmente resinas Rink amida. Qualquer outro similar poderia ser empregado, tais como CLEAR amide resin. A solvatação pode ser feita com solventes polares apróticos selecionados do grupo de dimetilformamida (DMF), N-metil-pirrolidona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO) ou misturas DMSO/NMP.

[0036] Foi utilizado o grupo Fmoc como protetor de função amina, sendo sua remoção realizada com uma base orgânica como citado acima. Nesse sentido, o solvente orgânico dimetilformamida ou N-metil-pirrolidona, preferencialmente o primeiro, é misturado com uma base orgânica selecionada, preferivelmente 4-metil-piperidina, em uma concentração de 20-30%. Outras bases orgânicas podem ser usadas, porém, a eficiência e segurança não são garantidas.

[0037] Para a lavagem do sistema, foram utilizados solventes polares apróticos selecionados do grupo que compreende dimetilformamida, dimetilsulfóxido e N-metilpirrolidona em alternância com metanol por 3 vezes de cada um.

[0038] Ao término das lavagens do sistema, foram realizados o teste de ninidrina (KAISER et al., 1970), para avaliar a presença e/ou ausência de grupo amina livre.

[0039] Os derivados de aminoácidos são usados em excesso molar (1,5-10) em relação à resina funcionalizada.

[0040] Os reagentes acopladores ou ativadores de grupo carboxila foram selecionados do grupo que compreende as carbodiimidas, triazóis, sais de fosfônio (BOP) ou de urônio [estes últimos combinados com N,Ndiisopropiletilamina (DIPEA) na proporção 1:3 mol/mol], preferivelmente, a combinação N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC)/1-hidroxibenzotriazol (HOBt).

[0041] Para a clivagem do peptídeo da resina e desproteção total, foi utilizada uma solução contendo ácido trifluoroacético (95%) e compostos que atuam como scavangers de íons carbônio (até 2,5-5%), preferencialmente triisopropilsilano (TIS). Água pode ser adicionada (2,5%)e a temperatura pode variar de ambiente a 40ºC.

[0042] O procedimento ou rota 2, refere-se à preparação do dendrímero peptídico em fase sólida convencional em temperatura ambiente, cujo fluxograma é também apresentado na Figura 5, e envolve as seguintes etapas:

• 1. Intumescimento e desproteção de Fmoc da resina;
• 2. Remoção do grupo protetor Boc (t-butoxicarbonil) e lavagem do sistema (adaptado de Burguer, Lindvall, 2010);
• 3. Reação de acoplamento e lavagem do sistema (adaptado de Merrifield, 1963; Hojo et al., 2000);
• 4. Clivagem do peptídeo da resina amida e desproteção total.

[0043] Como suporte polimérico, foi utilizada uma resina à base de um copolímero de poliestireno com 1 % divinilbenzeno aminado, preferivelmente a resina Rink amida. Outro similar também poderia ser empregado. A solvatação pode ser feita com solventes polares apróticos dimetilformamida (DMF), N-metil-pirrolidona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO) ou misturas DMSO/NMP.

[0044] Como grupo protetor, foi utilizado o grupo Boc como protetor da função α-amino via pirocarbonato de terc-butila. Sua remoção foi realizada com uma solução de TFA em diclorometano a 20-50%, preferivelmente a 50%.

[0045] Para a lavagem do sistema, foram utilizados solventes polares apróticos selecionados do grupo que compreende dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) em alternância com metanol (MeOH), preferivelmente dimetilformamida (DMF), em geral, 3 vezes de cada.

[0046] As bases orgânicas podem ser selecionadas de piperidinas, 4-metil-piperidinas.

[0047] Ao término das lavagens do sistema, foi realizado o teste de ninidrina (KAISER et al., 1970).

[0048] Os reagentes acopladores foram selecionados do grupo que compreende tetrafluoroborato de 2-(1-Hbenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU)com N,Ndiisopropiletilamina (DIPEA) na relação 1:3 mol/mol, 1- hidroxibenzotriazolanidro (HOBt) e dimetilaminopiridina (DMAP) ou suas misturas. A reação aconteceu à temperatura ambiente por até 2 horas.

[0049] Para a clivagem do peptídeo da resina e desproteção total, foi utilizada uma solução contendo ácido trifluoroacético (95%) e compostos que atuam como scavangers de íons carbônio (até 2,5-5%), preferencialmente triisopropilsilano (TIS) ou anisol. Água também pode ser adicionada (2,5%). Nesta etapa, o grupo Boc também usado como protetor de grupo amina, é removido.

Exemplo:

[0050] O exemplo experimental a seguir ilustra a presente invenção sem, contudo, limitar seu escopo exclusivamente ao mesmo.

Síntese química Procedimento sintético ou rota 1: preparação do dendrímero peptídico em fase sólida a 60°C, assistida por micro-ondas

[0051] As sínteses dos dois precursores (ramos 1 e 2), os acoplamentos entre os seus produtos assim como os produtos obtidos juntamente com todas as etapas são apresentados nas Figuras 7-9 e, com exceção da etapa que inclui a clivagem da resina, foram realizadas no Sintetizador Biotage Semiautomático SP Wave (Marca: Biotage Sweden, Uppsala, Suíça) do Laboratório de Química de Peptídeos do IQ-USP, Departamento de Bioquímica, usando protocolos lá estabelecidos (OKUDA-SHINAGAWA, et al., 2017; LOFREDO, et al., 2009; VARANDA, MIRANDA, 1997). Este procedimento sintético foi escolhido pela possibilidade de agilização das etapas na temperatura e condições escolhidas.

1. Intumescimento e desproteção da resina amidada

[0052] Para o intumescimento e a remoção do grupo 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) da resina amida, compatível com a estratégia química usada, empregaram solventes polares apróticos, por exemplo, dimetilformamida (DMF) e solução de até 20% de 4-metil-piperidina (ou outra base) no solvente polar aprótico escolhido. Ao terminar a lavagem, fez-se o teste de Kaiser, ou de ninidrina (KAISER et al., 1970).

2. Remoção do grupo protetor Fmoc e lavagem do sistema

[0053] A desproteção do grupo protetor Fmoc aconteceu com solução de até 25% de 4-metilpiperidina (ou outra base) em solventes polares apróticos, por exemplo, DMF. Manteve-se o sistema a 60°C por 5 minutos a 20-25 W. Em seguida, lavouse com solventes polares apróticos, por exemplo, DMF ou DMSO e MeOH. Ao terminar a lavagem, fez-se o teste de ninidrina (KAISER et al., 1970).

3. Reação de acoplamento e lavagem do sistema

[0054] Adicionaram-se reagentes acopladores, por exemplo, DIC/HOBt, em frasco contendo a resina amida intumescida e desprotegida. Em seguida, colocou-se o aminoácido contendo o grupo protetor Fmoc e os agentes acopladores. A reação aconteceu a 60°C por 15 minutos a 20-25 W. A lavagem aconteceu com solventes polares apróticos, por exemplo, DMSO e MeOH. Ao terminar a lavagem, fez-se o teste de ninidrina (KAISER et al., 1970).

4. Clivagem do peptídeo da resina e desproteção total

[0055] Colocou-se a peptidil-resina em contato com a solução de clivagem, por exemplo, solução ácido trifluoracético (TFA), TIS água e TFA. As reações de clivagem e desproteção ocorreram em “shaker”, por até 3 horas, com temperatura de 37 °C. Após este período, a precipitação do peptídeo aconteceu com éter diisopropílico gelado ou éter etílico gelado e fez-se a sua separação em solução contendo acetonitrila e água acidulada. A solução obtida foi liofilizada.

[0056] Esta rota incluiu as sínteses 1 e 2 do procedimento sintético 1. Na de número 1, obteve-se o intermediário BocLys(Suc)-Arg(Pbf)-Rink, o qual foi utilizado para reagir com o produto resultante da síntese 2, o Fmoc-Lys-Arg-NH2. A reação entre eles originou o dendrímero peptídico proposto.

[0057] Na síntese 1, os produtos 1, 2, 3, 4 e 5 (Figuras 5 e 7) foram submetidos ao teste de ninidrina dando as colorações amarelo, azul intenso, amarelo, azul intenso e amarelo que indicaram que eles poderiam ser Fmoc-Arg(Pbf)- resina amida, H-Arg(Pbf)-resina amida, Boc-Lys(Fmoc)- Arg(Pbf)-resina amida, Boc-Lys-Arg(Pbf)-resina amida e BocLys(Suc)-Arg-(Pbf)-resina amida, respectivamente. Estas colorações estão em conformidade com a literatura para presença e/ou ausência de grupo amina livre (KAISER et al., 1970).

[0058] Com o produto Boc-Lys(Suc)-Arg(Pbf)-resina amida fez-se o procedimento de clivagem do peptídeo da resina/desproteção total, obtendo-se H-Lys(Suc)-Arg-NH2 bruto. Analisou-se este produto bruto por LC-MS. A análise por LC-MS forneceu cromatograma (Figura 10) contendo pico majoritário de componente com relação (m/z) [M+H+] = 402,31, em aproximadamente 4,5 minutos, o qual está relacionado com a estrutura química desejada.

[0059] Utilizou-se o aminoácido Boc-Lys(Fmoc)-OH na síntese 1 e Fmoc-Lys(Boc)-OH na síntese 2. Pretendeu-se, assim, conseguir remover seletivamente os grupos protetores Boc e Fmoc para dar continuidade nas reações. Como na síntese 1, obtiveram-se colorações em teste de ninidrina amarelo, azul e amarelo para os compostos Fmoc-Arg(Pbf)-resina amida, H-Arg(Pbf)-resina amida, Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-resina amida, resultados estes em consonância com a literatura (KAISER et al., 1970).

[0060] Após a indicação de síntese de Fmoc-Lys(Boc)- Arg(Pbf)-resina amida por teste de ninidrina, fez-se a clivagem do peptídeo da resina/desproteção total deste material para a obtenção de Fmoc-Lys-Arg-NH2 bruto. O resultado de análise por LC-MS mostrou componente majoritário com [M+H+] = 524,25, [M+2H+] = 262,69 em aproximadamente 18,5 minutos, valor esperado para o composto de interesse (Figura 11).

[0061] Uma vez obtidos os Boc-Lys(Suc)-Arg(Pbf)-resina amida e o Fmoc-Lys-Arg-NH2, fez-se a reação entre eles em presença de DIC e HOBt em duas tentativas, para que o teste de ninidrina da peptidil-resina apresentasse coloração amarelo escuro. Para confirmar esse indício de obtenção do material final desejado, realizou-se a clivagem do peptídeo da resina/desproteção total e o resultado de LC-MS do produto bruto obtido mostrou um componente com relação (m/z) [M+H+] = 907,58 e [M+2H+] = 454,30, em aproximadamente 18 minutos (Figura 12), comprovando a obtenção do composto desejado Boc-Lys[Suc(Fmoc-Lys-Arg-NH2)]-Arg-NH2.

Procedimento sintético 2: preparação do dendrímero peptídico em fase sólida convencional em temperatura ambiente.

[0062] O procedimento sintético ou rota 2 ocorreu de forma parecida ao procedimento sintético ou rota 1, porém, utilizou-se a temperatura ambiente, condições e reagentes diferentes. A Figura 13 apresenta as etapas desse procedimento.

1. Intumescimento e desproteção de Fmoc da resina amidada

[0063] O intumescimento e a remoção do grupo Fmoc da resina, compatível com a estratégia química usada, ocorreu em solventes polares apróticos, por exemplo, DMF, e solução 25% de 4-metil-piperidina (ou outra base) em solventes polares apróticos, por exemplo, DMSO por até duas horas. Fez-se a lavagem da resina com solventes polares, por exemplo, DMF e etanol. Ao final do procedimento, realizouse o teste de Kaiser para a avaliação da presença ou ausência de grupo amino livre na resina (Kaiser et al., 1970). A remoção do Fmoc foi adaptada de Li e colaboradores (2001).

2. Remoção do grupo protetor Boc (t-butoxicarbonil) e lavagem do sistema (adaptado de Burguer, Lindvall, 2010)

[0064] Foi feita com solução de até 50% TFA em diclorometano. Fez-se, em seguida, a lavagem com solventes polares apróticos, por exemplo, DMF. Posteriormente, adicionou-se solução de até 20% de DIPEA (diisopropiletilamina) ou bases em solvente polar aprótico, por exemplo, DMF, e manteve-se a reação, sob agitação, por até 30 minutos. A lavagem final foi feita com solventes polares, por exemplo, metanol. Retirou-se uma alíquota para realização do teste de Kaiser (Kaiser et al., 1970).

3. Reações de acoplamento e lavagem do sistema (adaptado de Merrifield, 1963; Hojo et al., 2000)

[0065] Adicionaram-se o Fmoc-aminoácido e os reagentes acopladores, por exemplo, TBTU/DIPEA/HOBt ou TBTU/DMAP em frasco contendo a resina. A reação aconteceu à temperatura ambiente por até duas horas. Fez-se a lavagem com solventes polares, por exemplo, DMF e metanol. Ao terminar a lavagem, fez-se o teste de ninidrina da aminoacil ou peptidil-resina (Kaiser et al., 1970).

4. Clivagem do peptídeo da resina e desproteção total

[0066] Colocou-se a peptidil-resina em contato com a solução de clivagem, por exemplo, solução ácido trifluoracético (TFA), TIS, água e TFA. As reações de clivagem e desproteção ocorreram em shaker, por até 3 horas, com temperatura de 37°C. Após este período, a precipitação do peptídeo aconteceu com éter diisopropílico gelado ou éter etílico gelado e fez-se a sua separação em solução contendo acetonitrila e água acidulada. A solução obtida foi liofilizada.

[0067] Acompanharam-se as primeiras etapas com teste de ninidrina que revelou as colorações azul intenso, amarelo e azul intenso, para Fmoc-Arg(Pbf)-resina amida, Arg(Pbf)- resina amida e Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-resina amida, respectivamente. Importante mencionar que reações de reacoplamentos aconteceram, nas mesmas condições, quando o teste de ninidrina não evidencia a coloração esperada (KAISER et al., 1970). Pretendia-se, portanto, alcançar máxima substituição dos grupos -NH2 terminais livres e, quando se obteve esse indício, submeteu-se o suposto Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-resina amida à clivagem do peptídeo da resina/desproteção total para verificar a obtenção de FmocLys-Arg-NH2.

[0068] O composto desejado apareceu com tempo de retenção de 18,5-19,5 minutos (Figura 14), conforme padrão obtido no procedimento ou rota 1. Decidiu-se, então, realizar a remoção do grupo protetor Boc de Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-resina amida.

[0069] O teste de ninidrina de Fmoc-Lys-Arg(Pbf)-resina amida mostrou coloração azul intensa, confirmando a presença de grupo amina livre na lisina. Como o acoplamento do ácido succínico ao dipeptídeo forneceu resultado negativo no teste de ninidrina (coloração amarela) já esperado, avaliou-se por HPLC, o produto bruto resultante da clivagem do peptídeo da resina e desproteção total. O composto desejado FmocLys(Suc)-Arg-NH2 eluiu em 22,5 minutos (Figura 15). Próximo de 26 minutos apareceu uma impureza não identificada.

[0070] Utilizaram-se as condições listadas abaixo para a purificação em cromatografia flash (Tabela 1), que forneceu: Fmoc-Lys(Suc)-Arg-NH2 com tempo de retenção próximo de 26,5 minutos e pureza cromatográfica de 89% (Figura 16).

[0071] Ao produto Fmoc-Lys(Suc)-Arg(Pbf)-resina amida acoplou-se o Fmoc-Lys-NH2 para obtenção de Fmoc-Lys(Suc-LysFmoc)-Arg(Pbf)-resina amida (em azul na Figura 16). Em seguida, reagiu-se este último produto com Fmoc-Arg(Pbf)-OH para obtenção do dendrímero peptídico, Fmoc-Lys[SucLysArg(Pbf)]-Arg(Pbf)-resina amida. Em ambas as etapas houve a necessidade de reacoplamento. Acompanharam-se as reações com teste de ninidrina, revelando, ao final, ausência de grupo amina livre para os dois produtos.

[0072] Analisou-se por LC-MS o produto bruto gerado da clivagem/desproteção total. Apareceram muitos componentes no cromatograma, porém, com o tempo de retenção entre 38,8 a 39,4 minutos pode ser do composto desejado, pois seu espectro de massas mostrou íons com relação (m/z) [M+2H+] = 401,33 (Figura 17).

[0073] Este composto, entretanto, se apresenta tendo como contra-íon o TFA e, em meio a subprodutos em fase de identificação

[0074] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (18)

1. Método de obtenção de dendrímeros peptídicos dirigidos para a doença de Chagas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   • a) Intumescimento e desproteção da resina amidada com a remoção do grupo Fmoc;
   • b) Remoção do grupo protetor Fmoc ou Boc e lavagem do sistema;
   • c) Reação de acoplamento de derivado de aminoácido ou dipeptídeo e lavagem do sistema;
   • d) Monitoramento das etapas a-b pelo teste de Kaiser;
   • e) Clivagem do peptídeo da resina amidada e desproteção total;
   • f) Obtenção dos dendrímeros-alvo brutos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende como materiais de partida os derivados de aminoácidos Fmoc-Arg(Pbf)-OH e Fmoc-Lys(Boc)- OH, em que as carboxilas da arginina estão livres.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente os derivados de aminoácidos Boc-Lys(Fmoc)-OH e H-Arg(Pbf)-OH, em que H representa a amina α livre de OH a carboxila livre.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é empregado um suporte sólido selecionado de copolímeros de poliestireno com 1% de divinilbenzeno aminados, mais preferivelmente modificados para dar origem às resinas Rink amida.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que nas etapas a), b) e c) são empregados solventes polares apróticos selecionados do grupo que consiste em dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona (NMP) ou misturas de DMSO/MMP.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que na etapa b) para a remoção do grupo Fmoc, o referido solvente, preferivelmente dimetilformamida, é misturado com uma base 4-metil-piperidina, em uma concentração de 20%-30%.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa b), para remoção do grupo Boc, é usado como solvente a mistura de TFA em diclorometano 20- 50%.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa c), os reagentes acopladores são selecionados do grupo que compreende carbodiimidas, triazois, sais de fosfônio (BOP) ou de urônio, estes últimos combinados com N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)na proporção 1:3 mol/mol], como: N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), 1- hidroxibenzotriazol anidro (HOBt), tetrafluoroborato de 2- (1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU), hexafluorofosfato de 2-(1-H-7-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilurônio (HATU), em quantidade equimolar à dos derivados de aminoácidos e adicionados à resina amida intumescida e desprotegida para reação.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lavagem do sistema é realizada utilizando solventes polares apróticos selecionados do grupo que compreende dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) em alternância com metanol (MeOH), por 3 vezes de cada.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a lavagem do sistema foram obtidos os compostos H-Arg(Pbf)-Rink amida, Fmoc-Lys-Arg-NH2 e FmocLys-Arg(Pbf)-Rink amida.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa e), é adicionada uma solução contendo ácido trifluoroacético a 90-95% e compostos que atuam como scavengers de íons de carbônio na concentração que varia de 2,5 a 5%, preferencialmente triisopropilsilano (TIS) ou anisol, e opcionalmente água na concentração de 2,5%, sendo as misturas incubadas sob agitação a 25-37ºC.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que são obtidos os compostos Fmoc-Lys-Arg-NH2, e Fmoc-Lys[Suc(Fmoc-Lys-Arg)]-Arg-NH2.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o composto Fmoc-Lys-Arg-NH2 compreende amina ε e o grupo guanido sem proteções e a carboxila da Arg está amidada.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a obtenção do composto Fmoc-Lys-Arg-NH2 foi realizada com o composto ligado na resina polimérica.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto Fmoc-Lys-Arg-NH2 reage com o BocLys(Suc)-Arg(Pbf)-resina Rink amida.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que são obtidos os compostos Fmoc-Arg(Pbf)-Rink amida, Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Rink amida, Boc-Lys(Fmoc)- Arg(pbf)-Rink amida, Boc-Lys(Suc)-Arg(Pbf)-Rink amida, FmocArg(Pbf)-Rink amida, Fmoc-Lys(Suc)-Arg(Pbf)-Rink amida, Fmoc-Lys(Suc)(Fmoc-Lys)-Arg(Pbf)-Rink amida, FmocLys[Suc(Fmoc-Lys-Arg(Pbf)]-Arg(Pbf)-Rink amida.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa f) os dendrímeros obtidos compreendem um ácido succínico (AS) e ramificações dipeptídidicas contendo resíduos de lisina e arginina.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os dendrímeros têm a fórmula Y[Suc-(X)]- Arg-NH2, em que Y é Lys e X é Lys-Arg-NH2, Fmoc-Lys-Arg-NH2, Lys-Arg-OH.

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