DE4406491A1 - Spaltvorrichtung - Google Patents

Spaltvorrichtung

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Spaltvorrichtung, die zum Freisetzen eines auf einem festen Träger durch eine Festphasen-Peptidsynthese angesammelten Peptids eingesetzt wird.
Allgemein ist die Synthese von DNA, RNA und Peptiden (im folgenden einfach als Peptidsynthese bezeichnet) durch Wiederho­ len einer Reihe von Wasch-, Kopplungs-, Wasch- und Schutzgruppen­ entfernungsmaßnahmen auf einem festen Träger aus Glasperlen oder Harzpulver in einem Reaktionsgefäß mit angeschlossenem Filter durchgeführt worden. Um ein freies Peptid zu erhalten, ist gleichfalls ein Spaltverfahren nach den zuvor genannten Maßnahmen nötig.
Die chemische Peptidsynthese verlangt großes Wissen und hochentwickelte Technik; darüber hinaus sind Aminosäurederivate zur Peptidsynthese teuer. Daher wird das entstehende Peptid als eine Substanz mit hohem Wertzuwachs bezeichnet. Reagenzien und therapeutische oder diagnostische Mittel, die chemisch syn­ thetisierte Peptide enthalten, brachten gelegentlich einen extrem großen Gewinn. Wenn ein so synthetisiertes Peptid für praktische Zwecke verwendet wird, wird eine vergleichsweise große Menge benötigt, d. h. für den Einsatz in der Forschung sind mindestens 10 bis 20 mg notwendig und mehr als 100 g für kommerziellen Einsatz, vorklinische Tests oder klinische Verwendung. Eine Synthese im großen oder zumindest mittleren Maßstab ist somit unbedingt für praktische Zwecke erforderlich.
Bei einer derartigen Peptidsynthese in größeren Mengen nach einem herkömmlichen Verfahren (Boc-Chemie) wird jedoch ein spezieller Reaktor oder vorsichtiger Betrieb benötigt, da extrem gefährliche Reagenzien, wie Fluorwasserstoff oder Trifluormethan­ sulfonsäure (TFMSA) in großen Mengen bei der abschließenden Stufe des Spaltverfahrens verwendet werden. In den vergangenen Jahren wurde Fmoc-Chemie zur Festphasenpeptidsynthese vielfach auf dem Gebiet der Peptidchemie eingesetzt, die die Spaltbehandlung unter weniger gefährlichen Bedingungen zuläßt. Beim Fmoc-Polyamidver­ fahren wird mit TFA (Trifluoressigsäure) gespalten. TFA ist kein absolut sicheres Agens und bedarf vorsichtiger Handhabung. Die von in großen Mengen eingesetztem TFA ausgehende Gefahr ist nach wie vor eine aktuelle Sorge auf diesem technischen Gebiet. Daher wurde seit langem die Entwicklung einer Spaltvorrichtung, die eine leichte, sichere, schnelle und zuverlässige Spaltung bei einer Peptidsynthese mit großen Ansätzen erlaubt, betrieben.
Erfindungsgemäße Aufgabe ist es, eine Spaltvorrichtung zur Verfügung zu stellen, die eine einfache, sichere, schnelle und zuverlässige Spaltung bei einer Peptidsynthese mit großem Ansatz erlaubt.
Gemäß Erfindung wurden intensive Untersuchungen durch­ geführt, um die obige Aufgabe zu lösen; es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, die Spaltung durch Zirkulieren einer Spaltmi­ schung in einem geschlossenen System durchzuführen. Weitere Entwicklungsarbeiten vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Zusammengefaßt betrifft vorliegende Erfindung eine Spaltvor­ richtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Spaltmi­ schungstransportleitung zwischen einer Peptidsynthesesäule, die ein Peptid oder ein seitenkettengeschütztes Peptid enthält, das auf dem festen Träger nach Abschluß des Peptidzusammenbaus (im folgenden einfach als Peptidylharz bezeichnet) gebunden ist, und einer Spaltmischungszuführflasche, durch die die Spaltmischung aus der Spaltmischungszuführflasche der Peptidsynthesesäule zugeführt und von der Peptidsynthesesäule in die Spaltmischungs­ zuführflasche zurückgewonnen wird, aufweist.
In vorliegender Erfindung ist eine Spaltvorrichtung als eine Vorrichtung zum Spalten der Peptid-Harzbindung (fester Träger) und gleichzeitigem Entfernen der Seitenkettenschutzgruppen definiert, um ein auf dem festen Träger durch Festphasen- Peptidsynthese angesammeltes Peptid freizusetzen; hierbei handelt es sich beispielsweise um die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung.
Die Spaltvorrichtung besitzt eine verbindende Spaltmi­ schungstransportleitung zwischen einer Peptidsynthesesäule, die ein Peptidylharz enthält, und einer Spaltmischungszuführflasche, durch die die Spaltmischung aus der Flasche in die Säule geleitet wird und von dort in die Flasche zurückgewonnen wird. Durch Wechseln der Flußrichtung der Spaltmischung in der Spaltmi­ schungstransportleitung wird die Spaltmischung gerührt und transportiert, und durch Wiederholen des Rühr- und Transportzy­ klus wird die Spaltmischung zirkuliert. Nachdem die Spaltmischung für einen bestimmten Zeitraum zirkuliert wurde, wird sie in die Spaltmischungszuführflasche durch die Spaltmischungstrans­ portleitung zurückgewonnen. Die so zurückgewonnene Spaltmischung in der Spaltmischungszuführflasche enthält gelöst das gewünschte Peptid, das vom Harz abgespalten wurde und dessen Seitenketten­ schutzgruppen entfernt wurden.
Die erfindungsgemäß verwendete Spaltmischung ist eine Mischung aus einer oder mehreren Reagenzien, die zum Freisetzen des gewünschten Peptids geeignet sind, nämlich solchen, die zum Spalten in einer gewöhnlichen Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden, wie TFA, Anisol, Thioanisol, Ethandithiol, Dimethylsulfid (DMS), Ethylmethlysulfid (EMS), Phenol und Thiophenol als Beispiele.
Durch Einsatz der erfindungsgemäßen Spaltvorrichtung kann eine große Peptidmenge in leichter, sicherer, schneller und zuverlässiger Weise behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch folgende detaillierte Beschreibung und beigefügte, lediglich illustrierende und somit vorliegende Erfindung nicht einschränkende Zeichnungen besser verstanden.
Fig. 1 zeigt eine schematische Abbildung der erfindungs­ gemäßen Spaltvorrichtung; und
Fig. 2 zeigt ein Reverse-HPLC-Elugramm des rohen mit der erfindungsgemäßen Spaltvorrichtung gewonnenen Peptids.
Die Bezugszahlen der Fig. 1 bezeichnen die folgenden Elemente:
Element 1 ist eine mit Harz gepackte Synthesereaktionssäule; Element 2 ein Trichter, Element 3 ein Kolben, Element 4 ein Trichter, Element 5 ein Behälter, Element 6 ein Außenbad, Element 7 bis 11 Stickstoffgas, Element 12 ein Ventil, Element 13 eine Pumpe und Elemente a bis j Leitungen.
Das erfindungsgemäße Spaltverfahren zum Freisetzen des gewünschten Peptids von dem festen Träger (Harz) nach Abschluß des Peptidzusammenbaus wird im einzelnen beschrieben. Die in Fig. 1 gezeigte Spaltvorrichtung wird als eine typische erfindungs­ gemäße Ausführungsform verwendet.
Stufe (1): Nachdem die Festphasen-Peptidsynthese in einem kontinuierlichen Flußverfahren, d. h. Acylierung (Kopplung) und anschließendem Entfernen der Nα-Schutzgruppe abgeschlossen ist, wird die zur Synthese verwendete Säule an die in Fig. 1 gezeigte Spaltvorrichtung als eine Synthesereaktionssäule 1 angeschlossen. Wenn eine Festphasen-Peptidsynthese chargenweise durchgeführt wird, wird das entstandene Peptidylharz in die Reaktionssäule 1 gepackt.
Stufe (2): Als Waschflüssigkeiten werden Methanol, t- Butylmethylether und Diethylether in dieser Reihenfolge der Synthesereaktionssäule 1 durch Leitung i zugeführt, um das erhaltene Peptidylharz zu waschen. Alternativ kann jede Wasch­ flüssigkeit über einen Trichter 2 in die Flasche 3 und weiter der Synthesereaktionssäule 1 zugeführt werden, um das Peptidylharz zu waschen. Nach dem Waschen wird die entstandene Abfallflüssig­ keit über Leitung e abgeleitet. Das Peptidylharz in der Syn­ thesereaktionssäule 1 wird getrocknet, indem Stickstoffgas 8 unter erhöhtem Druck in die Synthesereaktionssäule 1 über die Leitung f zugeführt wird, wobei die Syntheserektionssäule 1 gespült und das Gas über Leitung g abgeleitet wird. Es ist ebenfalls möglich das Peptidylharz durch Zuführen von Stickstoff­ gas 7, anstelle von Stickstoffgas 8, unter erhöhtem Druck zur Synthesereaktionssäule 1 über Leitungen a, b, c und d zu trocknen, wobei die Synthesereaktionssäule 1 gespült und das Gas über Leitung e abgeleitet wird. Wenn jedoch die Peptidsynthese chargenweise durchgeführt wird, und das trockene Harz in die Reaktionssäule 1 gepackt werden kann, kann diese Operation unterlassen werden.
Stufe (3): Durch Zuführen von Stickstoffgas 8 zur Syn­ thesereaktionssäule 1 unter erhöhtem Druck über Leitung f und Ableiten über Leitung g wird das Innere der Synthesereaktions­ säule 1 getrocknet.
Stufe (4): Die Spaltmischung wird aus dem Trichter 2 der Flasche 3 (bevorzugt ein auberginenförmiger Kolben) zugeführt. Die Spaltmischung in Flasche 3 tritt in die Synthesereaktions­ säure 1 durch die Leitungen c und d ein. Die Leitungen c und d sind Spaltmischungstransportleitungen in der Spaltvorrichtung.
In einigen Fällen ist es notwendig, die Temperatur im Kolben 3 abhängig vom Typ des abzuspaltenden Peptids und des Typs der Seitenkettenschutzgruppen zu regeln. In diesem Fall wird im notwendigen Maß mit dem Außenbad 6 gekühlt oder erwärmt, dessen Temperatur durch einen Mikroprozessor geregelt werden kann. Wenn beispielsweise die das Peptid bildenden Aminosäuren säureempfind­ lich sind, ist es von Vorteil, die Spaltmischung auf etwa 4°C zu kühlen, bevor sie in die Synthesereaktionssäule 1 eingespritzt wird, um Nebenreaktionen zu verhindern. Obgleich es gelegentlich vorteilhaft ist, die Temperatur im Laufe der Zeit zu ändern, beispielsweise am Beginn und bei Zwischenstufen der Reaktion, hängen diese Bedingungen alle vom Typ des abzuspaltenden Peptids und der Seitenkettenschutzgruppen ab, und die vorzuziehenden Bedingungen sind dem Fachmann für jeden Fall bekannt. Gewöhnlich wird eine gekühlte Spaltmischung zu Beginn eingesetzt.
Stufe (5): Stickstoffgas 8 wird unter erhöhtem Druck der Synthesereaktionssäule 1 über die Leitung f zugeführt, um die in Stufe (4) der Synthesereaktionssäule 1 zugeführte Spaltmischung in Kolben 3 über die zuvor beschriebenen Spaltmischungstrans­ portleitungen (d. h. Leitungen d und c) zurückzuführen.
Stufe (6): Die Spaltmischung in Kolben 3 wird wieder in die Synthesereaktionssäule 1 über die Spaltmischungstransportleitun­ gen (d. h. Leitungen c und d) eingespritzt.
Stufe (7): Die zuvor beschriebenen Stufen (5) und (6) werden in etwa 9 bis 18 Zyklen wiederholt (über etwa 90 Minuten mit Intervallen von etwa 5 bis 10 Minuten), um die Spaltung des gewünschten Peptids zu vervollständigen. Es ist jedoch notwendig, längere Intervalle als gewöhnlich, d. h. etwa 5 bis 8 Stunden, bei Intervallen von etwa 20 bis 30 Minuten, zu verwenden, wenn das gewünschte Peptid Arg(Mtr)- oder Arg(Pmc)-Reste enthält.
Stufe (8): Nach Abschluß der Spaltung wird Stickstoffgas 8 unter erhöhtem Druck über die Leitung f, soweit zum vollständigen Rückführen der Spaltmischung in Kolben 3 notwendig, zugeführt. Zusätzliches Waschen wird durchgeführt. Insbesondere nachdem eine geringe Menge TFA oder Essigsäure zum Waschen von Trichter 4 der Synthesereaktionssäule 1 über die Leitung h zugeführt wird, wird Stickstoffgas 8 unter erhöhtem Druck der Synthesereaktionssäule 1 über die Leitung f zugeführt, um die im Harz der Säule verbliebene Spaltmischung zusammen mit der zuvor beschriebenen TFA oder Essigsäure in Kolben 3 zu spülen.
Anschließend wird Stickstoffgas 7 über die Leitungen a und b in Kolben 3 geleitet, gefolgt von Blasenbildung unter Kühlung (unterhalb 10°C). Zu der Zeit ist Ventil 12 geschlossen, um über Leitung j zu entlüften. Die Peptidkonzentration in der Spaltmi­ schung kann durch dieses Verfahren gesteigert werden. In einigen Fällen steigert dieses Verfahren die Peptidausbeute.
Stufe (9): Trockner Diethylether wird in Kolben 3 über den Trichter 2 gegeben. Alternativ wird Diethylether aus Trichter 4 dem Kolben 3 über Leitung d zugeführt. Ebenfalls kann Diethylet­ her mit einer Pumpe 13 oder durch erhöhten Druck auf der Diethy­ letherflasche über die Leitungen i und c Kolben 3 zugeführt werden. In diesem Fall wird Stickstoffgas 8 oder 9 Kolben 3 über die Leitungen f, d und c oder Leitungen i und c zugeführt, gefolgt von Rühren mit Blasenbildung. Während dieser Operation ist es vorteilhaft, Kolben 3 durch Außenbad 6 zu kühlen. Obwohl die für dieses Verfahren benötigte Zeit etwa 0,5 Stunden beträgt, kann die Peptidausbeute in einigen Fällen gesteigert werden, wenn Kolben 3 über Nacht kühl gehalten wird. Wenn das gewünschte Peptid aliphatisch ist oder durch Diethylether nicht fest wird, kann, wenn nötig, Petrolether oder n-Hexan zusammen oder anstelle von Diethylether verwendet werden.
Nach obigem Verfahren wird Kolben 3 abgenommen und der darin befindliche Niederschlag durch Filtrieren gesammelt, um nach anschließendem Trocknen das gewünschte Peptid als Rohprodukt zu ergeben.
Stufe (10): Das entstandene Rohpeptid wird durch ein geeignetes herkömmliches Verfahren gereinigt.
In den zuvor beschriebenen Stufen (1) bis (10) kann jeder Ventilbetrieb, Druckregelung, Reagenzzusatz und andere Operatio­ nen automatisiert werden, beispielsweise durch Verwendung eines Computers.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im folgendem durch das Arbeitsbeispiel, das die vorliegende Erfindung nicht einschränkt, besser beschrieben.
Beispiel 1: Synthese von Neurokinin A in semipreparativem Maßstab
Das gewünschte Peptid His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu- Met-NH2 (SEQ ID NR: 1) wird durch eine gewöhnliche kontinuierli­ che Flußsynthese unter Einsatz des folgenden Harzes syntheti­ siert.
Harz: Tentagel SRAM® (hergestellt durch Rapp Polymer Deutschland)
Harzsubstitution: 0,21 meq/g, 20 g.
Zum Entfernen der NαFmoc-Gruppe wird Piperidin (20% in DMF) verwendet. Die folgenden Aminosäurederivate werden in vierfachem Überschuß eingesetzt:
Fmoc-Met-OH|6,24 g
Fmoc-Leu-OH 5,94 g
Fmoc-Gly-OH 4,99 g
Fmoc-Val-OH 5,70 g
Fmoc-Phe-OH 6,51 g
Fmoc-Ser(tBu)-OH 6,44 g
Fmoc-Asp(OtBu)-OH 6,91 g
Fmoc-Thr(tBu)-OH 6,68 g
Fmoc-Lys(Boc)-OH 7,87 g
Fmoc-His(Trt)-OH 10,41 g
Jede Kupplung wird mit den Reagenzien BOP(Benzotriazol-1-yl- oxy-tris(dimethylamino)phosphonuimhexafluorphosphat), HOBt(1- Hydroxybenzotriazol) und NMM(N-Methylmorpholin) mit DMF als Reaktionslösungsmittel durchgeführt. Nachdem die NαFmoc-Gruppe entfernt ist, wird das Peptid vom festen Träger abgespalten, und die Seitenkettenschutzgruppen werden gleichzeitig durch Einsatz der erfindungsgemäßen Spaltvorrichtung aus Fig. 1 entfernt.
Im einzelnen wird die zur Peptidsynthese verwendete Säule als erstes an die Spaltvorrichtung aus Fig. 1 als Synthesereak­ tionssäule 1 (siehe Stufe (1)) angeschlossen.
Anschließend werden Methanol, t-Butylmethylether und Diethylether als Waschflüssigkeiten in dieser Reihenfolge aus Trichter 2 in Kolben 3 (auberginenförmiger Kolben) und an­ schließend zur Synthesereaktionssäule 1 geleitet, um das Peptidylharz zu waschen, anstelle sie über Leitung i der Synthesereaktionssäule 1 zuzuführen. Die Abfallflüssigkeit wird durch Leitung e (siehe Stufe (2)) nach dem Waschen abgelassen.
Um darüber hinaus den in Kolben 3 verbliebenen Ether abzulassen, wird Flasche 3 durch eine neue ersetzt, bevor die nächste Stufe durchgeführt wird.
Anschließend wird Stickstoffgas 7 unter erhöhtem Druck über Leitung a durch Leitungen b, c und d zugeführt und anschließend über Leitung e abgeführt, um das Innere der Synthesereaktions­ säule 1 (siehe Stufe (3)) zu trocknen, wonach eine Spaltmischung (eine Mischung aus 94% TFA, 5% Anisol und 1% Ethandithiol, 150 ml) aus Trichter 4 dem Kolben 3 zugeführt wird. Stickstoffgas 7 wird unter erhöhtem Druck über Leitung a zugeführt und die Spaltmischung in Kolben 3 in die Synthesereaktionssäule 1 über die Spaltmischungstransportleitungen (Leitungen c und d) überführt, um die Synthesereaktionssäule 1 damit zu füllen (siehe Stufe (4)).
Stickstoffgas 8 wird unter erhöhtem Druck der Synthesereak­ tionssäule 1 über Leitung f zugeführt, und die in der Syn­ thesereaktionssäule 1 befindliche Spaltmischung wird in den 1000- ml-Kolben 3 über die Spaltmischungstransportleitungen (Leitungen d und c) zurückgeführt (siehe Stufe (5)).
Anschließend wird die Spaltmischung aus Kolben 3 wieder in die Synthesereaktionssäule 1 über die Spaltmischungstransportlei­ tungen (Leitungen c und d) eingespritzt (siehe Stufe (6)). Das Verfahren der zuvor beschriebenen Stufen (5) und (6) wird über etwa 90 Minuten mit Intervallen von etwa 5 bis 10 Minuten, um das gewünschte Peptid vollständig abzuspalten, wiederholt (siehe Stufe (7)).
Nach Abschluß der Spaltung wird Stickstoffgas 8 über Leitung f zugeführt, um die Spaltmischung in Kolben 3 zu spülen (siehe Stufe (8)). Stickstoffgas 7 wird Kolben 3 über Leitungen a und b zugeführt, und während sich Blasen bilden, wird ein Teil der Spaltmischung entfernt, um deren Volumen zu verringern (siehe Stufe (9)). Während dieser Operation wird Kolben 3 durch das äußere Bad 6 gekühlt.
In diesem Beispiel werden die zuvor beschriebenen Verfahren automatisch durch einen Computer durchgeführt.
Anschließend werden 850 ml trockener Diethylether aus Trichter 2 in Kolben 3 gegeben und der Kolben wird über 3 Stunden kühl gehalten. Darauf wird Kolben 3, in dem das Peptid ausfällt, abgenommen und der Niederschlag durch Filtrieren gesammelt und getrocknet, um 5 g des gewünschten Peptids als Rohprodukt zu ergeben. Das Rohpeptid wird einer Sequenzanalyse unterzogen, um die gewünschte Aminosäuresequenz zu bestätigen. Zusätzlich ergibt FAB-MS unter Einsatz Kratos MS50 eine Massenzahl [M+H]⁺ von 1134, 5. Das Revers-Phasen-HPLC-Elugramm des Peptidrohprodukts ist in Fig. 2 gezeigt.
Bei der somit beschriebenen Erfindung ist es offensichtlich, daß sie vielfach abgewandelt werden kann. Diese Variationen können nicht als Abweichung vom Geist und Umfang der Erfindung angesehen werden, und alle Abweichungen, die für den Fachmann offensichtlich sind, sollen vom Schutzbereich der folgenden Ansprüche erfaßt werden.
Sequenzauflistung
  • (1) Allgemeine Information
    • (iii) Zahl der Sequenzen: 1
  • (2) Information zur SEQ ID NR: 1:
    • (i) Sequenzmerkmale:
      • (A) Länge: 10 Aminosäuren
      • (B) Typ: Aminosäure
      • (D) Topologie: Linear
    • (ii) Molekültyp: Protein
    • (ix) Kennzeichen
      • (A) Name/Schlüssel: Modifizierte Lage
      • (B) Ort: 10
      • (D) Weitere Information: Met-NH2
    • (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NR: 1:

Claims (4)

1. Spaltvorrichtung zum Spalten einer Bindung zwischen Peptid und festem Träger und zum Entfernen von Seitenketten­ schutzgruppen, um ein auf dem festen Träger durch Festphasen- Peptidsynthese angesammeltes Peptid freizusetzen, mit einer Säule zum Spalten, in der das auf dem festen Träger angesammelte Peptid vorhanden ist;
einer Spaltmischungszuführflasche, in der Spaltmischung enthalten ist;
einer Spaltmischungstransportleitung, die die Säule zum Spalten und die Spaltmischungszuführflasche verbindet, durch die die Spaltmischung aus der Spaltmischungszuführflasche der Säule zum Spalten zugeführt und in die Spaltmischungszuführflasche von der Säule zum Spalten zurückgewonnen wird; und
einem Gaszuführmittel, durch das die Spaltmischung in der Spaltmischungstransportleitung transportiert wird.
2. Spaltvorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin ein Mittel zum Waschen des auf dem festen Träger in der Säule zum Spalten angesammelten Peptids aufweist.
3. Spaltvorrichtung nach Anspruch 1, die zusätzlich ein Mittel zum Regeln einer Temperatur in der Spaltmischungszuführ­ flasche aufweist, um eine zum Spalten geeignete Temperatur zu halten.
4. Spaltvorrichtung nach Anspruch 1, wobei eine zur Peptidsynthese verwendete Säule als die Säule zum Spalten verwendet wird.
DE4406491A 1993-02-26 1994-02-28 Spaltvorrichtung Withdrawn DE4406491A1 (de)

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