DE69304950T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von synthetischen Peptiden ohne Verlust von Reagenzien - Google Patents

Description

• Allgemeine Grundlage der im folgenden offenbarten erfindungsgemäßen Technolgie ist die Festphasenpeptidsynthese; im besonderen betrifft die Erfindung eine Apparatur zur Isolierung von synthetisierten Peptiden durch Abspaltung von der unlöslichen Trägermatrix der Festphase und außerdem ein damit verbundenes, durch die Apparatur erleichtertes Verfahren, wodurch Peptide, die in gleichzeitigen Mehrfachsynthesen produziert wurden, zur Gewinnung in der endgültigen Produktform zusammen isolierbar sind.
• Die simultane Mehrfachpeptidsynthese gewinnt an signifikant zunehmender Bedeutung für das schnelle Screening oder die Beurteilung von Peptiden, wie Epitopen, Agonisten, Antagonisten oder wirksameren Strukturen. Zu diesem Zweck können Festphasensynthesevorrichtungen, welche Drainagesysteme und Drainageventile enthalten, wie in den früheren Anmeldungen EP-A-O 529573 und EP-O 529504 offenbart, verwendet werden. Außerdem wurde eine automatisierte Achtkanal-Simultanfestphasenpeptidsynthesevorrichtung hergestellt, welche eine große Flexibilität für Synthesen besitzt. Die Apparatur besitzt acht Reaktionsgefäße, von denen jedes eine Drainageöffnung, durch die Waschösungsmittel gespült wird, aufweist, acht Mikrospritzen und eine Aminosäurestation für 160 Aminosäureglasfläschchen. Die acht unabhängigen Kanäle gestatten kreuz-kontaminationsfreie Synthesen und die Erzeugung von variablen Mengen an Peptiden hoher Qualität.
• Die Flexibilität der automatisierten Peptidsynthesevorrichtung ermöglicht die gleichzeitige Herstellung von Peptiden verschiedener Länge, welche nach verschiedenen chemischen Protokollen hergestellt werden können, sowie die gleichzeitige Synthese verschiedener Peptide. Das Instrument kann deshalb zur schnellen Bewertung der Chemie des synthetischen Peptids oder der Bildungsreaktionsbedingungen und außerdem zum Studium von Epitopen oder Strukturaktivitätsbeziehungen verwendet werden.
• Die automatisierte Peptidsynthese umfaßt normale Aminosäurekupplungszyklen, wobei die carboxylterminalen Enden der Peptidketten von Aminosäureresten, die bei der Synthese gekuppelt wurden, an Styrol oder andere polymere Partikelkügelchen, die mit Harz beschichtet sein können und als eine Trägermatrix dienen, gebunden werden. Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die während der Synthese zur Kupplung zugegebenen wurde, muß geschützt (d. h., blockiert) werden, so daß ausschließlich ihr aktiviertes Carboxylende reaktiv ist (gewöhnlich werden Seitengruppen der Aminosäuren ebenso geschützt). Da die als Schutzgruppe dienende Verbindung mit dem Stickstoff in der α-Aminogruppe zusammenwirkt, könnte dieses als "N-α-Schutz" bezeichnet werden. Die α-Aminogruppe des terminalen Restes, der zuletzt an die wachsende Peptidkette gekuppelt wurde (oder anfänglich an die Trägermatrix gebunden wurde), liegt somit in geschütztem Zustand vor und muß deshalb vor der nachfolgenden Kupplungsreaktion "entschützt" (von der Schutzgruppe befreit) werden.
• Im allgemeinen werden am Ende eines Kupplungszyklus die verlängerten Peptidketten in Lösungsmittel gewaschen, um sie von zurückbleibenden Kupplungsreagenzien und Nebenprodukten der vorhergehenden Kupplungsreaktion zu reinigen. Dann wird der von dem verknüpften Ende der Peptidkette entfernt liegende N-Terminus zur Kupplung vorbereitet, indem die N-α-Schutzgruppe chemisch entfernt wird; nach einem weiteren Waschen wird ein Kupplungsreagens, welches die nächste geschützte Aminosäure (d. h., mit der angelagerten N-α-Blockierungsgruppe) zur Verbindung mit dem von den Schutzgruppen befreiten N-α-Ende des Peptidylharzes enthält, zugegeben. Auf diese Stufe, in der ein am aminoterminalen Ende geschütztes Peptidylharzintermediat in der Synthese gebildet wird, folgt ein weiteres Waschen in Lösungsmittel, womit ein normaler Kupplungszyklus in der Peptidsynthese abgeschlossen wird, der zum Erhalt eines Peptidprodukts mit einer gewünschten Aminosäuresequenz wiederholt werden kann.
• Auf die Kupplungszyklen einer Peptidsynthese in der Peptidsynthesevorrichtung folgt ein letzter Zyklus. Normalerweise werden, nachdem die Schutzgruppen der N-α-Enden des Peptidylharzes vor der Kupplung entfernt worden sind, die synthetisierten, harzgebundenen Peptide mit einer letzten Sequenz von Waschlösungsmitteln gereinigt. Alternativ kann, in Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung des synthetisierten Peptidprodukts in der endgültigen Form, das Peptidylharz vor dem letzten Waschen in seinem geschützten Zustand belassen werden; in Anbetracht der Chemie der Schutzgruppen kann das Produkt während des Isolierungsverfahrens so verbleiben. Das gewaschene Peptidprodukt wird dann durch inertes Gas, welches durch eine Zufuhröffnung in eine Reaktionskammer jedes Reaktionsgefässes, welches das Peptidylharz auf einem Filter enthält, geblasen wird, getrocknet.
• Zum Erhalt eines endgültigen Peptidprodukts müssen die synthetisierten Peptide durch Abspaltung von der Trägermatrix in einem Verfahren, welches außerhalb der Peptidsynthesevorrichtung durchgeführt wird, isoliert werden. Dieses Verfahren erfordert im allgemeinen, daß das Peptidylharz, d. h., das Peptid in seiner unlöslichen Festphase, im Anschluß an die Synthese manuell in einen separaten Behälter überführt wird, worin es mit einer Spaltlösung, welche die Peptide von ihrer Bindung an die Trägermatrix freisetzt, behandelt wird. Die erhaltene Peptidyllösung wird weiter durch ein gewöhnliches Extraktionsverfahren, nämlich Ausfällung und Zentrifugation, zu einer endgültigen Produktform isoliert.
• Der manuell durchgeführte Transfer des Peptidylharzes oder von Harz freigesetzter Peptidyllösung in Behälter, in denen die Abspaltungsreaktion oder die endgültige Produktextraktion durchgeführt wird, verursacht einen Verlust von Reagenzien (mechanischer Verlust), d. h., einiges Peptidylharz oder Lösung verbleibt in dem Gefäß, aus dem es (beispielsweise durch Schütten) überführt worden ist. Dies kann folglich die Peptidausbeuten herabsetzen, im besonderen im Fall der gleichzeitigen Mehrfachpeptidsynthese; außerdem sind die Peptide in dem Isolierungsverfahren anfällig für Kontamination.
• Es ist wünschenswert, den Wirkungsgrad der Peptidisolierungsprozedur insgesamt zu verbessern, im besonderen, Verlust von Reagenzien aufgrund von Transfer von Peptidylharz oder Peptidyllösung zwischen Gefäßen auszuschließen, und außerdem Genauigkeit bei der mikromolaren Regulation der Peptidsynthese in kleinem Maßstab zu gewährleisten.
• Diese Aufgaben werden durch die Apparatur gemäß Ansprüchen 1 bis 5 und das Verfahren gemäß Ansprüchen 9 bis 12 gelöst. Eine Einblaseinheit, die mit einer Peptidsyntheseeinheit verwendet werden kann, ist in den Ansprüchen 6 bis 8 definiert.
• In der erfindungsgemäßen Apparatur zur Isolierung eines synthetisierten Peptids wird die Reaktion, welche das Peptidylharz freisetzt, wobei die Harzträgermatrix in der Spaltlösung, in der die verlängerten, vom Harz abgespaltenen Peptidketten löslich werden, suspendiert ist, in den gleichen Reaktionsgefäßen, in denen die Peptide synthetisiert werden, durchgeführt. Jedes Reaktionsgefäß ist im wesentlichen zylindrisch und beinhaltet einen Filter in einem Abstand über einer Drainageöffnung, die sich an einem Ende des Gefäßes befindet. Der Bereich über dem Filter, welcher zusammen mit diesem von der Reaktionsgefäßwand abgegrenzt wird, ist eine Reaktionskammer. Die Drainageöffnung des Reaktionsgefäßes wird mit einem Verschluß oder einer Kappe verschlossen oder geöffnet. Die Spaltlösung wird dann direkt zu dem synthetisierten Peptidylharz, welches sich auf dem Filter in der Reaktionskammer befindet, gegeben. Mit der geöffneten Drainageöffnung ist der Druckausgleich derart, daß die Oberflächenspannung des Meniskus der Peptidylspaltlösung, welche gerade in die Öffnung eintritt, aufrecht erhalten wird, womit die Lösung vom Weiterwandern zurückgehalten wird.
• Mit dem so in einer Flüssigphase gelösten, synthesierten Peptid wird die Lösung in eine Zentrifugenröhre überführt, in der das Peptid ausgefällt und anschließend zentrifugiert und getrocknet wird. Der Transfer der Peptidyllösung wird durch unter Druck gesetztes, inertes Gas, welches durch eine erfindungsgemäße Einblaseinheit in die Reaktionskammer eingeführt wird und die Peptidyllösung vollständig durch die Drainageöffnung und in das Zentrifugenröhrchen austreibt, bewirkt.
• Demgemäß verläuft ein Verfahren zur Isolierung von Peptiden, die in den Reaktionsgefäßen synthetisiert wurden, welche den Kanälen einer Festphasensyntheseapparatur entsprechen, wie folgt:
• Anfänglich wird die Drainageöffnung zu der Reaktionskammer durch einen Verschluß verschlossen. Das Reaktionsgefäß, welches eine mit einem Flansch versehene Zufuhröffnung für Reaktionslösung aufweist, wird dann in eine Zentrifugenröhre eingesetzt, wobei es durch den Flansch auf der Zentrifugenröhreneinfassung getragen wird. Die Zentrifugenröhre wird dann in einen Ständer gestellt, der wenigstens soviel Röhren entsprechend der Anzahl an Kanälen der Festphasenpeptidsynthesevorrichtung tragen kann, so daß die Peptidisolierung gleichzeitig in dieser Anzahl an Reaktionsgefäßen durchgeführt werden kann.
• In die Reaktionskammer, worin synthetisiertes Peptidylharz, d. h. an die unlösliche Trägermatrix gebundene Peptidketten, enthalten ist, wird Spaltlösung gegeben. Hierbei können die N-α- Aminogruppen an den N-Termini (oftmals auch an den Seitenketten) der Peptide geschützt gelassen oder, in anderen Verfahren, entblockt werden. Die verschlossenen Reaktionsgefäße werden so in dem Ständer stehengelassen, bis genügend Zeit vergangen ist, um die Reaktion, in der die Peptide von dem Harz abgespalten werden, stattfinden zu lassen, und die Peptide in der Spaltungslösung gelöst sind.
• Jedes Reaktionsgefäß wird dann kurz aus der Zentrifugenröhre entfernt, der Verschluß von der Drainageöffnung entfernt und das Gefäß wieder in die Zentrifugenrröhre eingesetzt. Nachfolgend wird die Düse einer Druckpistole einer Einblaseinheit in die Zufuhröffnung des Reaktionsgefäßes eingesetzt und eingepreßt, wobei ein Plastikdüsenanschlußstück, welches mit der Düsenspitze verbunden ist, einen dichten Verschluß bildet. Das Bedienen des Abzuges der Druckpistole leitet inertes Gas, das durch einen Druckregler im Hauptgehäuse der Einblaseinheit unter Druck gesetzt wurde, in die Reaktionskammer. Die Spaltlösung, in der das Peptid gelöst ist, wird dadurch über einen Filter durch die Drainageöffnung geleitet und somit als Filtrat in die Zentrifugenröhre überführt. Das Trägerharz verbleibt dabei auf dem Filter in der Reaktionskammer.
• Zur Ausfällung des Peptids wird Ether (Diethylether) zu der Peptidyllösung in die Zentrifugenröhre gegeben. Die Isolierung des Peptidendprodukts wird dann durch Zentrifugieren und anschließendes Dekantieren des Überstandes abgeschlossen. Jedoch verbleibt an dieser Stelle der Peptidniederschlag mit dem Ausfällungsmittel durchnäßt und unterliegt, falls es nur durch Verdampfung getrocknet wird, Oxidation oder anderer Kontamination. Aus diesem Grund wird ein Nadelröhrenanschlußstück, welches mit der Druckpistole der Einblaseinheit verbunden ist, zur Verfügung gestellt, um einen Strahl trocknenden, inerten Gases auf den durchnäßten Peptidniederschlag zu blasen. Ein Ende der Nadelröhre ist derart ausgebildet, daß es mit dem Düsenanschlußstück, welches mit der Düse der Druckpistole verbunden ist, ausgetauscht werden kann, und das entgegengesetzte Ende verjüngt, um das unter Druck gesetzte, inerte Gas, welches aus der Nadelröhre ausströmt, zu fokussieren. Bei Aktivierung des Druckpistolenauslösers zur Öffnung des Düsenventils wird ein Strahl des unter Druck gesetzten, inerten Gases in die Zentrifugenröhre eingeleitet, wo er zum lokalen Trocknen des Peptidprodukts ausgerichtet werden kann. Auf diese Weise wird der durchnäßte Niederschlag schnell und ohne Verlust an Peptidyl getrocknet.
• Da ohne weiteres simultane Peptidspaltung unter Verwendung derselben Reaktionsgefäße durchgeführt werden kann, wird der Verlust an Reagenzien in der Abspaltungsstufe, sogar bei Synthesen in kleinem Maßstab, minimiert oder eliminiert. Außerdem trägt die Stickstoffatmosphäre, welche von der Einblaseinheit erzeugt wird, wenn die Peptidyllösung in die Zentrifugenröhre eingeleitet und wieder, wenn der Peptidniederschlag getrocknet wird, dazu bei, Oxidation des Peptidprodukts zu verhindern, und entfernt Spülmittel, mit dem das Peptidprodukt von Nicht- Peptidylmaterial gereinigt wurde.
• Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, welches eine Reaktionsanordnung in einer Festphasenpeptidsyntheseapparatur veranschaulicht und die damit verbundene Einblaseinheit zeigt.
• Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht eines Reaktionsgefäßes, welches in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
• Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht der erfindungsgemäßen Einblaseinheit.
• Fig. 4 ist eine perspektivische Ansicht der Peptidisolierungsapparatur vor einem Spaltungsprozeß.
• Fig. 1 zeigt schematisch die Grundkomponenten einer Reaktionsanordnung 1 in einer Festphasenpeptidsynthesemaschine und außerdem eine damit verbundene Peptidisolierungsapparatur 2 in der bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Reaktionsanordnung 1 umfaßt ein Reaktionsgefäß 5, eine Reagens/Lösungsmittel-Zufuhrstation 3 und eine Drainagevorrichtung 4.
• Das Reaktionsgefäß 5 ist entfernbar und wird in der Isolierungsapparatur 2 verwendet; es wird also sowohl für die Festphasenpeptidsynthese, welche (durch N-α-Gruppen) geschütztes Peptidylharz (oder alternativ, an N-α von Schutzgruppen befreites Peptidylharz) produziert, als auch für den darauffolgenden Abspaltungsprozeß, welcher die Peptide freisetzt, wobei sie in der Spaltungslösung gelöst werden können, verwendet. Die Isolierungsapparatur 2 umfaßt außerdem eine erfindungsgemäße Einblaseinheit 6.
• Gemäß Fig. 2 weist das Reaktionsgefäß 5 eine im wesentlichen zylindrische Form auf, wobei sich an seinem einen Ende eine Reagens/Waschlösungsmittel-Zufuhröffnung 5a, die durch einen Flansch 7 eingefaßt ist, und an seinem anderen Ende eine nippelförmige Drainageöffnung 8 befindet. Die Drainageöffnung 8 ist verjüngt oder kann eine äußerliche Rille oder Rillen besitzen, so daß sie durch eine flüssigkeitsdichte Kappe 9 mit einer entsprechend verjüngten Bohrung oder entsprechender innerer Rille(n) verschließbar ist. Das Reaktionsgefäß 5 ist aus einem Material hergestellt, welches mit der unlöslichen Trägermatrix, die im folgenden beschrieben wird, nicht chemisch reaktiv ist und kaum statische Elektrizität erzeugt. Ein geeignetes, kostengünstiges Material ist beispielsweise Polypropylenharz, dessen unspezifische Adsorptionsfähigkeit von synthetisiertem Peptid minimal ist.
• Das Innere des Reaktionsgefässes 5 ist durch einen Filter 10, der sich in einem Abstand über der Drainageöffnung 8 befindet, geteilt. Durch die Bohrung des Reaktionsgefässes und die peptidylharzzurückhaltende Oberfläche des Filter 10 wird eine Reaktionskammer 11 abgegrenzt. Der Filter 10 ist aus einem geeigneten porösen Material, beispielsweise aus polymeren Materialien, wie Polyalkylenharz, einschließlich Polypropylen- oder Polyethylenharz, hergestellt. Das bevorzugteste Material für den Filter 10 ist hier Polypropylenharz.
• Gemäß Fig. 3 besteht die Einblaseinheit 6 im wesentlichen aus einem Hauptgehäuse 12, welches einen (nicht gezeigten) Druckregler enthält, und einer Druckpistole 13. Der Druckregler ist durch einen Regler 14, welcher zusammen mit einer Einlaßöffnung 15 und einer Auslaßöffnung 16 außen an dem Hauptgehäuse 12 montiert ist, regulierbar. Die Einlaßöffnung 15 ist mit einer (nicht gezeigten) Stickstoffgasquelle, beispielsweise durch Verbindung mit einer Gaszufuhrleitung (verbunden mit einer Stickstoffgasbombe) der Peptidsynthesevorrichtung, verbunden. Der Griff 17 der Druckpistole 13 enthält einen Gasdurchfluß, dessen Eingang an der Basis des Griffes 17 mit einem Schlauch 19 verbunden ist, der wiederum mit der Auslaßöffnung 16 verbunden ist. An dem Ausgang des Gasdurchflusses ist eine Düse 18 angeschlossen. Die Düse 18 stößt inertes Gas, welches unter kontrollierbar reguliertem Druck von dem Hauptgehäuse 12 geliefert wird, aus. Ein Kunststoff (in der bevorzugten Ausführungsform Gummi)- Düsenanschlußstück 20 ist mit der Düse 18 verbunden und bildet einen luftdichten Verschluß, wenn es in die Reaktionskammer 11 eingeführt und gegen die Einfassung der Zufuhröffnung 5a des Reaktionsgfäßes 5 gepreßt wird. Der Abzug 21, welcher an dem Griff befestigt ist, wird zum Öffnen und zum Schließen eines Düsenventils 18 aktiviert. Das Gummidüsenanschlußstück 20 ist mit einem Nadelröhrenanschlußstück 20a, welches zum Trocknen des mit Ether durchnäßten Peptidniederschlags nach der Zentrifugation verwendet wird, austauschbar.
• Die Reagens/Lösungsmittel-Zufuhrstation 3 umfaßt eine Zufuhranordnung 22, welche durch Verbindung mit der Zufuhröffnung 5a jedes Reaktionsgfässes 5 Kupplungsreagenzien oder Waschlösungsmittel zuführt. Es werden eine Mehrzahl von Reagenstanks 24 bereitgestellt, um N-α-Schutzgruppen entfernendes Reagens zum Entblocken des Peptidylharzes und Reagenzien zur Herstellung von Batches aktivierter Aminosäurelösung aus der Aminosäurestation (welche nicht gezeigt ist) zur nachfolgenden Zufuhr in das Reaktionsgfäß 5 in die Zufuhranordnung 22 einzuleiten.
• Eine (nicht gezeigte) Dimethylformamid (DMF)-Lösungsmittelzufuhr ist ebenso Bestandteil der Zufuhrstation 3 und mit dem System hinter dem Punkt in der Reaktionslösungszufuhranordnung 22 verbunden, der mit einer Leitung von der Stickstoffgasbombe verbunden ist. Das DMF-Lösungsmittel wird sowohl zum Auswaschen des Reaktionsgefäßes 5 als auch zum Waschen des batchweise in Kupplungsstufen synthetisierten und auf dem Filter 10 gehaltenen Peptidprodukts verwendet; wobei die verlängerten, geschützten Peptide an die Harzpartikel gebunden bleiben, bis das endgültige (geschütze oder von den Schutzgruppen befreite) Produkt zur Reinigung abgespalten wird. Waschöffnungen 23 sind ein weiterer Bestandteil der Zufuhrstation 3 und sind mit der Zufuhranordnung 22 verbunden, wenn Waschlösungsmittel zu ihrer Reinigung durchgeleitet wird.
• Die Drainagevorrichtung 4 ist an die Drainageöffnung 8 des Reaktionsgefäßes 5 anschließbar und beinhaltet einen Durchfluß 25 und eine Stickstoffgaszufuhrleitung 26. Die Drainageöffnung 8 ist alternativ mit dem Durchfluß 25 oder der Stickstoffgaszufuhrleitung 26 durch Bedienen eines Austauschventils 27 anschließbar.
• In Verbindung mit der Funktion und Wirkung der Ausführungsform wird im folgenden ein Peptidsyntheseverfahren der oben genannten Festphasenpeptidsyntheseapparatur 1 beschrieben, um die Herstellung von synthetischem Peptidylharz in dem Reaktionsgefäß 5 zu erläutern.
• Zunächst wird eine Menge pulverisierter Harzpartikel auf den Filter 10 des Reaktionsgefäßes 5 gegeben. Nach Bindung der Carboxylenden der Ausgangs-α-Aminosäuren an das Trägerharz werden die N-α-Schutzgruppen ihrer N-terminalen Enden von den Schutzgruppen befreit (entblockt). Eine Lösung aus Kupplungsreagenzien, z. B. eine Mischung aus voraktivierten Acylkomponenten (im allgemeinen: geschützte Aminosäure) und Dimethylformamid (DMF)- Lösungsmittel wird dann über die Zufuhranordnung 22, gemäß Protokoll der Peptidsyntheseapparatur, aus den Reagenstanks 24 in die Reaktionskammer 11 eingeleitet. In den darauffolgenden Schutzgruppenentfernungs-, Kupplungs- und Waschstufen wird Stickstoffgas durch die Gaszufuhrleitung 26 und die Drainageöffnung 8 in die Reaktionskammer 11 eingedrückt, was durch das Austauschventil 27 gemäß Protokoll reguliert wird. Das zugeführte, inerte Gas drückt aus dem Filter 10 aus, wodurch die Reagenslösung sowie die Harzträgermatrix aufgewühlt und aufgerührt und die in Bildung begriffenen, in der Reaktionskammer 11 enthaltenen Peptide verankert werden.
• Während der Waschvorgänge zwischen den Kupplungszyklen und den darin enthaltenen Schutzgruppenentfernungsstufen sowie nach dem letzten Kupplungszyklus der Peptidsynthese wird Waschlösungsmittel (DMF) zugeführt. Das Waschlösungsmittel wird gemäß Protokoll durch die Zufuhröffnung 5a in die Reaktionskammer 11 eingeleitet.
• Am Ende des letzten Zyklus der Peptidsynthese wird der als letztes gekuppelte Aminosäurerest von seinen Schutzgruppen befreit oder, falls erforderlich, in der N-α-geschützten Beschaffenheit belassen (in der er verbleibt, da die Acidität der Spaltlösung, welche in dem unten beschriebenen Spaltverfahren verwendet wird, nicht die Schutzgruppe beeinflußt). Dann werden die synthetisierten verlängerten Peptide in Form eines Peptidylharzes einem letzten Waschen mit Dimethylformamid, Methanol und einem Ether in dieser Reihenfolge unterzogen und die Waschlösungsmittel durch die Drainageöffnung 8 des Reaktionsgefäßes 5 ausgespült. Dann wird Stickstoffgas durch die Zufuhröffnung 5a in die Reaktionskammer 11 eingedrückt, um das geschützte Peptidylharz zu trocknen.
• Zum Erhalt des synthetischen Peptidprodukts in seiner endgültigen Form wird das entstandene, an den Seitenketten mit Schutzgruppen versehene (und wahlweise terminal mit Schutzgruppen versehene) Peptidylharz in einem "Spaltcocktail", welcher sowohl die Seitenkettenschutzgruppen entfernt als auch die Peptide von den Harzträgerpartikeln freisetzt, indem die kettenverankernden Verbindungen gespalten werden, wodurch die Peptide gelöst in dem Spaltcocktail zurückgelassen werden, gespalten.
• Das Spaltverfahren wird mit der Spaltapparatur 2 durchgeführt. Zunächst werden die Zufuhranordnung 22 und die Drainagevorrichtung 4 von dem Reaktionsgfäß 5 abgetrennt und die Drainageöffnung 8 des Reaktionsgefäßes 5 durch die Kappe 9 verschlossen. Wie in Fig. 4 gezeigt, wird das Reaktionsgefäß 5 dann in eine Zentrifugenröhre 28 eingesetzt, wobei es auf der Einfassung der Röhre 28 durch den Flansch 7 getragen wird. Die Zentrifugenröhre 28 wird dann in einen Ständer 30 gestellt. Der Ständer 30 umfaßt eine Tischscheibe 31 mit radial angeordneten hemisphärischen Trägervertiefungen 31a und eine Standscheibe 32, welche konzentrisch mit der Tischscheibe 31 verbunden ist, wobei haltende Ausnehmungen 32a, welche die Standscheibe 32 radial perforieren, über den Vertiefungen 31a angeordnet sind. Auf diese Weise steht die Zentrifugenröhre 28 in einer Vertiefung 31a und wird durch die Kante der entsprechenden Ausnehmung 32a gehalten.
• Als nächstes wird der Spaltcocktail mit einer Mikrospritze oder ähnlichem durch die Zufuhröffnung 5a in die Reaktionskammer 11 des Reaktionsgefässes 5 gegeben; das Reaktionsgefäß 5 wird dann, so wie es ist, für eine vorbeschriebene Dauer stehengelassen, um dem Cocktail Zeit zu geben, die verlängerten synthetischen Peptide von der unlöslichen Harzträgermatrix abzuspalten, woraufhin die Peptide in dem Cocktail löslich werden. Bei geöffneter Drainageöffnung 8 ist der Druckausgleich derart, daß die Oberflächenspannung des Meniskus des Peptidylspaltcocktails, welcher gerade in die Öffnung eintritt, aufrecht erhalten wird, wodurch die Lösung gegen die Schwerkraft vom Weiterwandern die Drainageöffnung 8 hintunter zu der Kappe 9 zurückgehalten wird.
• Nach der Spaltcocktailbehandlung wird das Reaktionsgefäß 5 aus der Zentrifugenröhre 28 entfernt und die Kappe 9 von der Drainageöffnung 8 abgenommen. Das Reaktionsgefäß 5 wird dann wieder in die Zentrifugenröhre 28 eingesetzt. Anschließend wird das Gummidüsenanschlußstück 20 an der Druckpistole 13 in die Zufuhröffnung 5a eingesetzt und durch ausreichendes Einpressen der Druckpistole 13 in das Reaktionsgefäß 5 eingepaßt. Durch Aktivierung des Abzuges 21 öffnet sich dann das Düsenventil, wodurch unter Druck gesetztes Stickstoffgas entlassen wird, was durch den Druckregler des Hauptgehäuses 12 reguliert und mit Hilfe des Reglers 14 auf einen geeigneten Wert eingestellt wird. Das inerte Gas wird so durch das Düsenanschlußstück 20 geblasen, wodurch die Reaktionskammer 11 unter Druck gesetzt und von dem Spaltcocktail, welcher die Peptidyllösung enthält, entleert und die Lösung über den Filter 10 durch die Drainageöffnung 8 in die Zentrifugenröhre 28 eingeleitet wird, wobei die Peptidyllösung gefiltert und das Harz, gehalten auf dem Filter 10 in der Reaktionskammer 11, zurückgelassen wird.
• Als nächstes wird kalter Diethylether in die Zentrifugenröhre 28 gegeben, um das Peptidprodukt von dem Peptidylcocktailfiltrat zu isolieren. Nach Ausfällung wird die Suspension zentrifugiert, wodurch sie in Peptid und Überstand geteilt wird. Der Überstand wird dann von der Zentrifugenröhre 28 dekantiert, wodurch der Peptidniederschlag erhalten wird.
• Der Peptidniederschlag verbleibt darin mit Ether durchnäßt, und anstelle des Verdampfungstrocknens an offener Luft, wodurch Kontamination und Oxidation des Peptidprodukts riskiert wird, wird der Niederschlag mit der Einblaseinheit 6 getrocknet. Zu diesem Zweck wird das Gummidüsenanschlußstück 20 der Einblaseinheit 6 durch die Nadelröhre 20a ersetzt. Die Nadeiröhre 20a wird in die Zentrifugenröhre 28 eingeführt und der Abzug 21 aktiviert, um einen Strahl Stickstoffgas lokal auf den Peptidniederschlag zu sprühen, der derart ausgerichtet ist, daß der Niederschlag nicht weggeblasen wird. Auf diese Weise wird das Peptidprodukt in inertem Gas gebadet, was dazu beiträgt, Oxidation zu verhindern und es gleichzeitig wirksam und schnell vom Ether trocknet, indem das Spülmittel, welches das Peptid von dem Nichtpeptidylmaterial gereinigt hat, ohne Verlust des Produkts entfernt wird.
• Demgemäß findet bei Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidisolierungsapparatur 2 kein mechanischer Transfer von den in Harzpartikeln verankerten Peptidketten vom Reaktionsgefäß 5 in irgendwelche anderen Behälter statt. Der Transfer in die Zentrifugenröhre wird erst durchgführt, nachdem die synthetisierten Peptidketten in dem Spaltcocktail gelöst sind, was in der bevorzugten Ausführungsform innerhalb des Reaktionsgefäßes 5 selbst durchgeführt wird, was wiederum durch Verschließen der Drainageöffnung 8 mit der Kappe 9 ermöglicht wird. Es findet im besonderen ein Flüssigphasentransfer statt. Die Einblaseinheit 6 bläst den Peptidylcocktail durch die enge Drainageöffnung 8 aus, durch die anderenfalls nach Entfernung der Kappe 9 die Lösung nur sehr langsam fließen würde. Außerdem beschleunigt die Einblaseinheit 6 in hohem Maße das Trocknen (im Gegensatz zu Verdampfung ohne Hilfsmittel) des etherdurchnäßten Peptids, welches nach Ausfällung aus dem Peptidylcocktail und letztlicher Isolierung durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstands zurückbleibt.
• Zusammengefaßt wird ein mechanischer Verlust an Peptidylharz praktisch ausgeschlossen und bei Peptidsynthesen in kleinem Maßstab, welche eine mikromolare Steuerung erfordern, Genauigkeit gewährleistet. Außerdem wird das Auftreten von Kontaminationen zwischen Gefäßen, Kontamination mit Spülmitteln und Oxidation des Peptidprodukts größtenteils verhindert. In Verbindung mit einer Festphasenpeptidsynthesemaschine werden durch die Apparatur mit hohem Wirkungsgrad synthetische Peptide hoher Reinheit erhalten.

Claims (12)

1. Apparatur zur Isolierung eines synthetischen Peptids aus einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung, in welcher in Aminosäurekupplungsstufen synthetisierte, verlängerte Peptide an eine unlösliche Partikelträgermatrix in einer Festphase der synthetischen Peptiderherstellung gebunden sind, enthaltend:

ein Reaktionsgefäß mit einer Zufuhröffnung mit einem Flansch an seinem einen und einer Drainageöffnung an seinem anderen Ende und enthaltend einen Filter, der darüber eine Reaktionskammer abgrenzt, in der die Festphasenpeptidsynthese durchgeführt wird;

einen Verschluß, der zum Schließen und Öffnen der Drainageöffnung mit dieser abnehmbar verbunden ist;

eine Zentrifugenröhre mit einer Öffnung zur Aufnahme des Reaktionsgefäßes an ihrem einen Ende und einer Einfassung zum Tragen des Reaktionsgefäßes durch den Flansch;

eine Einblaseinheit, die entfernbar mit der Zufuhröffnung des Reaktionsgefäßes verbunden ist, zur Zufuhr inerten Gases unter reguliertem Druck durch die Zufuhröffnung in die Reaktionskammer, so daß eine Flüssigphase des Peptidprodukts in der Reaktionskammer durch den Filter und die geöffnete Drainageöffnung in die Zentrifugenröhre gedrückt wird.

2. Apparatur gemäß Anspruch 1, welche außerdem ein Standgestell zum gesicherten, gleichzeitigen Tragen mehrerer Zentrifugenröhren umfaßt.

3. Apparatur gemäß Anspruch 2, in welcher die Einblaseinheit folgende Bestandteile umfaßt:

eine Druckpistole mit einem Griff, enthaltend einen Gasdurchfluß, eine Düse, die durch ein Ventil mit dem Gasdurchfluß verbunden ist, und einen Abzug zum Öffnen und Schließen des Düsenventils;

ein Hauptgehäuse, enthaltend einen durch einen Regler regulierbaren Druckregler und mit einer Gaseinlaßöffnung, die mit einer Bombe verbunden werden kann, welche unter Druck gesetztes, inertes Gas zuführt, und mit einer Gasauslaßöffnung, die an einem Eingang des Gasdurchflusses mit der Druckpistole verbunden werden kann; und

ein Plastikdüsenanschlußstück, welches entfernbar mit einer Spitze der Druckpistolendüse verbunden ist und einen luftdichten Verschluß bildet, wenn es mit Druck in die Zufuhröffnung des Reaktionsgefäßes eingesetzt wird, wobei bei Herausziehen des Verschlusses aus der Drainageöffnung das Betätigen des Abzuges zur Öffnung des Drüsenventils die Reaktionskammer unter Druck setzt, um sie von der Spaltlösung, in der das Peptidprodukt löslich ist, zu entleeren und die Lösung über den Filter durch die Drainageöffnung und in die Zentrifugenröhre einzuleiten, in welche das Reaktionsgefäß eingesetzt wurde, und in der das Peptidprodukt durch Zugabe eines Fällungsmittels anschließend ausgefällt wird.

4. Apparatur gemäß Anspruch 3, welche außerdem eine Nadelröhre umfaßt, deren eines Ende verschließbar an die Druckpistolendüse angeschlossen werden kann, wobei es mit dem Plastikdüsenanschlußstück austauschbar ist, und deren gegenüberliegendes Ende zur Fokussierung eines Strahls des unter Druck gesetzten, inerten Gases, welches aus der Nadelröhre ausströmt, ausgebildet ist, und wobei der Strahl des unter Druck gesetzten, inerten Gases lokal das ausgefällte Peptidprodukt austrocknet, um die Verdampfung des Fällungsmittels zu beschleunigen und die Oxidation des Peptidprodukts zu verhindern.

5. Apparatur gemäß Anspruch 3, wobei die Bombe, welche der Einblaseinheit inertes Gas zuführt, außerdem dazu dient, der Festphasenpeptidsyntheseapparatur inertes Gas zuzuführen, um eine Mischbewegung der in der synthetischen Peptidherstellung verwendeten Reaktionslösungen zu bewirken und außerdem die synthetisierten, verlängerten Peptide in dem Reaktionsgefäß vor der Spaltung zu trocknen.

6. Einblaseinheit, verwendbar in Verbindung mit einer Mehrkanal-Festphasenpeptidsyntheseapparatur, zum Zuführen von inertem Gas unter regulierbarem Druck in eine Reaktionsgefäßreaktionskammer der Festphasenpeptidsyntheseapparatur, um die Reaktionskammer von der darin enthaltenen Peptidyllösung zu entleeren und sie über einen Filter, welcher die Reaktionskammer verschließt, durch eine Drainageöffnung des Reaktionsgefäßes zu drücken, wobei die Peptidyllösung aus der Zugabe einer Spaltlösung zu dem synthetisierten Peptidprodukt in der Reaktionsgefäßreaktionskammer zur Spaltung von Bindungen, welche die Peptide in einer unlöslichen Partikelträgermatrix in einer Festphase der synthetischen Peptidherstellung verankern, wodurch das Peptidprodukt löslich in der Spaltlösung zurückbleibt, resultiert, wobei außerdem die Peptidyllösung durch einen Verschluß, der die Drainageöffnung verschließt, in dem Reaktionsgefäß zurückgehalten wird, und wobei die Einblaseinheit folgende Bestandteile umfaßt:

eine Druckpistole mit einem Griff, enthaltend einen Gasdurchfluß, eine mit dem Gasdurchfluß durch ein Ventil verbundene Düse und einen Abzug zum Öffnen und Schließen des Düsenventils;

einen Hauptkörper, enthaltend einen durch einen Regler regulierbaren Druckregler und mit einer Gaseinlaßöffnung, die mit einer Bombe verbunden werden kann, welche unter Druck gesetztes Gas zuführt, und mit einem Gasauslaß, der mit der Druckpistole an einem Eingang des Gasdurchflusses verbunden werden kann; und

ein plastikdüsenanschlußstück, welches entfernbar mit einer Spitze der Druckpistolendüse verbunden ist und einen luftdichten Verschluß bildet, wenn es mit Druck in eine Zufuhröffnung des Reaktionsgefäßes eingesetzt wird, wobei bei Herausziehen des Verschlusses aus der Drainageöffnung die Aktivierung des Abzuges zur Öffnung des Düsenventils die Reaktionskammer unter Druck setzt, die Kammer von der Peptidyllösung entleert und sie über einen Filter, welcher für die Trägermatrix undurchlässig ist, durch die Drainageöffnung und in eine Zentrifugenröhre, in welche das Reaktionsgefäß eingesetzt worden ist, und in welcher das Peptidprodukt dann ausgefällt wird, einleitet.

7. Einblaseinheit gemäß Anspruch 6, welche außerdem eine Nadelröhre umfaßt, deren eines Ende verschließbar an die Druckpistolendüse angeschlossen werden kann, wobei es mit dem Plastikdüsenanschlußstück austauschbar ist, und deren gegenüberliegendes Ende zur Fokussierung eines Strahls des unter Druck gesetzten, inerten Gases, welches aus der Nadelröhre ausströmt, ausgebildet ist; und wobei außerdem der Strahl des unter Druck gesetzten, inerten Gases der lokalisierten Trocknung des ausgefällten Peptidproduktes dient.

8. Einblaseinheit gemäß Anspruch 6, wobei die Bombe, welche der Einblaseinheit inertes Gas zuführt, ebenso dazu dient, der Festphasenpeptidsyntheseapparatur inertes Gas zuzuführen, um eine Mischungsbewegung der in der synthetischen Peptidherstellung verwendeten Reaktionslösungen zu bewirken und außerdem die synthetisierten, verlängerten Peptide in dem Reaktionsgefäß vor der Spaltung zu trocknen.

9. Verfahren zur Isolierung eines synthetischen Peptids aus einem Festphasenpeptid, welches in einem Reaktionsgefäß synthetisiert worden ist, das an seinem einen Ende eine mit einem Flansch versehene Öffnung und an seinem anderen Ende eine durch einen Verschluß verschließbare Drainageöffnung besitzt, welches folgende Stufen umfaßt:

Bereitstellung einer Zentrifugenröhre mit einer eingefaßten Öffnung zur Aufnahme des Reaktionsgefäßes;

Behandlung des Festphasenpeptids mit einem Spaltcocktail zur Abspaltung verlängerter Peptide von einer unlöslichen Partikelträgermatrix, welche in dem durch den Verschluß verschlossenen Reaktionsgefäß enthalten ist,

Entfernen des Verschlusses aus dem Reaktionsgefäß zur Öffnung der Drainageöffnung;

Einsetzen des Reaktionsgefäßes in die Zentrifugenröhre, so daß die Einfassung der Zentrifugenröhre das Reaktionsgefäß durch den Flansch trägt;

Zuführen von inertem Gas unter reguliertem Druck in das Reaktionsgefäß zur Einleitung des eine Peptidyllösung enthaltenden Spaltcocktails durch die Drainageöffnung in die Zentrifugenröhre;

Trennen der Zentrifugenröhre von dem Reaktionsgefäß zur Überführung der Zentrifugenröhre in ein anschließendes Verfahren zur Isolierung eines Peptidprodukts aus dem die Peptidyllösung enthaltenden Spaltcocktail.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, in dem eine Spaltlösung die verlängerten, synthetischen Peptide durch ihre Abspaltung von der unlöslichen Trgermatrix in einer Flüssigphasenpeptidyllösung löst, welche in eine Zentrifugenröhre überführt wird, die zusammen mit mehreren anderen von einem Standgestell getragen werden kann, zur Ausfällung vor der Trennung in einer Zentrifuge, wobei

der Flüssigphasentransfer durch eine Inertgaseinblaseinheit mit einer Druckpistole mit einem Griff, enthaltend einen Gasdurchfluß, eine mit dem Gasdurchfluß durch ein Ventil verbundene Düse, einen Abzug zum Öffnen und Schließen des Düsenventils und ein an die Düse angeschlossenes Plastikdüsenanschlußstück, beschleunigt wird, wobei

die Druckpistole mit einem Hauptkörper verbunden ist, enthaltend einen durch einen Regler regulierbaren Druckregler und mit einer Gaseinlaßöffnung, die mit einer Bombe verbunden werden kann, welche unter Druck gesetztes, inertes Gas zuführt, und mit einer Gasauslaßöffnung, die mit dem Gasdurchfluß der Druckpistole verbunden werden kann, und wobei das Verfahren außerdem folgende Stufen umfaßt:

Verschließen der Drainageöffnung durch den Verschluß;

Einsetzen des Reaktionsgefäßes in die Zentrifugenröhre durch deren Öffnung, wobei die Zentrifugenröhre durch das Gestell getragen werden kann und seinerseits das Reaktionsgefäß trägt, das durch den Flansch der Zufuhröffnung gegen eine Einfassung der Zentrifugenröhrenöffnung gehalten wird;

Zugabe der Spaltlösung in die Reaktionskammer, wobei genügend Zeit zum Spalten und Lösen der synthetischen Peptide zur Verfügung gestellt wird;

Entfernen des Reaktionsgefäßes aus der Zentrifugenröhre und Herausziehen des Verschlusses aus der Drainageöffnung;

anschließendes wiedereinbringen des Reaktionsgefäßes in die Zentrifugenröhre und Einsetzen der Druckpistolendüse mit Druck in die Reaktionsgefäßzufuhröffnung, wobei ein luftdichter Verschluß gebildet wird;

Aktivierung des Abzuges zum Öffnen des Düsenventils, wobei die Druckkammer unter Druck gesetzt und von der Peptidyllösung entleert wird, und die Lösung über einen Filter durch die Drainageöffnung in die Zentrifugenröhre eingeleitet wird, wobei die Peptidyllösung ein Filtrat ist;

Ausfällen des Peptidylfiltrats mit einem Lösungsmittel;

Zentrifugieren zur Trennung und Sammlung des ausgefällten Peptids; und

Dekantieren des Überstandes von dem zentrifugierten Präzipitatpeptid zum Erhalt eines Peptidprodukts in roher Form.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Einblaseinheit außerdem eine Nadelröhre umfaßt, deren eines Ende verschließbar an die Druckpistolendüse angeschlossen werden kann, wobei sie mit dem Plastikdüsenanschlußstück austauschbar ist, und deren gegenüberliegendes Ende zur Fokussierung eines Strahls des unter Druck gesetzten, inerten Gases, welches aus der Nadelröhre ausströmt, ausgebildet ist, und welches außerdem folgende Stufen umfaßt:

Wiedereinsetzen des Plastikdüsenanschlußstückes in die Druckpistolendüse mit der Nadelröhre;

Aktivieren des Abzuges zum Öffnen des Düsenventils; und

lokales Einführen des Strahles unter Druck gesetzten, inerten Gases in die Zentrifugenröhre zum direkten Trocknen des Peptidprodukts.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, welches außerdem folgende Stufen umfaßt:

Lösen des getrockneten Peptidprodukts in einer acidischen Lösung;

Gefriertrocknen des Peptidprodukts.