DE2720375A1

DE2720375A1 - Verfahren und vorrichtung zum sequentiellen abbau von protein- oder peptidketten

Info

Publication number: DE2720375A1
Application number: DE19772720375
Authority: DE
Inventors: William Jakob Dreyer
Original assignee: Durrum Instrument Corp
Current assignee: Durrum Instrument Corp
Priority date: 1976-05-07
Filing date: 1977-05-06
Publication date: 1977-11-17
Also published as: JPS52136101A; JPS6256464B2; SE7705293L; GB1540956A; SE445265B; CA1095896A; US4065412A

Description

PATENTANWÄLTE

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PATENTANMELDUNG

PRIORITÄT: V. St. ν. A. Ser. No. 684 178 vom 7. 5. 1976

BEZEICHNUNG: Verfahren und Vorrichtung zum sequentiellen Abbau von Protein- oder Peptidketten

ANMELDER: Durrum Instrument Corporation,

1228 Titan Avenue, Sunnyvale, Kalif. (V.St.A.)

ERFINDER: William J. Dreyer, 2369 Highland, Altadena, Kalif. (V.St.A.)

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum sequentiellen Abbau von Protein- oder Peptidketten in einer Reaktionskammer durch aufeinanderfolgende Koppelungs- und Spaltreaktionen. Der sequentielle Abbau der Aminosäureketten erfolgt dabei insbesondere nach dem Prinzip des sogenannten Edman-Abbaus.

Seither erfolgt der sequentielle Abbau von Peptiden und Proteinen im allgemeinen anhand einer Reihe chemischer Reaktionen, wobei ein Durchlauf des sequentiellen Verfahrens als Edman-Abbau bezeichnet wird. Der typische Abbau umfaßt summarisch betrachtet die Verfahrensschritte einer Koppelung, einer Spaltung und einer Umwandlung. Das Peptid von N-Aminosäuren in Länge wird in einem basischen Milieu mit dem Koppelungsreagenz Phenylisothiocyanat (PITC) gekoppelt, wobei ein Phenylthiocarbamylderivat (PTC-Derivat) des Peptids entsteht. Bei der Spaltung wird das PTC-Peptidderivat mit starker, wasserfreier Säure als Spaltmittel behandelt, wodurch ein instabiles zyklisches Derivat des Peptids entsteht, das sich schnell in das stabilere Anilinothiazolinonderivat (ATZ-Derivat) des Aminosäurerestamins und ein freies Peptid oder eine Aminosäure der Länge N-1 aufspaltet, welches das ursprüngliche Peptid darstellt, bei dem der Aminosäurerest entfernt worden ist. Die Endstufe des Verfahrens, die Umwandlung, wird von Hand und getrennt von der bekannten, automatischen Sequenzabbauvorrichtung durchgeführt. Die durch den Edman-Abbau erzeugten ATZ-Aminosäuren, die in Anwesenheit von Sauerstoff äußerst instabil sind, werden mit wässriger Säure aufbereitet und dadurch in die stabileren Phenylthiohydantoinaminosäuren (PTH-Aminosäuren) umgewandelt, welche chromatografisch nachgewiesen und bestimmt werden. Das gekürzte

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Peptid oder Protein dient als Ausgangsmaterial für einen weiteren Durch Lauf des Hdnian-Abbaus .

Aufqabe der Erfindung ist nunmehr die Schaffuncj eines verbesserten Verfahrens und einer zur Durchführunq eines derart verbesserten Verfahrens qeeiqneten Vorrichtunq zum sequentiellen Abbau von Protein- oder Peptidketten, die samt Liehe Vt; r f ahrensschr i t te umfassen und zur Automat is ierunq qeeiqnet sind.

Das zur Lösunq der gestellten Auf<jabe vorgesch lagene Verfahren ist erfindunqsqemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Protein- oder Peptidketten auf einer in der Reaktionskammer angeordneten Reatantträgerflache unbeweglich festgelegt werden, ein Koppe lungsreagenz mit den Protein- oder Peptidketten chemisch gekoppeLt wird und ein Spal treage'iz enthaltender Dampfstrom während einer zur Abspaltung von Aminosäurederivaten von den gekoppelten Protein- oder Peptidketten ausreichend langen Zeitspanne unter Druck durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird.

Entsprechend dem vorgeschlagenen Verfahren werden die Protein- oder Peptidketten auf einer makroporösen Reaktantträgerf lache wie z.B. aus Polystyrol mit Makronetzstruktur oder niakroporösem Glas unbeweglich festgelegt ("immobilisiert"). Aus; (!runden der Beschre ibungsvereinfarhung wird in der Beschreibung im a LLgemeinen nur von "Peptidketten" gesprochen, wobei s ich ti ie entsprechenden Maßnahmen, sofern nicht anders angegeben, auch auf Proteinketten beziehen. Die unbewegliche Festlegung der Peptidketten erfoLgt je nach Wunsch entweder durch kovalente Bindung oder durch Adsorption an der makroporö;;en Trägermatr ix . />ur Ausführung der Koppelungsreaktion wird die Reaktant. 11 Jigerf Lache mit mit dem Koppelunqs-

reaqenz benetzt,und ein unter Druck stehender Dampfstrom mit der KoppeLLinqsbii.se durch die Reaktionskammer durchqeleitet, wodurch in dieser ein basisches KoppeLunqs-HiL lieu ausqebiLdet wird. Nach Waschen mit einem fLüssiqen Lösunqsni i tte 1 wird ein unter Druck stehender inerter Gusstrom durch die Reaktionskammer durchqe Le itet, um die Reaktantträqerflache weniqstens teiLweise zu trocknen. Anschließend wird ein unter Druck stehender Dampf strom aus Spa I tt eaqonz durch die Re₁Ik t ionskammer durchqeLeitet , um die Aminosäurederivate von den qekoppelten Ketten abzuspalten. Diese Derivate werden durch FLüssiqkeit extrahiert. Das Zuführen der Koppe lurujsl)asendampfe und des SpaLtreaqenz erfoLqt vorzuqsweise dadurch, daß ein inertes Trüqerqai; durch diese; Reaqenzien in flüssiqer Form enthaLtende Vorratsbehälter durchqeLeitet wird und diese dabei mitnimmt, bevor es in die Reaktionskammer einqeLeitet wird. Der qLeiche, unter Druck stehende friertcjasstrom kann auch zur Trocknung der Reaktantträqerflache und zum Transport der fLüssiqen Reuqenzien verwendet werden, wobei entsprechende VentiIe vorqesehen sind.

Die weiterhin zur Ausführunq dieses Verfahrens vorqeschLuqone Vorrichtunq ist er f indunqsqemüß qekennze Lehnet durch eine teststehende DurchfLuß-Reaktionskammer, eine in der Reakt ionskanimer anqeordnete, zur Aufnahme einer uribewecjLich festqeleqten i'robensubs tanz dienende Reaktuntträqert1äche, zum Zuführen von unter Druck stehendem das zur Reaktionskammer dienende VorrichLunqen und eine VentiIbauqruppe mit einem zwischen öffnunqs- und HchLießsteLLunq verstellbaren, zwischen den zum Zuführen eines Druckqasstroms dienenden Vorrichtunqen und der Reaktionskammer angeordneten ersten Ventil.

Das Verfahren und die Vorr icht unq nacli der Fifindunq

werden im nachfolgenden anhand der Zeichnung näher erläutert, in welcher

Fig. 1 ein schematischer Arbeitsplan des erfindungsgemäß vorgeschlagenen sequentiellen Abbauverfahrens und

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zur Ausführung dieses Verfahrens geeigneten Vorrichtung ist.

Das Verfaliren ist geeignet allgemein zum sequentiellen Abbau von Proteinen oder Peptiden in wiederholten Durchläufen mit Koppelung an einen Aminosäurerest und Abspaltung der gekoppelten Aminosäurederivate. Da das Verfahren insbesondere zur Ausführung des vorstehend Edman-Abbaus geeignet ist, sei es anhand dieses bekannten Verfahrens beschrieben. Dabei soll jedoch bemerkt werden, daß das erfindungsgeinäß vorgeschlagene Verfahren mit entsprechenden Abänderungen auch auf andere, die gleichen grundlegenden Verfahrensschritte beinhaltende Sequenzverfahren anwendbar ist. *beschriebenen

Der schematische Verfahrensgang ist anhand Figur 1 kurz wie folgt: In Verfahrensschritt 10 werden die Peptide auf einer vorzugsweise makroporösen, in einer Reaktionskammer angeordneten Reaktantträgerflache immobilisiert, d.h. unbeweglich festgelegt. In Verfahrensschritt 11 wird ein Koppelungsreagenz wie z.B. PITC in flüssiger Form durch die Reaktionskammer durchgeleitet und in Berührung mit dem unbeweglich festgelegten Peptid gebracht. Gleichzeitig damit wird ein unter Druck stehender Dampfstrom aus Koppelungsgasdampf durch die Reaktionskanuner durchgoleitet und bildet ein basisches Milieu für die Koppelung des PITC an den Peptidresten.

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In Verfahrensschritt 12 wird ein flüssiges Waschlösungsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um die Reaktantträgerflache zu waschen und nichtreagiertes Koppelungsreagenz und andere Verunreinigungen von dieser zu entfernen. In Verfahrensschritt 13 wird die Reakt^ntträgerfläche wenigstens teilweise von dem Lösungsmittel durch Trocknen befreit, indem ein unter Druck stehender Inertgasstrom durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird. In Verfahrensschritt 14 wird ein unter Druck stehender Spaltreagenzdampfstrom, der von einem Trägergas mitgeführt wird, während einer ausreichend langen Zeit durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um die ATZ-Aminosäurederivate von den PTC-Peptiden abzuspalten.

In Verfahrensschritt 15 wird ein inertes Gas durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um die Reaktantträgerfläche zu trocknen und Spuren des Spaltreagenz zu entfernen. In Verfahrensschritt 16 wird ein flüssiges Extraktionslösungsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um das abgespaltene ATZ-Aminosäurederivat zu extrahieren und abzuziehen. In Verfahrensschritt 17 wird die Reaktantträgerflache wiederum mit einem inerten Gasstrom getrocknet, um alle noch verbleibenden Spuren von Extraktionslösungsmittel zu beseitigen.

Verfahrensschritt 17 schließt den Durchlauf ab und bereitet die Reaktantträgerflache für den nächsten Durchlauf vor, der wiederum mit Verfahrensschritt 11 beginnt. In Verfahrensschritt 18, welcher außerhalb der Reaktionskammer ausgeführt wird, wird das flüssige Extraktionslösungsmittel aus Verfahrensschritt 16, welches das Aminosäurederivat enthält, einem Prüfröhrchen in einem Fraktionssammler zugeführt. In diesem wird das ATz-Aminosäurederivat in ein stabiles PTH-Aminosäurederivat umgewandelt, das auf bekannte Weise chromatografisch bestimmt wird.

Die verschiedenen Verfahrensschritte sind im nachfolgenden im einzelnen näher betrachtet.

In Verfahrensschritt 10 wird das Protein oder Peptid entweder a) physikalisch, d.h. nichtchemisch an der Reaktantträgerfläche adsorbiert oder b) kovalent an diese gebunden. Die Reaktantträgerflache muß eine ausreichend große Oberfläche aufweisen, damit das Protein oder Peptid in einerdünnen Schicht aufgebracht werden kann, welche einen leichten Zugang der Reagenzien gestattet. Zu diesem Zweck ist das Feststoffmaterial der Reaktantträgerflache vorzugsweise makroporös ausgebildet. Ein weiterer Vorteil der Makroporösität besteht darin, daß die Porenwände eine Sperre gegen Scherkräfte der durchströmenden flüssigen Reagenzien bilden, wodurch die Auswaschverluste der Probe im Vergleich zu denen bei einer nichtporösen Oberfläche wesentlich verringert werden. Die Reaktionen erfolgen innerhalb des Porenraums, so daß es demzufolge erforderlich ist, Flüssigkeiten und Gase frei innerhalb der Poren zirkulieren zu lassen. Durch Ausbildung der Reaktantträgerfläche aus einem starren Werkstoff behalten die Poren eine ausreichend offene Formgebung, welche den freien Durchtritt von Gasen und Flüssigkeiten gestattet. Ansonsten könnte es vorkommen, daß der Durchfluß so weit verringert wird, daß die Reaktion nur noch auf dem Wege einer Diffusionsreaktion erfolgen kann, wodurch der Zeitbedarf für die Ausführung des Verfahrens in unvertretbarer Weise gesteigert werden würde.

Die Reaktantträgerflache ist chemisch inert und unlöslich in sämtlichen im Verfahren verwendeten Reagenzien. Bei Verwendung eines Polymerisatharzes als Matrix für das makroporöse Material sollten sich daher die Polymerisat-

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ketten nicht so weit lösen, daß sie frei im Lösungsmittel aufschwimmen und nur noch durch Vernetzungsbindungen oder dgl. mit der Matrix verbunden sind.

Eine bevorzugte Reaktantträgerflache hat die folgende Beschaffenheit: Um die Ausbreitung einer typischen Peptidprobe in einer feine Bohrungen aufweisenden Reaktionskammer zu gestatten, besteht die Reaktantträgerflache aus makroporösen Teilchen, deren spezifische Oberfläche wenigstens etwa 1 m² pro g Teilchenmasse beträgt. Ausgezeichnete Ergebnisse werden mit Teilchen erhalten, deren spezifische Oberfläche zwischen 50 bis 100 m² pro g Teilchen oder mehr beträgt. Aufgrund dieser Eigenschaft lassen sich verhältnismäßig kleine Teilchenbetten und kleine Reaktionskammern verwenden, wodurch der Bedarf an Reagenzien verringert ist und sich kürzere Trocknungszeiten ergeben.

Die mittlere Porengröße der makroporösen Reaktantträgerflache ist vorzugsweise so groß bemessen, daß große Proteine frei durch die Poren hindurchtreten können. Eine bevorzugte Größe für Proteine und größere Peptide liegt in der Größenordnung von 70 bis 1000 Angström oder darüber. Außerdem sollte das Material eine ausreichend hohe Steifigkeit aufweisen, damit sich die Poren während des Trocknungsvorgangs nicht zusammenziehen oder zusammenfallen und eine solche Größe annehmen, bei welcher ein freier Durchfluß durch die Poren beeinträchtigt oder sogar unterbunden wäre. Die makroporöse Trägerfläche gestattet einen freien Durchtritt von Gasen und Flüssigkeiten, der nicht auf Diffusion beruht, und ermöglicht ein schnelles Entfernen und den Austausch von Reagenzien und Lösungsmitteln, sowie einen schnellen Durchfluß von Stoffen unter verhältnismäßig niedrigem Beaufschlagungsdruck.

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Besonders wirksame Reaktantträgerflachen bestehen aus makroporösem Glas und Harz mit einer Makronetzstruktur. In bezug auf Glas sind geeignete poröse, anorganische Stoffe mit verhältnismäßig hoher spezifischer Oberfläche und innerhalb enger Toleranzgrenzen bestimmbaren Porendurchmessern beispielsweise Siliziumdioxid-Glaskugeln von vorbestimmter Porengröße mit der Typenbezeichnung GZO-3900 (Hersteller Corning Biomedical Products Department, Medfield, Mass., V.St.A.). Dieses poröse Glas vorbestimmter Porengröße ist in unveränderter Form zur Erzielung einer adsorptiven Bindung verwendbar. Weiterhin geeignet sind Aminoarylderivate derartiger poröser Siliziumdioxidgläser mit der Bezeichnung GAO-3940 vom gleichen Hersteller. Die letztgenannten Materialien weisen reaktionsfähige Nebengruppen auf, die wie weiter unten beschrieben zur unbeweglichen Festlegung durch kovalente Bindung geeignet sind.

Ein zur adsorptiven Festlegung besonders gut geeignetes Harz mit Makronetzstruktur ist ein nicht modifiziertes Polymerisat-Adsorptionsmittel in Kugelform mit der Bezeichnung "Amberlite XAD-2" (Hersteller Röhm und Haas Co., Philadelphia, Penn. V.St.A.). Jede Kugel dieses Materials besteht aus einer Agglomeration einer großen Anzahl kleiner Mikrokugeln aus synthetischem, nichtlöslichem, vernetztem Polystyrolpolymerisat mit einer Größe von o,3 - 0,8 mm. Dieses Material kann modifiziert sein durch Einschluß eines Amins zur Festlegung durch kovalente Bindung, wie weiter unten beschrieben ist. Ein derartiges Harz mit Makronetzstruktur ist besonders gut geeignet zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, da es bei Zu- und Abführen von Lösungsmittel nicht in nennenswertem Umfang aufquillt bzw. schrumpft. Das Harz läßt sich völlig trocknen, und Reagenzien können in Gasphase zugeführt werden, ohne daß dabei die Poren in sich zusammenfallen. Die Poren dieses Harzes bestehen aus

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Hohlräumen in der Größenordnung von 100 Angström zwischen den einzelnen Mikrokugeln. Diese Poren sind wesentlich größer als die von gelartigen Harzen, welche bei einem bekannten Flüssigkeitssystem nach Laursen u.a. verwendet werden. Die großen Poren gestatten ein ungehindertes Eindringen von Proteinmolekülen, die wesentlich größer sind als diejenigen, welche in gelartige Harze eindringen können.

Ein Verfahren zur unbeweglichen Festlegung der Proteine und Peptide in der makroporösen Reaktantträgerflache entsprechend Verfahrensschritt 10 in z.B. Glas vorbestimmter Porengröße oder Harz mit Makronetzstruktur ist vermittels physikalischer Sorption und insbesondere Adsorption nach Ablagerung aus einer Lösung möglich. Das Peptid wird zu diesem Zweck in einer Lösungsmittelmenge gelöst, die ausreichend bemessen ist, um die Poren der Reaktantträgerflache zu bedecken und auszufüllen. Das Peptid dringt dann in die Poren ein und wird von diesen adsorbiert. Anschließend wird das Lösungsmittel beispielsweise durch Trocknen mit einem Stickstoff-Gasstrom und Anlegen eines Vakuums entfernt. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Trifluoressigsäure oder Ameisensäure. Auf diese Weise läßt sich die Probe in einer sehr dünnen Schicht ausbreiten. Dadurch wird verhindert, daß die Probe in ihrer eigenen Matrix "begraben" wird. Da jedes Molekül der Probe ganz freiliegt, kann es mit den Reagenzien im umgebenden Gas oder in der Flüssigkeitsphase frei reagieren. Aufgrund dieser ungehinderten Zugänglichkeit ist auch zum öffnen der Probenmatrix zum Zwecke der Extraktion oder des Waschens die Verwendung eines starken Reagenz nicht erforderlich.

Durch die unbewegliche Festlegung des Proteins oder Peptide durch nichtchemische oder physikalische Adhäsion an der Oberfläche des Trägermaterials wird ein Auswaschen samt-

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licher Peptide mit Ausnahme von sehr kleinen Peptiden verhindert, und das umso mehr, weil die in Verfahrensschritt 11 eingesetzte Koppelungsbase und das in Verfahrensschritt 14 verwendete Spaltreagenz in Dampfform zugeführt werden. Nach Trocknen des Proteins oder Peptids auf der Festkörperfläche ist dieses keinem flüssigen Lösungsmittel, in welchem es hoch löslich wäre, ausgesetzt, so daß das Protein oder Peptid einwandfrei an der Fläche zurückgehalten wird.

Es kann erforderlich sein, verhältnismäßig kleine Proteinsegmente oder Peptide durch kovalente Bindung unbeweglich an der Fläche festzulegen. Eine kovalente Bindung sollte jedoch nur dann erfolgen, wenn mit physikalischer Adsorption eine übermäßig starke Auswaschung zu beobachten ist. Das ist darauf zurückzuführen, daß die Verfahrensschritte zur Erzielung einer kovalenten Bindung verhältnismäßig komplex sind und ggf. unerwünschte Nebenwirkungen nach sich ziehen, so z.B. eine irreversible Bindung einiger Aminosäureeinheiten an der Festkörper-Trägerfläche, so daß Thiazolinonderivate nicht zur Bestimmung ausgewaschen werden können. Zur unbeweglichen Festlegung kleiner Peptide kann dies jedoch ggf. der einzig mögliche Weg sein.

Die kovalente Bindung von Peptiden an Festkörper-Trägerflächen kann in bekannter Weise erfolgen. Die entsprechenden Verfahren sind bereits gründlich untersucht worden in bezug auf gelartige Harze in einer Sequenzvorrichtung mit Flüssigkeits-/Festphase, in welcher wie vorstehend erwähnt eine kovalente Bindung erforderlich ist. Diese Systeme lassen sich jedoch auch auf Harz mit Makronetzstruktur entsprechend der Erfindung anwenden, das mit Aminogruppen substituiert ist. Ein entsprechendes Verfahren ist beschrieben in einem Aufsatz von A. Previero u.a. in "FEBS Lett.", 33, 135 (1973). Bei diesem Verfahren wird ein disubstituiertes Carbodiimid-Koppelungsreagenz zur Erzielung einer Bin-

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dung zwischen den primären Aminogruppen an dem Harz und den Carboxylsäuregruppen an den Enden des Proteins oder Peptids verwendet. Die Bindungen sind dabei die gleichen wie die der Aminosäureeinheiten untereinander im Protein oder Peptid. Dementsprechend lassen sich auch andere Verfahren zum Synthesieren von Proteinen zur Bindung von Proteinen oder Peptiden an Festkörper-Trägerflächen mit primären Aminogruppen verwenden. Eine allgemeine Übersicht über derartige Verfahren ist enthalten in dem Buch "The Peptides", Band 1, E.F. Schröder und Lübke, Academic Press, New York, 1966. Die insbesondere auf besondere Klassen von Peptiden anwendbaren Techniken zur kovalenten Bindung sind in einem Aufsatz von Horn u.a. in "FEBS Lett.", 36, 385, (1973) und in einem weiteren Aufsatz von Laursen u.a. in "FEBS Lett.", 21, 67 (1972) beschrieben.

Der Anmelderin sind zur Zeit keine handelsüblichen Harze mit Makrostruktur des vorstehend genannten Typs XAD-2 bekannt, welche zum Zwecke des Einsatzes in den vorstehend beschriebenen Koppelungsverfahren mit Aminogruppen substituiert sind. Die Herstellung derartiger mit Primäramin derivatisierter Harze kann in der folgenden Weise ausgeführt werden. Das vernetzte Polystyrolharz vom Typ XAD-2 wird zunächst durch Reaktion des Harzes mit Chlormethyl-Methyläther in einem Chloroformgemisch chlormethyliert. Das chlormethylierte Harz wird dann getrocknet und mit Äthylendiamin umgesetzt und dadurch in ein Primäraminharz umgewandelt. Weitere Einzelheiten über die Herstellung dieses Harzes sind weiter unten beschrieben.

Zur Bindung von Proteinen oder Peptiden an makroporösem Glas mit z.B. aromatischen Aminosäuregruppen sind bereits viele Verfahren bekannt. Verwiesen sei in diesem Zusammenhang auf einen Aufsatz von R.D. Mason u.a. in Biotech, Bioeng., 14, 367 (1972).

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Die Verfahrensschritte 11 bis 17 des erfindungsgemäßen Verfahrens werden an dem Protein oder dem Peptid ausgeführt, das in einer Durchfluß-Reaktionskammer unbeweglich an der makroporösen Trägerfläche festgelegt ist. Aus Gründen der Vereinfachung der Beschreibung sei angenommen, daß die makroporöse Trägerfläche aus einer Vielzahl von Kugeln besteht, welche in der Reaktionskammer in Form eines Betts angeordnet sind. Die Reaktionskammer ist ein frei durchströmbares Glasrohr, durch welches Gase und flüssige Reagenzien mit Hilfe einer Ventilsteuerung durchgeleitet werden.

In Verfahrensschritt 11 wird ein Koppelungsreagenz in einer zur Benetzung des unbeweglich festgelegten Proteins oder Peptids ausreichend hohen Menge durch eine eine Reaktionskammer bildende Patrone durchgeleitet. Entsprechend dem typischen Edman-Abbaugang besteht das Koppelungsreagenz aus Phenylisothiocyanat (PITC). Dieses Reagenz ist handelsüblich erhältlich und in einem flüchtigen Lösungsmittel wie z.B. Heptan in einer Verdünnung von z.B. 17 Vol.-% enthalten. Damit läßt sich das verhältnismäßig viskose PITC leichter zumessen und in Form einer gleichförmig starken Schicht auf die Trägerfläche aufbringen. Nach Benetzung der Trägerfläche mit dem PITC-Reagenz wird das ggf. noch vorhandene Heptan an der Reaktantträgerflache bis zur Trockne verdampft, indem ein inertes Gas durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird, bis die Reaktantträgerflache nur noch flüssiges PITC aufweist. Dann wird die Koppelungsphase in dampfförmiger Form durch die Reaktionskammer durchgeleitet. Eine ausgezeichnete Koppelungsbase für diesen Zweck ist Trimethylamin (TMA). Dieses Reagenz bildet ein hoch basisches Milieu mit einem pH-Wert von etwa 10,5 für die Koppelungsreaktion aus.

Ein wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht

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darin, daß die Koppelungsbase in Verfahrensschritt 11 in dampfförmiger Form zugeführt wird. Damit wird eine Auswaschung des Peptids oder Proteins in einem flüssigen Koppelungsreagenz vermieden, was besonders dann zu Schwierigkeiten Anlaß geben könnte, wenn das Protein oder Peptid physikalisch an der Reaktantträgerflache adsorbiert ist. Ein weiterer Vorteil, der dadurch erzielt wird, daß die Koppelungsbase in dampfförmiger Form zugeführt wird, besteht darin, daß dadurch eine übermäßig starke Austrocknung nach der Beendigung der Koppelungsreaktion vermieden wird. Die Verdampfung der Koppelungsbase erfolgt bevorzugt in der Weise, daß ein inertes Trägergas durch einen Vorratsbehälter durchgeleitet wird, der eine Lösung von 25 Vol.-% TMA in entionisiertem Wasser enthält, wobei die Base von dem durch die Reaktionskammer durchgeleiteten Trägergas mitgeführt wird. Stattdessen kann die Koppelungsbase auch in den dampfförmigen Zustand übergeführt und unter Druck durch die Reaktionskammer durchgeleitet werden.

Anstelle der vorstehend beschriebenen lassen sich auch andere Koppelungsreagenzien verwenden, die selektiv mit dem Aminosäurerest in einem Peptid oder Protein reagieren, so daß das benachbarte Peptid für eine nachfolgende Spaltreaktion aktiviert wird, durch welche selektiv nur diese Bindung gebrochen wird. Gleichzeitig reagieren die diese Funktion aufweisenden bekannten Koppelungsreagenzien mit dem Aminosäurerestamin. Als Reagenz können auch andere Isothiocyanatderivate wie z.B. Methylisothiocyanat verwendet werden. Fluoreszierende Isothiocyanatderivate bieten eine gesteigerte Empfindlichkeit bei der Ermittlung von Mikroproben. Als Koppelungsreagenzien können auch Kohlenstoffdisulfid und andere Isothiocyanatderivate eingesetzt werden.

Das Zuführen des Koppelungsreagenz zur Patrone kann auch in anderer Weise erfolgen. Da lediglich erforderlich ist, daß

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das Koppelungsreagenz und die Koppelungsbase gleichzeitig in der Patrone vorhanden sind, könnte das Koppelungsreagenz in Verbindung mit der Koppelungsbase in einem kontinuierlichen Dampfstrom zugeführt werden.

Andere Koppelungsbasen sind gleichfalls verwendbar. Zum sequentiellen Abbau mit Isothiocyanat-Koppelungsreagenzien besteht das Koppelungsmedium aus einer starken Base in einem wässrigen Milieu. Die Base darf dabei jedoch nicht so stark sein, daß sie eine Spaltung der Peptidbindungen verursacht. Wenn jedoch die Koppelungsreaktion in einer Gasatmosphäre erfolgt, wird die hydrolytische Spaltung wesentlich herabgesetzt, so daß dementsprechend starke Basen verwendbar sind. Quadrol, Dimethylallylamin (DMAA) und Dimethylbenzylamin (DMBA) sind in der wässrigen Phase als Koppelungsbasen in sequentiell arbeitenden Abbauvorrichtungen vom Drehtassentyp einsetzbar. Andere, in gleicher Weise wirkende starke Basen sind gleichfalls verwendbar.

Nach Ausführung der Koppelung in der vorstehend beschriebenen Weise kann die Reaktionskammer in einem ggf. zwischengeschalteten zusätzlichen Verfahrensschritt ausgeblasen werden, indem ein inertes Trägergas durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird, um alle etwa zurückgebliebenen Koppelungsbasendämpfe auszutreiben.

In Verfahrensschritt 12 wird ein flüssiges Waschlösungsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um nicht reagiertes Koppelungsreagenz und Nebenprodukte aus der Koppelungsreaktion zu entfernen. Das Waschlösungsmittel weist eine solche Beschaffenheit auf, daß es nicht reagiertes Koppelungsreagenz und Reaktionsnebenprodukte auflöst, ohne jedoch die PTC-Peptidketten in der Patrone aufzulösen oder anzugreifen. Zu diesem Zweck besonders gut geeignet

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ist ein nichtpolares aromatisches Lösungsmittel wie z.B. Benzol.

In Verfahrensschritt 13 wird die Reaktantträgerflache vermittels eines durch die Reaktionskammer durchgeleiteten inerten Gases getrocknet, wodurch das Waschlösungsmittel entfernt wird. Ggf. kann eine zusätzliche Reinigung der Kammer durch Anlegen eines Vakuums erfolgen.

In Verfahrensschritt 14 wird ein Spaltreagenz, vorzugsweise eine wasserfreie Säure wie z.B. Trifluoressigsäure (TFE) in dampfförmiger Form durch die Reaktionskammer durchgeleitet. Dieses Reagenz bildet zur Ausführung der Spaltreaktion ein Milieu mit einem pH-Wert von 1,0 aus. Die überführung des Spaltreagenz in die dampfförmige Form erfolgt in der Weise, daß ein inertes Trägergas durch einen das flüssige Spaltreagenz enthaltenden Vorratsbehälter durchgeblasen wird.

Das Spaltreagenz ist eine starke wasserfreie Säure. Bei Vorhandensein von Wasser kann eine Spaltung von Peptidbindungen an anderer Stelle als an der Endgruppe eins erfolgen, so daß Mehrfachpeptidfragmente entstehen. Es ist möglich, wasserfreie Halogenwasserstoffgase wie z.B. HCl, HBr oder HI unter Druck zuzuführen, so daß kein inertes Trägergas benötigt wird.

In Verfahrensschritt 15 wird wiederum inertes Trägergas durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um diese von zurückbleibenden Spaltreagenziendämpfen zu reinigen. Dann wird in Verfahrensschritt 16 ein flüssiges Extraktionslösungsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet, um das abgespaltene Aminosäurederivat abzuführen und einem Prüfröhrchen in einem Fraktionssammler zuzuführen. Das Extraktionslösungsmittel ist dabei so gewählt, daß es die ATZ-Aminosäurederivate leicht löst, jedoch kein Lösungs-

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mittel für die verbleibenden Peptidketten darstellt. Zu diesem Zweck geeignete Lösungsmittel sind z.B. 1-chlorbutan, Benzol, Chloroform und Äthylendichlorid, jeweils für sich oder in Mischung. Ein wirksames Lösungsmittel besteht aus einer 0,1 %-igen Essigsäurelösung in Äthylazetat. In Verfahrensschritt 17 wird die Reaktantträgerflache wiederum getrocknet, indem ein Inertgasstrom durch die Kammer durchgeleitet wird, um das System für einen neuen Durchlauf vorzubereiten, der mit dem oben beschriebenen Verfahrensschritt 11 beginnt.

Die Umwandlung in Verfahrensschritt 18 erfolgt vermittels bekannter Techniken. Dadurch werden die ATZ-Aminosäuren durch Reaktion mit einer Säure in einem wässrigen Milieu zu stabilen PTH-Aminosäuren umgewandelt. Diese Umwandlungsreaktion kann an mehreren extrahierten ATZ-Aminosäurederivaten gleichzeitig oder nacheinander ausgeführt werden. Im Anschluß an die Umwandlung werden die Rückstände beispielsweise auf herkömmliche gaschromatografische Weise bestimmt.

Eine verhältnismäßig preiswerte Inertgasquelle ist unter Druck zugeführter Stickstoff. Es lassen sich jedoch auch andere, bei den Reaktionsbedingungen in der Reaktionskammer inerte Gase wie z.B. Helium und Argon verwenden.

Bei der Durchführung des Verfahrensgangs kann auch ein Vakuum eingesetzt werden, welches die vorstehend beschriebenen Trocknungs- und Reinigungsfunktionen des Inertgases unterstützt. Bei jedem Verfahrensschritt, in welchem Inertgas zum Abführen eines Reagenz durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird, kann gleichzeitig auch an der Abstromseite der Reaktionskammer ein Vakuum angelegt werden, wodurch die Trocknungszeit verkürzt wird.

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Ein weiteres wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß unter einem Überdruck stehendes Inertgas für die Trocknungsvorgänge, sowie zum Zuführen der Koppelungsbase und des Spaltreagenz in jeweils dampfförmiger Phase zugeführt wird. Aufgrund dieser Maßnahme werden die Durchlauftaktzeiten des Sequenzverfahrens wesentlich verkürzt. Das Inertgas treibt die Reagenzien durch Verdrängung mit hohem volumetrischem Wirkungsgrad aus. Zu diesem Zweck wird das Inertgas unter einem mittleren Druck von z.B. 1,4 atü durch die Reaktionskammer in einem Durchsatz durchgeleitet, bei welchem das gesamte, in der Reaktionskammer vorhandene Gasvolumen mehr als 1000 mal pro Minute ausgetauscht und somit eine schnelle und vollständige Verdrängung erzielt wird. Auch mit Durchsätzen, die einen wenigstens 100-fachen Gasaustausch pro Minute zur Folge haben, lassen sich wesentlich bessere Ergebnisse erzielen als bei der Oberflächenverdampfung stehender Reagenzien wie sie bei dem oben beschriebenen, von Hand auszuführenden Verfahren nach Edman angewandt wird. Da der zu entfernende Reagenzfilm in einer sehr dünnen Schicht über eine sehr große Oberfläche der makroporösen Trägefläche dispergiert ist, kann der durchgeleitete Inertgasstrom unmittelbar auf das Reagenz einwirken und führt daher zu einer äußerst raschen Trocknung.

Eine preiswerte und einfache Technik zum Zuführen der flüssigen Reagenzien besteht im Einsatz von unter Druck stehendem Inertgas aus der gleichen Gasquelle wie der, vermittels welcher die flüssigen Reagenzien unter Druckbeaufschlagung durch die Reaktionskammer durchgedrückt werden.

In Figur 2 der Zeichnung ist schematisch eine automatisch arbeitende Vorrichtung zum sequentiellen Abbauen von Pro-

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tein oder Peptid vermittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens dargestellt. Unter Druck stehendes Inertgas wie z.B. Stickstoff wird von einer Inertgasquelle 30 über eine Sauerstoffalle 31 und über eine Rohrleitung 34 mit einem Gasdruckregler 36 und einem zur Anzeige des in der Rohrleitung 34 herrschenden Drucks dienenden Druckmesser zu einem Inertgas-Hauptverteilerrohr 32 zugeführt. Der Gasdruckregler 36 setzt den Druck des Inertgases vor dessen Eintritt in das Hauptverteilerrohr 32 auf beispielsweise 1,4 atü herab. Die Inertgasquelle 30 ist außerdem über eine Leitung 42 mit einem Absperrventil 44 mit dem durch gestrichelte Linien angedeuteten Gehäuse 40 verbunden, in welchem eine Stickstoffatmosphäre bei geregelter Temperatur aufrecht erhalten wird. Die Sauerstoffalle 31 ist z.B. von einer Ausführung mit heißem Kupferdraht. In der Öffnungsstellung des Absperrventils 44 strömt Stickstoff in einem hohen Durchsatz in das Gehäuse 40 ein. Die Inertgasquelle 30 ist außerdem über die Rohrleitung 48 mit einem Druckregler 50 und einem Druckmesser mit dem Fraktionssammler 46 verbunden. An das Ventil 54 ist in der weiter unten beschriebenen Weise der Fraktionssammler 46, die Rohrleitung 48 und eine Vakuumquelle 56 angeschlossen. Die Rohrleitungen 34, 42 und 48 sind vorzugsweise sauerstoffundurchlässig ausgebildet.

Eine abnehmbar an dem Gehäuse 40 anbringbare Patrone 58 bildet eine Durchfluß-Reaktionskammer, in welcher die vorstehend beschriebenen Teilchen der Reaktantträgerflache in Form eines Betts angeordnet sind. Die Reaktionskammer weist beispielsweise einen Innendurchmesser von 1 mm und eine Länge von 40 mm auf. Das Trägerteilchenbett ist zwischen inerten Sieben an den beiden offenen Enden der Patrone zurückgehalten.

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Die Patrone 58 ist mit dem übrigen Teil der Vorrichtung über ein Wählventil 60 mit 10 Einlassen P1 bis P10 verbunden. Das Wählventil 60 ist auslaßseitig mit einer einzigen Auslaßleitung 62 verbunden. Das Wählventil 60 besteht aus einer Drehscheiben-Dichtungs-Ventilbaugruppe und gestattet, jeweils einen beliebigen Einlaß P1 bis P10 mit der Auslaßleitung 62 zu verbinden, wobei gleichzeitig die jeweils anderen neun Einlasse gesperrt sind. Die zehn Stellungen des Ventils liegen in gegenseitigen Abständen in Radialrichtung um das Ventil herum verteilt und werden taktweise angesteuert, indem die zehn Einlasse P1 bis P10 nacheinander mit dem Auslaß des Ventils verbunden werden. Ein für diesen Zweck geeignetes Wählventil 60 ist beispielsweise das Drehventil Cheminert Typ R6000 (Hersteller Laboratory Data Control, Division of Milton-Roy Corp.), das 10 anstelle von 6 Einlassen aufweist.

Der Aufbau der Vorrichtung zwischen Hauptverteilerrohr 32 und Wählventil 60 ist kurz wie folgt: Vorratsbehälter 64, 66, 68 und 70 für flüssiges Reagenz sind einlaßseitig über eine Rohrleitung 72, 74, 76 bzw. 78 mit dem Hauptverteilerrohr 32 verbunden. Sämtliche einlaßseitigen Rohrleitungen münden am oberen Ende der Vorratsbehälter oberhalb eines vorbestimmten Reagenzflüssigkeitspegelstands. Die Auslaßleitungen 80, 82, 84 und 86 verbinden die Vorratsbehälter in gleicher Reihenfolge mit den Einlassen P1, P3, P5 bzw. P9. Das in den Vorratsbehältern befindliche Ende der Auslaßleitungen 80, 82, 84 bzw. 86 ist bis in den unteren Bereich der Vorratsbehälter 64, 66, 68 und 70 geführt und befindet sich unterhalb des vorbestimmten Flüssigkeitsreagenzpegelstands in den Vorratsbehältern. Die Auslaßleitungen 80, 82, 84 und 86 weisen jeweils eine Durchflußdrossel 88, 90, 92 bzw. 94 auf, vermittels welcher der Durchsatz von dem jeweiligen Vorratsbehälter zum Wählventil 60 vorgebbar ist. Geeignete Durchflußdrosseln sind

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beispielsweise Rohrschlangen, deren Länge so bemessen ist, daß sie aufgrund des Fließwiderstands einen gewünschten Durchsatz ergeben.

Jeder nicht angesteuerte Einlaß ist am Wählventil 60 gesperrt. Wenn der angesteuerte Einlaß offen ist, drückt das am oberen Ende der Durchflußdrossel 88, 90, 92 oder 94 in der angesteuerten Leitung eintretende Gas die im Vorratsbehälter befindliche Flüssigkeit über die entsprechende Rohrleitung und durch den angesteuerten Einlaß des Wählventils 60 hindurch in einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom aus.

Die Vorratsbehälter 96 und 98 dienen zum Zuführen von durch den unter Druck stehenden Inertgasstrom in dampfförmiger Form mitgeführtem Reagenz durch das Wählventil 60. Das Verteilerrohr 32 ist über die Rohrleitungen 100 und 102 mit dem Ventil 104 bzw. dem Ventil 106 verbunden. Außerdem sind mit den Ventilen 104 und 106 die Rohrleitungen 108 und 110 verbunden, welche in den unteren Bereich der Vorratsbehälter 96 und 98 geführt sind und an ihrer Mündung eine Ausblasöffnung aus gefrittetem Glas aufweisen, welche sich unterhalb des vorbestimmten Flüssigkeitspegelstands im Vorratsbehälter befindet und dazu dient, das Inertgas in Form feiner Blasen in das Reagenz abzugeben. Die Rohrleitungen 108 und 110 weisen jeweils eine regelbare Durchflußdrossel 111 bzw. 113 auf. Die Auslaßleitungen 112 und 114 verbinden jeweils einen oberen Bereich des Vorratsbehälters 96 bzw. 98 mit dem Ventil 104 bzw. 106. Die Ventile 104 und 106 sind jeweils über eine Rohrleitung 116 bzw. 118 mit dem Wählventil 60 verbunden. Die Rohrleitung 116 verzweigt sich in die Rohrleitung 116a, welche mit dem Einlaß P2 des Wählventils 60 verbunden ist, und in die mit dem Einlaß P4 verbundene Rohrleitung 116b. Die Rohrleitung 118 ist mit dem Einlaß P7 des Wählventils 60 verbunden.

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Die Rohrleitungen 120, 121 und 122 verbinden das Verteilerrohr 32 jeweils unmittelbar mit dem Einlaß P6, P8 bzw. P10 des Wählventils 60 und dienen zum unmittelbaren Zuführen von reinem Inertgas zur Patrone 58.

SämtLiche Einlasse P1 bis P10 sind jeweils mit der Auslaßleitung 62 verbindbar, indem das Wählventil 60 gewissermaßen ein "Tor" bildet, das jeweils nur für einen ausgewählten Einlaß offen, jedoch für alle anderen Einlasse geschlossen ist. Das Wählventil 60 stellt daher eine Ventilbaugruppe dar, in welcher jeder Einlaß einen Teil eines zwischen einer öffnungs- und einer Schließstellung verstellbaren Tors bildet. Die Ventile 104 und 106 wirken mit dem Wählventil 60 in der Weise zusammen, daß sie in Abhängigkeit von ihrer Einstellung jeweils nur Inertgas oder Reagenz von den Vorratsbehältern 96 oder 98 zuführen. In der Öffnungsstellung von Einlaß P2 des Wählventils 60 befindet sich das Ventil 104 in der in Fig. 2 in ausgezogenen Linien dargestellten Bypasstellung, in welcher nur Inertgas durch die Kammer der Patrone 58 strömen kann. Wenn das Ventil 104 in die durch gestrichelte Linien angedeutete zweite Stellung verstellt ist, strömt Inertgas durch die Rohrleitungen 100 und 108 und durch die Ausblasöffnung am unteren Ende des Vorratsbehälters 96 in Blasenform in die in diesem Vorratsbehälter enthaltene Flüssigkeit ein und wird dabei vor Erreichen des oberen Gasraums im Vorratsbehälter mit Dämpfen der Flüssigkeit gesättigt. Das so gesättigte Inertgas gelangt dann über die Rohrleitung 112 zurück zum Ventil 104 und durch die Rohrleitungen 116, 116a und 116b zu den beiden Einlassen P2 und P4. Das Ventil 106 weist wie das Ventil 104 zwei entsprechende Betriebsstellungen auf, wobei es in.gleicher Weise in einer ersten Betriebsstellung als Bypass für den Vorratsbehälter 98, und in einer zweiten Betriebsstellung zur Einschaltung desselben

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dient, so daß das Inertgas vor Einleitung in die Rohrleitung 118 mit dem im Vorratsbehälter befindlichen Reagenz gesättigt wird. Wenn sich die beiden Ventile 104 und 106 in ihrer
ersten Bypass-Betriebsstellung befinden, trennen sie somit
die Vorratsbehälter 96 und 98 ab, so daß diese sich nicht
gegenseitig oder die anderen, mit dem Verteilerrohr 32 verbundenen Vorratsbehälter 64, 66, 68 und 70 für Reagenz und
Lösungsmittel verunreinigen können. Dieses Merkmal ist
besonders vorteilhaft, da der Vorratsbehälter 96 zur Aufnahme von Trimethylamin oder einer anderen Koppelungsbase bestimmt ist, während der Vorratsbehälter 98 Trifluoressigsäure oder ein anderes Spaltreagenz enthält, und beide Mittel den Verfahrensablauf stören, wenn sie auch nur spurenweise die
anderen Vorratsbehälter verunreinigen.

Die Patrone 58 ist auslaßseitig über die Rohrleitung 126 mit dem Ventil 128 verbunden, welches seinerseits über eine Rohrleitung 132 mit einer Durchflußdrossel 134 mit einer Vakuumpumpe 130 verbunden ist. Das Ventil 128 weist die in ausgezogenen Linien dargestellte erste Betrxebsstellung, in welcher es einen Durchfluß von der Rohrleitung 126 zur Rohrleitung 138 und dem Ventil 136 ermöglicht, und eine zweite, in gestrichelten Linien dargestellte Betriebsstellung auf,
in welcher das Vakuum an die Reaktionskammer der Patrone 58 angelegt ist.

Eine mit dem Ventil 136 verbundene Rohrleitung 140 ist bis
zum Boden einer Dampffalle 142 geführt, so daß das durch
die Rohrleitung zugeführte Gas das in der Falle befindliche flüssige Reagenz durchsetzt. Der Auslaß der Dampffalle 142 ist über eine Rohrleitung 144 mit dem bodenseitigen Bereich einer Dampffalle 146 verbunden, und diese ist ihrerseits
über eine Rohrleitung 148 mit einer weiteren Dampffalle 150 verbunden. Die Dampffalle 142 kann mit einer kleinen Menge

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konzentrierter Schwefelsäure beschickt sein, so daß Basendämpfe im Gasstrom absorbiert werden und Lösungsmittel in flüssiger Form als Schicht auf der Schwefelsäure schwimmen. Inertes Gas und nichtbasische Dämpfe durchsetzen die Dampffalle 142 und gelangen über die Rohrleitung 144 in die mit Natriumhydroxidlösung gefüllte Dampffalle 146, in welcher Säuredämpfe aus dem Gasstrom zurückgehalten werden. Das Gas gelangt dann über die Rohrleitung 148 in die Aktivkohle enthaltende Dampffalle 150, in welcher im Gasstrom enthaltene organische Dämpfe adsorbiert werden.

Der Umwandlungsteil der Vorrichtung besteht aus einem Vorratsbehälter 152 für Umwandlungsreagenzien wie z.B. verdünnte Säure. Unter Druck stehendes Inertgas wird über eine Rohrleitung 154 zu einem oberhalb des vorbestimmten Flüssigkeitspegelstands im Vorratsbehälter befindlichen Einlaß zugeführt. Eine Rohrleitung 156, welche innerhalb des Vorratsbehälters 152 unterhalb des vorbestimmten Flüssigkeitspegelstands mündet, führt flüssiges Reagenz in einem kontinuierlichen Strom über eine Durchflußdrossel 158 dem Ventil 160 zu. Eine weitere Rohrleitung 162 verbindet das Hauptverteilerrohr 32 mit dem Ventil 160 und ist mit einer regelbaren Durchflußdrossel 164 versehen. Die Ventile 160 und 136 sind über eine Rohrleitung 166 miteinander verbunden. Das Ventil 160 ist verstellbar zwischen einer ersten Betriebsstellung, in welcher nur reines Inertgas durch die Rohrleitungen 162 und strömen kann, und einer zweiten Betriebsstellung, in welcher das im Vorratsbehälter 152 befindliche flüssige Reagenz unter Beaufschlagung durch den in der Rohrleitung 154 herrschenden Gasdruck durch die Rohrleitung 156 in die Rohrleitung 166 gedrückt wird.

Ein Auslaß 168 des Ventils 136 ist oberhalb einer Probenauf nehmestat ion für Prüfröhrchen 170 mit einem zur Aufnahme

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einer Vielzahl senkrecht stehender Prüfröhrchen 170 dienenden Drehkarussell 172 angeordnet. Das Drehkarussell ist vermittels hier nicht dargestellter Vorrichtungen während jedes Durchlaufs synchron zu dem nächsten Prüfröhrchen fortschaltbar. Eine Auslaßgasleitung 174 verbindet den Innenraum des abgeschlossenen Fraktionssammlers 4 6 mit dem Ventil 54. Zwischen dem Ventil 54 und der Vakuumquelle 56 ist eine Auslaßleitung 178 mit einer Durchflußdrossel 180 angeordnet. Ein Druckmesser 184 dient zur Überwachung des im Fraktionssammler herrschenden Drucks. Der Fraktionssammler wird vorzugsweise gegenüber der umgebenden Atmosphäre auf einem geringen Überdruck gehalten, um eine Verunreinigung seiner Inertgasatmosphäre durch Sauerstoff zu verhindern.

Das Ventil 136 ist zwischen zwei Betriebsstellungen verstellbar. In der ersten, in ausgezogenen Linien dargestellten Betriebsstellung tritt die Flüssigkeit über die Rohrleitung 166 in den Fraktionssammler 46 ein. In der Sperrstellung des Ventils 160 kann flüssiges Reagenz aus dem Vorratsbehälter 152 in die Prüfröhrchen 170 und den Fraktionssammler gelangen. In der ersten Betriebsstellung des Ventils 136 wird die vom Ventil 128 zugeführte Flüssigkeit im Nebenstrom am Fraktionssammler vorbeigeführt und durch die hintereinandergeschalteten Dampffallen 142, 146 und 150 aus der Vorrichtung entfernt.

In der in gestrichelten Linien angedeuteten zweiten Betriebsstellung des Ventils 136 wird die über die Rohrleitung 166 zugeführte Flüssigkeit im Nebenstrom am Fraktionssammler vorbeigeführt und verläßt die Vorrichtung durch die vorgenannten Dampffallen. Wenn sich das Ventil 128 in der ersten Betriebsstellung befindet, gelangt der Ausstrom von der Patrone 58 über das Ventil 136 in die Prüfröhrchen 170.

In der ersten Betriebsstellung des Ventils 54, die durch gestrichelte Linien angedeutet ist, strömt Inertgas durch die Rohrleitung 174 in den Fraktionssammler ein. In der zweiten, in ausgezogenen Linien dargestellten Betriebsstellung wird der Fraktionssammler durch die Vakuumquelle 56 entleert.

Die regelbare Durchflußdrossel 164 dient zur Einstellung des Inertgasdurchsatzes durch die Rohrleitung 166, so daß in der Öffnungsstellung der Ventile 136 und 160 das Inertgas durch die Rohrleitungen 162, 166 und 168 in das Prüfröhrchen 170 an der Probenaufnehmestation im Fraktionssammler einströmen und ohne Kavitation oder Verspritzen von Lösungsmittel eine maximale Trocknungsgeschwindigkeit hervorrufen kann.

Die Durchflußdrosseln 158, 88, 90, 92 und 94 dienen zur Drosselung des Flüssigkeitsdurchsatzes aus den entsprechenden Vorratsbehältern. Diese Durchflußdrosseln lassen sich so bemessen, daß sie innerhalb enger Toleranzen einen vorgegebenen Gesamtvolumendurchsatz während einer vorbestimmten Zeitspanne zulassen.

Die regelbaren Durchflußdrosseln 111 und 113 dienen zur Einstellung des Durchsatzes der in Gasphase vorliegenden Reagenzien von den Vorratsbehältern 96 und 98 und gestatten die Bemessung des Durchsatzes unabhängig von der Länge der Abgabezeit.

Aufgrund des Durchflusses durch die Reaktantträgerflache in der Kammer der Patrone 58 ergibt sich ein Fließwiderstand. Die Durchflußdrosseln 111, 113, 88, 90, 92 und 94 sind in ihrem Fließ- oder Durchflußwiderstand derart bemessen, daß dieser wesentlich höher ist als der Fließwiderstand der Patrone 58. Daher sind bei Reihenschaltung der

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Patrone 58 mit einer dieser Durchflußdrosseln die entsprechenden Durchsätze durch die Vorrichtung im wesentlichen unbeeinflußt von unterschiedlichen Fließwiderständen innerhalb der Reaktionskammer, welche durch unterschiedliche Probenansätze bedingt sein können.

Bei der vorstehend beschriebenen Vorrichtung wird zunächst dem Gehäuse 40 Inertgas in einem hohen Durchsatz zugeführt, indem das Absperrventil 44 geöffnet wird, um Sauerstoff aus dem Gehäuse 40 auszutreiben, was beispielsweise dann erforderlich ist, wenn die Patrone 58 ausgetauscht oder das Gehäuse geöffnet worden ist. Das Absperrventil 44 wird dann wieder geschlossen. Im kontinuierlichen Betrieb wird in das Gehäuse 40 kontinuierlich Inertgas über die eine Durchflußdrossel 188 aufweisende Rohrleitung 186 abgegeben. Aufgrund dieser kontinuierlichen Inertgaszufuhr wird das Gehäuse unter einem leichten Inertgasüberdruck gehalten, welcher eine Verunreinigung des Gehäuses durch eindringenden Sauerstoff verhindert.

Der Innenraum des Gehäuses 40 und die in diesem befindlichen Elemente werden beheizt, so daß auch die Reaktionspatrone 58 auf der zur Ausführung der Reaktion gewünschten optimalen Betriebstemperatur gehalten wird. Zu diesem Zweck sind eine Heizvorrichtung 190 und ein zur automatischen Steuerung derselben dienender Temperaturfühler 192 vorgesehen. Zur gleichförmigen Temperaturverteilung innerhalb des Gehäuses wälzt ein Gebläse 194 die inerte Atmosphäre an dem Heizelement der Heizvorrichtung 190 und dem Temperaturfühler 192 vorbei innerhalb des Gehäuses 40 um, so daß sämtliche Komponenten der Vorrichtung gleichmäßig temperiert werden. Auf diese Weise werden auch sämtliche Rohrleitungen vor dem Zuführen von Flüssigkeiten oder Gasen zur Patrone 58 vorgewärmt. Somit weisen auch die Flüssigkeiten und

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Gase die gewünschte Betriebstemperatur auf und tragen dazu bei, daß eine gleichförmige Reaktionstemperatur aufrecht erhalten bleibt. Für die Reaktionskammer innerhalb der Patrone 58 können auch noch weitere Temperaturregelvorrichtungen wie z.B. ein hier nicht dargestellter Heizmantel oder dgl. vorgesehen sein.

Die Arbeitsweise der Vorrichtung ist wie folgt, wobei mit dem ersten Durchlauf des Protein- oder Peptidkettenabbaus begonnen wird. Dieser Durchlauf wird so lange wiederholt, bis ein gewünschter Grad von Protein- oder Peptidabbau erzielt ist.

Vor Beginn des Arbeitsablaufs der automatischen Vorrichtung mit Einlaß P7 wird das Protein oder Peptid in der vorstehend beschriebenen Weise unbeweglich festgelegt und an einer von der Vorrichtung getrennten Stelle in die Reaktionskammer der Patrone 58 eingebracht. Die das unbeweglich festgelegte Protein oder Peptid enthaltende Patrone 58 wird dann abnehmbar an der Vorrichtung an der in Fig. 2 dargestellten Stelle befestigt. Das Gehäuse 40 wird durch öffnen des Absperrventils 44 vermittels des einströmenden Inertgases ausgespült. Nach Schließen des Absperrventils 44 strömt durch die Rohrleitung 186 kontinuierlich Inertgas in das Gehäuse zu und hält dieses auf einem geringen Überdruck. Außerdem werden die Heizvorrichtung 190 und das Gebläse 194 angeschaltet und wälzen das aufgewärmte Inertgas im Gehäuseinneren um, so daß dieses auf einer konstanten Solltemperatur gehalten wird. Die nachstehende Beschreibung ist abgestellt auf die schrittweise Fortschaltung der Einlasse P1 bis P10 am Wählventil 60.

Nulldurchlauf. Viele Proteine und Peptide sind teilweise "blockiert" durch ein chemisches Halbscheid, das kovalent

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mit dem Aminosäurerest in der Weise gebunden ist, daß die Koppelungsreaktion nach dem Edman-Abbau nicht stattfinden kann. In manchen Fällen läßt sich das so gebundene chemische Halbscheid durch eine Behandlung mit Spaltsäure wie z.B. während der normalen Spaltreaktion beim Abbau entfernen. In diesen Fällen werden bei Behandlung der Probe nach dem normalen Abbau entsprechend Edman mit der Koppelungsreaktion beginnend nur die nicht blockierten Aminoendgruppenteile der Probe in die Abbaureaktion des ersten Durchlaufs eingeführt. Der blockierte Anteil wird erst im zweiten Durchlauf abgebaut, nachdem die Blockierung durch die Spaltreaktion des ersten Durchlaufs beseitigt ist, Folglich wird für alle Proben vorzugsweise mit dem Verfahrensschritt 7 des nachstehend beschriebenen Verfahrensgangs begonnen. Dieser Verfahrensschritt, bei dem die Probe den Bedingungen der Spaltreaktion nach dem Edman-Abbau unterworfen ist, wird als "Nulldurchlauf" des Abbaus bezeichnet, und dieser liefert kein Aminosäurederivat im Fraktionssammler, sondern dient lediglich zum Entblockieren von ggf. blockierten Teilen der Probe vor Beginn des ersten Durchlaufs des Edman-Abbaus.

Verfahrensschritt 1
Funktion Bypass
Zeitdauer 1 Sekunde
Durchsatz 10 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in die Position 1 gebracht, in welcher ein Durchstrom aus der Rohrleitung 80 durch den Einlaß P1 in die Patrone 58 erfolgt. Bei dieser Positionsstellung handelt es sich dabei jeweils um diejenige Stellung des Wählventils 60, in welcher nur der Einlaß mit der entsprechenden Zahlbezeichnung offen steht. Für die meisten Proben ist der Vorratsbehälter 64 leer, so daß die Position 1 eine Ersatzleitung darstellt. Beim normalen

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Bypassverfahren wird die Zeitdauer dieses Verfahrensschritts gerade so lang bemessen, um die Umschaltung zur nächsten Position zu gestatten. Die Zeitdauer kann dabei z.B. 1 Sekunde betragen. Eine Funktion dieser Ersatzleitung ist beispielsweise für ein ggf. eingesetztes, gekennzeichnetes Koppelungsreagenz wie z.B. radioaktives PITC für Mikroproben, wie weiter unten erläutert ist. Unter der Annahme, daß der Vorratsbehälter 64 leer ist, befinden sich in Stellung 1 die Ventile 104, 106, 128, 136 und 160 in der Sperrstellung, so daß die folgenden Bedingungen herrschen: Die Vorratsbehälter 96 und 98 sind gegenüber dem übrigen Teil des Systems getrennt, die Ventile 104 und 106 befinden sich in der Bypasstellung und Inertgas tritt in die Rohrleitungen 116 und 118 ein. Das aus der Patrone 58 austretende Gas gelangt über das Ventil 126 zur Rohrleitung und dann durch das Ventil 136 zur Rohrleitung 140 und über die Dampffallen 142, 146 und 150 zur freien Atmosphäre. Das über die Rohrleitung 162 zugeführte Inertgas gelangt über das Ventil 160, die Rohrleitung 166, das Ventil 136 und die Rohrleitung 168 zu dem Prüfröhrchen 170 in der Probenaufnehmestation. Das in dieser Stellung befindliche Prüfröhrchen enthält bei jedem auf den ersten Durchlauf folgenden Durchlauf ATZ-Aminosäureerivat aus dem vorhergehenden Durchlauf. Der Inertgasstrom verdampft das Lösungsmittel, in welchem das Derivat aufgelöst ist. Dieser Zustand der Vorrichtung stellt einen stetigen Betriebszustand dar, der auch bei allen nachfolgenden Verfahrensschritten des Durchlaufs herrscht, sofern nicht anders angegeben ist.

Verfahrensschritt 2

Funktion Bypass

Zeitdauer 1 Sekunde

Durchsatz 100 ml/min

Das Wählventil 60 wird während 1 Sekunde zu Einlaß P2,

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einer weiteren Bypasstellung fortgeschaltet. Inertgas gelangt über die Rohrleitung 116a und durch den Einlaß P2 zur Leitung 62 und zur Patrone 58.

Verfahrensschritt 3

Funktion Abgabe von Koppelungsreagenz Zeitdauer 8 Sekunden
Durchsatz 0,150 ml/min.

Das Wählventil 60 wird auf Stellung 3 fortgeschaltet und läßt Koppelungsreagenz aus dem Vorratsbehälter 66 in einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom durch die Leitung 82 zur Patrone 58 gelangen. Die Zeitdauer dieses Verfahrensschritts von z.B. 8 Sekunden und der Durchsatz von z.B. 0,150 ml/min sind so bemessen, daß eine ausreichende Menge an Koppelungsreagenz in die Patrone zugeführt wird, um die in dieser befindliche Reaktantträgerflache gründlich zu benetzen.

Verfahrensschritt 4a
Funtkion Entfernen von Lösungsmittel Zeitdauer 15 Sekunden
Durchsatz 100 ml/min.

Das Wählventil 60 wird zu Position 4 fortgeschaltet, in welcher Inertgas aus der Rohrleitung 116 durch den Einlaß P4 und die Rohrleitung 62 zur Patrone 58 gelangt. Das Inertgas dient dazu, das während Verfahrensschritt 3 über die Rohrleitung 62 in die Patrone 58 eingeführte flüssige Koppelungsreagenz zur Sättigung der in der Patrone befindlichen Reaktantträgerflache auszutreiben. Der Flüssigkeitsüberschuß wird aus der Patrone ausgetrieben und wird ggf. in der Dampffalle 142 zurückgehalten. Die Inertgaszufuhr wird lange genug fortgesetzt, um das Heptanlösungsmittel von der Reaktantträgerflache zu verdampfen, so daß nur flüssiges PITC auf dieser zurückbleibt.

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Verfahrensschritt 4b
Funktion Zuführen von Koppelungsbase Zeitdauer 585 Sekunden
Durchsatz 2,5 ml/min.

Das Wählventil 60 bleibt in Position 4, jedoch wird das Ventil 104 verstellt und liefert Inertgas über die Rohrleitung 108 in Blasenform durch die im Vorratsbehälter 96 befindliche Koppelungsbase Dimethylamin (in 25 %-iger Lösung in Wasser), so daß das aus dem Vorratsbehälter 96 über die Rohrleitung 112 austretende Inertgas mit der Base gesättigt ist und in dieser Form zur Patrone 58 gelangt. Der Durchfluß von Koppelungsbase durch die Patrone 58 wird so lange aufrecht erhalten, daß sich ein hoch alkalisches Gasmilieu einstellt, in welchem die Koppelungsreaktion stattfinden kann. Die Reaktion wird dabei durch einen hohen Überschuß an Koppelungsbase begünstigt. Da die Koppelungsbase in dampfförmiger Form vorliegt, besteht keine Gefahr einer Auswaschung der Probe aus der Patrone. Die Koppelungsbase wird während einer zur vollständigen Durchführung der Koppelungsreaktion ausreichend langen Zeitspanne zugeführt.

Verfahrensschritt 5a

Funktion Auswaschen der Patrone und Zuführen von Waschlösungsmittel

Zeitdauer 4 Sekunden
Durchsatz 0,52 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in Stellung 5 fortgeschaltet, in welcher Inertgas in der Rohrleitung 76 die Oberfläche des im Vorratsbehälter 68 enthaltenen Waschlösungsmittels Benzol druckbeaufschlagt, so daß ein kontinuierlicher Lösungsmittelstrom durch die Rohrleitung 84, den Einlaß P5 und die Patrone 58 abgegeben wird. Das Waschlösungsmittel löst nicht reagiertes Koppelungsreagenz, Reaktionsnebenprodukte und ggf. zurückbleibende Koppelungsbasendämpfe auf und

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wäscht diese aus. Das Waschlösungsmittel und Abfallprodukte gelangen über das Ventil 126 zur Rohrleitung 138 und dann durch das Ventil 136 in die Rohrleitung 140 und zur Dampffalle 142, in welcher sie aufgefangen und zurückgehalten werden. Gleichzeitg damit wird das Ventil 160 betätigt und läßt Umwandlungsreagenz aus dem Vorratsbehälter 152 unter dem in der Rohrleitung 105 herrschenden Inertgasdruck durch die Rohrleitung 176 und über das Ventil 136 und die Rohrleitung 168 zum Fraktionssammler 46 zuströmen, von welchem es in das Prüfröhrchen 170 in der Probenaufnehmestation gelangt. Nach dem ersten Durchlauf enthält dieses Prüfröhrchen das ATZ-Aminosäurederivat aus dem vorhergehenden Abbaudurchlauf, von welchem das Lösungsmittel verdampft worden ist. Das Umwandlungsreagenz verbleibt im Prüfröhrchen bis zu seiner Verdampfung, welche nach z.B. 20 bis 60 Minuten erfolgt ist, wobei die Umwandlungsreaktion während dieser Zeit erfolgt.

Verfahrensschritt 5b

Funktion Fortsetzen der Patronenwäsche Zeitdauer 56 Sekunden
Durchsatz 0,52 ml/min.

Das Wählventil 60 verbleibt in Position 5 während Waschlösungsmittel aus dem Vorratsbehälter 68 weiterhin der Patrone 58 zugeführt wird. Ventil 160 wird dann in seine Sperrstellung gebracht, wodurch die Zufuhr von Umwandlungsreagenz aus dem Vorratsbehälter 152 beendet wird.

Verfahrensschritt 6a

Funktion Trocknen und Fortschalten des Fraktionssammlers Zeitdauer 10 Sekunden

Durchsatz 100 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in Stellung 6 fortgeschaltet, in welcher Inertgas aus der Rohrleitung 13 die Patrone 58 in

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einem Höchstdurchsatz durchsetzt, so daß Waschlösungsmittel an der Reaktantträgerfläche weggetrocknet wird. Dieser Inertgasstrom wird über das Ventil 128, die Rohrleitung 138, das Ventil 136 und die Rohrleitung 140 zugeführt und durchsetzt die hintereinandergeschalteten Dampffallen. Gleichzeitig damit wird das Drehkarussell in die nächste Drehstellung fortgeschaltet, so daß das in Drehrichtung nächstfolgende Prüfröhrchen sich in der Probenaufnehmestation in einer Position zur Aufnahme des Aminosäurederivats aus dem gerade durchgeführten Abbaudurchlauf befindet.

Verfahrensschritt 6b
Funktion Trocknen
Zeitdauer 50 Sekunden
Durchsatz 100 ml/min.

Das Wählventil 60 verbleibt in Position 6 und Inertgas fließt über die Rohrleitung 120 zur Patrone 58. Durch Verstellen von Ventil 128 wird ein Vakuum über die Leitung am unteren Ende der Patrone 58 angelegt, wodurch die letzten Spuren von Waschlösungsmittel von der Reaktantträgerflache entfernt werden. Dieser Verfahrensschritt ist wahlweise ausführbar und stellt den normalen Punkt für die Unterbrechung des Abbauverfahrens beispielsweise zum Abschalten der Vorrichtung oder dgl. dar, wozu lediglich ein hier nicht dargestellter Schalter betätigt wird.

Verfahrensschritt 7

Funktion Zuführen von Spaltreagenz Zeitdauer 700 Sekunden

Durchsatz 2,5 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in die Position 7 fortgeschaltet, und Ventil 106 verstellt, so daß Spaltreagenz über die Rohrleitung 118 zugeführt werden kann. Das Inertgas durch-

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strömt die Rohrleitung 102, das Ventil 106, die Rohrleitung 110, wird in Blasenform durch das Spaltreagenz TFA abgegeben und durchsetzt dann das Ventil 106, die Rohrleitung 118 und den Einlaß P7. Das in die Patrone 58 eingeführte Inertgas ist dabei mit Spaltreagenz gesättigt. Dieses Reagenz ist eine starke Säure, welche ein saures Gasmilieu zur Ausführung der Spaltreaktion bildet. Das Spaltreagenz kann in hohem Überschuß zugeführt werden, ohne die Reaktion nachteilig zu beeinflussen, so daß dementsprechend die Zufuhr bis zur völligen Durchführung der Spaltung erfolgt.

Verfahrensschritt 8
Funktion Reinigung
Zeitdauer 180 Sekunden
Durchsatz 100 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in Position 8 fortgeschaltet, in welcher es einen Inertgasstrom durch die Rohrleitung und den Einlaß P8 zur Patrone 58 zuführt. Ggf. kann durch Betätigung von Ventil 128 ein Vakuum an die Patrone angelegt werden, um sämtliche Spuren von Spaltreagenz aus der Patrone 58 zu entfernen. Die Reinigung muß dabei sehr gründlich erfolgen, da die Dämpfe des Spaltreagenz zum Niederschlagen in der Patrone auf einer Protein- oder Peptidprobensubstanz neigen. Wenn Spaltreagenz in der Patrone zurückbleibt, kann dieses zu einer Auflösung des Proteins oder Peptids im Extraktionslösungsmittel im nachfolgenden Verfahrensschritt führen, so daß es zur einer Auswaschung kommt. Dabei handelt es sich um einen verhältnismäßig lange andauernden Verfahrensschritt, um eine gründliche Verdampfung von sämtlichem, in der Patrone abgesetztem Spaltreagenz zu erzielen. In Verfahrensschritt wird das Ventil 54 verstellt und läßt unter einem niedrigen Druck stehenden Stickstoff aus der Rohrleitung 48

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durch die Rohrleitung 170 in den Fraktionssammler 46 eintreten, um das Vakuum abzulösen, bevor im nachfolgenden Verfahrensschritt Lösungsmittel in den Fraktionssammler eingeführt wird.

Verfahrensschritt 9

Funktion Extraktion von Aminosäurederivaten Zeitdauer 20 Sekunden
Durchsatz 0,78 ml/min.

Das Wählventil 60 wird in Position 9 fortgeschaltet und das Ventil 136 wird in die durch die strichpunktierten Linien angedeutete Stellung gebracht. Das Extraktionslösungsmittel wie z.B. Äthylazetat wird über Einlaß P9 zur Patrone 58 zugeführt und gelangt durch Rohrleitung 138, Ventil 136 und Rohrleitung 168 zu dem in der Probenaufnehmestation unterhalb der Auslaßleitung 178 des Fraktionssammlers befindlichen Prüfröhrchen 170. Das Ventil 176 bleibt verstellt, so daß der Innenraum des Fraktionssammlers 46 auf einem geringen überdruck gehalten wird und keine Saugwirkung auf das in die Rohrleitung 168 eintretende Extraktionslösungsmittel ausübt. Das während dieses Abbaudurchlaufs erzeugte ATZ-Aminosäurederivat wird beim Durchgang durch die Patrone 58 durch das Extraktionslösungsmittel aufgelöst und in gelöster Form dem Prüfröhrchen zugeführt. Während der übrigen Verfahrensschritte des gerade ausgeführten Durchlaufs und in den ersten vier Verfahrensschritten des nachfolgenden Umlaufs wird das Lösungsmittel aus dem Prüfröhrchen verdampft, so daß am Boden desselben zu Beginn von Verfahrensschritt 5 des folgenden Durchlaufs nur trockenes Aminosäurederivat zurückbleibt.

Verfahrensschritt 10a
Funktion Trocknen
Zeitdauer 10 Sekunden
Durchsatz 100 ml/min.

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Das Wählventil 60 wird in Position 10 fortgeschaltet, in welcher Inertgas aus der Rohrleitung 112 durch den Einlaß P10 in die Patrone 58 gelangt und den größten Teil des in dieser enthaltenen Extraktionslösungsmittels zum Verdampfen bringt.

Verfahrensschritt 10b
Funktion Trocknen
Zeitdauer 50 Sekunden
Durchsatz 100 ml/min.

Das Wählventil 60 verbleibt in Position 10, wohingegen das Ventil 128 verstellt wird, so daß das über die Rohrleitung 134 angelegte Vakuum das Entfernen der letzten Spuren von Extraktionslösungsmittel aus der Patrone unterstützt. Das Anlegen dieses Vakuums ist wahlweise. Damit ist ein vollständiger Abbaudurchlauf beendet. Der nächste Durchlauf beginnt wiederum mit Verfahrensschritt 1.

In Abänderung des Arbeitsgangs kann im Vorratsbehälter ein Koppelungsreagenz vorgesehen werden, das eine radioaktive oder fluoreszierende Kennzeichnung aufweist und somit die Empfindlichkeit für Mikroproben steigert. In diesem Falle ist der in Verfahrensschritt 3 beschriebene Verfahrensgang anwendbar auf Verfahrensschritt 1, und der in Verfahrensschritt 4 beschriebene Verfahrensgang ist anwendbar auf Verfahrensschritt 2. Entsprechende Abänderungen in der Zeitdauer der einzelnen Verfahrensschritte und in den Durchsätzen sind ggf. erforderlich, um diese an die kleineren Probenmengen in der Patrone anzupassen.

Aufgrund der baukastenförmigen Ausbildung der Patrone können mehrere Proben vorab in mehrere Patronen eingefüllt werden und stehen somit nach Beendigung eines Abbaus zum Einsetzen in die Vorrichtung zur Verfügung. Da die Proben

7 ;: ? 3 A 6 / 1 1 0 2

außerhalb der Vorrichtung vorbereitet werden, läßt sich eine Patrone unmittelbar gegen eine neue austauschen, so daß sich praktisch keine Stillstandszeiten ergeben.

Wie ohne weiteres ersichtlich sein dürfte, lassen sich das vorstehend beschriebene Verfahren und die Vorrichtung ohne weiteres abändern, um das System z.B. zur Ausführung einer Peptid- oder Proteinsynthese verwendbar zu machen. Außerdem kann die Vorrichtung ohne weiteres vollautomatisch gesteuert sein.

Das Verfahren nach der Erfindung ist im nachfolgenden anhand mehrerer Ausführungsbeispiele noch weiter veranschaulicht. Die in diesen Beispielen angegebenen Aminosäurefolgen sind ausgedrückt in dem gebräuchlichen 3-Buchstaben-Aminosäurekode wie folgt:

AEC - S-Aminoäthylcystein ALA - Alanin

ARG - Arginin

ASP - Asparaginsäure

ASN - Asparagin

ASX - entweder Asparaginsäure oder Asparagin CYS - Cystein

GLN - Glutamin

GLU - Glutaminsäure

GLY - GIyζin

GLX - entweder Glutaminsäure oder Glutamin HIS - Histidin

ILE - Isoleuzin

LEU - Leuzin

LYS - Lysin

MET - Methionin

PHE - Phenylalanin

PRO - Prolin

SER - Serin

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THR	Threonin
TRP	Tryptophan
TYR	Tyrosin
VAL	Valin
XXX	unbestimmt
Beispiel 1

Ein primäres Aminderivat in Form von XAD-2-Harz wurde wie folgt zur Verwendung als Reaktantträgerflache vorbereitet: 400 g XAD-2-Harz von 0,3 bis 0,8 mm Größe wurden 48 Stunden lang unter Vakuum bei 42 ⁰C getrocknet. Das trockene Harz wurde auf einem Eisbad in 500 ml Chloroform eingerührt, wobei ein Gemisch aus 60 ml Zinnchlorid und 400 g Chlormethyl-Methyläther tropfenweise zugesetzt wurde. Das Zinnchlorid und Chlormethyl-Methyläther-Gemisch wurde über einen Zeitraum von 45 Minuten zugesetzt, wonach das Umrühren auf dem Eisbad noch 1 Stunde lang fortgesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde von dem Harz abgetrennt, und dann wurde das Harz gewaschen, nämlich zweimal mit Dioxan und Wasser im Verhältnis 3:1, zweimal mit Dioxan - 3n HCl im Verhältnis 3:1, zweimal mit Dioxan-Wasser im Verhältnis 3:1, zweimal mit Dioxan-Wasser im Verhältnis 5:1, einmal mit 100 %-igem Dioxan, zweimal mit Dioxan-Methanol im Verhältnis 3:1, einmal mit Dioxan-Methanol im Verhältnis 2:1, zweimal mit Dioxan-Methanol im Verhältnis 1:1, einmal mit Dioxan-Methanol im Verhältnis 1:5 und zweimal mit 100 %-igem Methanol. Anschließend wurde das Harz 24 Stunden lang unter Vakuum bei 85 ⁰C getrocknet. 300 g Harz wurden mit einer zum Bedecken des Harzbetts ausreichend großen Menge Äthylendiamin vermischt und unter gelegentlichem Umrühren bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang absitzen gelassen. Das Harz wurde von dem Äthyldiamin abgetrennt und dreimal mit Wasser, zweimal mit 10 %-iger Ameisensäure, zweimal mit 40 %-iger Ameisensäure, einmal mit 88 %-iger Ameisensäure, viermal mit Wasser, dreimal mit 6n HCl, dreimal mit Wasser

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und zweimal mit Aceton gewaschen und anschließend unter Vakuum bei 70 ⁰C über Nacht getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Primäraminharzhydrochlorid wurde in einer Gewürzmühle gemahlen und wie oben für das unterderivatisierte XAD-2-Harz beschrieben in verschiedene Größenklassen klassiert.

Beispiel 2

16,1 mg S-Aminoäthylinsulin B-Kette wurden in 300 μΐ einer 98 %-igen Ameisensäure aufgelöst und auf 150 mg eines entsprechend Beispiel 1 hergestellten Primäraminharzhydrochlorids von 0,12 bis 0,24 mm Größe trocknen gelassen. 300 μΐ 2M 1-äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimideHCl mit einem pH-Wert von 4,75 wurden zugesetzt, und das Gemisch dann über Nacht bei 4 ⁰C zur Inkubation gebracht, um das Peptid kovalent mit dem Harz zu binden. Die dabei erhaltene Harz-Peptid-Verbindung wurde gewaschen, nämlich zweimal mit Wasser, zweimal mit 0,1n HCl und zweimal mit Methanol, um einen Überschuß an Reagenzien abzuscheiden. Dann wurde die Verbindung unter Vakuum getrocknet. 13,4 mg der angesetzten Menge (angenähert 360 Nanomol) wurden in eine Patrone eingesetzt und vermittels des vorstehend beschriebenen abgeänderten Verfahrensganges für Apomyoglobin sequentiell abgebaut. Die ATZ-Aminosäurederivate wurden mit 6N HCl bei 110 ⁰C 20 Stunden lang hydrolysiert, um freie Aminosäuren zu gewinnen, und die Aminosäuren wurden vermittels eines Aminosäurenanalysators vom Typ DURRUM D500 analysiert, wobei die nachstehend angegebene und mit "EXP." bezeichnete Folge erhalten wurde. Die bekannte Folge ist zu Vergleichszwecken darunterstehend angegeben.

1 5 10

EXP. : PHE-VAL-ASX-GLX-HIS-LEU-AEC-GLY-XXX-HIS-LEU-VAL-GLX-Bekannt: PHE-VAL-ASN-GLN-HIS-LEU-CYS-GLY-SER-HIS-LEU-VAL-GLU-

15 20 25

30

LYS-ALA
LYS-ALA-Ende. 709846/1 102

Beispiel 3

3 mg Spermawalapomyoglobin (sperm whale apomyoglobin) wurden in 30 μΐ 98 %-iger Ameisensäure aufgelöst und auf 15 mg
vernetzter makroporöser Polystyrolkugeln getrocknet. (Die Kugeln bestanden dabei aus XAD-S-Harz der Herstellerfirma Röhm und Haas Co., gemahlen auf eine Korngröße von 0,12
bis 0,24 mm, gewaschen in Methanol und 1-chlorbutan, sowie anschließend getrocknet.) 14,8 mg des Ansatzes (entsprechend angenähert 150 Nanomol) wurden in eine Patrone eingesetzt und vermittels des vorstehend beschriebenen Verfahrensgangs sequentiell abgebaut, wobei dieser jedoch in folgenden Punkten abgeändert war: Verfahrensschritt 3
wurde während eines Zeitraums von 3 Sekunden und mit einem Durchsatz von 0,5 ml pro Minute ausgeführt. Der Verfahrensschritt 4a dauerte 60 Sekunden. Ein zusätzlicher Verfahrensschritt 4c wurde zwischen den Verfahrensschritten 4b
und 5 zwischengeschaltet und bestand in der Reinigung der Patrone in einem Durchsatz von 100 ml/min Stickstoff während eines Zeitraums von 120 Sekunden. Der Verfahrensschritt 6b dauerte 360 Sekunden. Der Verfahrensschritt 7 dauerte 720 Sekunden. Der Verfahrensschritt 9 dauerte 25 Sekunden, wobei anstelle von Äthylazetat als Extraktionslösungsmittel 1-chlorbutan verwendet wurde. Der Verfahrensschritt 10b dauerte 350 Sekunden. Das Ventil 128 wurde in den Verfahrensschritten 4b, 6b , 8 und 10 betätigt, um ein Vakuum an die Patrone 58 anzulegen. Verfahrensschritt 6a wurde ganz weggelassen, so daß die ATZ-Derivate der Aminosäuren nicht zu PTH-Aminosäuren umgewandelt werden konnten. Die ATZ-Aminosäuren wurden mit 6n HCl
20 Stunden lang bei 110 ⁰C zur Rückgewinnung freier Aminosäuren hydrolysiert, und die Aminosäuren wurden vermittels Hochspannungs-Papierelektrophorese analysiert, wobei die
nachstehend angegebene und mit "EXP." bezeichnete Folge
erhalten wurde. Die bekannte Folge von Spermawalapomyoglobin ist zum Vergleich darunterstehend angegeben.

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EXP.: VAL-LEU-XXX-GLX-GLY-GLX-XXX-GLX-LEU-VAL-LEU-HIS-VAL-Bek.: VAL-LEU-SER-GLU-GLY-GLU-TRP-GLN-LEU-VAL-LEU-HIS-VAL-

15 20 25

xxx-ala-lys-val-glx-ala-asx-val-ala-gly-his-gly-glx-asx-iletrp-ala-lys-val-glu-ala-asp-val-ala-gly-his-gly-gln-asp-ile-

30 35 40

leu-ile-arg-leu-phe-lys-xxx-his-xxx-xxx-xxx-xxx-xxx-lys-phe leu-ile-arg-leu-phe-lys-ser-kis-pro-glu-thr-leu-glu-lys-phe-45

ASX-ARG
ASP-ARG

Beispiel 4

15 mg Spermawalapomyoglobin wurden in 300 μΐ 98 %-iger Ameisensäure aufgelöst und auf 120 mg Glas vorgegebener Porengröße getrocknet,(Bei diesem Glas handelte es sich um Glas des Typs Corning CPG 10-700 vorgegebener Porengröße der Firma Corning Biomedical Products Department, Medfield, Mass. V.St.A..) Eine nachfolgend ausgeführte Aminosäurenanalyse zeigte, daß ein Millgramm des Ansatzes 5,72 Nanomole Protein enthielt. 2,6 mg (entsprechend 15, 8 Nanomol) des Ansatzes wurden in eine Patrone 58 für sequentiellen Abbau gegeben. Da diese Menge die Patrone nicht ausfüllte, wurde der verbleibende Patroneninnenraum mit zwei zylindrischen Glasstäben ausgefüllt, welche die Patronenbohrung gerade ausfüllten, wobei noch genügend Zwischenraum für den freien Durchfluß von Gasen und Flüssigkeiten verblieb. Die in der Patrone enthaltene Probe wurde vermittels des vorstehend beschriebenen Abbauverfahrens sequentiell abgebaut, wobei die folgenden Abänderungen vorgenommen wurden: Der Vorratsbehälter 64 wurde mit einem radioaktiv gekennzeichneten Koppelungsreagenz aus 0,33 Vol.-% 35-S-PITC in Heptan gefüllt. Der Verfahrensschritt 1 entsprach einer Zeitdauer von 1 Sekunde, bei einem Durchsatz von 0,150 ml pro Minute, wobei das radioaktive Koppelungsreagenz zur Patrone zugeführt wurde. Der Verfahrensschritt 2 wurde durch die Verfahrensschritte. 2b und 2b ersetzt, welche den Verfahrensschritten 4a und 4b entsprechen, mit der Ausnahme,

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daß die Zeitdauer für Verfahrensschritt 2b nur 298 Sekunden betrug. Der Verfahrensschritt 3 wurde auf 1 Sekunde Zeitdauer begrenzt. Der Verfahrensschritt 4a betrug 2 Sekunden, und das Ventil 128 wurde verstellt, um während dieses Verfahrensschritts ein Vakuum an die Patrone anzulegen. Die Zeitdauer von Verfahrensschritt 4b betrug 598 Sekunden. Die Zeitdauer von Verfahrensschritt 6b betrug 80 Sekunden. Die Zeitdauer von Verfahrensschritt 9 betrug 85 Sekunden, bei einem Durchsatz von 0,30 ml/min. Die Zeitdauer von Verfahrensschritt 10a betrug 90 Sekunden, und Verfahrensschritt 10b wurde weggelassen. Die PTH-Aminosäuren wurden durch Dünnschichtchromatografie analysiert, und die radioaktiven Derivate wurden durch Autoradiografie ermittelt, wobei die folgende, als "EXP." bezeichnete Reihenfolge erhalten wurde. Die bekannte Reihe von Spermawalapomyoglobin ist darunterstehend zu Vergleichszwecken angegeben.

5 10

EXP.:VAL-LEU-XXX-GLU-GLY-GLU-TRP-GLN-LEU-VAL-LEU-HIS-VAL-Bek.:VAL-LEU-SER-GLU-GLY-GLU-TRP-GLN-LEU-VAL-LEU-HIS-VAL-

15 20 25

trp-ala-lys-val-glu-ala-asp-val-ala-gly-his-gly-gln-asp-iletrp-ala-lys-val-glu-ala-asp-val-ala-gly-his-gly-gln-asp-ile-

30 35 40

leu-ile-arg-leu-phe-lys-xxx-his-pro-glu-xxx-leu-glu-lys-pheleu-ile-arg-leu-phe-lys-ser-his-pro-glu-thr-leu-glu-lys-phe- 45

HIS-ARG
HIS-ARG

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Claims

Patentansprüche :

Verfahren zum sequentiellen Abbau von Protein- oder Peptidketten in einer Reaktionskammer durch aufeinanderfolgende Koppelungs- und Spaltreaktionen, dadurch gekennzeichnet , daß

a) die Protein- oder Peptidketten auf einer in der Reaktionskammer angeordneten Reaktantträgerflache unbeweglich festgelegt werden,

b) ein Koppelungsreagenz mit den Protein- oder Peptidketten chemisch gekoppelt wird und

c) ein Spaltreagenz enthaltender Dampfstrom während einer zur Abspaltung von Aminosäurederivaten von den gekoppelten Protein- oder Peptidketten ausreichend langen Zeit unter Druck durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unter Druck durchgeleitete Dampfstrom aus von einem inerten Trägergas mitgeführten Spaltreagenzdämpfen gebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mitnahme des Spaltreagenz von dem Trägergasstrom durch Durchleiten des Gasstroms in Blasenform in flüssiges Spaltreagenz erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Festlegung entsprechend Verfahrensschritt a) durch nichtchemische Sorptionsablagerung der Protein- oder Peptidketten auf der Reaktantträgerflache erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekenn zeichnet, daß als Spaltreagenz eine wasserfreie Säure eingesetzt wird.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß

d) im Anschluß an Verfahrensschritt c) ein zum Extrahieren und Abziehen der abgespaltenen Aminosäurederivate dienendes, flüssiges Extraktionsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionslösungsmittel von einer unter Druck stehenden Inertgasquelle unter Druck in die Reaktionskammer eingeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Verfahrensschritten b) und c) die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden, nämlich daß

e) zum Abführen von nicht umgesetztem Koppelungsreagenz und anderer Verunreinigungen von der Reaktantträgerfläche ein flüssiges Waschlösungsmittel durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird und

f) zur wenigstens teilweisen Trocknung der Reaktantträgerfläche ein unter Druck stehender Strom inerten Trägergases durch die Reaktionskammer durchgeblasen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaktantträgerflache von makroporöser Beschaffenheit eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die makroporöse Reaktantträgerflache aus einem Material gebildet wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus vernetztem Polystyrol mit Makronetzstruktur und dessen Derivaten, sowie makroporösem Glas und dessen Derivaten.

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11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktantträgerflache aus einem im Weg des die Reaktionskammer unter Druck durchströmenden Dampfstroms angeordneten Teilchenbett gebildet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausführung von Verfahrensschritt b) in der Weise erfolgt, daß

1) das Koppelungsreagenz in Berührung mit den festgelegten Protein- oder Peptidketten durch die Reaktionskammer durchgeleitet und

2) ein Koppelungsbasendampf enthaltender, unter Druck stehender Dampfstrom zur Erzielung eines basischen Milieus für die Koppelung des in Berührung mit den festgelegten Protein- oder Peptidketten stehenden Koppelungsreagenz durch die Reaktionskammer durchgeleitet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Koppelungsbase durch Durchleiten des Gasstroms durch die flüssige Koppelungsbase von dem Trägergasstrom mitgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Koppelungsreagenz in flüssiger Form durch die Reaktionskammer durchgeleitet, und die Koppelungsbase in Berührung mit den durch die Koppelungsbase nassen Protein- oder Peptidketten gebracht wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß die unbewegliche Festlegung in Verfahrensschritt a) durch nichtchemische Sorptionsablagerung der Protein- oder Peptidketten erfolgt.

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16. Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 15, gekennzeichnet durch

a) eine feststehende Durchfluß-Reaktionskammer (58),

b) eine in der Reaktionskainmer angeordnete, zur Aufnahme einer unbeweglich festgelegten Probensubstanz dienende Reaktantträgerflache,

c) zum Zuführen von unter Druck stehendem Gas zur Reaktionskammer dienende Vorrichtungen (30-40, 100, 104, 116, 120, 106, 118, 121, 122) und

d) eine Ventilbaugruppe (60) mit einem zwischen Öffnungsund Schließstellung verstellbaren, zwischen den zum Zuführen eines Druckgasstroms dienenden Vorrichtungen und der Reaktionskammer angeordneten ersten Ventil.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktantträgerflache starr und in makroporöser Beschaffenheit ausgebildet ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe an der Reaktantträgerflache nicht-chemisch adsorbiert ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die makroporöse Trägerfläche aus in der Reaktionskammer zurückgehaltenen Teilchen gebildet ist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Oberflächen-Volumen-Verhältnis des makroporösen Trägerflächenmaterials über 100:1 beträgt.
21. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das makroporöse Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus agglomerierten Polystyrol-

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teilchen und porösem Glas.
22. Vorrichtung nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen zur Aufnahme von flüssigem Reagenz dienenden ersten Vorratsbehälter (96) mit einem mit den zum Zuführen eines Druckgasstroms dienenden Vorrichtungen verbundenen Einlaß (108), der unterhalb eines vorbestimmten ersten Reagenzflüssigkeitpegelstands mündet, und einem mit dem ersten Ventil verbundenen Auslaß (112), der oberhalb dieses Pegelstands mündet, wobei ein Teil des Reagenz in dampfförmiger Form von dem Dampfstrom mitführbar und in der Öffnungsstellung des ersten Ventils durch den Auslaß hindurch in die Reaktionskammer abgebbar ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, gekennzeichnet durch

e) einen zur Abgabe von flüssigem Reagenz dienenden zweiten Vorratsbehälter (98) mit einem mit den zum Zuführen eines Druckgasstroms dienenden Vorrichtungen verbundenen aufstromseitigen Einlaß und einem mit der Reaktionskammer verbundenen abstromseitigen Auslaß, und

f) ein in der Ventilbaugruppe zwischen öffnungs- und Schließstellung verstellbares, zwischen dem zweiten Vorratsbehälter und der Reaktionskammer angeordnetes zweites Ventil (106).
24. Vorrichtung nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen zur Aufnahme von flüssigem Reagenz dienenden ersten Vorratsbehälter (64) mit einem mit den zum Zuführen eines Druckgasstroms dienenden Vorrichtungen verbundenen Einlaß (72) , der oberhalb eines vorbestimmten Reagenzflüssigkeitpegelstands mündet, und einem mit dem ersten Ventil verbundenen Auslaß, der unterhalb dieses Pegelstands mündet, wobei das Reagenz in der Öffnungsstellung des ersten Ventils unter Druckgasbeaufschlagung in

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flüssiger Form durch den Auslaß abgebbar ist.
25. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer aus einem schnell abnehmbar und nicht drehbar an der Vorrichtung befestigten Behälter (58) besteht.
26. Vorrichtung nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen zum Auffangen von Flüssigkeit dienenden und über eine Rohrleitung mit der Reaktionskammer verbundenen, abgeschlossenen Flüssigkeitssammler (46).
27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Flüssigkeitssammler (46) über eine Rohrleitung (166) mit den zum Zuführen eines Druckgasstroms dienenden Vorrichtungen verbunden und auf einem Gasüberdruck haltbar ist.

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