DE69306430T2 - Vermischungsstabilisator für Peptidsynthetisierungsvorrichtung in fester Phase - Google Patents

Description

• Die vorliegende Verbindung betrifft Festphasenpeptidsynthese; genauer betrifft sie das Bewegen von Reaktionslösungsahargen, die in Aminosäurekupplungsstufen mit einer unlöslichen Trägermatrix, in der wachsende Peptidketten verankert sind, gemischt werden, in einer Festphasensynthesevorrichtung.
• Die Anwendungen der Festphasenpeptidsynthese in den Biowissenschaften sind vielfältig und umfassen die schnelle Bewertung von Peptidsynthesechemie und Reaktionsbedingungen, das Studium von Epitopen, Agonisten, Antagonisten oder wirksameren Strukturen, das Studium von Struktur-Aktivitäts- Beziehungen, das Screening und/oder das Suchen nach Peptiden zur Sequenzbestimmung sowie die synthetische Herstellung von Neuropeptiden, Hormonen und Antigenen.
• In jeder Synthesestufe ist das Produkt an den unlöslichen Träger gebunden, so daß es schnell gefiltert und gewaschen werden kann. Die in Bildung begriffene Peptidkette verbleibt in einem einzigen Gefäß, in dem der Peptidkettenzusammenbau durchgeführt wird, in dem Träger verankert und wird anschließend für die Reinigung gespalten. Dies schließt Verluste aus, die andererseits aufgrund der Notwendigkeit des Überführens der Produkte von einer Stufe zur nächsten auftreten würden.
• Wünschenswert ist eine hocheffiziente Synthese, bei der in hohem Maße homogene Zielmaterialien durch schnellen Zusammenbau hergestellt werden, die Reaktionszeit für die Kupplung der Aminosäuren an die wachsende Peptidkette beschleunigt wird, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten zu unterdrücken, und eine Ausbeute nahe der quantitativen Massenwiedergewinnung erreicht wird.
• In einem chargenweisen Peptidsyntheseverfahren verkürzt das fortwährende Mischen der Synthesereagenzien zum gleichmäßigen Dispergieren des Trägermaterials in den Lösungschargen die Acylierungszeit und erhöht die Effizienz durch das Fördern einer schnellen Synthese, was für die unterdrückung von Nebenprodukten vorteilhaft ist. Alternativ zur "Continuous-Flow-Synthese" wird die Kupplungsreaktion bei der chargenweisen Synthese nicht durch Mittel für die Rezirkulation von Reagenzien durch die Reaktionsgefäße der Peptidsynthesevorrichtung, sondern durch Mischbewegung von Synthesereagenzien und Waschlösungsmitteln, die in den Gefäßen verbleiben, bis sie abgelassen oder ausgeschüttet werden, bewirkt.
• Chargenweise Peptidsynthese, die das "Vortex"-Mischen als Mittel zur Förderung der Peptidkupplung beinhaltet, ist für das Mischen während der Deprotektions-, Kupplungs- und/oder Waschstufen des Syntheseverfahrens hoch wirksam. Jedoch ist die Massenwiedergewinnung gering, da das Peptidylharz, d. h., das mit verlängerten, geschützten Peptidketten verbundene Trägermaterial, durch das wiederholte "Vortex"-Mischen zerstört wird und ein Teil des Peptidylharzes dadurch den Filter des Reaktionsgefäßes passieren kann. Außerdem kann Ultraschall- oder mechanisches Mischen verwendet werden; diese Verfahren begünstigen jedoch ebenfalls das Zerbrechen oder Zerstören des Peptidylharzträgermaterials.
• Peptidsynthese, bei der das Mischen alternativ durch das Blasen von inertem Gas durch das Reaktionsgefäß bewirkt wird (es wird N&sub2;-Gas verwendet), ist bei der Herstellung von großen Peptiden erfolgreich.
• Eine Vorrichtung für die DNA-Synthese ist aus JP-A-63 297 396 bekannt.
• Der Zyklus von chargenweisen Synthesereaktionen wird bei Verwendung einer kürzlich entwickelten Simultanmehrfachpeptidsynthesevorrichtung automatisiert. Die Peptide können gleichzeitig in Kanälen der Synthesevorrichtung hergestellt werden.
• Das Reaktionsgefäß der automatisierten Festphasenpeptidsynthesevorrichtung besitzt eine Zufuhröffnung, durch die Chargen von Reaktionslösungen in eine Reaktionskammer, die durch das Reaktionsgefäß definiert wird, zugeführt werden. Die Kammer enthzlt eine geeignete Trägermatrix, typischerweise ein Partikelharz, in dem die in Bildung begriffenen Peptidketten während des Zusammenbaus in der Peptidsynthese verankert sind. Sowohl zwischen als auch im Anschluß auf die nacheinanderfolgenden Nα-Deprotektions- und Kupplungsstufen des Peptidsynthesezusammenbauverfahrens wird ein Waschverfahren durchgeführt, durch das überschüssige Reagenzien und unerwünschte Produkte über Waschlösungsmittel durch eine Abflußöffnung des Gefäßes abgeführt werden. Ein Filter bedeckt die Abflußöffnung und hält den Träger. Gleichzeitig dient die Abflußöffnung als Einlaß, durch den inertes Gas in die Reaktionskammer eingedrückt wird, um Blasenbewegung zu bewirken.
• Während der Deprotektions- und Kupplungsstufen werden die Vorgänge durch das inerte Gas, das kräftig durch die Reaktionskammer des Reaktionsgefäßes geblasen wird, gefördert (je stärker die Bewegung, desto effizienter reagieren die Reagenzien mit den wachsenden Peptidketten). Während des darauffolgenden Waschverfahrens verbessert die Blasenbewegung ebenso die Wascheffizienz. Das Trägermaterial, die Reagenzien und die Waschlösung neigen jedoch dazu, aus der Reaktionskammer aus zuspritzen.
• Während des Peptidkettenzusammenbaus können Ausflokkungen entstehen, die zu Verklumpungen und koagulativer Hautbildung des geschützten Peptidylharzes führen; diese Ausflockungen sind vermutlich auf Interaktionen zwischen den Peptidketten - von aromatischen Ringen der Seitenkette mit ihren Schutzgruppen -, auf sterische Behinderung der von den Schutzgruppen befreiten terminalen Enden der Kupplungsaminosäuren und/oder auf Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen. Diese Neigung wird besonders deutlich, wenn Peptidketten von 10 bis 15 Aminosäuren oder mehr synthetisiert werden, trotz des Einblasens des inerten Gases als Mischungsmittel. Außerdem wirbelt die Blasenbewegung, wenn sie zunehmend kräftig wird, die Ausflockungen innerhalb der Reaktionskammer auf, so daß verklumptes oder hautbildendes Peptidylharz schließlich aus dem Gefäß befördert wird. Dieses Phänomen verschlechtert die Konsistenz der Kupplungsreaktion und erniedrigt die Peptidausbeuten.
• Einfache Reduzierung der Intensität des Einblasens des inerten Gases schränkt das Ausspritzen der Reaktionslösungen und Ausflocken der an das Harz gebundenen geschützten Peptide ein. Bewegungen, die nicht kräftig genug sind, können eher die Kupplungsverfahren beeinträchtigen als ihre Effizienz fördern; da jedoch mit dem Einblasen auf niedrigem Niveau, welches eine entsprechend längere Reaktionszeit erfordert, die Reaktionen nicht vollständig ablaufen, werden unvollständige Peptide hergestellt, und es finden Nebenreaktionen statt, die das Risiko einer unerwünschten Bildung von Nebenprodukten oder Deletionspeptiden erhöhen und die Produkthomogenität und gewünschte Reaktionseffizienz zunichte machen.
• Eine andere Alternative wäre das Verschließen des Reaktionsgefäßes; ein derartiger Verschluß müßte jedoch durchlöchert sein, um das Austreten des blasenbildenden Gases zu erlauben, wobei die Löcher wiederum das Austreten von Reaktionslösungen und in Harzpartikeln verankerten Peptiden, wie es durch die Blasen bewirkt wird, aus dem Gefäß erlauben würden. Außerdem wäre ein derartiger Verschluß bei der Verhinderung oder dem Aufbrechen der o. g. Ausflockungseffekte nicht wirksam, noch brächte er ein effizienteres Mischen der Reaktionslösungen, die den Träger umspülen, mit sich.
• Die Reagenzien und Waschlösungsmittel jeder Charge von Reaktionslösungen werden während eines Peptidsyntheseverfahrens durch die Zufuhrspitze einer Röhre zugeführt, die in die Reaktionsgefäßzufuhröffnung eingesetzt wird und mit der Reaktionskammer in gleicher Höhe liegt, um das Zürückbleiben der Synthesereagenzien aufgrund von Kapillarwirkung an der Zufuhrspitze im Anschluß an die Zufuhr zu verhindern. Es ist jedoch wünschenswert, daß das Waschlösungsmittel bei seiner Zufuhr gleichmäßig entlang der zylindrischen Oberfläche der Reaktionskammer verteilt wird, um sie vollständig von der Reaktionslösung zu reinigen.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die Effizienz der Peptidsynthese in einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung unter Herstellung von Resten hoher Homogenität mit einer Ausbeute, die sich der Massenwiedergewinnung nähert, zu verbessern.
• Eine andere Aufgabe ist, das Austreten von Reaktions lösungen und von mit geschützten, verlängerten Peptiden verbundenem Harz aufgrund der Wirkung von blasenbildendem, inerten Gas, welches darin verwendet wird, um Aminosäurekupplung und Deprotektion von Nα-Gruppen vor der Kupplung zu fördern, aus dem Gefäß zu verhindern.
• Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verklumpungen und koagulative Hautbildung des peptidgebundenen Harzes aufgrund von Ausflockungseffekten, die durch die Tätigkeit des blasenbildenden, inerten Gases begünstigt und während der Peptidsynthese gegen die Öffnung des Reaktionsgefäßes befördert werden, aufzubrechen.
• Eine weitere Aufgabe ist, die Genauigkeit bei der Zufuhr von Peptidsynthesereagenzien zu gewährleisten und die Gründlichkeit bei der Zufuhr von Waschlösungsmitteln in das Reaktionsgefäß einer automatisierten Peptidsynthesevorrichtung zu verbessern.
• Die erfindungegemäßen Aufgaben werden durch die Festphasenpeptidsynthesevorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 5, den Stabilisator gemäß Ansprüchen 6 bis 11, der in dem Reaktionsgefäß einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung verwendet werden kann, und das Kupplungspeptidsyntheseverfahren gemäß Ansprüchen 12 und 13 gelöst.
• Die erfindungsgemäße Festphasenpeptidsynthesevorrichtung fördert die Peptidsynthese durch Blasen eines inerten Gases durch einen unlöslichen Träger, in dem geschützte Peptidketten in Kupplungsbildung verankert sind und der von Reagenzien umspült wird. Die Lösungen für die Kupplungsreaktion sind in Reaktionskammern enthalten, die jeweils durch ein Reaktionsgefäß, welches einen Kanal der Vorrichtung umfaßt, definiert werden. Zwischen den Kupplungsstufen werden die Nα-Schutzgruppen vorübergehend entfernt; vor und nach diesem Verfahren werden die Peptidketten und die Reaktionskammer durch Waschlösungsmittel, die ebenfalls durch das inerte Gas aufgewallt werden, gereinigt. Die Lösungen werden durch eine Abflußöffnung des Reaktionsgefäßes, welche als Einlaß für die unter Druck durchgeführte Einleitung des inerten Gases in die Reaktionskammer dient, ausgelassen. Der unlösliche Träger umfaßt typischerweise Partikelharz und wird innerhalb der Reaktionskammer auf einem Filter, der die Abflußöffnung bedeckt, gehalten.
• Ein entfernbarer Stabilisator ist in der Reaktionskammer angeordnet und verhindert das Ausspritzen der Reaktionslösungen aufgrund der Blasenbewegung, die durch das inerte Gas, welches durch die Reaktionskammer geleitet wird, bewirkt wird. Der Stabilisator dient außerdem dazu, Verklumpungen und koagulative Hautbildung des peptidgebundenen Harzes aufgrund von Ausflockungseffekten, die durch die Blasenbewegung des inerten Gases begunstigt werden, aufzubrechen, wobei das Einblasen das Aufsteigen von Klumpen und Haut innerhalb der Reaktionskammer in Richtung einer Reaktionslösungszufuhröffnung des Reaktionsgefäßes unter Wirkung des eingeblasenen Gases verursacht.
• Der Stabilisator wirkt außerdem als eine Ablenkung, um die Wirksamkeit der Mischbewegung zu unterstützen und das dispersive Mischen des Peptidylharzes mit den Reagenzien und Waschlösungsmitteln während des Peptidkettenzusammenbaus zu fördern. Außerdem ist der obere Bereich des Stabilisators ein Anulus, welcher der zylindrischen Oberfläche der Reaktionskammer entspricht. Der Stabilisator bewirkt so die kreisförmige Verteilung der Reagenzien und, im besonderen, der Waschlösungsmittel entlang der Reaktionskammerwand.
• Die genannten und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich.
• Figur 1 ist ein schematisches Diagramm, welches eine Reaktionsvorrichtung und damit verbundene Elemente, die einen erfindungsgemäßen Reaktionszusammenbau zur Peptidsynthese in einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung bilden, zeigt;
• Figur 2 ist eine perspektivische Ansicht des Reaktionsgefäßes und zeigt außerdem in getrennter Darstellung den erfindungsgemäßen Bewegungsstabilisator;
• Figur 3 ist eine perspektivische Ansicht einer Röhre aus Ausgangsmaterial und zeigt ein Verfahren zum Erhalt eines Bewegungsstabilisators;
• Figur 4 ist eine Ansicht des Reaktionsgefäßes im Querschnitt;
• Figur 5 ist eine perspektivische Ansicht einer Modifikation des in Figur 2 gezeigten Bewegungsstabilisators;
• und
• Figur 6 ist eine Ansicht des Reaktiongefäßes im Querschnitt, welches im Inneren eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bewegungsstabilisators zeigt.
• Die Hauptbestandteile der Reaktionsanordnung 1 einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung sind, wie in Figur 1 gezeigt, eine Reaktionsvorrichtung 2 und eine Reaktionslösungszufuhrvorrichtung 3. Die Reaktionsvorrichtung 2 besteht im wesentlichen aus einem Reaktionsgefäß 4, das erfindungsgemäß ausgestattet ist, und einer Sammelvorrichtung 5.
• Figur 2 veranschaulicht die Bestandteile des Reaktionsgefäßes 4: ein ungefähr zylindrischer Gefäßkörper 6, dessen eines Ende eine Zufuhröffnung 8, die durch einen Flansch 9 eingefaßt ist, aufweist und von dessen anderem Ende eine Abflußöffnung 10 ausgeht. Ein Stabilisator 7 ist in getrennter Darstellung gezeigt. Der Gefäßkörper 6 ist aus einer Substanz gefertigt, die mit dem unlöslichen Träger, der im folgenden beschrieben wird, nicht chemisch reaktiv ist, und die kaum statische Elektrizität erzeugt. Ein Beispiel für ein geeignetes Material, welches kostengünstig ist und das synthetisierte Peptid nur minimal adsorbiert, ist Polypropylen.
• Ein Filter 11 befindet sich am Ende des Gefäßkörpers 6 über der Abflußöffnung 10. Der Filter 11 trennt eine Reaktionskammer 12, die durch den Gefäßkörper 6 definiert wird, von der Abflußöffnung 10. Der Filter 11 ist aus einem geeigneten porösen Material, z. B. einem Polyalkylenpolymer, wie Polypropylen, Polyethylen usw., gefertigt, wobei hier Polypropylen am bevorzugtesten ist.
• Der Stabilisator 7 besteht aus einem Anulus 7a, einem Trägerschenkel 13 und einem Ablenkschenkel 14, die sich in der Darstellung von dem Anulus 7a nach unten erstrecken. Der äußere Durchmesser des Anulus 7a ist etwas kleiner als der innere Durchmesser der Reaktionskammer 12. Der Trägerschenkel 13 und der Ablenkschenkel 14 sind mit dem Anulus 7a integral verbunden und diametral entgegengesetzt. Die Länge des Ablenkschenkels 14 beträgt etwa die Hälfte der Länge des Trägerschenkels 13 und ist gegen den letzteren und, bezogen auf den Anulus, radial nach innen geneigt. Der Stabilisator 7 ist in die Reaktionskammer 12 eingebracht, welche den Träger, bei dem es sich um ein Partikelharz, anfänglich in pulverisierter Form, das auf dem Filter 11 gehalten wird, handelt, enthält. Der Schenkel 13 dringt in den Harzträger, der auf dem Filter 11 ruht, ein, wobei der Stabilisator 7 innerhalb der Reaktionskammer derart steht, daß der gebogene Ablenkschenkel 14 über dem Harzträger hängt.
• Der Stabilisator 7 ist wiederverwendbar und aus einem Polymermaterial, wie Polypropylen oder Fluorkohlenstoffpolymer ("Teflon"), gefertigt. Bevorzugt ist "Teflon". Der Stabilisator 7 wird aus einer Ausgangsröhre 15, wie in Figur 3 gezeigt, hergestellt. Die Röhre 15 wird entlang der gepunkteten Linien, wie gezeigt, geschnitten, um ein Schenkelpaar zu bilden; dann wird einer der Schenkel in halber Höhe längs geschnitten und gegen den anderen Schenkel gebogen.
• Die in Figur 1 gezeigte Sammelvorrichtung 5 ist abnehmbar mit der Abflußöffnung 10 des Reaktionsgefäßes 4 verbunden und besitzt eine Abflußleitung 16, eine Sammelleitung 17 und eine Gaszufuhrleitung 18. An der Verbindung der Leitungen 16, 17 und 18 befindet sich ein Richtungskontrollventil 19, welches die Fließrichtung aus dem Gefäß durch die Verbindung der Leitungen 16 - 18 mit der AbflußÖffnung 10 ändert. Das andere Ende der Gaszufuhrleitung 18 ist mit einer (nicht gezeigten) inerten Gaszufuhr verbunden.
• Von der Reaktionslösungszufuhrvorrichtung 3 geht eine Reaktionslösungszufuhrleitung 20 aus, welche Reagenzien und Waschlösung durch eine Röhre zuführt, dessen Zufuhrspitze leicht in das Reaktionsgefäß 4 durch die Zufuhröffnung 8 eingesetzt ist, wobei sie an die Reaktionskammer 12 angrenzt, um das Zurückbleiben der Reaktionslösungen nach der Zufuhr aufgrund von Kapillarwirkung an der Zufuhrspitze zu verhindern. Auf halbem Weg entlang der Reaktionslösungszufuhrleitung 20 sind eine Mehrzahl von Reagenstanks 21, welche Chargen von Reagenzien, die in den Kupplungsstufen der Peptidsynthese verwendet werden, enthalten, und eine Mehrzahl von Waschlösungstanks 22, welche die Waschlösungen, die sowohl zum Auswaschen des Reaktionsgefäßes 4 als auch zum Waschen des durch jede Charge in dem Kupplungsverfahren hergestellten und auf dem Filter 11 gehaltenen Peptidprodukts verwendet werden, enthalten, angeschlossen; die verlängerten, geschützten Peptide bleiben dabei an die Harzpartikel gebunden, bis das Endprodukt für die Reinigung gespalten wird. Das andere Ende der Reaktionslösungszufuhrleitung 20 ist mit der inerten Gaszufuhr verbunden.
• Im folgenden wird ein chargenweises Kupplungspeptidsyntheseverfahren in Bezug auf die erfindungsgemäße Ausführungsform beschrieben.
• Zunächst wird eine Menge pulverisierten Partikelharzes 23 in die Reaktionskammer 12 des Reaktionsgefäßes 4, welche Kanälen der Peptidsynthesevorrichtung entspricht, gegeben, wobei der Harzträger 23 auf dem Filter 11 über der Abflußöffnung 10 des Reaktionsgefäßes 4 ruht, wie in den Figuren 2 und 4 dargestellt. Dann wird der Stabilisator 7 so in die Reaktionskammer 12 eingesetzt, daß der Trägerschenkel 13 in den Harzträger 23 eindringt, um auf dem Filter 11 zu ruhen, und der Anulus 7a des Stabilisators 7 konzentrisch innerhalb der Reaktionskammer 12 steht, wobei der Ablenkschenkel 14 den Harzträger, in dem die in Kupplung begriffenen Peptidketten während der Peptidsynthese verankert sind, nicht stört.
• Dann wird eine Lösung von Kupplungsreagenzien oder eine Mischung aus voraktivierten Acylkomponenten (im allgemeinen geschützte Aminosäure) und Dimethylformamid (DMF)- Lösungsmittel, über die Zufuhrleitung 20 von den Reagenstanks 21, gemäß Protokoll der Peptidsynthesevorrichtung, der Reaktionskammer 12 zugeführt. In den aufeinanderfolgenden Deprotektions- und Kupplungsstufen wird inertes Gas, z. B. N&sub2;-Gas, durch die Gaszufuhrleitung 18 und die Abflußöffnung 10 in die Reaktionskammer 12 eingedrückt, was durch das Ventil 19 der Sammelvorrichtung 5 protokollgemäß reguliert wird. Das zugeführte inerte Gas spritzt aus dem Filter 11 aus und wallt die in der Reaktionskammer 12 enthaltene Reagenslösung sowie den Harzträger 23, in dem die in Bildung begriffenen Peptide verankert sind, auf.
• Nach einiger Zeit, die ausreicht, um Peptidkupplung stattfinden zu lassen, wobei das Kupplungsverfahren in dem Lösungsbad durch die Gasblasenbewegung gefördert wird, wird durch inertes Gas, das entgegengesetzt der Blasenbewegungsrichtung durch die Zufuhrleitung 20 in die Reaktionskammer 12 eingeleitet wird, das Reagens aus der Reaktionskammer 12 durch den Filter 11, die Abflußöffnung 10 und die Abflußleitung 16 abgelassen, wobei die gekuppelten Peptide, die die in Bildung begriffenen Peptidketten darstellen, in dem Harzträger 23, der in der Reaktionskammer 12 durch den Filter 11 gehalten wird, verankert bleiben.
• Während der Waschverfahren wird Waschlösungsmittel der Reaktionskammer 12 durch die Zufuhröffnung 8 über die zufuhrleitung 20 von den Waschlösungsmitteltanks 22, ebenfalls gemäß Protokoll, zugeführt. N&sub2;-Gas wird wiederum in die Reaktionskammer 12 durch die Abflußöffnung 10 als ein Zirkulationsmittel, das das Waschen der harzgebundenen verlängerten Peptide in Kupplungsbildung fördert, eingedrückt. Ebenso wird das Waschlösungsmittel aus der Reaktionskammer 12 durch die Abflußöffnung 10 ausgeleitet, wenn sie über das Richtungskontrollventil 19 mit der Abflußleitung 16 verbunden wird. Die sich in Kupplungszusammenbau verlängernden Peptidketten verbleiben gebunden an den Harzträger 23, gehalten auf dem Filter 11.
• Im Gegensatz dazu würden andere, gewöhnliche Verfahren die Verwendung einer Hohlnadel mit einem Filter an der Spitze beinhalten, um die überschüssige Waschlösung oder Überstände, die nach der Ausfällung des Peptidprodukts nach Spaltung für die Reinigung zurückbleiben, aufzusaugen.
• Während der Kupplungsverfahren in der Peptidsynthese können Flocken, die eine koagulative Haut 24 bilden, wie in Figur 4 gezeigt, sowie verklebte oder aggregierte Klumpen aus Harzträger 23, in dem die wachsenden Peptidketten verankert sind (d. h., verlängertes Peptidylharz), wenn sie entweder von Reagens- oder Waschlösungen umspült werden, in der Reaktionskammer 12 auftreten, was durch die Blasenbildung des inerten Gases begünstigt wird. Die koagulative Haut 24 oder aggregierte Klumpen werden in Richtung Zufuhröffnung 8 befördert, wenn der Druck in der Kammer aufgrund des zugeführten Gases steigt, aber aufgebrochen, wenn sie in Kontakt mit dem Ende des Ablenkschenkels 14 des Stabilisators 7 treten. Außerdem wird Ausspritzen des Reagens oder der Waschlösung, welche den Harzträger 23, in dem die Peptidketten verankert sind, enthalten, soweit, wie das Aufwallen der Haut 24 oder Klumpen die Materialien aus der Zufuhröffnung 8 treibt, durch die Form des Stabilisators 7 verhindert.
• Entsprechend werden, wie vorangehend beschrieben, der Harzträger 23 und die Reaktionslösungschargen, die mit der Peptidkupplung in den Synthesestufen in Verbindung stehen, am Ausspritzen aus dem Gefäß gehindert und sicher innerhalb der Reaktionskammer 12 zurückgehalten, so daß genaue Verhältnisse der Reagenzien für maximale Ausbeuten aufrechterhalten werden. Die Anwesenheit des Stabilisators erlaubt außerdem die Zufuhr des blasenbildenden inerten Gases mit erhöhtem Druck, so daß eine maximale Effizienz der Mischbewegung bewirkt wird, die nicht durch Ausflockungsnebeneffekte behindert wird. Im Vergleich mit konventionellen Verfahren werden so höhere Ausbeuten näher der quantitativen Massenwiedergewinnung (beispielsweise 99%ige Ausbeuten) von hochhomogenem Peptidprodukt erreicht.
• Der erfindungsgemäße Bewegungsstabilisator für die Peptidsynthese kann, wie in Figur 5 gezeigt, modifiziert werden. Der Stabilisator wird von einer Ausgangsröhre erhalten, die zur Bildung eines überlappenden Bruches entlang der Röhrenwand geschnitten wird. Die Ablenk- und Trägerschenkel sind wie bei dem vorherigen Stabilisator geformt; aber der entstehende Anulus 7a' des modifizierten Stabilisators ist mit einem überlappenden Bruch gebildet, der als Ablenkung wirkt, um das dispersive Mischen des Harzträgers mit den Kupplungsreaktionslösungen weiter zu fördern und die Peptidylharzflocken aufzubrechen.
• Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in Figur 6 dargestellt. Die Ausführungsform umfaßt einen 0-Ring 25, der entfembar in dem Reaktionsgefäß 4 derart untergebracht ist, daß er in planarer Richtung des Ringes vertikal in der Reaktionskammer 12 liegt, mit ausreichendem Abstand von der Zufuhröffnung 8, so daß Spritzer und Flocken, wie vorangehend beschrieben, durch den 0-Ring selbst nicht aus dem Gefäß geführt werden. Die erzielten Vorteile sind die gleichen, wie die, die durch die oben beschriebene Ausführungsform erreicht werden.

Claims (13)

1. Festphasenpeptidsynthesevorrichtung, wobei die Peptidsynthese mittels Blasenbewegung von Reagenzien und Waschlösungen, die eine unlösliche Trägermatrix (23), in der durch Kupplungszusammenbau von Peptidbindungen erhaltene verlängerte Peptidketten verankert sind, umspülen, beschleunigt wird, aufweisend:

ein Reaktionsgefäß (6) mit einer Abflußöffnung (10), durch welche ein inertes Gas in eine im wesentlichen zylindrische Reaktionskammer (12), die durch das Reaktionsgefäß (6) definiert wird, gedrückt wird, um die Blasenbewegung zu bewirken, wobei das Reaktionsgefäß (6) außerdem eine Zufuhröffnung (8) besitzt, durch welche die Reagenzien und Waschlösung der Reaktionskammer (12) zugeführt werden, wobei die Reaktionskammer (12) außerdem die unlösliche Trägermatrix (23) enthält, die auf einem Filter (11) gehalten wird, der derart befestigt ist, daß er die Öffnung (10) abdeckt; und

einen entfernbaren Stabilisator (7), welcher in der Reaktionskammer (12) eingebracht ist, um das Ausspritzen der Reagenzien und waschlösungen aufgrund der Blasenbewegung zu verhindern und außerdem Verklumpungen und koagulative Hautbildung der peptidgebundenen Trägermatrix aufgrund von Ausflockungseffekten, die durch die Blasenbewegung während des Kupplungszusammenbaus von Peptidketten begünstigt wird, aufzubrechen, wobei das Einblasen das Aufsteigen von Klumpen und Haut innerhalb der Reaktionskammer (12) verursacht;

wobei der Stabilisator (7) teilweise als ein Anulus (7a) geformt ist, der einen Durchmesser besitzt, der der Reaktionskammer (12) entspricht, um seine konzentrische Anordnung in dieser zu ermöglichen,

wobei der Anulus (7a) des Stabilisators (7) durch einen Schenkel (13) gehalten wird, der sich von ersterem aus erstreckt, und

wobei der Anulus außerdem einen Ablenkschenkel (14) besitzt, der sich ebenso wie der Trägerschenkel (13) erstreckt, aber kürzer als dieser ist und sich, bezogen auf den Anulus (7a), radial nach innen neigt, um Verklumpungen und koagulative Hautbildungen der peptidgebundenen Trägermatrix (23) aufgrund der Ausflockungseffekte aufzubrechen, wobei der Ablenkschenkel (14) außerdem das dispergierende Mischen der unlöslichen Trägermatrix (23), in der die sich bildenden Peptidketten verankert sind, mit den Reagenzien und Waschlösungen während des Peptidkettenkupplungszusammenbaus fördert.

2. Festphasenpeptidsynthesevorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Stabilisator (7) derart geformt und in der Reaktionskammer (12) angeordnet ist, daß er nicht die Zufuhr der Reagenzien und waschlösung in die Reaktionskammer (12) stört.

3. Festphasenpeptidsynthesevorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei der Stabilisatorträgerschenkel (13) bei Anordnung in der Reaktionskammer (12) in die unlösliche Trägermatrix (23) eindringt und an den Filter (11) innerhalb der Reaktionskammer (12) angrenzt.

4. Festphasenpeptidsynthesevorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei die Zufuhr der Reagenzien und Waschlösung durch ein Rohr geschieht, dessen Zufuhrspitze mit der Reaktionskammer (12) in der Nähe der Zufuhröffnung (8) des Reaktionsgefäßes (6) zusammenhängt, um das Rückhalten der Reagenzien oder waschläsung nach Zuführung durch Kapillarwirkung an der Zufuhrspitze zu verhindern, wobei außerdem

der Anulus (7a) des Stabilisators (7) kreisförmige Verteilung der Reagenzien und Waschlösung entlang der Reaktionskammer bewirkt, so daß im besonderen ein gründliches Reinigen der Reaktionskammer (12) durch die Waschlösung gefördert wird.

5. Festphasenpeptidsynthesevorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Peptidkettenzusammenbau in einem chargenweisen Kupplungsverfahren durchgeführt wird.

6. Stabilisator, verwendbar in einem Reaktionsgefäß (6) einer Festphasenpeptidsynthesevorrichtung, unter Verwendung eines in das Reaktionsgefäß (6) geleiteten inerten Gases, um Blasenbewegung der Peptidsynthesereagenzien und zugehöriger waschlösung, die durch eine Zufuhröffnung (8) des Reaktionsgefäßes (6) eingeleitet werden, zu bewirken, um Kupplungsreaktionen im Peptidkettenzusammenbau zu beschleunigen, mit:

einem Anulus (7a), der derart dimensioniert ist, daß er konzentrisch in einer Reaktjonskammer (12), die durch das Reaktionsgefäß (6) definiert wird, anzuordnen ist, wobei die Reaktionskammer (12) im wesentlichen zylindrisch ist;

einem Trägerschenkel (13), welcher sich von dem Anulus (7a) aus erstreckt und

einem Ablenkschenkel (14), der sich ebenso von dem Anulus (7a) aus erstreckt, aber kürzer als der Trägerschenkel (13) ist und sich, bezogen auf den Anulus (7a), radial nach innen neigt.

7. Stabilisator gemäß Anspruch 6, wobei der Ablenkschenkel (14) im Verhältnis zu dem Trägerschenkel (13) genügend kurz und, bezogen auf den Anulus (7a), ausreichend radial nach innen geneigt ist, so daß der Ablenkschenkel (14) das dispergierende Mischen einer unlöslichen Trägermatrix (23), in der die sich bildenden Peptidketten verankert sind, mit den Reagenzien und Waschlösungen während des Peptidkettenzusammenbaus fördert, und wobei der Ablenkschenkel (14) wirksam Verklumpungen und koagulative Hautbildung einer peptidgebundenen Trägermatrix (23) aufgrund von Auskflockungseffekten, die durch die Blasenbewegung während des Peptidkettenzusammenbaus begünstigt werden, aufbricht, wobei das Einblasen das Aufsteigen von Klumpen und Haut innerhalb der Reaktionskammer (12) verursacht; wobei außerdem

der eingebrachte Stabilisator (7) als Spritzschutz dient, welcher das Ausspritzen aus dem Gefäß verhindert, welches durch die Blasenbewegung der Reagenzien und Waschlosung in dem Reaktionsgefäß (6) verursacht wird; und wobei

der Anulus (7a) des Stabilisators (7) eine kreisformige Verteilung der Reagenzien und Waschlösung entlang der Reaktionskammer (12) nach ihrer Einleitung bewirkt, im besonderen derart, daß eine gründliche Reinigung der Reaktionskammer (12) durch die Waschlösung gefördert wird.

8. Stabilisator gemäß Anspruch 71 wobei der Trägerschenkel (13) und der Ablenkschenkel (14) diametral gegenüberliegend angeordnet sind.

9. Stabilisator gemäß Anspruch 8, welcher aus einem Polymermaterial wie Polypropylen, oder vorzugsweise aus einem Fluorkohlenstoffpolymeren hergestellt ist.

10. Stabilisator gemäß Anspruch 9, wobei das Material, aus dem der Stabilisator hergestellt ist, Polypropylen ist.

11. Stabilisator gemäß Anspruch 9, wobei das Material, aus dem der Stabilisator (7) hergestellt ist, ein Fluorkohlenstoffpolymer ist.

12. Chargenweises Kupplungspeptidsyntheseverfahren in einer automatisierten Festphasenpeptidsynthesevorrichtung mit folgenden Stufen:

Einbringen einer unlöslichen Trägermatrix (23) in Pulverform in wenigstens ein Reaktionsgefäß (6) von Reaktionsgefäßen, die Kanälen der Peptidsynthesevorrichtung entsprechen, wobei das Trägermatrixpulver auf einem Filter (11) über einer Abflußöffnung (10) des Reaktionsgefäßes (6) ruht;

Einbringen eines Stabilisators (7) mit einem Anulus (7a), einem Trägerschenkel (13) und einem Ablenkschenkel (14), der derart gestaltet ist, daß er kürzer als der Trägerschenkel ist und sich, bezogen auf den Anulus radial nach innen neigt, wobei sich Träger- und Ablenkschenkel jeweils nach unten von dem Anulus (7a) aus erstrecken; und

Anordnen des Stabilisators (7) in einer im wesentlichen zylindrischen Reaktionskammer (12), die durch das Reaktionsgefäß (6) definiert wird, derart, daß der Trägerschenkel (13) in die Trägermatrix (23) eindringt, um auf dem Filter (11) zu ruhen, und der Stabilisator (7) konzentrisch innerhalb der Reaktionskammer (12) steht,

Zuführen von Reagenz, gemäß eines Protokolls der Peptidsynthesevorrichtung, in die Reaktionskammer (12) durch ein Rohr, dessen Zufuhrspitze mit der Reaktionskammer (12) in der Nähe einer Einfuhröffnung (8) des Reaktionsgefäßes (6) zusammenhängt, um das Verbleiben des Reagenz nach der Zufuhr aufgrund von Kapillarwirkung an der Zufuhrspitze zu verhindern,

Eindrücken eines inerten Gases in die Reaktionskammer (12) durch die Abflußöffnung (10) des Reaktionsgefäßes (6) als ein bewegungserzeugendes Mittel in einem Einblasverfahren, welches sowohl die Deprotektion als auch die Peptidkupplung beschleunigt;

Ablassen der Reagenz aus der Reaktionskammer (12) durch die Abflußöf fnung (10) des Reaktionsgefäßes (6) nach einer Zeitdauer, die ausreicht, um die Peptidkupplung stattfinden zu lassen, wobei die durch Kupplungszusammenbau erhaltenen Peptidketten verankert in der Trägermatrix (23), gehalten auf dem Filter (11), verbleiben.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12 mit den weiteren Stufen

Zuführen einer Waschlösung in einem protokollgemäßen Waschverfahren in die Reaktionskammer (12) durch die Zufuhröffnung (8),

Eindrücken eines inerten Gases in die Reaktionskammer (12) durch die Abflußöffnung (10) des Reaktionsgefäßes (6) während des Waschverfahrens als ein zirkulierendes Mittel, welches das Waschen der durch den Kupplungszusammenbau erhaltenen Peptidketten beschleunigt;

Ablassen der Waschlösung aus der Reaktionskammer (12) durch die Abflußöf fnung (10) des Reaktionsgefäßes (6), um das Waschverfahren zu beenden, wobei der Stabilisatoranulus (7a) die kreisförmige Verteilung der Waschlösung entlang der Reaktionskammer (12) bewirkt, so daß ein gründliches Reinigen der Reaktionskammer (12) durch die waschlösung gefördert wird und die Peptidketten in der Trägermatrix (23), die von dem Filter (11) getragen wird, verankert bleiben;

Zuführen von Deprotektionslösung in die Reaktionskammer (12) durch die Zufuhrspitze und Umwälzen dieser Lösung darin durch das Einblasverfahren, um vorübergehend die Nc-Schutzgruppen von den Peptidketten zu entfernen; und

Wiederholen des Waschverfahrens.