DE3788169T2

DE3788169T2 - Geräte und Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Aminosäuren.

Info

Publication number: DE3788169T2
Application number: DE87304996T
Authority: DE
Inventors: William Jack Kohr
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2007-06-06
Also published as: JPS6325555A; ATE97494T1; DE3788169D1; EP0257735B1; EP0257735A2; EP0257735A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz von Polypeptiden und Proteinen sowie Geräte zur Durchführung solcher Bestimmungen.
Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Proteinsequenzanalyse ist der Edman-Abbau zum sequentiellen Entfernen von Aminosäureresten. Bei diesem Schema werden Aminosäuren in einem zweistufigen chemischen Verfahren vom N-Terminus des Peptids her entfernt. Der Vorgang für eine Spaltung ist unten dargestellt. (Kopplung) (Spaltung) (Neuanordnung) (über Anfangszyklus freigesetzte PTH-Aminosäure)
Im ersten Schritt wird eine Aktivierungsgruppe, die als Kopplungsreagens bezeichnet wird und im obigen Diagramm durch Phenylisothiocyanat dargestellt ist, an die freie Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure des Polypeptids angeknüpft, dessen Sequenz zu bestimmen ist. Dieser Schritt wird als Kopplung bezeichnet und wird in einem Puffer durchgeführt, der eine Kopplungsbase mit hohem pH-Wert (pH 8-9) enthält. Beim Edman-Prozeß wird typischerweise Phenylisothiocyanat (PITC) als Kopplungsreagens verwendet. Andere Reagenzien, wie Methylisothiocyanat oder Pentafluorphenylisothiocyanat, sind verwendet worden1,2. Die Funktion der Kopplungsreaktion besteht darin, die Peptidbindung zwischen den ersten und zweiten Resten leichter säurehydrolysierbar zu machen als irgendeine der anderen Peptidbindungen im Protein. Nach dem Entfernen von überschüssigem Kopplungsreagens und Puffer besteht der zweite Schritt in der Hinzufügung eines Spaltungsreagens, wasserfreier Säure, um diese aktivierte Peptidbindung zu hydrolysieren. Das abgespaltene Aminosäurederivat kann dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Der Peptidrest mit dem neu gebildeten N-Terminus wird für darauffolgende Zyklen zurückgelassen. Das extrahierte Derivat enthält Information über die Identität des anfänglichen N-terminalen Restes, da die Aminosäure in seiner Struktur enthalten ist. Durch Differenzierung der etwa 20 Derivate auf der Basis ihrer Seitenkette (R&sub1;) kann das nach jeder Spaltung gebildete Derivat identifiziert und die Aminosäure festgestellt werden. Wenn dieses Verfahren wiederholt wird, kann jeder nachfolgende Rest ideal bestimmt werden. Jedoch ist es nicht praktisch, sich wiederholende chemische Reaktionen unendlich oft durchzuführen, da die Kopplungs- und Spaltungsreaktionen nie eine 100%ige Ausbeute erreichen. Obwohl die gekoppelte N-terminale Peptidbindung mehr für Säurehydrolyse anfällig ist als irgendeine andere Bindung, kann und wird zufällige Spaltung auftreten.
Der Edman-Prozeß ist bei manuellen Verfahren und bei automatisierten Verfahren zur Aminosäuresequenzbestimmung verwendet worden.
Die manuellen Verfahren werden am häufigsten zur Sequenzbestimmung kleiner Peptide oder kurzer Proteinabschnitte verwendet, oder wenn die Kosten für einen automatischen Sequenzierer nicht zu rechtfertigen sind. Es sind viele solche Verfahren berichtet worden3,5. Bei den meisten Ansätzen wird das Protein oder Peptid zuerst auf einen Träger, wie einen Papierstreifen, aufgetragen. Nachdem die Probe getrocknet ist, wird Phenylisothiocyanat in einem Lösungsmittelpuffersystem (d. h. Dioxan oder Pyridin usw.) in das immobilisierte Peptid eingebracht. Zum Abschließen der Kopplungsreaktion können mehrere Stunden bei 40-50ºC erforderlich sein. Bei diesem Schritt ist es wichtig, daß Sauerstoff ausgeschlossen wird, um Blockierung des N-Terminus über Nebenreaktionen zu verhindern. Nachdem das Koppeln abgeschlossen ist, werden die überschüssigen Reagenzien (PITC usw.) und Nebenprodukte (d. h. Diphenylthioharnstoff) ohne den Verlust von PTC(Phenylthiocarbamyl)-Peptiden entfernt. Für diesen Schritt sind mehrere Lösungsmittelsysteme vorgeschlagen worden (z. B. Benzol, Alkohol-Ather)&sup6;. Die Extraktion mit Benzol alleine, um diese Nebenprodukte zu entfernen, ist langsam, entfernt aber keine gekoppelten Peptide.
Entweder Athylacetat oder eine Alkohol-Ather-Mischung eignet sich besser zum Entfernen der Nebenprodukte, aber diese extrahieren auch kleine hydrophobe Peptide.
Nach der ersten Wäsche wird das PTC-Peptid in die Thiazolinonaminosäure und ein freies Peptid gespalten. Da unter wässerigen Bedingungen die Spaltung innerer Peptidbindungen auftreten kann&sup7;, ist bei den meisten Verfahren wasserfreie Säure, wie Trifluoressig- oder Heptafluorbuttersäure, erforderlich. Während dieses Schritts wird die Reaktion bei einer geringeren Temperatur als beim Koppeln durchgeführt, und Wasser wird aus der Probenkammer ausgeschlossen. Die Spaltung gekoppelter Reste ist bei Prolyl- oder Glycylresten schwieriger, und diese können eine höhere Temperatur oder einen längeren Reaktionszeitraum erfordern. Übermäßig heftige Hydrolysebedingungen an diesem Punkt können zu falscher Spaltung innerer Peptidbindungen führen.
Im letzten Schritt wird die 2-Anilino-tert.-thiozolinonaminosäure (ATZ) mit Benzol und Athylaceat extrahiert. Der Phasentransfer ist bei den meisten Aminosäurederivaten mit Ausnahme von ATZ-Arg und ATZ-His quantitativ. Athylacetat alleine ergibt bessere Extraktion von ATA-Arg und ATZ-His, kann aber auch kleine hydrophobe Peptide extrahieren. Aceton stellt einen zufriedenstellenden Kompromiß dar, wenn alle Spuren von Wasser und dem Säurespaltungsreagens zuvor durch Trocknen im Vakuum entfernt erden. Die extrahiere ATZ-Aminosäure ist instabil und muß durch wässerige Hydrolyse in die stabile PTH(3-Phenyl-2-thiohydantoin)-Form umgewandelt werden. Das Edman-Verfahren wird allgemein verwendet. Die Umwandlungsreaktion besteht in der Hydrolyse des Thiazolinons zur PTC-Aminosäurezwischenverbindung, gefolgt von Umgruppierung in die PTH-Form. Der Benzol/Athylacetat-Extrakt wird unter Stickstoffstrom zur Trockene verdampft und dann in verdünnter HCL aufgelöst. Die Temperatur wird rasch auf 80ºC gebracht und 10 Minuten lang beibehalten, dann gesenkt. Die Lösung wird getrocknet und in einem kleinen Puffervolumen aufgelöst, woraufhin das PTH-Aminosäurederivat analysiert wird.
Im allgemeinen wird die Aminosäuresequenzbestimmung nach automatisierten Verfahren in Geräten durchgeführt, die für diesen Zweck bestimmt sind. Die bei solchen automatisierten Verfahren eingesetzte Chemie ist im Grunde die gleiche wie die beim manuellen Verfahren verwendete. Gegenwärtige automatische Sequenzierer basieren entweder auf Flüssigphasen (Zentrifugierschalen)- oder Gasphasenkonstruktionen. Bei den Flüssigphaseninstrumenten wird Proteinprobe als ein dünner Film auf der Innenwand einer rotierenden Reaktionsschale verteilt. Das Protein wird immobilisiert, während in die Reaktionsschale am Boden eingebrachte flüssige Edman-Reagenzien sich durch Zentrifugalkraft nach oben über den Proteinfilm bewegen. Flüssigkeiten werden von der Oberseite der Schale durch einen Löffel entfernt, der in eine Rille um die Oberseite der Schale ragt.
Eine Beschreibung des Zentrifugierschalensequenzierers findet sich in der Originalpublikation von Edman und Begg&sup7;. Beim Betrieb eines solchen Sequenzierers wird eine Lösung der Probe in die Schale einbracht und im Vakuum getrocknet, während die Schale sich dreht, wodurch ein dünner Film an den unteren Wänden der Schale gebildet wird. Die Probenmenge beträgt im allgemeinen um 100 bis 300 nmol Probe, aufgelöst in etwa 500 ul des entsprechenden Lösungsmittels. Nachdem die Probe getrocknet worden ist, wird der automatische Zyklus in Gang gesetzt.
Der erste Schritt ist das Einbringen von Kopplungsreagens (5% PITC in Heptan) und Puffer in die Zentrifugierreaktionsschale. Der Puffer enthält im allgemeinen N,N-Dimethyl-N-allylamin (DMAA), um den alkalischen pH-Wert aufrechtzuhalten, der für die Kopplungsreaktion erforderlich ist. Ein geeigneter Puffer, der DMAA und ein Detergens enthält, wird unter dem Markennamen Quadrol verkauft. Die Kopplungsmischung verteilt sich über den Proteinfilm und löst ihn auf. Die darauffolgende Reaktion läuft für etwa 20 Minuten bei 55ºC ab. Nach dem teilweisen Entfernen von PITC und
Lösungsmittel durch Vakuum wird die Kopplungsreaktion durch das Einbringen von Benzol zum Stillstand gebracht. Das Benzol fällt das Protein aus und führt das überschüssige PITC-Reagens und einige der Zerlegungsprodukte von PITC ab. Wenn Quadrol als Puffer verwendet wird, wird die Schale mit Athylacetat gewaschen, um überschüssigen Puffer und mehr von den Zerlegungsprodukten zu entfernen. Nach dem Vakuumtrocknen verbleibt das Protein als weißer Film in der Schale.
Wasserfreie Heptafluorbuttersäure (HFBA) wird zugegeben, um die Spaltung einzuleiten. Die flüchtige HFBA bedeckt und löst den Proteinfilm, und nach nur zwei bis drei Minuten wird die N-terminale Aminosäure als das Anilinothioazolinonderivat abgespalten. Schließlich wird das verbleibende HFBA durch Vakuum entfernt, dann wird die frei gesetzte ATZ-Aminosäure mit Butylchlorid extrahiert und an einen Fraktionssammler abgegeben. Bei jedem Zyklus des obigen Verfahrens wird ein neuer Rest an den Fraktionssammler abgegeben.
Die gesammelten Fraktionen der ATZ-Aminosäuren stellen nun die sequentielle Reihenfolge von Aminosäureresten dar, die die Peptid- oder Proteinprobe enthält. Die Fraktionen können in die stabileren PTH-Aminosäureprodukte umgewandelt werden. Die Lösung wird 10 Minuten lang in 1,0M HCl bei 80ºC oder 25% TFA (Trifluoressigsäure) in H&sub2;O bei 60ºC erwärmt. Nach der Abfuhr der Wärme können alle PTH-Aminosäurederivate mit Ausnahme von PTH-Arg und PTH-His mit Athylacetat extrahiert werden. Flüssigkeitschromatographieanalyse in diesem Stadium ist vorteilhaft, da nicht die Notwendigkeit besteht, die beiden Phasen zu trennen: Alle vorhandenen PTH-Aminosäuren können in einer einzelnen Injektion bestimmt werden. Zum Zweck der Vorkonzentration wird die Fraktion üblicherweise bei niedriger Temperatur vor der Chromatographie zur Trockene gebracht.
Der Zentrifugierschalensequenzierer unterliegt den Nachteilen, daß die Abgabe präzise kalibrierter Reagensmengen erforderlich ist, weil Protein sonst leicht aus der Schale gewaschen wird, das Protein kontinuierlich durch aufeinanderfolgende Ausfällungs- und Resolubilisierungszyklen geführt werden muß, was zu Proteinverlust und Denaturierung führt, und Extender wie Polybrene oder blockierte Proteine häufig erforderlich sind, um die Ausfällung der Testprobe zu unterstützen. Der Nachteil von Extendern auf Proteinbasis besteht darin, daß sie während Edman-Abbau-Zyklen häufig hydrolysiert werden. Diese hydrolysierten Extender enthalten freie Aminotermini, die gemeinsam mit der Testprobe sequenziert werden, wodurch in die Bestimmung störende Reste Eingang finden.
Automatische Festphasensequenzierer führen den Edman-Abbau an Peptiden weitgehend auf die gleiche Art wie Flüssigphasensysteme durch, mit der Ausnahme, daß das Peptid durch kovalente Bindung an ein festes Trägermateial immobilisiert ist und und keinen Solubilisierung- und Ausfällungszyklen unterworfen wird. Reagenzien und Lösungsmittel werden wie erforderlich in einer Richtung durch eine Säule aus gebundenem Peptid gepumpt. Bei diesem Sequenzierertyp muß das Probenpeptid zuerst kovalent an das Stützmaterial gebunden werden. Es sind mehrere Verfahren zur Erreichung dieses Ziels berichtet worden. Beim verläßlichsten Kopplungsverfahren wird die &epsi;-Aminogruppe von Lysin¹&sup0; oder ein C-terminales Homoserin¹&sup5; verwendet. Die Kopplungsausbeuten betragen üblicherweise bis zu etwa 80%, aber das Peptid muß Lysin oder eine C-terminale Carboxylgruppe¹&sup6; enthalten. Die beiden allgemein verwendeten Typen fester Träger zur kovalenten Kopplung sind Polystytrol¹&sup7; und poröses Glas¹³. Beide sind in hohem Maß mit funktionellen Gruppen substituiert und gegenüber den beim Sequenzieren verwendeten Reagenzien und Lösungsmitteln inert. Kleine Peptide, die Lysin enthalten, werden üblicherweise nach dem Diisothiocyanat-Kopplungsverfahren an das Aminopolystyrol gebunden. Peptide ohne Lysin werden durch Carboxylaktivierung an Triäthylentetraminharz gebunden. Große Peptide und Proteine werden nach der Aktivierung mit Diisothiocyanat an Aminoglasträgern fixiert¹&sup8;.
Nach der Peptidanfügung wird das Harz gewaschen und in eine kleine Glassäule gepackt. Die Reaktionssäule wird dann in einer erwärmten Halterung im Sequenzierer angeordnet. Ab diesem Punkt folgt das Festphaseninstrument weitgehend dem gleichen chemischen Verfahren wie das manuelle und das Zentrifugierschalenverfahren, mit der Ausnahme, daß eine weitere Palette von Reagenzien, Puffer und Lösungsmittel durch die Säule geschickt werden kann, ohne daß die Gefahr des Auswaschens des kovalent gebundenen Peptids besteht. Die routinemäßig verwendeten Festphasensequenzierungschemikalien sind: PITC (5 Vol-% in Acetonitril, Pyridin:N-Methylmorpholiniumtrifluoracetatpuffer (Volumsverhältnis 2 : 3) und Trifluoressigsäure. Athylendichlorid und Methanol werden als Lösungsmittel verwendet. Fraktionen der ATZ-Aminosäuren werden in einem Fraktionssammler gesammelt und später entweder manuell oder automatisch wie oben beschrieben in das PTH-Aminosäurederivat umgewandelt.
Der Festphasensequenzierer unter Verwendung kovalenter Immobilisierung des Testproteins hat niemals weitverbreitete kommerzielle Akzeptanz gefunden. Das ist vorwiegend das Ergebnis der Art der kovalenten Immobilisierung, die spezialierte Bedingungen für jedes Polypeptid erfordert und zu Proteinverlusten führt.
Der Gasphasensequenzierer ist insofern mit dem Festphasensequenzierer verwandt, als er vorimmobilisiertes Polypeptid verwendet. Jedoch wird bei diesem System, anstatt Peptidverlust durch kovalente Immobilisierung zu vermeiden, eine gasförmige Form des alkalischen Puffer-Kopplungsreagens verwendet, um die Eluierung nicht-kovalent adsorbierten Polypeptids zu vermeiden. Der Gasphasensequenzierer hat beträchtlichen kommerziellen Erfolg genossen und verdrängte sowohl den Zentrifugierschalen- als auch den Festphasensequenzierer.
Eine frühe Version eines Gasphasensequenzierers wird in der US-PS-4,065,412 beschrieben. Ein kommerzieller Sequenzierer, der auf dem in diesem Patent beschriebenen System basiert, wird von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, verkauft. Bei diesem System wird das Protein oder Peptid nichtkovalent auf einer Glasfaserscheibe abgelagert, die einen Proteinextender (Polybrene) enthält. Das Protein und der Extender bilden einen immobiliserten Film an der Glasfaserscheibe, die in einer kleinen Glaskammer gehalten wird. Gasförmige und flüssige Edman-Regenzien treten durch eine kleine Öffnung an der Oberseite der Kammer ein und durch den Boden aus.
Das Kopplungsreagens wird in einem organischen Lösungsmittel (Heptan) hinzugefügt, welches das Peptid nicht verdrängt. Die Kopplungsreaktion tritt nach dem Benetzen der gesamten Oberfläche der Glasscheibe mit der Kopplungsreagenslösung und dem Abtrocknen des organischen Lösungsmittels auf. Die Reaktion wird in Gang gesetzt, indem die gasförmige Kopplungsbase Trimethylamin (TMA) eingebracht wird. Der Dampfstrom von Kopplungsbase und Wasserdampf erhöht den pH-Wert des Proteinfilms. Im Gegensatz zum Zentrifugierschalensequenzierer ist die Probenkammer klein und einfach. Da es keine flüssige Pufferlösung gibt, können bestimmte Peptide ohne kovalentes Anbinden sequenziert werden. Jedoch ist es dazu erforderlich, daß das Kopplungsreagens in einem organischen Lösungsmittel hinzugefügt wird und daß die Kopplungsbase in einem getrennten Schritt eingebracht wird. Weiters besteht ein Nachteil der Verwendung der gasförmigen Kopplungsbase darin, daß die Reaktion nicht so leicht gesteuert werden kann, wie bei einer flüssigen Pufferlösung. In der Lösung beträgt der optimale pH-Wert etwa 9,0. Bei einem pH-Wert über 9,5 beginnt das Kopplungsreagens rascher mit Wasser zu reagieren, um Nebenprodukte (Anilid und Diphenylthioharnstoff) zu bilden. Bei höheren pH-Werten kann der Abbau des Peptids oder Proteins zu einem Problem werden, wie in der obengenannten US-PS-4,065,412 beschrieben. Um den pH-Wert an der Reaktionsoberfläche wirksam zu steuern, muß die Durchflußrate der gasförmigen Phase ebenso wie die Konzentration der Base (z.b. TMA) in der gasförmigen Atmosphäre präzise gesteuert werden. Diese Anforderung hinsichtlich präziser Steuerung oder Durchflußraten und Konzentrationen führt zu einem sehr komplexen und kostspieligen Instrumentarium, das hochgeschultes Bedienungspersonal erfordert. Temperaturregelung des gesamten Instrumentariums ist erforderlich, um präzise kalibrierte Reagensaliquote zu gewährleisten.
Ein weiterer Nachteil des Gasphasensystems besteht in der Anforderung, daß Polybrene (z. B. in Mengen von 1-2 mg) verwendet wird, um das Protein auf der kleinen Glasscheibe zu halten. Jedoch hält Polybrene auch Nebenprodukte wirksamer zurück. Es ist berichtet worden, daß kovalent gebundene Peptide, wenn sie in einem Gasphasensequenzierer ohne die Verwendung von Polybrene sequenziert werden, viel weniger des Nebenproduktpeaks erzeugen¹&sup9;. Große Mengen an Nebenproduktpeaks können die Identifizierung einiger Aminosäurederivate erschweren.
Ein weiterer Nachteil der Durchführung der Reaktion an der Oberfläche des Gasphasensequenzierers mit wenig oder keinem wässerigen Lösungsmittel besteht darin, daß geringe Mengen an Salzen, Denaturierungsmitteln wie Harnstoff, oder Pufferionen, die von der Testprobe abgelagert werden, die Reaktion des alpha-Aminos des N-terminalen Restes stören können, oder die Lösungsmittelextraktion von Aminosäurederivaten zur Identifizierung oder das Auswaschen unerwünschter Nebenprodukte stören können.
Ein weiterer Nachteil des Gasphasensequenzierers besteht darin, daß, nachdem die Kopplungsreaktion abgeschlossen ist, der gesamte verbleibende Wasserdampf durch Trocknung mit einem Inertgas entfernt werden muß. Dann werden die Nebenprodukte entfernt, indem ein organisches Lösungsmittel durch die die Scheibe haltende Kammer durchfließen gelassen wird. Es ist wichtig, daß das Durchfließen von Lösungsmittel präzise gesteuert wird, damit kein immobilisiertes Protein aufgelöst oder verdrängt wird. Da das Durchfließen nur in einer Richtung erfolgt und es bei dem Verfahren keinen Schritt der Filmwiederbildung gibt, wird alles aufgelöste Peptid bei der Wäsche verloren.
Es ist seit ziemlich langer Zeit üblich, die Testproben zur Aminosäuresequenzierung durch das Trennen der Polypeptide voneinander oder von Verunreinigungen durch die Verwendung von Dialysemembranen oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie herzustellen. Jedoch haben solche Verfahren nicht in Aminosäuresequenziervorrichtungen Eingang gefunden, und sie werden tatsächlich als unerwünscht betrachtet, da sie zu einem Verlust an Probe führen.
Demgemäß ist es wünschenswert, daß die vorliegende Erfindung einen Sequenzierer schafft, der weniger kostspielig ist als die Sequenzierer nach dem Stand der Technik, da er keine feingeeichten Fluid- oder Gasabgabesysteme oder Temperaturregelung des gesamten Instrumentariums erfordert.
Es ist weiter wünschenswert, daß die Erfindung einen Sequenzierer schafft, der einfacher zu verwenden ist als die Systeme nach dem Stand der Technik, wodurch es ungeschulten Personen ermöglicht wird, den Sequenzierer zu bedienen.
Es ist auch wünschenswert, einen Sequenzierer zu schaffen, der zu einer prozentuell höheren Ausbeute bei Wiederholung fähig ist als bisher erreichbar, und der somit für eine größere Anzahl von Zyklen verwendet werden kann als Systeme nach dem Stand der Technik.
Es ist weiters wünschenswert, daß die Erfindung einen Sequenzierer schafft, der bei verunreinigten Peptiden verwendet werden kann, die nicht zuvor gereinigt worden sind. Das verhindert Proteinverluste in Probenpräparaten und Wiedergewinnungsverfahren, die bisher bei herkömmlichen Sequenzierern verwendet worden sind. Das bedeutet, das über das kombinierte Verfahren von Probenherstellung und Sequenziererbetrieb weitaus weniger Polypeptid erforderlich ist, um die Aminosäuresequenz zu erhalten.
Es ist auch wünschenswert, ein System zu schaffen, das eine wesentlich geringer Zykluszeit erfordert, indem die Reaktionsbedingungen für und die Auswahl der Edman-Reagenzien optimiert wird, und das für eine präzisere Steuerung der Kopplungsreaktion sorgt, als mit im Handel erhältlichen Gasphasensequenzierern möglich ist.
Es ist außerdem wünschenswert, ein System zur Durchführung von Sequenzierungschemie in einem billigen Mehrfachsäulensequenzierer zur gleichzeitigen Bestimmung von Aminosäuresequenzen an einer Vielzahl von Testproben zu schaffen, d. h. das Ziel besteht darin, bei den Sequenzierern billige Turmventile mit niedrigen Fluidabgabetoleranzen verwenden zu können.
Es ist weiters wünschenswert, ein System zur Aminosäuresequenzierung zu schaffen, worin das Polypeptid nicht so denaturiert oder modifiziert ist, daß es in wässerigen Reagenzien unlöslich wird. Polypeptide, die frei mit Wasser assoziieren können, können präziser sequenziert werden, da der Aminoterminus nicht potentiell zu einer unlöslichen Matrix gefaltet wird und somit nicht für die Sequenzierungsreagenzien unzugänglich ist.
Es ist wünschenswert, die Kosten und Schwierigkeiten bei der Arbeit mit Proteinextendern wie Polybrene vermeiden zu können.
Es ist auch wünschenswert, eine Vorrichtung zur Aminosäuresequenzierung zu schaffen, bei der die Vorteile der Temperaturregelung während der Aminosäuresequenzierungreaktionen voll umgesetzt werden können.
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit und Einfachheit der Verwendung ist es auch wünschenswert, einen Aminosäuresequenzierer zu schaffen, der austauschbare Probenkammerkassetten aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt eine revolutionierende Änderung der Art und Weise dar, wie Polypeptidtestproben in Aminosäuresequenzierungssystemen gehandhabt werden. Während es bisher nach dem Stand der Technik als essentiell betrachtet wurde, daß die Testprobe während zumindest eines Teils der Behandlung mit flüssigen Edman-Reagenzien starr immobilisiert ist, um Proteinverluste aufgrund von Auswaschen aus der Probenkammer zu verhindern, hat die Anmelderin erkannt, daß viele Vorteile erreicht werden, wenn die Testprobe tatsächlich frei innerhalb der Sequenziererprobenkammer wandern kann, und daher nicht darin immobilisiert oder ausgefällt werden sollte. Die Anmelderin hat das Auswaschen der Probe, das ansonsten nicht-immobilisiertes Polypeptid betrifft, durch eine wesentliche Änderung bei Flüssigphasensequenzierern nach dem Stand der Technik vermieden, nämlich dadurch, daß der verbesserte Sequenzierer das Hindurchströmen durch die Probenkammer in mehrere Richtungen zuläßt. Das ermöglicht es, daß Reagenzien der Reihe nach an gegenüberliegenden Öffnungen in der Probekammer eingebracht werden können, wodurch die Testprobe zuerst mit einem Lösungsmittel in eine Richtung und dann durch ein anderes Lösungsmittel in die entgegengesetzte Richtung wandert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Kammer auch eine Vielzahl diskreter Absorbentien für das Polypeptid, die in Tandemanordnung im Lösungsmitteldurchflußweg durch die Kammer angeordnet sind. Die Absorbentien sind so gewählt, daß sich die Polypeptidprobe zwischen einem ersten Adsorbens und Lösungsmittel anders verteilt als zwischen einem zweiten Adsorbens und dem gleichen Lösungsmittel. Das bedeutet, daß ein bestimmtes Polypeptid durch die Kammer (und ihre Tandemadsorbentien) in eine Richtung langsamer wandert als in die andere, wenn die Kammer mit einem bestimmten Lösungsmittel eluiert wird. Das ist mit der oben beschriebenen Ausführungsform mit Durchfluß in mehrere Richtungen kombiniert, um wasserlösliches Polypeptid in einem Band innerhalb der Kammer zu fokussieren, das sich zwischen den Kammeröffnungen befindet, d. h. es wandert innerhalb der Kammer hin und her, wenn Sequenzierungsreagenzien eingebracht werden, aber aufgrund der Verwendung mehrerer Absorbentien mit entgegengesetzten Eigenschaften und Durchfluß in mehrere Richtungen wird die Probe nicht aus der Probenkammer ausgewaschen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptidsequenzierer geschaffen, der umfaßt (a) eine Durchflußprobenkammer, die einen Fluiddurchflußweg definiert und erste und zweite Öffnungen entlang des Durchflußwegs aufweist, (b) chromatographisches Medium, das in der genannten Probenkammer entlang dem Durchflußweg angeordnet ist, sowie (c) Mittel zum sequentiellen Einbringen von Fluidreagenzien abwechselnd zu den genannten ersten und zweiten Öffnungen, wodurch Fluidreagenzien sequentiell in entgegengesetzte Richtungen entlang dem genannten Durchflußweg für chromatographisches Medium geschickt werden können.
Bei der bevorzugten Ausführungsform enthält die Probenkammer eine Tandemanordnung verschiedenartiger Absorbentien mit unterschiedlichen Festphasen/lösungsmittelverteilungseigenschaften bezogen auf das Probenpolypeptid. Dies wird gemeinsam mit dem multidirektionellen Durchfluß verwendet, um das Polypeptid in der Probenkammer zu suspendieren.
Ein bevorzugtes chromatographisches Medium umfaßt zwei diskrete chromatographische Mediumsegmente im Tandem mit unterschiedlichen chromatographischen Eigenschaften, von denen am meisten bevorzugt das eine hydrophil und das andere hydrophob ist.
Ein zweckmäßiges Merkmal des erfindungsgemäßen Sequenzierers besteht darin, daß die Sequenzierungsreaktionen in einem Behälter durchgeführt werden, der erste und zweite Öffnungen und darin angeordnet innerhalb des Fluiddurchflußwegs eine Vielzahl diskontinuierlicher Adsorbentien, vorzugsweise Chromatographieharze, in Tandemanordnung im Fluidurchflußweg aufweist.
Bei einem beispielhaften Verfahren wird wasserlösliches Peptid auf dem chromatographischen Medium abgelagert und wandert an die Grenzfläche zwischen den Segmenten. Die Probe wird dann mit Kopplungsreagens und Kopplungsbase in Berührung gebracht, die in eine erste Richtung fließt, um das Kopplungsreagens an das Peptid zu konjugieren. Dann wird ein flüssiges Waschlösungsmittel in die im wesentlichen entgegengesetzte Richtung fließen gelassen, um unumgesetzte Kopplungsreagenzien und Verunreinigungen zu entfernen. Daraufhin fließt Spaltungsreagens durch die Reaktionszone in die erste Richtung, um Aminosäurederivate von den gekoppelten Peptiden abzuspalten. Ein flüssiges Extraktionslösungsmittel wird dann in die zweite Richtung durch die Probenkammer fließen gelassen, um die abgespaltene Aminosäure zu extrahieren und abzuziehen, während das verbleibende Peptid im chromatographischen Medium gehalten wird. Bei allen vorangehenden Flüssigkeitseluierungen wird die Durchflußrichtung so gewählt, daß das Polypeptid von einem "raschen" Harz in ein "langsames" Harz für das betroffene Lösungsmittel wandert. Ein "rasches" Harz ist eines, bei dem sich das Polypeptid in einem größeren Ausmaß in die Lösungsmittelphase verteilt und daher rascher durch das Harz wandert als durch das "langsame" Harz, das eine höhere Affinität für das Polypeptid im gleichen Lösungsmittel hat. Das Aminosäurederivat wird dann abgezogen und analysiert, und das Verfahren wird für aufeinanderfolgende Aminosäurederivate wiederholt. Die Durchflußumkehr ermöglicht Wanderungschromatofokussierung des Peptids in der Probenkammer.
Die Harze können im wesentlichen kontinuierliche erste und zweite Mischungen von Chromatographieharzen sein, wobei die Harze in der ersten Mischung sich, was elektrostatische Ladung und Hydrophobität betrifft, im Vergleich zu den Harzen in der zweiten Mischung unterscheiden. Vorzugsweise umfaßt der Sequenzierer eine Einrichtung zum Einstellen der Temperatur im Behälter in Koordination mit Reaktionen, die in der Probenkammer auftreten. Vorzugsweise wird die Temperatur zur Kopplung von Phenylisothiocyanat an zu sequenzierendes Polypeptid bei etwa 55ºC und zur Säureextraktion bei etwa 0ºC bis 50ºC gehalten.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines Zweiphasenharzsequenzierers mit Durchfluß in zwei Richtungen zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung.
Die Fig. 2a-2e veranschaulichen die Schritte, die bei der Verwendung der vorliegenden erfindungsgemäßen Vorrichtung beim Edman-Sequenzierungsverfahren durchgeführt werden.
Fig. 3 veranschaulicht eine weggeschnittene Ansicht des symmetrischen Endes einer bevorzugten Kassetten- oder Patronenprobenkammer zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Sequenzierer.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Sequenzieren von Proteinen oder Peptiden durch wiederholte Zyklen der Kopplung an eine terminale Aminosäure und Abspaltung der gekoppelten Aminosäurederivate. Um die Beschreibung zu vereinfachen, umfaßt der Begriff sowohl Peptide als auch Proteine als Probenmaterialien. Die Erfindung ist besonders an das grundlegende Edman-Verfahren angepaßt, das im Abschnitt über den Hintergrund der Erfindung dargelegt ist. Die vorliegende Anwendung bezieht sich auf dieses Verfahren.
Auf Fig. 1 bezugnehmend ist ein Sequenzierer dargestellt, der sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignet. Wässerige flüssige Probenlösung, die wie es ist vorliegendes Peptid enthält, wird auf geeignete Weise manuell über eine Satze 10 über die Leitung 12a in die die Durchflußkammer 14 beschickende Leitung 12, oder über eine an einem Ende der Kammer 14 angeordnete Durchflußöffnung 16 eingebracht. Die Kammer 14 hat vorzugsweise die Form einer länglichen Durchflußsäule, die lichtdurchlässig (z. B. aus Glas gebildet) ist. Das Gesamtvolumen der Kammer kann variiert werden, wird aber im allgemeinen bei etwa 20 ml gehalten und enthält etwa 20 bis 40 mg trockener Glasperlen. Kammer 14 enthält chromatographisches Medium 18, das zumindest verschiedenartiges erstes chromatograpisches Mediumsegment 18a und zweites chromatographisches Mediumsegment 18b mit unterschiedlichen chromatographischen Eigenschaften in Fluidkommunikation miteinander entlang dem Durchflußweg der Säule aufweist. Die Segmente 18a und 18b sind vorzugsweise ein Tandem und liegen aneinander an, um eine Grenzfläche zu bilden. Das Medium 18a ist vorzugsweise hydrophil, während das Medium 18b vorzugsweise hydrophob ist. Andere geeignete chromatographische Medien sind Synchropak® AX300, 0300, CM300 oder 5300, die Anionen- und Kationenaustausch-HPLC-Träger sind.
Bei der dargestellten Ausführungsform ist die untere stationäre Phase, das chromatographische Medium 18a, hydrophil in Form eines Normalphasen-HPLC-Mediums. Sie sollte eine lange Verweilzeit für die hydrophile Peptidgruppe und eine geringe Affinität für die hydrophoben Nebenprodukte der Edman-Reaktion aufweisen. Kontrolliert poröses Glas (z. B. von Electro-Nucleonics, Inc., Fairfield, NJ) oder Kieselsäure mit der Bezeichnung Nu-Gel* können als diese untere stationäre Phase verwendet werden. Ein geeignetes Volumen dieses Segments 18a ist 0,1 ml. Die Eigenschaften sind folgende: Nu-Gel* 952 AC 20 nm, Porengröße 200-400 Mesh.
Das hydrophobe obere Phasensegment 18b ist aus Umkehrphasen-HPLC-Material, wie Alkyl(z. B. C8 bis C18)-gekoppelteter Kieselsäure gebildet. Dieses Material weist gute Fließeigenschaften auf und ist resistent gegen beim Sequenzieren verwendete Reagenzien. Ein geeignetes Volumen dieses Segments 18b beträgt 0,1 ml. Die Eigenschaften von Synchroprep-gekoppelter Kieselsäure sind die folgenden: Porengröße 300 Angström, Teilchengröße 30 um.
Während das System mit doppelter stationärer Phase wegen seiner Fähigkeit, die Peptide zurückzuhalten, wie unten beschrieben, bevorzugt wird, versteht es sich, daß auch eine einzelne Phase, vorzugsweise vom hydrophilen Typ, bei Durchfluß in zwei Richtungen verwendet werden kann.
Insgesamt besteht die Wichtigkeit der chromatographischen Phase darin, daß das Peptid, das mobil, d. h. nicht kovalent an das chromatographische Material gebunden, sondern statt dessen reversibel adsorbiert ist, durch dieses System zurückgehalten wird, wenn es in einer wässerigen Lösung nach oben wandert, weil das Umkehrphasenmaterial verwendet wird. Proteine und hydrophobe Peptide können in Lösungen mit hoher Konzentration von Salzen und anderen Denaturierungsmitteln (z. B. Harnstoff, SDS, Sacharose und ähnlichem) zugeführt werden. Die untere Säule mit normaler Phase hält das Peptid zurück, wenn Extraktion von Überschüssigem Reagens, Nebenprodukten und dem Aminosäure(ATZ)-Derivat mit organischem Lösungsmittel durchgeführt wird.
Das chromatographische Medium ist vorzugsweise ein Partikelbett, das während des Flüssigkeitsdurchflusses durch ein geeignetes Material, welches das Hindurchgelangen von Fluid, aber nicht des chromatographischen Partikelbettes zuläßt, an seinem oberen und unteren Ende in Position gehalten wird. Wie dargestellt umfassen solche Rückhaltemittel poröse Stopfen 17, die geeigneterweise aus Glas- oder Teflonwolle gebildet sind.
Wieder auf Fig. 1 bezugnehmend ist Leitung 12 abnehmbar dicht mit der Öffnung 16 verbunden. Die Kammer 14 ist mit einer zweiten Öffnung 20 an ihrem oberen Ende versehen, die mit Leitung 22 in Verbindung steht. Das System ist an den Öffnungen 16 und 20 fluiddicht. Geeignete lösbare Armaturen oder Kupplungen (81) zum einfachen In-Eingriff oder Außer-Eingriff-Bringen mit dem Sequenzierer sind an beiden Enden vorgesehen, um auf herkömmliche Art eine fluiddichte Abdichtung an den Öffnungen 16 und 20 zu bilden. Auf diese Art wird die Kammer 16 nach dem Abschluß der Sequenzierung eine Patrone, die für jeden neuen Durchgang vom Sequenzierer entfernt und vorzugsweise durch eine saubere Patrone ersetzt werden kann, um kreuzweise Verunreinigung von Peptiden zu vermeiden.
Eine geeignete Probekammer ist eine kleine Glassäule (Durchmesser 2 mm), die mit einer geeigneten Einrichtung zur Temperaturregelung ausgestattet sein kann, wie einem Wassermantel 80, in den über die Leitungen 82 ein Fluid mit eingestellter Temperatur geschickt wird. Die Säulenarmatur am unteren Ende 81 kann gebildet werden, indem in die Säule eine Verengung geschmolzen wird, in der ein Stück Teflonrohr mit kleiner Bohrung 11,5 mm eingeklemmt wird, um eine feste Passung herzustellen (siehe Fig. 3). Das Rohr kann dann durch Federspannung oder einen O-Ring und Schraubmuffe abdichtend gehalten werden.
Das System umfaßt eine(n) erste(n) Reservoireinrichtung oder Block (umfassend Reagens-, Kopplungsreagens- und Kopplungsbasenbehälter), die/der allgemein mit der Bezugszahl 28 bezeichnet wird. Der Durchfluß vom Block 28 erfolgt durch die Leitung 30 zum Vierwegventil 32. Wie darstellt umfaßt der Block 28 eine Quelle 34 für inertes Druckgas (z. B. Stickstoff), einen Lösungsmittelbehälter 36, einen Dampfpuffer-(Kopplungsbasen-)Behälter 38, einen Flüssigkeitspuffer-(Kopplungsbasen-)Behälter 40 und Kopplungsreagens(PITC)-Behälter 42. Die Begriffe "Puffer" und "Kopplungsbase" werden austauschbar verwendet.
Das System umfaßt auch einen Abspaltungsreagensblock 44, der durch die Leitung 46 an Ventil 32 angeschlossen ist. Der Block 44 umfaßt eine Quelle 48 für inertes Gas wie Stickstoff, einen Lösungsmittelbehälter 52, einen Behälter 54 für Spaltungsreagens(TFA)-Dampf und einen Behälter 56 für flüssiges Spaltungsreagens (TFA). Das Ventil 32 ist über die Leitung 58 an ein zweites Vierwegventil 60 angeschlossen, das eine Position zur Abgabeleitung 62 und eine weitere Position umfaßt, um derivatisierte Aminosäure in Leitung 64 zu leiten, die mit einem (nicht gezeigten) geeigneten Detektor in Verbindung steht. Die Leitung 1 verbindet die Probenkammer 14 mit dem Ventil 60.
Die Leitung 22 ist an das Vierwegventil 66 angeschlossen, das wiederum über die Leitung 68 mit einer Reihe von Behältern in einem Lösungsmittelblock verbunden ist, der mit der Bezugszahl 70 gekennzeichnet ist. Block 70 umfaßt der Reihe nach eine Quelle 72 für inertes Gas, wie Stickstoff, einen mit einem Ventil versehenen Behälter 74 für Acetonitrillösungsmittel, einen mit einem Ventil versehenen Behälter 76 für Athylacetatlösungsmittel und einen mit einem Ventil versehenen Behälter 78 für Benzollösungsmittel. Ein (nicht gezeigtes) Hochdruckventil kann in der Leitung 68 zwischen den Lösungsmittelreservoirs und dem Ventil 66 angeordnet sein.
Um die Beschreibung zu vereinfachen, wird die Probenkammer in einer vertikalen Ausrichtung beschrieben, wobei Öffnung 16 die Unterseite bezeichnet und Öffnung 20 die Oberseite bezeichnet. Es sollte jedoch verstanden werden, daß die Ausrichtung der Probenkammer das Verfahren nicht beeinflußt. Beispielsweise kann sie umgedreht oder horizontal angeordnet sein. In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich die Unterseite auf den Einlaß angrenzend an das normale oder hydrophile chromatographische Medium (das "untere Medium"), während die Bezeichnung Oberseite sich auf die Öffnung bezieht, die an die Umkehrphase oder das hydrophobe chromatographische Medium (das "obere Medium") angrenzt.

Methodik

In Schritt 1 (Fig. 2a) wird die Probe in Einspritzventil 10, geeigneterweise in einer wässerigen Lösung, von der Unterseite der Säule eingebracht, indem die Probe durch die Leitung 12a und die Leitung 12 in die Kammer 14 eingespritzt wird. Die meisten Proteine und einige Peptide werden durch das hydrophile untere Mediumsegment 18a zurückgehalten. Wenn das Protein mit einer hohen Salz- oder Denaturierungsmittelkonzentration vorliegt, kann es vom unteren Mediumsegment 18a eluieren und in das Segment 18b wandern, wo es zurückgehalten wird. Die Lösung, die durch die Säule gelangt, kann zwecks Analyse gesammelt werden, um zu verifizieren, daß das gesamte Protein von der Säule zurückgehalten wird. In diesem Fall befindet sich das Ventil 60 in einer Bypassposition, während das Ventil 66 sich in der dargestellten Position befindet, wobei überschüssige Lösung durch die Leitung 90 gesammelt wird. Lösungsmittel vom Block 70 werden über die Abfall-Leitung 92 abgezogen.
Typischerweise wird das Medium 18 mit wässeriger Probenlösung geflutet, so daß das Protein in der Lösung durch die Säule nach oben wandert, aber durch das hydrophobe obere Mediensegment 18b verzögert wird. Es wird angemerkt, daß, obwohl es vorzuziehen ist, das Peptid von der Unterseite des Systems einzubringen, auch von der Oberseite eingebracht werden kann.

Schritt 2

Bei diesem Schritt wird Lösungsmittel an einem für die Probe verwendeten Einlaß 10 injiziert und fließt durch die Säule nach oben, um es in einem Waschflüssigkeitsammelgefäß wie Durchgangsleitung 90 zu entfernen. Die Waschlösung kann Wasser oder Acetonitril in geringer Konzentration als mobile Phase sein, die vorzugsweise von der Unterseite zur Oberseite der Säule und an der Oberseite abfließt. Bei diesem Schritt werden die verbleibenden Salze, Denaturierungsmittel oder kleinen unerwünschten Peptide oder Aminosäuren aus der Probenkammer entfernt. Die Schritte 1 und/oder 2 können automatisch oder manuell entweder im Sequenzierer oder getrennt vom Instrumentarium durchgeführt und für darauffolgendes Sequenzieren gelagert werden.

Schritt 3

Bei diesem Schritt wird geeignetes Kopplungsreagens (PITC) in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Acetonitril, Benzol, Chlorbutan, Methylenchlorid, Athylacetat oder Heptan) zugeführt, vorzugsweise 2% PITC in Heptan. (Siehe Fig. 2b). In einer Ausführungsform wird das PITC in Behälter 42 zuerst durch die Ventile 32 und 60 gelenkt und fließt dann als Abfall ab, wodurch das Totvolumen zwischen den beiden Ventilen (58) gefüllt wird. Daraufhin werden die Positionen der Ventile 32 und 60 gleichzeitig geändert, und inertes Gas in Quelle 48 von Block 44 wird so gelenkt, daß die präzise geregelte Menge an Kopplungsbase in der Totvolumenschleife 58 zwischen den Bentilen 32 und 62 in den Unterteil der Reaktionssäule 14 geschickt wird. Diese Ausführungsform, bei der sorgfältig reguliertes Volumen verwendet wird, ist fakultativ, wird aber bevorzugt. Sobald das Kopplungsreagens in die Säule gelangt, kann die ungenutzte Teilmenge des Reagens im Ventil 32 ausgewaschen werden, indem Inertgas von der Quelle 34 über die Leitung 30 und das Ventil 32 als Abfall abfließt, wie durch Leitung 94 bezeichnet.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann Schritt 3 durchgeführt werden, indem das Kopplungsreagens vom Behälter 42 direkt durch die Ventile 32 und 60 zum Unterteil der Reaktionssäule abgegeben wird, indem einfach das (nicht gezeigte) Kopplungsbasenregelventil geöffnet wird, wobei die Ventile 32 und 60 an die Reaktionssäule angeschlossen sind. Diese Technik wird weniger bevorzugt, da das Volumen an Kopplungsbase, das durch die Probenkammer gelangt, nicht so präzise reguliert wird wie bei der obengenannten Ausführungsform, bei der ein präzises Schleifenvolumen verwendet wird. Diese Ausführungsform kann im herkömmlichen Fall verwendet werden, wenn das Peptid durch das hydrophobe Segment 18b zurückgehalten wird. Bei dieser alternativen Ausführungsform wird vorgezogen, das PITC in Heptan und nicht in Acetonitril zu führen, um Eluierung kleiner Peptide von der Oberseite des hydrophilen Medienabschnitts zu verhindern, falls unbeabsichtigt eine große Menge an Kopplungsreagens verwendet wird.
Nach jedem der beiden obigen Verfahren zur Zufuhr von Kopplungsreagens wird vorgezogen, das System durch Durchströmen mit Inertgas entweder von der Oberseite oder der Unterseite der Probenkammer her aus den Quellen 34, 48 oder 72 zu trocknen. Dieses Trocknen hat die Funktion, das Lösungsmittel zu entfernen. Es handelt sich dabei jedoch um einen fakultativen Schritt.

Schritt 4

Bei diesem Schritt wird die Kopplungsbase [Puffer] (Fig. 2b) auf analoge Art wie bei Schritt 3 zugeführt.
Das zunächst oben beschriebene Schleifenverfahren kann verwendet werden, um eine kleine präzise regulierte Menge an flüssigem Puffer zuzuführen, um zu verhindern, daß überschüssige Mengen zugeführt werden, die kleine Peptide in der Säule nach oben tragen können. Der flüssige Puffer kann mit flüchtigem Puffer (z. B. Trimethylamin oder Triäthylamin und Wasser) aus Quelle 28 kombiniert werden. Da die auf diese Art zugeführte Flüssigkeitsmenge typischerweise zu klein ist, um das chromatographische Medium vollständig zu benetzen, wandert das Peptid nach oben durch die Säule, aber nicht aus der Probenkammer hinaus. Wenn die Peptidprobe groß genug ist, um auf dem hydrophoben Medium gehalten zu werden, kann die Menge an flüssigem Puffer verwendet werden, die das Volumen von Kammer 14 übersteigt. Das nutzt das diskontinuierliche hydrophile-hydrophobe Zweiphasensystem, um das große Peptid an der Grenzfläche zwischen dem normalen Phasenträger und dem oberen Umkehrphasenträger zu fokussieren.
Das Volumen an zugeführtem flüssigem Puffer wird über das Säulenvolumen hinaus erhöht, indem zuerst das Flüssigpufferventil für den Behälter 40 im Block 28 geöffnet wird, so daß die Flüssigkeit durch die Ventile 32 und 60 und zum Abfallabfluß fließt. Dann wird das Ventil 60 in Position verschoben, um den flüssigen Puffer nach oben durch die Leitung zur Säule zu lenken, kurz (z. B. zwei Sekunden) bevor das Ventil 32 den Fluß zum Abfallauslauf ablenkt. Inertgas aus der Quelle 48 in Block 44 wird verwendet, um den Puffer durch das Ventil 60 und die Leitung 12 in den Unterteil der Reaktionssäule zu drängen. Diese Zeitgebung kann so eingestellt werden, daß ausreichend flüssiger Puffer in die Probenkammer eintritt, um das gesamte chromatograpische Medium 18 zu benetzen, wobei überschüssiger Puffer frei durch die Oberseite der Säule eluiert werden kann. Die folgenden Kriterien werden verwendet, um die Kopplungsbase auszuwählen: die Kopplungsbase regelt den pH-Wert so, daß er im Bereich von 8 bis 10 liegt, und löst sowohl Peptid als auch Reagens auf. Geeignete Kopplungsbasen sind hydrophile Lösungen, wie Quadrol, DMAA, DMBA oder ähnliche, denen aber vorzugsweise ein Propanolgehalt zugesetzt ist, der geringer als bei den gegenwärtigen herkömmlichen Quellen dieser Produkte ist (z.b. 5-20% oder weniger). Eine solche hydrophile Lösung verursacht typischerweise mäßige Wanderung der Peptide nach oben durch das hydrophile chromatographische Medium, aber bestenfalls sehr langsame Wanderung durch das hydrophobe Mediensegment.
Die Flexibilität dieses Systems, das die Verwendung hoher Volumina an flüssigem Puffer zuläßt, ermöglicht eine Steigerung der Effizienz der Kopplungsreaktion durch präzise Steuerung des pH-Werts. Wenn gewünscht, kann der flüssige Puffer auch Detergenzien wie SDS enthalten, um die Solubilisierung des Proteins zu unterstützen. Ein weiteres Reagens, das enthalten sein kann, ist Norleukin, ein primäres Amin, das natürlichen Aminosäuren ähnlich ist und das als innerer Standard und als Träger-Scavenger für PTC-Aminosäure verwendet werden kann.
Obwohl die Schritte 3 und 4 bezogen auf die sequentielle Hinzufügung von Kopplungsreagens und Kopplungsbase beschrieben werden, ist es für die Reaktion nur wichtig, daß die beiden Reagenzien sich im gleichzeitigen Kontakt mit dem Peptid befinden. Somit kann das System verwendet werden, indem die Schritte 3 und 4 mit der kombinierten Hinzufügung von Kopplungsreagens und Kopplungsbase kombiniert werden.

Schritt 5

Bei diesem Schritt wird die Säule durch das Hindurchströmen eines Inertgases nach dem Abschluß der Kopplungsreaktion getrocknet. Bei einer bevorzugten Technik wird das Gas zuerst nach oben strömen gelassen, so daß wässerige Flüssigkeit in die Richtung des hydrophoben Materials fließt. Das kann erreicht werden, indem Inertgas aus der Quelle 34 durch die Ventile 32 und 60 und die Leitung 12 nach oben durch die Säule geschickt wird. Dann kann, nachdem ein Großteil der Flüssigkeit entfernt wurde, das Trocknen durch Hochdruckgas abgeschlossen werden, wie von Ventil 72 durch Ventil 66 und Leitung 22 und durch die Säulenleitung 12, Ventil 60, Leitung 64 und zum Abfallablauf hin zugeführt. Das vollständige Entfernen von Wasser ist wünschenswert, ist aber nicht so kritisch wie bei Techniken nach dem Stand der Technik, wie einem oben beschriebenen Zentrifugierschalensequenzierer oder Gassequenzierer. Der Grund dafür ist, daß die Wanderung des Peptids aufgrund des Wassers, das zuläßt, daß die organische mobile Phase stärker hydrophil wird, durch die nächste Hinzufügung von flüssigem Puffer von unten ausgeglichen würde, die ein Refokussieren des Peptids zurück zur Grenzfläche zwischen dem hydrophilen und hydrophoben Material hin verursacht.
Während der Abwärtsbewegung des Hochdruckgases kann das Ventil 32 durch Hindurchgehen von Lösungsmittel vom Behälter 36 durch das Ventil und die Leitung 82 zum Abfallabfluß gewaschen werden.

Schritt 6

In diesem Schritt (Fig. 2c) werden organische Lösungsmittel in Abwärtsrichtung durch die Probenkammer geschickt, um nicht-flüchtige Nebenprodukte und verbleibende Puffer von der Säule zu entfernen. Die zum Eluieren verwendeten Lösungsmittel reichen von sehr unpolaren Lösungsmitteln, wie Heptan und Benzol, zu Lösungsmittel mit mäßigerer Polarität, wie Athylacetat oder Acetonitril. Alle Lösungsmittel gelangen von oben in die Säule und werden nach unten und unten aus der Säule heraus eluiert. Typischerweise weisen die in Leitung 68 durch das Ventil 66 und die Leitung 22 zugeführten Lösungsmittel einen Druck im Bereich von etwa 0,7 bis 7 kg/cm² (10 psi bis 100 psi) auf. Ventile in den Behältern in Block 70 müssen einen Druck von bis zu 7 kg/cm² (100 psi) von Quelle 70 aushalten können, so daß inertes Hochdruckgas durch die Säule strömen gelassen wird, um alle Gasblasen zusammenzudrücken, die verbleibende Nebenprodukte oder Reagenzien einschließen können.

Schritt 7

In diesem Schritt wird das gekoppelte (PTC-) Peptid mit einer Spaltungssäure gespalten (Fig. 2d). Das folgende Kriterium wird eingesetzt, um die entsprechende Spaltungssäure auszuwählen: Sie muß wasserfrei und flüchtig sein und ausreichend niederen pH-Wert aufweisen, um die Spaltung des PTC-Peptids in die Thiazolinonaminosäure und ein freies Peptid mit einer Aminosäure weniger zu verursachen. Die Spaltung kann entweder mit einer flüssigen Säure (HFBA, TFA, PFPA oder ähnlichem in einer wasserfreien Essigsäure- oder Acetonitrillösung oder ähnlichem), einem Säuredampf oder einer Kombination aus beiden durchgeführt werden. Die flüssige Säure erhöht die Kinetik der Reaktion. Andererseits vermindert die Verwendung des Gases das Risiko der Eluierung des Peptids nach oben aus der Säule. Somit wird die flüssige Säule für verkürzte Reaktionszeiten bevorzugt, wenn das Peptid relativ groß und daher das Risiko der Eluierung aus der Säule nicht groß ist. Das System kann mit flüssiger Säure in den Anfangsstadien des Sequenzierens und mit einer Gasphasensäure in den späteren Stadien arbeiten, wenn die Peptidkette wesentlich reduziert ist.
Auf die Verwendung von Säuredampfspaltung bezugnehmend wird Dampf vom Behälter 54 über die Leitung 46 und die Ventile 32 und 60 über die Leitung 12 in den Unterteil der Probenkammer 14 gelenkt. Das gleiche Durchflußsystem wird für die Abgabe der flüssigen Spaltungssäure aus Quelle 56 verwendet.
Es wird vorgezogen, die Spaltungsreaktion bei einer Temperatur von 10ºC bis 50ºC durchzuführen. Die Temperatur kann durch die Temperatur des zirkulierenden Wassers im Wassermantel 80 variiert werden. Die Reaktion wird durch das Trocknen von überschüssiger flüssiger oder gasförmiger Säure durch ein Aufwärtsströmen von Inertgas gefolgt von Abwärtsströmen unter hohem Druck wie oben beschrieben zum Stillstand gebracht. Das Trocknen kann vollständiger sein als sowohl im Gasphasensequenzierer als auch im Zentrifugierschalensequenzierer. Der Grund dafür ist, daß die Extraktion der abgespaltenen ATZ-Aminosäure aufgrund der chromatographischen Trennung von ATZ-Aminosäure vom verbleibenden Peptid mit einem stärker polaren Lösungsmittel durchgeführtwerden kann, als bei diesen beiden Systemen. Die Extraktion hängt nicht von einer kleinen Menge an verbleibender Säure ab, wie bei diesen Techniken nach dem Stand der Technik.

Schritt 8

In diesem letzten Schritt (Fig. 2e) wird die abgespaltene ATZ-Aminosäure mit einem geeigneten organischen Extraktionslösungsmittel wie Athylacetat oder Acetonitril extrahiert. Die Kriterien zur Wahl des Lösungsmittels sind folgende: Vollständiges Eluieren aller ATZ-Aminosäuren, aber gewisse Wanderung von freiem Peptid durch das Harz.
Wie dargestellt, wird Lösungsmittel vom Behälter 76 über das Ventil 66 und durch die Leitung 23 nach unten durch die Säule und durch das Ventil 60 und 80 und zu einer geeigneten Reaktionsphiole zur darauffolgenden Reaktion geschickt. Die abgespaltene ATZ-Aminosäure im Lösungsmittel wird in einer solchen, nicht gezeigten, Phiole auf herkömmliche Art in stabile PTH-Aminosäuren umgewandelt. Wie typisch ist, kann die Phiole zur Umwandlung der wässerigen Säure eine wässerige TFA-Lösung enthalten oder damit beaufschlagt werden. Ein Inertgas wird auf eine oben beschriebene Art durch die Probenkammer strömen gelassen, um verbleibende organische Säure zu entfernen. Dann ist die Säule bereit, damit das Sequenzierungsverfahren für darauffolgende ATZ-Aminosäurederivate wiederholt werden kann.
Nach der Umwandlung der ATZ-Aminosäuren in PTH-Aminosäuren durch die Umsetzung mit der Säure (nicht gezeigt), können die Reste durch geeignete Flüssigphasenchromatographie identifiziert werden.
Ein Vorteil des obigen Systems besteht darin, daß die Probenkammer umgangen werden kann, so daß das Reagenszufuhrsystem direkt zum Abfallauslauf hin gewaschen werden kann. Weiters kann im Fall eines Mikrosequenzierers das Volumen des Ventils und der Leitungen, das erforderlich ist, um alle bei der Edman-Abbauchemie verwendeten Reagenzien zuzuführen, so groß wie das Volumen der Probenkammer sein. Das Umgehen anderer Probenkammern schaltet das Problem des Auswaschens überschüssiger Reagenzien, die in den Ventilen und Leitungen verbleiben, zum Abfallauslauf hin über die Probe enthaltende Probenkammer aus. Das vermindert die Menge an Lösungsmittel, die über die Probe fließt. Übermäßiges Waschen durch Lösungsmittel ist aufgrund von Extraktionsverlusten von Probe sowie Oxidation des PTC-Peptids durch Spurenmengen an Peroxid im Lösungsmittel schädlich. Das Ventil im Leitungswaschverfahren kann weiterarbeiten, während die Probenkammer getrocknet wird, was zur Verringerung der zum Waschen erforderlichen Zeit beiträgt.
Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems besteht darin, daß es möglich ist, eine mobile Phase des Peptids ohne kovalente Bindung am Medium, aber ohne Auswaschen der Probe zu verwenden. Die flüssigen Reagenzien sind so ausgewählt, daß das Peptid aufgelöst wird, was Wanderung in der Durchflußrichtung bewirkt. Durch das Ändern der Durchflußrichtungen bewegt sich das Peptid die Säule hinauf und hinunter und neigt dazu, an der Grenzfläche zwischen der hydrophilen und hydrophoben Phase zu fokussieren. Die Wanderungsrate hängt von der Verteilung zwischen der mobilen Phase (flüssiges Reagens) und stationären Phase (chromatographisches Medium) ab.
Um das Fokussieren des Peptids in der Säule zu veranschaulichen, fließt eine Peptidprobe in einer wässerigen Lösung, mit der die Probenkammer beaufschlagt wird, durch die Säule nach oben. Etwas Peptid ist typischerweise im hydrophilen unteren Segment enthalten, während andere Peptide durch das hydrophobe obere Segment zurückgehalten werden. Bestandteile mit geringem Molekulargewicht werden aus der Säule abeluiert. Während des Koppelns gelangen die/das wässerige Kopplungsbase und Kopplungsreagens nach oben durch die Säule, und das Peptid neigt dazu, sich nach oben in das hydrophobe Medium zu bewegen. Daraufhin gelangen die organischen Lösungsmittel in Schritt 6 nach unten durch den Kuppler, um die PTC-Aminosäure wieder zur hydrophilen Phase hin zu bewegen. Dann fließt gelagt die Spaltungssäure in Schritt 7 wieder nach oben in der Säule, um das Peptid wieder zum hydrophoben Abschnitt zu bewegen. Schließlich wird die Extraktion des ATZ-Aminosäurenderivats in einer Abwärtsrichtung durchgeführt. Diese abwechselnde Bewegung des Peptids durch Variieren der Durchströmungsrichtung zwischen den hydrophilen und hydrophoben chromatographischen Abschnitten bewirkt ein Fokussieren des Peptids nahe der Grenzfläche zwischen den beiden Segmenten, was ein Auswaschen des Peptids während des Verfahrens verhindert.

Claims

1. Probenbehälter für einen Protein- oder Peptidsequenzierer, der erste und zweite Öffnungen mit einem Fluiddurchflußweg dazwischen aufweist und darin innerhalb des genannten Fluiddurchflußwegs eine Vielzahl von Adsorbentien für Polypeptid angeordnet hat, die in Tandemanordnung im genannten Fluiddurchflußweg ausgerichtet sind und unterschiedliche Festphasen-Trenneigenschaften bezogen auf die Probe aufweisen, so daß sich die Probe zwischen einem ersten genannten Adsorbens und Lösungsmittel anders verteilt als zwischen einem zweiten genannten Adsorbens und dem gleichen Lösungsmittel, wodurch ein bestimmtes Polypeptid in einer Richtung langsamer durch die Tandemadsorbentien wandert als in einer anderen, wenn es mit einem bestimmten Lösungsmittel eluiert.

2. Behälter nach Anspruch 1, der erste und zweite Adsorbentien aufweist, die ohne wesentliches Vermischen in direktem Kontakt zueinander stehen.

3. Behälter nach Anspruch 1 oder 2, worin die genannten Adsorbentien Chromatographiemedien sind.

4. Behälter nach Anspruch 3, worin die Medien Hochdruckflüssigkeitschromatographieharze sind.

5. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Adsorbentien erste und zweite Harze umfassen, die sich bezogen auf die elektrostatische Ladung oder Hydrophobizität unterscheiden.

6. Behälter nach Anspruch 5, worin ein genanntes erstes Harz eine elektronegative Ladung trägt und ein genanntes zweites Harz eine elektropositive Ladung trägt.

7. Behälter nach Anspruch 6, worin das elektropositiv geladene Harz ein quaternäres oder tertiäres aminosubstituiertes makroporöses Polyolefin ist und das elektronegativ geladene Harz ein sulfonatsubstituiertes makroporöses Polyolefin ist.

8. Behälter nach Anspruch 5, worin ein genanntes zweites Harz hydrophob ist und ein genanntes erstes Harz hydrophil ist.

9. Behälter nach Anspruch 8, worin das zweite Harz alkylsubstituierte Kieselsäure ist und das erste Harz unsubstituierte Kieselsäure ist.

10. Behälter nach Anspruch 9, worin das hydrophobe Harz C-4- bis C-18-alkylsubstituierte Kieselsäure oder ein polymeres hydrophobes Harz ist und das hydrophile Harz Glas mit definierten Poren oder unsubstituierte Kieselsäure ist.

11. Behälter nach einem der Ansprüche 5 bis 10, worin jedes der ersten und zweiten Harze im wesentlichen eine kontinuierliche Mischung aus Chromatographieharzen ist und worin die Harze in der ersten Mischung sich bezogen auf die elektrostatische Ladung und Hydrophobizität im Vergleich zu den Harzen in der zweiten Mischung unterscheiden.

12. Behälter nach Anspruch 11, worin die zweite Mischung ein hydrophobes Harz und ein elektronegativ geladenes Harz enthält und die erste Mischung ein hydrophiles Harz und ein elektropositiv geladenes Harz enthält.

13. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die Absorbentien in etwa auf halbem Weg zwischen den Öffnungen eine Grenzfläche innerhalb des Behälters bilden.

14. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der Mittel zum umkehrbaren und abdichtbaren In-Eingriff-Bringen der Mittel zum Einbringen von Fluid in die genannten Öffnungen aufweist.

15. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 14, der weiters Druckarmaturen umfaßt, die mit den ersten und zweiten Öffnungen in Verbindung stehen.

16. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der zylindrisch ist und fähig ist, Innendrücke von etwa 7 kg/cm² auszuhalten.

17. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der Mittel zum Regeln der Temperatur des Behälters umfaßt.

18. Behälter nach Anspruch 17, worin das Temperaturregelmittel ein Wassermantel ist.

19. Protein- oder Peptidsequenzierer, umfassend:

(a) einen Durchflußprobenbehälter, der einen Fluiddurchflußweg definiert und erste und zweite Öffnungen entlang des Durchflußweges aufweist;

(b) ein Adsorbensmedium zur Adsorption von Polypeptid, das im genannten Probenbehälter innerhalb des Durchflußwegs angeordnet ist; und

(c) Mittel zum sequentiellen Einbringen von Fluidsequenzierungsreagenzien abwechselnd an der genannten ersten und zweiten Öffnung, wodurch Fluidreagenzien während des Seqenzierungsverfahrens sequentiell in im wesentlichen entgegengesetzten Richtungen entlang des genannten Durchflußweges durch das Adsorbensmedium geschickt werden können.

20. Protein- oder Peptidsequenzierer nach Anspruch 19, worin der genannte Probenbehälter und das darin befindliche Adsorbensmedium einem der Ansprüche 1 bis 18 entsprechen.

21. Sequenzierer nach Anspruch 19 oder 20, worin die Mittel zum Einbringen von Flüssigkeit in die erste und zweite Probe im Probenbehälter mit Reservoirs in Verbindung stehen, die zum Enthalten von Peptidsequenzierungsreagenzien geeignet sind.

22. Sequenzierer nach Anspruch 21, worin der Sequenzierer Druckgasmittel umfaßt, um Reagenzien vom Reservoir zu den genannten ersten und zweiten Öffnungen zu befördern und um den Probenbehälter zu trocknen.

23. Sequenzierer nach einem der Ansprüche 19 bis 22, der weiters eine Einrichtung zum Einstellen der Temperatur des Behälters in Koordination mit Reaktionen umfaßt, die im Behälter stattfinden.

24. Verfahren zum sequentiellen Abbau von Peptiden durch aufeinanderfolgende Kopplungs- und Spaltungsreaktionen, an denen Edman-Abbau beteiligt ist, wobei das Verfahren umfaßt:

a) das Ablagern des genannten Peptids in einer mobilen Form auf einem Adsorbensmedium für das Polypeptid, das sich im Durchflußweg innerhalb eines Durchflußprobenbehälters befindet,

b) das In-Berührung-Bringen von Kopplungsreagens mit dem genannten abgelagerten Peptid und das Fließenlassen von Kopplungsbase in eine erste Richtung über das Peptid, um das genannte Kopplungsreagens an das genannte Peptid zu koppeln,

c) das Fließenlassen von Spaltungsreagens durch den Probenbehälter, um Aminosäurederivate vom genannten gekoppelten Peptid abzuspalten, und

d) das Fließenlassen eines flüssigen Extraktionslösungsmittels durch den Probenbehälter in einer zweiten Richtung, die der genannten ersten Richtung entgegengesetzt ist, um die genannte abgespaltene Aminosäure zu extrahieren und aus dem genannten Probencontainer abzuziehen, während verbleibendes Peptid im Adsorbens belassen wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, das zwischen den Schritten (b) und (c) weiters den Schritt des Fließenlassens eines flüssigen Waschlösungsmittels in der genannten zweiten Richtung umfaßt, um unumgesetztes Kopplungsreagens und andere Verunreinigungen aus dem chromatographischen Medium zu entfernen, ohne das genannte Peptid zu entfernen, wobei das Durchfließen in Schritt (c) in die genannte erste Richtung erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin das genannte Peptid während der Schritte (b) und (c) in die genannte erste Richtung und während Schritt (d) in die genannte zweite Richtung im genannten chromatographischen Medium wandert.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin das genannte Peptid in einer Lösung abgelagert ist, die gelöste Stoffe enthält, die fähig sind, die Bestimmung der Aminosäuresequenz durch Edman-Abbau zu stören.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die genannten gelösten Stoffe isoelektrische Fokussierungspuffer, Natriumdodecylsulfonat, Saccharose, Aminosäuren oder Harnstoff umfassen.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, worin das in Schritt (b) verwendete Kopplungsreagens in einem Lösungsmittel getragen wird, das aus Heptan, Benzol, Chlorbutan, Methylenchlorid, Athylacetat oder Acetonitril ausgewählt ist.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, worin das Koppeln von Schritt (b) in einer wässerigen Umgebung durchgeführt wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, worin in Schritt (b) der Kontakt des Kopplungsreagens mit dem Peptid und das Durchfließen der Kopplungsbase gleichzeitig durchgeführt werden.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, worin das genannte Spaltungsreagens während Schritt (c) durch die genannte Säule in wasserfreier flüssiger Form fließt.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, bei dem in den Schritten (b), (c) und (d) ausreichend Flüssigkeit durch die Probenkammer fließen gelassen wird, um das Volumen des Probenbehälters zu übersteigen.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, worin das Absorbens zwischen den Schritten (a) und (b) mit einem Volumen einer wässerigen Lösung gewaschen wird, das jenes des Probenbehälters übersteigt.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 34, worin das Adsorbens nach den Schritten (b), (c) und (d) mit inertem Gas getrocknet wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 35, worin die Adsorbentien Chromatographieharze sind, die im in wässerigen Lösungen wesentlich nicht quellbar sind.

37. Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 36, bei dem ein Probebehälter oder Sequenzierer nach einem der Ansprüche 1 bis 23 verwendet wird.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 37, worin erste und zweite Öffnungen des Probenbehälters mit ersten und zweiten Reservoirs in Verbindung stehen, die Peptidsequenzierungsreagenzien enthalten, wobei das genannte erste Reservoir eine Phenylisothiocyanatlösung oder ein Derivat davon zum Koppeln mit dem zu sequenzierenden Polypeptid enthält.

39. Verfahren nach Anspruch 38, worin die Lösung ein polares Lösungsmittel enthält.

40. Verfahren nach Anspruch 39, worin das Lösungsmittel eine alkalische gepufferte wässerige Lösung ist.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 40, worin erste und zweite Öffnungen des Probenbehälters mit ersten und zweiten Reservoirs in Verbindung stehen, die Peptidsequenzierungsreagenzien enthalten, wobei das genannte zweite Reservoir ein im wesentlichen unpolares organisches Lösungsmittel enthält.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 41, worin die Temperatur in der Probe in Koordination mit Reaktionen, die innerhalb des Behälters stattfinden, eingestellt wird.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 42, worin die Temperatur im Probenbehälter zum Koppeln von Phenylisothiocyanat an ein zu sequenzierendes Polypeptid bei etwa 55ºC, und zur Aminosäureextraktion bei etwa 0ºC bis 50ºC gehalten wird.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 43, worin die Sequenzierreagenzien durch unter Druck stehendes inertes Gas durch die Probenkammer befördert werden.