DE69334031T2

DE69334031T2 - Faktorielle chemische bibliotheken

Info

Publication number: DE69334031T2
Application number: DE69334031T
Authority: DE
Inventors: P. Stephen Palo Alto FODOR; Lubert Stanford STRYER
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2013-04-29
Also published as: EP0639276B1; AU4229693A; EP1324045A2; US5541061A; WO1993022684A1; EP0639276A1; EP1324045A3; DE69334031D1; EP0639276A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Polymer-Screening. Genauer gesagt, stellt die Erfindung ein besseres Verfahren zur Herstellung einer Polymerbank bereit, die zur Identifikation eine Polymersequenz verwendet werden kann, die komplementär zu einem Rezeptor ist.
Es gibt viele Assays zur Messung der Bindungsaffinität von Rezeptoren und Liganden, aber die Information, die aus diesen Experimenten erhalten werden kann, ist oft durch die Anzahl und den Typ der verfügbaren Liganden beschränkt. Kleine Peptide sind ein beispielhaftes System zur Untersuchung der Beziehung zwischen Struktur und Funktion in der Biologie. Werden die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren zu Peptiden kondensiert, bilden sie ein breites Spektrum dreidimensionaler Konfigurationen, die sich jeweils aus einer bestimmten Aminosäuresequenz und Lösungsmittelbedingung ergeben. Die Anzahl möglicher Pentapeptide aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren beträgt zum Beispiel 20⁵ oder 3,2 Millionen verschiedene Peptide. Die Wahrscheinlichkeit, dass Moleküle dieser Größe bei Rezeptorbindungsstudien nützlich sein können, wird von Epitopanalysestudien unterstützt, die zeigen, dass einige Antikörper Sequenzen von nur wenigen Aminosäuren mit hoher Spezifität erkennen.
Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung einer großen Zahl verschiedener Oligomere waren unerträglich langsam, wenn sie in einem Maßstab verwendet wurden, der für ein effizientes rationales oder zufallsgemäßes Screening ausreichte. Zum Beispiel hat man das in Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press (1989), beschriebene "Merrifield"-Verfahren, das hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, zur Synthese von Peptiden an einem festen Träger, wie Nadeln oder Stäben, verwendet. Die Peptide werden dann gescreent, und es wird bestimmt, ob sie zu einem Rezeptor komplementär sind. Unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens ist das Screening von mehr als wenigen Peptiden pro Tag nicht ökonomisch durchführbar.
Auf ähnliche Probleme trifft man beim Screening anderer Polymere mit einem verschiedenartigen Basissatz von Monomeren. Zum Beispiel weisen verschiedene Verfahren zur Oligonukleotidsynthese, wie das Phosphittriester-Verfahren und das Phosphotriester-Verfahren, das in Gait, "Oligonucleotide Synthesis", IRL Press (1990), beschrieben und hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, ähnliche Beschränkungen auf, möchte man viele verschiedenartige Oligonukleotide für ein Screening synthetisieren.
Für das Screening einer größeren Zahl von Polymersequenzen sind fortschrittlichere Techniken offenbart worden. Zum Beispiel beschreiben Pirrung et al., WO 90/15070, das hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, ein Verfahren zur Synthese einer großen Zahl von Polymersequenzen an einem festen Substrat unter Verwendung lichtgesteuerter Verfahren. Dower et al., US-Anmeldung mit der laufenden Nr. 07/762 522, das hier ebenfalls für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschreibt ein Verfahren zur Synthese einer Polymerbank und ein Verfahren zu deren Verwendung. Die Polymere werden beispielsweise auf Perlen synthetisiert. Ein erstes Monomer wird an einen Pool von Perlen gebunden. Danach wird der Perlenpool geteilt, und ein zweites Monomer wird gebunden. Das Verfahren wird wiederholt, bis ein gewünschter verschiedenartiger Satz von Polymeren synthetisiert worden ist.
Andere Verfahren zur Synthese und zum Screening von Polymeren sind ebenfalls vorgeschlagen worden. Zum Beispiel erläutern Houghten et al., "Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery", Nature (1991) 354:84–86, ein Verfahren zur Herstellung von Peptidbanken, die zum Screening der Peptide im Hinblick auf biologische Aktivität verwendet werden (siehe auch Houghton et al., "The Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for the Identification of Bioactive Peptides", Peptide Research (1992) 5:351–358). Houghton synthetisierte eine kombinatorische Peptidbank (SPCL), die aus einigen 34 × 10⁶ Hexapeptiden bestand, und führte ein Screening durch zur Identifikation von Antigendeterminanten, die von einem monoklonalen Antikörper erkannt werden. Furka et al., "General Method for Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures", Int. J. Peptide Protein Res. (1991) 37:487–493, erläutern ein Verfahren zur Synthese von Mehrkomponenten-Peptidgemischen. Furka schlug das Bilden eines Pools als allgemeines Verfahren zur schnellen Synthese von Mehrkomponenten-Peptidgemischen vor und veranschaulichte dessen Anwendung durch Synthese eines Gemischs von 27 Tetrapeptiden und 180 Pentapeptiden. Lam et al., "A new type of synthetic peptide library for identifying ligandbinding activity", Nature (1991) 354:82–84, verwendeten das Bilden eines Pools zur Erzeugung einer Pentapeptidbank auf Perlen, die hinsichtlich der Bindung an einen monoklonalen Antikörper gescreent wurde. Blake et al., "Evaluation of Peptide Libraries: An Interative Strategy To Analyze the Reactivity of Peptide Mixtures With Antibodies", Bioconjugate Chem. (1992) 3:510–513, erläutern das Screening angenommener Gemische von 50625 Tetrapeptides und 16777216 Hexapeptiden zur Auswahl von Epitopen, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden.
Die synthetische Peptidbank von Lam besteht aus einer großen Zahl Perlen, wobei jede Perle Peptidmoleküle einer Art enthält. Perlen, die an ein Ziel (z.B. einen Antikörper oder Streptavidin) binden, werden farbig oder fluoreszierend gemacht. Lam berichtet, dass mehrere Millionen Perlen, verteilt in 10–15 Petrischalen, mit einem Niederleistungs präpariermikroskop an einem Nachmittag gescreent werden können. Positive Perlen werden mit 8 M Guanidinhydrochlorid gewaschen, wodurch das Zielprotein entfernt wird, und dann sequenziert. Die Perlen mit 10–200 μm Durchmesser enthalten 50–200 pmol Peptid, also wahrscheinlich recht viel mehr als ihre 5-pmol-Empfindlichkeitsgrenze. Drei Pentapeptid-Perlen wurden täglich sequenziert. Das Wesentliche an Lams Verfahren ist, dass die Identität positiver Perlen durch direktes Sequenzieren erhalten wird.
Houghton et al. verwenden einen anderen Ansatz zur Identifikation von Peptidsequenzen, die von einem Antikörper erkannt werden. Unter Verwendung der hier verwendeten Nomenklatur haben Houghton et al. eine X₆X₅X_4pX_3pX_2pX_1p-Bank gescreent und gefunden, dass das Gemisch DVX_4pX_3pX_2pX_1p in ihrem Inhibitionsassay die größte Stärke aufweist. Houghton synthetisierte dann eine DVX_4pX_3pX_2pX_1p-Bank und identifizierte die stärkste Aminosäure in der dritten Position. Nach drei weiteren Annäherungen fanden sie, dass DVPDYA an den Antikörper mit einer K_d von 30 nM bindet. Das Wesentliche an Houghtons Verfahren ist die rekursive Retrosynthese, bei der die Anzahl gepoolter Positionen mit jeder Annäherung um eins abnimmt.
Blake et al. verwendeten eine "Falschmünzen-Strategie", um zu einer bevorzugten Aminosäuresequenz zu gelangen. Bei dieser Strategie wird zunächst ein Basissatz von Monomeren (15 Aminosäuren) in drei Gruppen unterteilt. Blake et al. wählten A, L, V, F, Y (Untergruppe α), G, S, P, D, E (Untergruppe β) und K, R, H, N, Q (Untergruppe γ). Durch Einstellen der "Gewichtung der Untergruppen in jeder Position in der Polymersequenz und anschließendes Testen der Aktivität des gewichteten Polymers gegen ein ungewichtetes Polymer wurde eine Untergruppe für jede Monomerposition in der Sequenz ausgewählt. Bei einem von Blake et al. durchgeführten Experiment wurde eine vollständige Kollektion von Tetrameren X_1P, X_2P X_3P X_4P durch 4 Hemmexperimente auf α₁ α₂ γ₃ α₄ reduziert. Dann wurden die Untergruppen α und γ jeweils weiter in drei Gruppen von Aminosäuren unterteilt, die zur Synthese von vier weiteren Kollektionen gewichteter Polymere verwendet wurden. Hemmstudien mit jeder dieser Kollektionen legten ein Epitop (F oder Y)₁(A oder L)₂(K oder R)₃(F oder Y)₄ nahe. Eine weitere Annäherung ergab das gewünschte Epitop FLRF.
Verfahren des Standes der Technik haben zwar einige Erfolge erzielt, stießen aber auch an bestimmte Beschränkungen. Zum Beispiel möchte man manchmal die Verwendung der Ausrüstung vermeiden, die zur Durchführung lichtgesteuerter Techniken benötigt wird. Zudem lieferten einige Verfahren des Standes der Technik nicht das gewünschte Ausmaß an Diversität mit der gewünschten Effizienz.
Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass ein besseres Verfahren zur Synthese einer verschiedenartigen Kollektion chemischer Sequenzen erwünscht ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung einer Polymerbank nach Anspruch 1 bereitgestellt.
Die Erfindung führt effizient zu Banken von Polymeren, die zur Identifikation der Monomersequenz von Polymeren verwendet werden können, die eine signifikante Bindung an einen Liganden aufweisen.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Bank von Polymeren hergestellt unter Verwendung von "Pool-" und "Nicht-Pool-" (oder "getrennten") Kupplungsschritten. Bei den Pool-Schritten wird jedes Monomer aus einem Basissatz an Monomeren an den Terminus einer wachsenden Kette von Monomeren an einer Mehrzahl zuvor vermischter fester Substrate gekuppelt. Die gemischten Substrate werden für das Kuppeln jedes einzelnen Monomers in einem Basissatz aufgeteilt. In getrennten Schritten werden die Substrate aus einem vorhergehenden Kupplungsschritt nicht vermischt, und jedes Monomer in einem Basissatz wird getrennt an den Terminus einer wachsenden Kette von Monomeren an einer Mehrzahl der unvermischten Substrate gekuppelt.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung haben die Pool- und die Nicht-Pool-Schritte eine derartige Reihenfolge, dass die Identifikation einer Monomersequenz, die an einen Rezeptor bindet, aus der Bank leicht identifiziert werden kann. Zum Beispiel stammen bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mehrere Gruppen von Produkten aus den Syntheseschritten. Jede Gruppe wird zur Identifikation des Monomers an einer spezifischen Position in der Polymerkette verwendet.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird die Bank unter Verwendung einer geordneten Abfolge von Kupplungsschritten konstruiert, bei denen die aus einem getrennten Schritt hervorgehenden Produkte anschließend nur Pool-Kupplungsschritten unterworfen werden. Aus einem Pool-Kupplungsschritt hervorgehende Produkte, die vorher nicht einem Nicht-Pool-Schritt unterworfen wurden, werden immer für die Pool- und die Nicht-Pool-Kupplung aufgeteilt. Diese geordnete Abfolge von Schritten führt zu einer vergleichsweise kleinen Anzahl Kupplungsschritte, ermöglicht aber immer noch die Identifikation der Monomersequenz eines Polymers, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist. Zum Beispiel wird eine erste Gruppe von Produkten zur Identifikation des Monomers an einer ersten Stelle in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor komplementär ist. Eine zweite Gruppe von Produkten wird zur Identifikation des Mo nomers an einer zweiten Stelle in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor komplementär ist.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Polymerbank kann zur Bereitstellung eines Polymerbank-Screeningkits verwendet werden. Das Kit enthält Familien von Polymeren X₃-X_2p-X_1p, X_3p-X₂-X_1p und X_3p-X_2p-X₁, wobei X_3p-X_2p-X₁ eine Kollektion von mindestens ersten und zweiten Polymergemischen enthält, wobei das erste Polymergemisch ein erstes Monomer in einer ersten Position von Polymermolekülen darin und andere Monomere in der zweiten und der dritten Position der Polymermoleküle darin besitzt und wobei das zweite Polymergemisch ein zweites Monomer in der ersten Position von Polymermolekülen darin und andere Monomere in der zweiten und der dritten Position der Polymermoleküle darin besitzt; X_3p-X₂-X_1p eine Kollektion von mindestens dritten und vierten Polymergemischen enthält, wobei das dritte Polymergemisch ein drittes Monomer in der zweiten Position und das vierte Polymergemisch ein viertes Monomer in der zweiten Position besitzt, wobei das dritte und das vierte Polymergemisch jeweils andere Monomere in der ersten und der dritten Position besitzen; und X₃-X_2p-X_1p eine Kollektion von mindestens fünften und sechsten Polymergemischen enthält, wobei das fünfte Polymergemisch ein fünftes Monomer in der dritten Position und das sechste Polymergemisch ein sechstes Monomer in der dritten Position besitzt, wobei das fünfte und das sechste Polymergemisch jeweils andere Monomere in der ersten und der zweiten Position besitzen, wobei das erste, dritte und vierte Monomer gleich oder verschieden sind und das zweite, vierte und fünfte Monomer gleich oder verschieden sind.
Die mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellte Polymerbank kann bei einem Verfahren zur Identifikation eines ersten und eines zweiten Monomers in einem Polymer verwendet werden, das zu einem Rezeptor komplementär ist. Das Verfahren zur Identifikation enthält die Schritte Kuppeln von ersten und zweiten Monomeren in einem ersten Basissatz an einzelne Substrate und Mischen der Substrate unter Erhalten eines Pools erster Produkte; Kuppeln der ersten und zweiten Monomere aus dem ersten Basissatz an einzelne Substrate und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalten von mindestens ersten und zweiten getrennten Produkten; getrenntes Kuppeln von ersten und zweiten Monomeren aus einem zweiten Basissatz an Substrate aus dem Pool erster Produkte und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalt von mindestens dritten und vierten getrennten Produkten, wobei der zweite Basissatz gleich oder verschieden von dem ersten Basissatz ist; Kuppeln der ersten und zweiten Monomere aus dem zweiten Basissatz an einzelne Substrate aus den ersten getrennten Produkten und Mischen der Substrate unter Erhalten eines Pools zweiter Produkte; Kuppeln der ersten und zweiten Monomere aus dem zweiten Basissatz an einzelne Substrate aus den zweiten getrennten Produkten unter Erhalten eines Pools dritter Produkte; und Aussetzen von einem Rezeptor den dritten und vierten getrennten Produkten zur Identifizierung von einem zweiten Monomer in einem Polymer, das zu einem Rezeptor komplementär ist, und Aussetzen des Pools zweiter und dritter Produkte dem Rezeptor zur Identifikation von einem ersten Monomer in einem Polymer, das zu einem Rezeptor komplementär ist.
Es wird auch eine Polymer-Screening-Technik unter Verwendung von Faktorierung offenbart.
Ein weitergehendes Verständnis der Art und der Vorteile der Erfindungen kann anhand der verbleibenden Teile der Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen erlangt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt/zeigen:
1a und 1b schematisch spezifische Ausführungsformen der Erfindung;
2 ein einfaches Reaktionsdiagramm;
3 ein Reaktionsdiagramm von einem Produktpool und getrennten Produkten;
4 ein vereinfachtes Reaktionsdiagramm;
5a, 5b und 5c eine Familie von Pool-Synthesen;
6 ein Reaktionsdiagramm zur Herstellung der Produkte X_3pX₂X_1p;
7 ein Reaktionsdiagramm für alle 64 Trinukleotide;
8 die Synthese von AAT, TGC, TGT, GTA, GTG und CCG;
9 eine alternative Darstellung der Erfindung;
10a, 10b und 10c eine rekursive Retrosynthese-Ausführungsform der Erfindung;
11a, 11b und 11c eine erfindungsgemäße kombinatorische Synthesekammer und
12 eine Polymerbank nach einer Ausführungsform der Erfindung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
INHALT

I. Terminologie
II. Gesamtbeschreibung
III. Auf das Screening angewendete polynomische Faktorierung
IV. Zusammenfassung

I. Terminologie
Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden, die mit der Erfindung untersucht werden können, sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren, Toxinen und Giften, Virusepitopen, Hormonen (z.B. Opiaten, Steroiden usw.), Hormonrezeptoren, Peptiden, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren, Arzneistoffen, Lektinen, Zuckern, Oligonukleotiden, Nukleinsäuren, Oligosacchariden, Proteinen und monoklonalen Antikörpern.
Monomer: Ein Element von dem Satz kleiner Moleküle, die miteinander verbunden sind oder verbunden werden können unter Erhalt eines Polymers. Der Satz von Monomeren beinhaltet zum Beispiel, ist aber nicht beschränkt auf den Satz üblicher L-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz synthetischer und/oder natürlicher Aminosäuren, den Satz von Nukleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen sowie Untergruppen davon. Die bestimmte Reihenfolge von Monomeren in einem Polymer wird hier als "Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie hier verwendet, bedeutet Monomer jedes Element von einem Basissatz zur Synthese eines Polymers. Zum Beispiel bilden Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren einen Basissatz von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden. Unterschiedliche Basissätze von Monomeren können in aufeinander folgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers eingesetzt werden. Zudem kann jeder der Sätze geschützte Elemente beinhalten, die nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung wird hier hauptsächlich im Hinblick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, die Sequenzen von Monomeren, wie Aminosäuren, enthalten, kann aber leicht auf die Herstellung anderer Polymer angewendet werden. Zu diesen Polymeren gehören zum Beispiel lineare und zyklische Polymere von Nukleinsäuren, Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden mit α-, β- oder ω-Aminosäuren, Heteropolymere, in denen ein bekannter Arzneistoff an eines der Vorstehenden kovalent gebunden ist, Polynukleotide, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethy lenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Polymere, die beim Lesen dieser Offenbarung deutlich werden. Solche Polymere sind "verschiedenartig", wenn Polymere mit unterschiedlichen Monomersequenzen an verschiedenen, zuvor festgelegten Regionen eines Substrats hergestellt werden. Verfahren zur Zyklisierung und zur Polymerumkehrung von Polymeren, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind in der gleichzeitig eingereichten Anmeldung offenbart mit der laufd. Nr. 796 727, eingereicht am 22. November 1991 mit dem Titel "POLYMER REVERSAL ON SOLID SURFACES", die hier für alle zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die "Position" eines Monomers in einem Polymer betrifft den Abstand, die Anzahl Monomere, von einem Terminus oder einer anderen Referenzstelle auf einem Polymer.
Peptid: Ein Polymer, in dem die Monomere α-Aminosäuren sind und über Aminobindungen verbunden sind, ersatzweise auch als Polypeptid bezeichnet. Im Kontext dieser Beschreibung sollte erkannt werden, dass die Aminosäuren das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer sein können. Peptide sind oft zwei oder mehr Aminosäuremonomere und oft mehr als 20 Aminosäuremonomere lang. Standardabkürzungen für Aminosäuren werden verwendet (z.B. P für Prolin). Diese Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, dritte Auflage 1988, enthalten, das hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Rezeptor: Ein Molekül mit Affinität zu einem gegebenen Liganden. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Moleküle sein. Sie können zudem im unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies eingesetzt werden. Rezeptoren können, kovalent oder nicht-kovalent, direkt oder über eine spezielle Bindungssubstanz, an ein Bindungselement gebunden werden. Beispiele für Rezeptoren, die bei der Erfindung eingesetzt werden können, sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf Antikörper, Zellmembranrezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, die mit spezifischen Antigendeterminanten (beispielsweise auf Viren, Zellen oder anderen Substanzen) reaktionsfähig sind, Arzneistoffe, Polynukleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Cofaktoren, Lektine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organellen. Rezeptoren werden im Stand der Technik manchmal als Anti-Liganden bezeichnet. Da hier der Begriff Rezeptor verwendet wird, ist keine andere Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn zwei Makromoleküle sich über molekulare Erkennung unter Bildung eines Komplexes verbinden.
Spezielle Beispiele für Rezeptoren, die mit der Erfindung untersucht werden können, sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf:

a) Mikroorganismen-Rezeptoren: Die Ermittlung von Liganden, die an Rezeptoren binden, wie spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben von Mikroorganismen wichtig sind, eignet sich für eine neue Klasse von Antibiotika. Von besonderem Wert wären Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoen und Bakterien, die gegen die zurzeit verwendeten Antibiotika resistent sind.
b) Enzyme: Zum Beispiel die Bindungsstelle von Enzymen, wie den für die Spaltung von Neurotransmittern verantwortlichen Enzymen; die Bestimmung von Liganden, die an bestimmte Rezeptoren binden und die Wirkung von Enzymen modulieren, die die verschiedenen Neurotransmitter spalten, ist zur Entwicklung von Arzneistoffen nützlich, die zur Behandlung von Neutrotransmissionsstörungen verwendet werden können.
c) Antikörper: Die Erfindung kann zum Beispiel zur Untersuchung der Ligandenbindungsstelle auf dem Antikörpermolekül nützlich sein, das sich mit dem Epitop eines Antigens von Interesse vereinigt; Bestimmen einer Sequenz, die ein Antigenepitop nachahmt, kann zur Entwicklung von Impfstoffen führen, deren Immunogen auf einer oder mehr dieser Sequenzen basiert, oder zur Entwicklung damit zusammenhängender Diagnostika oder Verbindungen führen, die sich für therapeutische Behandlungen eignen, beispielsweise für Autoimmunerkrankungen (z.B. durch Blockierung der Bindung der "Selbst"-Antikörper).
d) Nukleinsäuren: Sequenzen von Nukleinsäuren können zur Feststellung von DNA- oder RNA-bindenden Sequenzen synthetisiert werden.
e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die eine chemische Reaktion vorantreiben können, die die Umwandlung von einem oder mehr Reaktanten in ein oder mehr Produkte beinhaltet. Diese Polypeptide enthalten gewöhnlich eine Bindungsstelle, die für mindestens einen Reaktanten oder ein Reaktionszwischenprodukt spezifisch ist, und eine aktive Funktionalität in der Nähe der Bindungsstelle, die den gebundenen Reaktanten chemisch modifizieren kann. Katalytische Polypeptide und andere sind beispielsweise beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen WO 90/05746, WO 90/05749 und WO 90/05785, die hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen sind.
f) Hormonrezeptoren: Zum Beispiel die Rezeptoren für Insulin und Wachstumshormon. Die Ermittlung von Liganden, die mit hoher Affinität an einen Rezeptor binden, ist beispielsweise zur Entwicklung von einem oralen Ersatz für die täglichen Injektionen nützlich, die Diabetiker verwendet müssen, um die Diabetessymptome zu lindern, und ande rerseits von einem oralen Ersatz für das seltene menschliche Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder durch DNA-Rekombinationstechno-logie gewonnen werden kann. Weitere Beispiele sind die Rezeptoren für Vasokonstriktionshormon; die Ermittlung von Liganden, die an einen Rezeptor binden, kann zur Entwicklung von Arzneistoffen zur Regulation des Blutdrucks führen.
g) Opiatrezeptoren: Die Ermittlung von Liganden, die an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich zur Entwicklung weniger abhängig machender Ersatzstoffe für Morphin und verwandte Arzneistoffe.

Substrat oder fester Träger: Ein Material mit einer Oberfläche, das im Wesentlichen unlöslich in einer Lösung ist, die zum Kuppeln von Monomeren an eine wachsende Polymerkette verwendet wird. Diese Materialien haben vorzugsweise die Form von kleinen Perlen, Pellets, Scheiben oder andere geeignete Formen. Es können aber auch andere Formen verwendet werden. Eine etwa kugelförmige oder eiförmige Gestalt ist bevorzugt.
Basissatz: Eine Gruppe von Monomeren, die für die direkte oder indirekte Bindung an ein festes Substrat bei einem gegebenen Kupplungsschritt ausgewählt wird. Unterschiedliche Basissätze oder die gleichen Basissätze können bei einer Synthese von einem Kupplungsschritt zum nächsten verwendet werden.
Synthetisch: Mit chemischer oder enzymatischer In-vitro-Synthese hergestellt. Die erfindungsgemäßen synthetischen Banken stehen beispielsweise den in Virus- oder Plasmidvektoren konstruierten gegenüber, die in bakteriellen, Hefe- oder anderen lebenden Wirten vermehrt werden können.
Symbole

x_i

steht für den Satz von Monomereinheiten in Reaktionsrunde i.

x_ij

steht für die j. Monomereinheit in Reaktionsrunde i; x_ij kann Null (⌀) sein.

S_i

steht für die getrennten Produkte nach Reaktionsrunde i.

P_i

steht für den Produktpool der Runde i und aller vorhergehender Runden.

X_ip

steht für den Pool von Reaktanten aus nur der Runde i.

Reaktionsdiagramme
Ein ausgefüllter Kreis • steht für ein Reaktionsprodukt, das in einer bestimmten Monomereinheit x_ij endet. Der Satz von Reaktionsprodukten, der in x_i endet, ist durch einen Satz von Kreisen auf derselben horizontalen Ebene dargestellt.
Ausgefüllte Kreise, die miteinander reagieren, sind durch Geraden verbunden. Das Bilden von Pools ist durch Linien dargestellt, die sich darunter in einem offenen Kreis treffen.
Bei einer faktorierbaren polynomischen Synthese wird jede Monomereinheit einer Runde mit jedem Monomer der vorhergehenden Runde verbunden. In einem Diagramm von einer solchen Synthese ist jeder ausgefüllte Kreis auf einer Ebene mit jedem ausgefüllten Kreis der Ebene darüber verbunden. 7 zeigt zum Beispiel das Reaktionsdiagramm, das einer faktorierbaren 3-Runden-Synthese mit
X₁ = X₂ = X₃ = (A,T,G,C)
entspricht, die alle 64 Trinukleotide ergibt.
Dagegen fehlt bei einer unreduzierbaren (primären) polynomischen Synthese mindestens eine Linie in dem Diagramm der entsprechenden faktorierbaren polynomischen Synthese. Solche Synthesen sind in 8 nur für die Synthese von AAT, TGC, TGT, GTA, GTG und CCG dargestellt.
II. Gesamtbeschreibung
1 zeigt eine Gesamtdarstellung von einem Aspekt der Erfindung. Wie dort dargestellt, werden die Monomere A und B, die den gesamten oder einen Teil des ersten Basissatzes von Monomeren darstellen, an Substrate 2 in den Gefäßen 4a und 4b gekuppelt. Die Substrate in jedem der Gefäße 4a und 4b werden geteilt. Ein Teil der Substrate aus jedem Gefäß 4a und 4b wird im Gefäß 6 gemischt und für einen anschließenden Kupplungsschritt in die Gefäße 6a und 6b aufgeteilt. Eine weitere Fraktion der Monomere aus den Gefäßen 4a und 4b wird nicht gemischt, wie durch die Gefäße 10 und 12 angegeben.
Danach werden die Substrate an Monomere aus einem zweiten Basissatz C, D gekuppelt, der gleich dem Basissatz A, B sein kann oder nicht. Wie dargestellt, wird Monomer C an die gemischten oder den "Pool" von Substraten im Gefäß 6a gekuppelt, während das Monomer D an den "Pool" von Substraten im Gefäß 6b gekuppelt wird. Ein Teil der Produkte dieser Reaktionen kann für spätere Kupplungsschritte gemischt werden, aber zumindest ein Teil der Produkte in den Gefäßen 6a und 6b wird nicht gemischt.
Die Produkte in den Gefäßen 10 und 12 werden vorzugsweise jeweils für die Kupplung an Monomer C geteilt, wie in den Gefäßen 10b und 12b dargestellt. Die Substrate in den Gefäßen 10a und 12a werden für die Kupplung der Monomers D an die wachsende Polymerkette verwendet. Die Produkte der Reaktionen in den Gefäßen 10a und 10b werden gemischt oder gepoolt und in Gefäß 20 überführt. Die Produkte der Reaktionen in den Gefäßen 12a und 12b werden gemischt oder gepoolt und in Gefäß 22 überführt.
Die Produkte in den Gefäßen 20 und 22 werden anschließend zur Identifikation eines ersten Monomers in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist. Zu Veranschaulichung wird hier angenommen, dass die Monomersequenz AC zum Rezeptor R komplementär ist. Ein beispielsweise mit einer fluoreszierenden oder radiaktiven Markierung * markierter Rezeptor wird den Substanzen in den Gefäßen 20 und 22 ausgesetzt. Ungebundener Rezeptor wird von den festen Trägern abgetrennt. Die Bindung an die Substrate erfolgt nur mit den Substraten im Gefäß 20. Daher wird nur in Gefäß 20 Fluoreszenz beobachtet. Aus dieser Beobachtung kann man schließen, dass A das erste Monomer in einem komplementären Rezeptor ist, weil alle Polymere im Gefäß 22 das erste Monomer B enthalten. Dagegen enthalten alle Polymere in Gefäß 20 das erste Monomer A.
Der markierte Rezeptor wird auch den Polymeren in den Gefäßen 26a und 26b ausgesetzt. In diesem Fall wird Bindung des markierten Rezeptors nur im Gefäß 26a beobachtet. Also kann man das zweite Monomer in einer komplementären Sequenz als C identifizieren, weil keines der Polymere im Gefäß 26b das zweite Monomer C enthält. Dagegen enthalten alle Polymer im Gefäß 26a das zweite Monomer C. Daher kann man schließen, dass die Sequenz AC zu R komplementär ist, weil in den Gefäßen 26a und 20 eine Bindung beobachtet wird.
1b veranschaulicht Aspekte einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in mehr Einzelheiten mit einer größeren Polymerkette. Der in 1b gezeigten Ausführungsform zufolge wird in jedem Kupplungsschritt ein Basissatz von 3 Monomeren A, B und C verwendet. Die synthetisierten Polymere sollen drei Monomere lang sein. Der Fachmann erkennt, dass die Anzahl Monomere in einem Basissatz und die Anzahl Kupplungsschritte von einer Anwendung zur anderen breit variieren. Auch zwischengeschaltete Kupplungsschritte von beispielsweise gemeinsamen Monomersequenzen können bei einigen Ausführungsformen verwendet werden. Wird beispielsweise ein Polymer hier durch die Kennung "ABC" oder "ABE" dargestellt, soll dies so verstanden werden, dass andere gemeinsame Monomere hinzugefügt werden können, so dass ABDC und ABDE durch ABC und ABE wiedergegeben werden. Die in 1b gezeigte Ausführungsform wird nur zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt.
Siehe 1b: Die Synthese erfolgt an einer Mehrzahl Substrate 2. Unter einem bevorzugten Aspekt der Erfindung haben die Substrate 2 die Form von Perlen, beispielsweise aus Glas, Harzen, Kunststoffen oder dgl. Der Begriff "Perlen" wird hier austauschbar mit dem Wort "Substrat" verwendet. Es sollte aber selbstverständlich sein, dass die Perlen keine runde oder einförmige Gestalt annehmen müssen und die Form jedes geeigneten Substrats haben könne. Es sollte weiter selbstverständlich sein, dass die Substrate 2 nur im oberen Teil der 1b gezeigt sind, dass aber in jedem der in 1b gezeigten Reaktionsprodukte links von der Monomersequenz Substrate vorhanden sind. In jedem Gefäß in 1b sind alle möglichen Polymerprodukte aufgelistet. Viele "Kopien" jeder Sequenz sind in der Regel vorhanden.
Nach einer Ausführungsform werden herkömmliche Merrifield-Techniken zur Synthese von Peptiden verwendet, wie beschrieben in Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press (1989) beschrieben, das hier zuvor für alle Zwecke unter Bezugnahme aufgenommen wurde. Andere Synthesetechniken sind natürlich geeignet, werden andere Monomere verwendet. Zum Beispiel werden die in Gait et al., Oligonucleotide Synthesis, das hier zuvor für alle Zwecke unter Bezugnahme aufgenommen wurde, beschriebenen Techniken verwendet, sind die zu der wachsenden Polymerkette hinzuzufügenden Monomere Nukleotide. Diese Techniken dienen nur als Beispiele. Fortschrittlichere Techniken werden bei einigen Ausführungsformen verwendet, beispielsweise zur reversen und zyklischen Polymersynthese, die in der hier zuvor für alle Zwecke unter Bezugnahme aufgenommenen US-Anmeldung mit der laufd. Nr. 07/796 727 offenbart sind.
Eine große Zahl Perlen wird verwendet, so dass die Perlen in späteren Schritten in getrennte Reaktionsgefäße aufgeteilt werden können und trotzdem in ausreichender Zahl vorhanden sind, dass das Vorliegen eines komplementären Rezeptors nachgewiesen werden kann. Als allgemeine Regel ist gewünscht, dass das 10- bis 100-Fache der Anzahl kombinatorischer Möglichkeiten für die Synthese verwendet wird. So wird gewährleistet, dass jedes Element eines Satzes synthetisiert wird. Zudem gewährleistet die Verwendung einer großen Zahl Perlen, dass der Pool von Reaktionsprodukten in jedes folgende Reaktionsgefäß verteilt wird, wird eine gepoolte Gruppe von Perlen aufgeteilt.
Die Perlen sind vorzugsweise so klein wie möglich, so dass die Reaktionsgefäße und weitere bei dem Verfahren verwendete Ausrüstung zur Handhabung der Substanzen ebenfalls so klein wie möglich sein können. Vorzugsweise haben die Perlen einen Durchmesser von weniger als etwa 1 mm, vorzugsweise weniger als etwa 100 μm und stärker bevorzugt weniger als etwa 10 μm. Bei einigen Ausführungsformen erfolgt die Synthese in Lösung. Bei anderen Ausführungsformen wird die Synthese an festen Substraten durchgeführt. Die erhaltenen Polymere werden dann vor der Bindung an den Rezeptor von den Substraten abgespalten.
Siehe 1b: Die Monomere A, B und C werden an Substrate in drei Reaktionsgefäßen 4a, 4b bzw. 4c gekuppelt. Zur Verdeutlichung ist in 1b ein einziges Substrat gezeigt, aber man erkennt, dass in jedem Reaktionsgefäß eine große Zahl Perlen vorhanden ist. Also wird in jedem der Reaktionsgefäße 4a, 4b und 4c eine große Zahl "Kopien" der Substrate mit den jeweiligen daran gekuppelten Monomeren erzeugt. Man erkennt, dass die Monomere nicht direkt an das Substrat gekuppelt werden müssen. In den meisten Fällen werden Linkermoleküle zwischen den Monomeren und dem Substrat bereitgestellt, wie die in der US-Anmeldung mit der laufd. Nr. 07/624 120 beschriebenen, die hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist. Es sollte zudem erkannt werden, dass den Schritten in 1b andere Syntheseschritte vorausgehen oder nachfolgen können, sie kombinatorische Schritte unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken sein können oder nicht.
Danach wird eine Fraktion der Produkte in jedem Gefäß 4a, 4b und 4c vereinigt, gemischt und in jedes Reaktionsgefäß 6a, 6b und 6c erneut verteilt. Die verbleibenden Fraktionen der Produkte in den Gefäßen 4a, 4b und 4c werden nicht vereinigt. Stattdessen wird die verbleibende Fraktion der Produkte im Reaktionsgefäß 4a aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 8a, 8b und 8c überführt. Ebenso wird die verbleibende Fraktion der Produkte im Gefäß 4b aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 10a, 10b und 10c überführt. Die verbleibende Fraktion der Produkte im Reaktantengefäß 4c wird aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 12a, 12b und 12c überführt.
Die in die Gefäße 6a, 6b und 6c überführten Reaktanten werden hier als "Pool" von Reaktanten bezeichnet, weil sie ein Gemisch der Produkte umfassen, die aus dem vorhergehenden Kupplungsschritt hervorgehen. Die in die Gefäße 8, 10 und 12 überführten Reaktanten sind dagegen getrennte Reaktanten, weil sie keine Gemische der Produkte aus den vorhergehenden Kupplungsschritten sind. Einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zufolge werden die Reaktanten in den Gefäßen 8, 10 und 12 zunächst einem getrennten Kupplungsschritt unterworfen und dann nur noch den Pool-Kupplungsschritten. Dagegen werden in jedem anschließenden Kupplungsschritt die Pool-Reaktanten einem Kupplungsschritt unterworfen und für anschließende getrennte und Pool-Kupplungsschritte aufgeteilt.
Vorzugsweise werden die Reaktanten derart aufgeteilt, dass eine größere Fraktion der Perlen auf die Pool-Synthese verteilt wird. Siehe 9: Zum Beispiel gelangen 4/5 der Perlen in die erste Pool-Gruppe 905 und 1/5 in die Nicht-Pool-Gruppe 903.
Danach werden die Monomere A, B und C an die wachsende Polymerkette in den Reaktionsgefäßen 8a, 8b bzw. 8c gekuppelt. Die erhaltenen Polymere haben dann die Monomersequenz CA, CB und CC in den Reaktionsgefäßen 8a, 8b bzw. 8c. Die Produkte dieser Reaktionen werden dann im Reaktionsgefäß 9 gemischt oder gepoolt. Die Mischung wird in die Reaktionsgefäße 14a, 14b und 14c erneut verteilt. Die Monomere A, B und C werden erneut an die wachsende Polymerkette in den Gefäßen 14a, 14b bzw. 14c gekuppelt. Die Produkte dieser Reaktionen werden wiederum gemischt oder gepoolt und in Gefäß 16a überführt.
Ebenso werden die Monomere A, B und C an die wachsende Polymerkette in den Gefäßen 10a, 10b und 10c gekuppelt, dann im Gefäß 18 gemischt, aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 20a, 20b und 20c überführt. Die Monomere A, B und C werden erneut an die wachsende Polymerkette in den Gefäßen 20a, 20b bzw. 20c gekuppelt, gemischt und in Gefäß 16b überführt. Die Monomere A, B und C werden auch an die wachsende Polymerkette in den Reaktantengefäßen 12a, 12b bzw. 12c gekuppelt, gemischt und in Gefäß 21 überführt. Diese Produkte werden für die Reaktion mit den Monomeren A, B und C in die Gefäße 22a, 22b bzw. 22c aufgeteilt, gemischt und in Gefäß 16c überführt. Ein charakteristisches Merkmal der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sollte in der rechten Hälfte von 1b beachtet werden. Genauer gesagt, werden die Produkte von Kupplungsschritten anschließend immer gepoolt, wird aus den Produkten einer Reaktion einmal kein Pool gebildet (wie in den Gefäßen 8, 10 und 12).
Siehe den linken Teil von 1b: Der Reaktanten-Pool in den Gefäßen 6a, 6b und 6c wird an die Monomere A, B bzw. C gekuppelt, was zu den in den Gefäßen 26a, 26b und 26c gezeigten Produkten führt. Weil die Produkte in den Gefäßen 26a, 26b und 26c von einer "Kette" von Pool-Reaktionen herrühren, werden die Produkte für Pool- und getrennte Reaktionen aufgeteilt. Genauer gesagt, wird ein Teil der Substrate in den Gefäßen 26a, 26b und 26c vereinigt, gemischt und für Pool-Reaktionen mit den Monomeren A, B und C in die Gefäße 28a, 28b bzw. 28c aufgeteilt. Zusätzlich wird der verbleibende Teil der Produkte in den Gefäßen 26a, b und c jeweils getrennt aufgeteilt und in die Reaktionsgefäße 30a-c, 32a-c bzw. 34a-c überführt. Die Substanzen in den Gefäßen 30a, 32a und 34a werden an Monomer A gekuppelt, die Substanzen in den Gefäßen 30b, 32b und 34b an Monomer B und die Substanzen in den Gefäßen 30c, 32c und 34c an Monomer C. Weil die Produkte in den Gefäßen 30, 32 und 34 aus einer vorhergehenden getrennten Reaktion stammen, werden die Produkte in den Gefäßen 30, 32 und 34 gepoolt oder gemischt und in die Gefäße 36a, 36b bzw. 36c überführt.
Aus Gründen, die später noch erläutert werden, werden die Gefäße in Gruppe 42 zur Bestimmung der Identität des Monomers in der ersten Position in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor komplementär ist. Die Gefäße der Gruppe 44 werden zur Bestimmung der Identität des zweiten Monomers in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor komplementär ist. Die Gefäße der Gruppe 46 werden zur Bestimmung der Identität des dritten Monomers in einem Polymer verwendet, das zu einem Rezeptor komplementär ist.
Man nehme beispielsweise an, dass ein gegebener Rezeptor zu der Monomersequenz ABC komplementär ist, aber die Sequenz des komplementären Polymers nicht ab initio bekannt ist. Wird der Rezeptor mit einer geeigneten Markierung markiert, wie Fluorescein, und in jedes Gefäß der Gruppen 42, 44 und 46 eingebracht, wird Fluoreszenz nur in den Gefäßen 16c, 36b und 28c nachgewiesen, weil die Polymersequenz ABC nur in diesen Gefäßen zugegen ist. Fluoreszenz kann beispielsweise unter Verwendung der Verfahren nachgewiesen werden, die beschrieben sind in Mathies et al., US-Patent 4 979 824, das hier durch Bezugnahme für alle Zwecke vollinhaltlich aufgenommen ist.
Weil alle Polymere im Gefäß 16c das Monomer A in erster Position haben und keines der Polymere in den Gefäßen 16a oder 16b das Monomer A in erster Position hat, ist leicht zu bestimmen, dass das Monomer in der ersten Position eines komplementären Polymers das Monomer A ist. Weil alle Polymere im Gefäß 36b das Monomer B in zweiter Position haben, ist leicht bestimmbar, dass das Monomer B die zweite Position einer komplementären Polymersequenz einnehmen muss. Weil alle Polymere im Gefäß 28c das Monomer C in dritter Position haben, muss der komplementäre Rezeptor ein C an dritter Position haben. So ist leicht bestimmbar, dass die komplementäre Sequenz zu dem Rezeptor die Monomersequenz ABC hat.
Bei sorgfältiger Betrachtung der Sequenzen in den Gefäßgruppen 42, 44 und 46 kommt es ungeachtet der Monomersequenz, die zu dem Rezeptor von Interesse komplementär ist, in der Regel nicht zu Zweideutigkeiten. Zum Vergleich sei gesagt: Ist der Rezeptor von Interesse komplementär zu der Sequenz BBA, wird Fluoreszenz nur in den Gefäßen 16b, 36b und 28a ermittelt. Aus dieser Information wird deutlich, dass die komplementäre Monomersequenz BBA sein muss.
Die obige Ausführungsform veranschaulicht die Synthese von Pools von Gruppen von Polymeren durch Auftrennung in getrennte Gefäße und anschließendes Kuppeln und Mischen. Man erkennt, dass die nur zur leichteren Veranschaulichung erfolgt und dass bei einigen Ausführungsformen die Pools von Gruppen von Polymeren unter gesteuerten Bedingungen durch gleichzeitige Reaktion jedes an die Polymere zu kuppelnden Monomers in einem einzigen Reaktor synthetisiert werden. Es wird zudem erkannt, dass die obigen Syntheseschritte bei vielen Ausführungsformen durch vorhergehende, zwischengeschaltete und anschließende Kupplungsschritte ergänzt werden, die zur leichteren Veranschaulichung nicht dargestellt sind.
Das vorstehende Verfahren kann allgemein durch Anwendung einer geeigneten Nomenklatur dargestellt werden. Beispielsweise bezeichne X_i den Satz von Monomereinheiten, der in der Reaktionsrunde i an eine wachsende Polymerkette gebunden wird. Man nehme beispielsweise an, dass
X₁ = {L,G}
X₂ = {P,Y}
X₃ = {R,A}
Ein bestimmtes Monomer wird als x_ij bezeichnet. Zum Beispiel
X_3,1 = R
Die Reaktionsprodukte S₃ einer 3-Runden-Peptidsynthese werden kurz dargestellt durch
S₃ = X₃X₂X₁
S₃ wird bestimmt durch polynomisches Ausweiten einer Reaktion, wie in Fodor et al., Science (1991) 251:767–773 beschrieben, das hier für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen ist.
S₃ = (R + A)(P + Y)(L + G)
S₃ besteht also aus 8 Tripeptiden:
RPL, RYL, RPG, RYG, APL, AYL, APG und AYG
S_ij bezeichnet einen Satz von Reaktionsprodukten, der in der Monomereinheit x_ij endet. Im obigen System ist zum Beispiel
S₁₂ = G
S₂₁ = {PL,PG}
S₃₂ = {APL,AYL,APG,AYG}
Diese Drei-Runden-Synthese lässt sich auch durch ein Reaktionsdiagramm, wie in 2 gezeigt, darstellen. Jedes Reaktionsprodukt der Runde i ist durch einen ausgefüllten Punkt auf dergleichen horizontalen Ebene dargestellt. Jeder Punkt der Runde i ist mit jedem Punkt der vorhergehenden Runde und mit jedem Punkt der darauf folgenden Runde verbunden. Zum Beispiel ist der S₂₁ bezeichnende Punkt mit den Punkten für S₁₁ und S₁₂ und auch mit den Punkten S₃₁ und S₃₂ verbunden. Man beachte, dass Punkte auf der gleichen Ebene nie miteinander verbunden sind, weil sich per definitionem die Monomereinheiten einer Runde nicht vereinigen.
Es wird allgemein angenommen, dass die Produkte jeder Runde räumlich getrennt und zuordnenbar sind. Jeder kann leicht untersucht werden. Die Anzahl Verbindungen, die durch ein kombinatorisches System erzeugt wird, kann nach einigen Runden die Anzahl experimentell verfügbarer Behälter oder Gefäße sehr stark übersteigen. Dann ist es vorteilhaft, einen Pool der Produkte von mehr als einer Syntheserunde zu bilden. Zum Beispiel ergibt eine 5-Runden-Synthese unter Verwendung des Basissatzes von 20 Aminosäuren 20⁵ oder 3,2 × 10⁶ Pentapeptide. Bildet man dagegen von den Produkten der ersten beiden Runden einen Pool, ergeben die anschließenden drei Runden nur 8000 Sätze von Produkten. Beim Pool-Verfahren geht Information verloren, aber die Anzahl Produkte wird experimentell behandelbar.
Die obige Darstellung der kombinatorischen Synthese kann so modifiziert werden, dass der Pool-Effekt berücksichtigt wird. Nimmt man an, dass von den ersten beiden Runden der zuvor erwähnten 3-Runden-Synthese ein Pool gebildet wird. Das Reaktionsdiagramm mit Pool-Schritten ist in 3 dargestellt. Der Produktpool der Runde i ist zur Unterscheidung von den getrennten Produkten S_i mit P_i bezeichnet. In einem Reaktionsdiagramm ist der Pool durch dargestellt die Konvergenz der Linien von den S_i, von denen ein Pool gebildet wird. P_i ist dann als offener Kreis dargestellt.
Bei diesem Beispiel gilt:
P₁ = {L + G}
P₂ = {PL + PG + YL + YG}
S₃ = X₃P₂ = {RPL + RPG + RYL + RYG, APL + APG + AYL + AYG}
Das Pluszeichen verbindet die in einem Gemisch vorhandenen Produkte. Dagegen befinden sich durch Kommas getrennte Produkte in getrennten Behältern und sind räumlich zuordnenbar. Bei diesem Beispiel befinden sich der Produktpool der zweiten Runde in einem Behälter, aber die Produkte nach drei Runden in zwei Behältern. Eine Behälter enthält das Gemisch RPL + RPG + RYL + RYG, der andere Behälter das Gemisch APL + APG + AYL + AYG.
Dieses Reaktionsdiagramm kann vereinfacht werden. Man nehme an, dass P₁ an ein äquimolares Gemisch von x₂₁ und x₂₂ in einem einzigen Behälter gekuppelt wurde. Sind die Kupplungseffizienzen für alle Spezies gleich, sind die Mengen und Arten der erhaltenen Produkte die gleichen wie bei der Kupplung von P₁ mit x₂₁ und x₂₂ in getrennten Behältern und anschließendem Bilden eines Produktpools. Also sind Pools von Produkten und Pools von Reaktanten formal äquivalent, vorausgesetzt, dass die Reaktionen in einer im Wesentlichen homogenen Lösung erfolgen und die Kupplungseffizienzen im Wesentlichen gleich sind. Eine X₃P₂-Synthese kann somit am einfachsten durch das in 4 gezeigte Reaktionsdiagramm dargestellt werden.
Die Linie, die P₂ mit P₁ verbindet, bedeutet, dass alle Produkte in P₁ gleichermaßen an alle Reaktanten X₂ gekuppelt werden, entweder durch (1) Einstellen der Konzentrationen von Reaktanten oder (2) Treiben der Reaktionen bis zur Vollständigkeit in getrennten Behältern und anschließendes Bilden eines Pools. Bei Perlen oder einzelnen Partikeln gilt (2) öfter, so dass jedes Partikel nur für eine Art Produkt steht.
Zum Vergleich stellt sich die Synthese von 180 Pentapeptiden in Furka et al., "General Method for Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures", Int. J. Peptide Protein Res. (1991) 37:487-493, in der obigen Nomenklatur als S₅ = X₅P₄ dar, wobei X₁ = {A}, X₂ = {E,F,K}, X₃ = {E,P,K}, X₄ = {E,F,G,K} und X₅ = {E,G,K,L,P}. Die kombinatorische Peptidbanksynthese in Houghton et al., "Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research an Drug Discovery", Nature (1991) 354:84-86, ist S₆ = X₆X₅P₄, wobei X_i jeweils ein Satz von 18 natürlich vorkommenden Aminosäuren ist. Die S₆-Produkte befinden sich in 18 × 18 oder 324 Behältern, die jeweils ein Gemisch von 18³ = 5832 Hexapeptiden enthalten. Die Pool-Synthese in Lam et al., "A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity", Nature (1991) 354:82-84, wird unter Verwendung der obigen Nomenklatur als P₅ dargestellt, wobei X_i jeweils ein Satz von 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren ist. P₅ ist ein Gemisch von 19⁵ = 2,48 × 10⁶ Perlen, die jeweils eine Art Peptid tragen.
Bei den Pool-Synthesen von Houghton, Lam und Furka werden alle Produkte von Runde 1 bis Runde n gemischt. Bei der Furka-Synthese (X₅,P₄) wird ein Pool von den ersten vier Runden gebildet. Bei einer X₃P₂-Synthese wird ein Pool von den ersten beiden Runden gebildet.
Hier sind in den 5a, 5b und 5c repräsentative Pool-Synthesetechniken nach einer bevorzugten Ausführungsform dargestellt. Das Symbol X_ip bedeutet, dass von den Reaktanten der Runde i ein Pool gebildet wurde, aber nicht von den Reaktionsprodukten der vorhergehenden Runden. Dies wird beispielsweise durch (1) Mischen der Reaktanten X_i oder (2) durch Umsetzen jedes Elements von X_i mit jedem Reaktionsprodukt von S_i-1 erzielt, wie in 6 für X_3pX₂X_1p gezeigt.
Bei Pentapeptiden, die beispielsweise aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren hergestellt sind, ist eine Familie von fünf erfindungsgemäßen Pool-Synthesegruppen besonders nützlich:
Die Produkte aus jeder dieser fünf Syntheseproduktgruppen befinden sich in 20 physikalisch isolierten Behältern. Jeder Behälter enthält ein anderes Gemisch von 160000 Pentapeptiden. Wie bei dem in 1b gezeigten Trimer wird die Identität der Monomere, die ein komplementäres Pentamer bilden, unzweideutig ermittelt, indem ermittelt wird, welcher der 20 Behälter in jeder der fünf Syntheseproduktgruppen Bindung an einen Rezeptor zeigte.
Es sollte selbstverständlich sein, dass "Behälter" hier zwar zur Vereinfachung genannt werden, dass aber jede von einer Vielzahl Techniken zur physikalischen Trennung des Peptidgemischs oder anderer Polymergemische verwendet werden kann.
Genauer gesagt, wird eine Sequenz von Monomeren in einem komplementären Liganden für einen Rezeptor wie folgt identifiziert. Man betrachte beispielsweise die Familie gepoolter Tripeptidbanken aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren:
X₃X_2pX_1p X_3pX₂X_1p X_3pX_2pX₁
Die stärkste Aminosäure an der linken Position (x_3i) ergibt sich durch die Analyse der 20 Behälter von X₃X_2pX_1p; x_2j wird bestimmt durch Analyse von X_3pX₂X_1p, und x_1k wird durch Analyse von X_3pX_2pX₁ ermittelt. Die Sequenz des stärksten Tripeptids wird dann als x_3ix_2jx_1k vorausgesagt. Also enthüllt jede gepoolte Gruppe in der Bank die Identität eines Monomers an einer anderen Position in einem komplementären Polymer.
Man erkennt, dass es nicht immer wünschenswert ist, wenn die Identität der gesamten Monomersequenz in einem Polymer, das komplementär zu einem Rezeptor ist, bestimmt wird. Stattdessen ist es in einigen Fällen nur nötig, die Identität ausgewählter Monomere in dem Polymer zu ermitteln. Die Monomere von Interesse können sich an Stellen innerhalb der Polymerkette befinden und mit anderen Monomeren durchsetzt sein. Im allgemeineren Sinne liefert also das erfindungsgemäße Verfahren die Synthese einer Bank von Polymeren. Die Bank wird zur Identifikation von mindestens zwei Monomeren von Interesse in einer Polymerkette verwendet.
Die Identität des x_2j-Monomers wird beispielsweise ermittelt durch Analyse einer Bank von Polymeren T-X₂-I-X_1p-T; und die Identität des Monomers x_1k wird ermittelt durch Analyse einer Bank von Polymeren T-X_2p-I-X₁-T, wobei T endständige Gruppen an der Polymerkette darstellt, die Null-Gruppen sein können, und I für in der Polymerkette befindliche Gruppen steht, die ebenfalls Null-Gruppen sein können.
Das Verfahren zur Herstellung der Bank verwendete Pool- und getrennte Syntheseschritte. Die Polymere besitzen mindestens zwei Monomerstellen, an denen die Identität von Monomeren ermittelt werden soll, die ein Polymer mit einer zu einem Rezeptor komplementären Sequenz ergeben. Die Bank wird derart synthetisiert, dass die Produkte einer Pool-Synthese aufgetrennt und einer getrennten Synthese oder einer zweiten Pool-Synthese unterworfen werden. Die Produkte der getrennten Synthese werden einer Reihe von Pool-Synthesen unterzogen, bei bevorzugten Ausführungsformen ohne weitere getrennte Synthese. Dagegen werden die Produkte der zweiten Pool-Synthese aufgeteilt und einer getrennten und einer dritten Pool-Synthese unterzogen.
Die Syntheseschritte führen zu einer Bank von Polymeren mit mindestens ersten und zweiten Untergruppen. Die erste Untergruppe wird zur Ermittlung der Identität eines Monomers oder von Monomeren an einer ersten Stelle in der Polymerkette, die zu einem Rezeptor komplementär ist, verwendet. Die zweite Untergruppe der Bank wird zur Ermittlung der Identität eines Monomers oder von Monomeren an einer zweiten Stelle in der Polymerkette, die zu einem Rezeptor komplementär ist, verwendet.
Das Verfahren verwendet summierte Assays zur Identifikation optimaler Sequenzen. Die Aktivitätsverteilung in dem untersuchten Gemisch bleibt unbekannt. Nur die Aggregataktivität wird ermittelt. Mehr Informationen können aus Analysen von Perlen oder anderen Partikeln erhalten werden, die mehrere Kopien einer Art von Sequenz enthalten. Die Aktivität jeder Perle kann quantifiziert werden, obwohl ihre Identität unbekannt ist.
Man nehme an, dass Perlen mit 2 μm Durchmesser für eine Pool-Synthese verwendet werden. Einige Eigenschaften typischer Perlen sind:
Volumen = 4,2 μm³
Oberfläche = 12,6 μm²
Anzahl Zielstellen = 1,3 × 10⁵
(unter der Annahme von 1 pro 100 mm²)
Anzahl Perlen pro cm³ = 2,4 × 10¹¹
Fluoreszenzmessungen von Perlen, die schnell durch einen Laserstrahl strömen, erfolgen unter Verwendung von Techniken, wie denjenigen im US-Patent 4 979 824, das hier zuvor für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen wurde, die beispielhafte Verfahren zur Ermittlung der Verteilung von Aktivitäten in einer Pool-Synthese darstellen.
Man nehme an, dass ein Lichtstrahl von 2 μm Durchmesser zur Ermittlung fluoresceinmarkierter Perlen bei einer Flussrate von 20 cm/s verwendet wird. Die Durchgangszeit einer Perle durch den Strahl beträgt dann 10 μs. Die Emissionsrate von einem einzigen Chromophor kann bis zu 10⁸ s^-1 betragen. Sind 10% der Zielstellen besetzt, entspricht dies einer Emissionsrate von etwa 10¹² s^-1 oder 10⁷ emittierten Photonen in 10 μs, die leicht nachweisbar sind. Ist 10% des Probenvolumens von Perlen besetzt, durchläuft im Durchschnitt eine Perle alle 0,1 ms den Strahl. Also können 10⁴ Perlen pro Sekunde analysiert werden. Eine Bank von 3,2 × 10⁶ Perlen (die jeweils ein anderes Pentapeptid tragen) kann in etwa 6 Minuten analysiert werden.
Ersatzweise können die Perlen durch Ausbreiten auf einer Oberfläche analysiert werden. Zum Beispiel nehmen 3,2 × 10⁶ Perlen 1,28 × 10² μm² ein, wenn sie in eine quadratische Anordnung gepackt werden. In 1,28 cm² nähmen diese Perlen 10% der Oberfläche ein. Kleinere Perlen, z.B. 0,2 μm², ergäben ein ausreichendes Fluoreszenzsignal. Der Vorteil kleinerer Perlen ist, dass höhere Perlendichten verwendet werden können, was zu einer deutlichen Verringerung der für die Analyse benötigten Zeit führt.
Die Fluoreszenzimpulshöhenverteilung, die sich aus jeder Analyse ergibt, enthüllt, ob in der Perlenprobe viele oder wenige optimale Sequenzen enthalten sind. Im einfachsten Fall sieht man eine einzige helle Perle in nur einem Behälter einer Pool-Synthese. Die Identität der besten Sequenz ergibt sich dann direkt aus der Analyse jeder Pool-Synthese der Familie.
In anderen Fällen gibt es eine Verteilung von Intensitäten in mehreren Sätzen von Perlen. Als allgemeine Regel zeigen positionierte Banken, in denen sich eine Bindung in mehreren Behältern zeigt, dass eine bestimmte Position eine weniger signifikante Rolle bei der Bindung spielt. Bei einigen Ausführungsformen werden Positionen, an denen eine Zweideutigkeit ermittelt wird, durch die VLSIPS^TM-Technik weiter untersucht. Die VLSIPS^TM-Arrays variieren nur an den Positionen, an denen das Monomer nicht zweifelsfrei ermittelt wurde. Die Erfindung wird daher bei einigen Ausführungsformen dazu verwendet, die Anzahl an Polymeren zu verringern, die mittels VLSIPS^TM gescreent werden.
In anderen Fällen werden in mehreren Behältern synthetisierte Polymermischungen von ihren jeweiligen Perlen abgespalten und dann auf ihre Aktivität untersucht. Die freigesetzten Polymere können dann mit Rezeptoren in verschiedenen Ausrichtungen wechselwirken. Die Aktivität dieser Polymere kann mit verschiedenen bekannten Techniken untersucht werden, wie ELISA.
9 zeigt eine alternative Beschreibung der Erfindung. Dorf wird im Schritt 901 eine Kollektion von Substraten Pool- und getrennten Kupplungsschritten unterzogen, wodurch der Pool von Produkten und die getrennten Produkte 905 bzw. 903 erhalten werden. Verglichen mit der in 1b gezeigten Ausführungsform sind die Produkte 903 analog zu den in den Gefäßen 8, 10 und 12 gezeigten Produkten. Die Produkte 905 sind analog zu den Produkten in Gefäß 6. Die Kollektion von Substratprodukten 903 wird dann den Pool-Kupplungsschritten 903, 905, 907 und 909 unterzogen, d.h. die anschließenden Kupplungsschritte der getrennten Reaktanten sind nur Pool-Kupplungsschritte. Also wird die Identität des Monomers an der ersten Position eines Polymers, das zu einem Rezeptor komplementär ist, durch Untersuchung der Produkte 907 bestimmt.
Dagegen wird der Pool von Produkten 905 aufgeteilt und den Pool- und getrennten Kupplungsschritten 909 unterzogen, woraus sich der Pool von Produkten 907 bzw. die getrennten Produkte 913 ergeben. Wie die getrennten Produkte 903, werden die getrennten Produkte 913 anschließend nur Pool-Kupplungsschritten unterzogen, was zu den Pools von Produkten 915 und 917 führt. Die Produkte 917 werden zur Ermittlung des Monomers in einer zweiten Position in einem Polymer, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet.
Ebenso wird der Pool von Produkten 907 aufgeteilt und den Pool- und getrennten Kupplungsschritten 919 unterzogen, woraus sich der Pool von Produkten 923 bzw. die getrennten Produkte 921 ergeben. Die getrennten Produkte 923 werden anschließend nur einer Pool-Reaktion unterzogen, wobei die Produkte 925 zur Ermittlung des Monomers in einer dritten Position in einem Polymer, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet werden. Der Pool von Produkten 921 wird aufgeteilt und den Pool- und getrennten Reaktionen 927 unterzogen, was zu dem Pool von Produkten 929 bzw. den getrennten Produkten 931 führt. Die Produkte 907, 917, 925, 931 und 929 werden zur Identifikation komplementärer Rezeptoren verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird anhand des Pools von Produkten 927 zunächst ermittelt, ob überhaupt Polymere von Interesse zugegen sind. Die getrennten Produkte 931 werden zur Ermittlung der Identität eines Monomers in einer vierten Position in einem Polymer, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet.
Siehe 9: Pools von Produkten, die keinen vorhergehenden getrennten Reaktionen unterworfen wurden, werden hier erfindungsgemäß aufgeteilt und Pool- und getrennten Reaktionen unterzogen. Dagegen werden Produkte, die aus einem vorhergehenden getrennten Kupplungsschritt hervorgehen, nur Pool-Kupplungsschritten unterzogen.
Bei einer in den 10a–10c dargestellten anderen Ausführungsform wird eine rekursive Retrosynthese für das Screening eines Satzes verschiedenartiger Polymere verwendet. Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen rekursiven Retrosyntheseverfahren von Houghton et al. identifiziert dieses Verfahren die Sequenz eines "besten" Polymers durch Identifikation einer Kollektion von Polymeren ("Bank"), die die Perle enthält, die das stärkste Signal ergibt. Dagegen identifizieren Houghton et al. die gesamte Bank und nicht das einzelne Polymer (die Perle) mit dem stärksten Signal. Also kann die Technik von Houghton et al. ein falsches Monomer in der Sequenz von Interesse identifizieren, weil die Bank, die das Monomer enthält, das stärkste Signal lieferte, während sich das "beste" Polymer in einer anderen Bank befindet. Die erfindungsgemäße Ausführungsform der rekursiven Retrosynthese beseitigt diese Schwierigkeit des Verfahrens von Houghton et al., indem das einzelne Polymer identifiziert wird, das das stärkste Signal liefert.
Siehe 10a–10c: Es ist ein Beispiel für dieses Verfahren beschrieben für den Satz aller Pentamere, die aus einem Basissatz von 50 Monomeren gebildet werden. Siehe 10a: Die gesamte Kollektion von Quadrameren wird an einer Anzahl Perlen (z.B. 3 × 10⁸ Perlen) durch vier Zyklen von abwechselndem Aufteilen, Umsetzen und Bilden eines Pools der Perlen synthetisiert. Der Pool von Quadrameren wird dann in 50 Behälter aufgeteilt, die jeweils mit einem anderen Element des Basissatzes umgesetzt werden, wobei 50 Behälter von Pentameren erhalten werden, die jeweils nur die Pentamere enthalten, die in einem bestimmten Monomer enden. Mit der hier verwendeten Kennzeichnung wird diese Polymerkollektion als X_1P X_2P X_4P X_5(1-50) dargestellt. Die einzelnen Perlen in jedem Behälter werden dann untersucht, wodurch die einzelne beste Perle (d.h. die Perle, die das stärkste Signal nach Bindung an den Rezeptor von Interesse liefert) identifiziert wird. Dies kann in etwa acht Stunden beispielsweise mittels FACS, wie oben be schrieben, erreicht werden. Nachdem der Behälter mit der Perle, die das stärkste Signal ergibt, ermittelt wurde, ist die Identität des Monomers in der fünften Position bekannt. Bei dem Beispiel in 10 ist dieses Monomer D.
Dann wird die vollständige Kollektion von Trimeren wie zuvor hergestellt (z.B. aus 6 × 10⁶ Perlen) durch Zyklen von Aufteilen, Umsetzen und Bilden eines Pools der Perlen, wie in 10b dargestellt. Ersatzweise kann die Trimerbank nach dem dritten Zyklus des vorhergehenden Schritts (während der Bildung der vollständigen Pentamerbank) beiseite gelegt werden. An diesem Punkt wird der Pool von Perlen in 50 Behälter aufgeteilt, die jeweils mit einem anderen Element des Basissatzes umgesetzt werden. Die Quadramere in jedem Behälter werden dann mit D umgesetzt, so dass eine Kollektion von Perlen hergestellt wird, die durch X_1P X_2P X_3P X_4(1-50)D dargestellt wird. Die Perlen in jedem Behälter werden dann erneut untersucht, und die Perle, die das stärkste Signal liefert, wird identifiziert. Der Behälter, aus dem diese Perle entnommen wurde, identifizierte das Monomer an der nächsten Position: In diesem Falle A. Das obige Verfahren wird wiederholt unter Bildung von X_1P X_2P X_3(1-50)AD, und das Monomer an der nächsten Position wird identifiziert, wie in 10c dargestellt. Bei diesem Beispiel wird als nächstes Monomer Q identifiziert. Die abschließenden zwei Monomere der Sequenz können auf die gleiche Weise identifiziert werden. Es kann jedoch effizienter sein, wenn die verbleibenden 2500 möglichen Pentamere mit einer VLSIPS^TM-Technik gescreent werden.
Bei einem Polymer der Länge N, das aus einem Basissatz von n Monomeren synthetisiert wurde, kann das endständige Monomer in der Regel mit dem folgenden Verfahren identifiziert werden. Zunächst wird eine Pool-Bank von Substraten derart gebildet, dass auf jedem Substrat ein anderes Polymer synthetisiert wird. Die Pool-Bank enthält eine Kollektion von Polymeren, die durch X_1pX_2p ... X_(N-1)p dargestellt wird. Die Bank wird in n getrennte Behälter aufgeteilt, die dann jeweils mit einem anderen Monomer umgesetzt werden, wodurch eine Bank X_1pX_2p ... X_(N-1)pX_N(1-n) erhalten wird. Schließlich wird ein Rezeptor dem Substrat in jedem der n getrennten Behälter ausgesetzt, und der Behälter, der das Polymer enthält, das am stärksten an den Rezeptor bindet, wird identifiziert. Dieser Behälter liefert die Identität des Monomers in der Position X_N. Das vorletzte Monomer wird mit einem ähnlichen Verfahren aus X_1pX_2p ... X_(N-1) _(1-n)R identifiziert, wobei R das zuvor identifizierte endständige Monomer ist. Jedes darauf folgende Monomer kann auf die gleiche Weise identifiziert werden. Bei diesem Beispiel enthielten die beiden Basissätze, die zur Identifikation der Monomere an den Positionen N und N-1 verwendet wurden, jeweils n Elemente. Man erkennt, dass die Monomer-Basissätze, die zur Identifikation des Monomers an jeder Position auf dem Polymer verwendet werden, von dem anderen Basissätzen unabhängig sein können.
Eine kombinatorische Synthesekammer zur Durchführung der Synthese-, Pool- und Aufteilschritte, die bei jedem erfindungsgemäßen Zyklus eingesetzt werden, ist in 11a–11c dargestellt. Einzelne Kammern 200, die jeweils eine bestimmte Menge gepackte Perlen 203 enthalten, sind nahe beieinander unter Bildung eines zweidimensionalen Arrays angeordnet. Die Reaktionskammern 200 sind auf einer Basis 207 über Durchgänge 211 befestigt. Ein Filter 213 ist am Grund jeder Kupplungskammer 200 vorgesehen und verhindert, dass die Perlen die Kupplungskammern 200 verlassen, werden Lösungen durch die Durchgänge 211 abgelassen. Im Synthesemodus werden Kupplungslösungen durch die Passagen 205 eingebracht, wobei die Abdeckung 201 geschlossen ist (wie in 11a dargestellt). Der Inhalt jeder Kammer 200 wird durch die Abdeckung 201 daran gehindert, mit benachbarten Kammern in Kontakt zu kommen. Die Durchgänge 205 und 211 werden über Ventile oder andere nicht gezeigte Regelmechanismen geregelt.
Nachdem die Kupplungsreaktionen bis zu dem gewünschten Ausmaß abgelaufen sind, werden die Kupplungslösungen aus der Synthesekammer durch die Durchgänge 211 abgelassen. Anschließende Waschschritte können vor dem Bilden eines Pools und der Wiederverteilung notwendig sein. Bei diesen Waschschritten werden Waschlösungen durch die Durchgänge 205 eingebracht, wobei die Abdeckung geschlossen ist. Nach einer ausreichenden Zeitspanne wird die Waschlösung durch die Durchgänge 211 abgelassen. Mehrere Waschschritte können durchgeführt werden, wenn nötig, wodurch ungebrauchte Kupplungslösungen aus den Kammern 200 entfernt werden. Bei den Umsetzungs- und Waschschritten können die Perlen in den Reaktionskammern durch Drehen oder Schütteln der gesamten Synthesekammer durchmischt werden.
Siehe 11b: Das Bilden eines Pools und das Aufteilen der Perlen erfolgt durch Wegschieben der Abdeckung 201 von der Basis 207 unter Bildung einer Mischkammer 215. Die zuvor gepackten Perlen 203 werden dann in einer Flüssigkeit gerührt, so dass sie sich in der Mischkammer 215 mischen. Schließlich, nachdem das Rühren gestoppt wurde, setzen sich die Perlen zufallsgemäß in verschiedenen Kammern 200 ab. An diesem Punkt kann die Suspensionslösung durch die Durchgänge 211 abgelassen werden. Der Deckel 201 kann abgesenkt werden, so dass er auf den Oberseiten der Kammer 200 ruht, wie in 11a gezeigt. Bei den Pool- und Aufteilschritten sind die Ventile in den Durchgängen 205 und 211 geschlossen. Eine Dichtungsvorrichtung 209 ist vorgesehen, so dass Perlen oder Flüssigkeit die Synthesekammer nicht verlassen können.
11c zeigt eine Aufsicht auf einen zweidimensionalen Array von Reaktionskammern 200, die auf einer Basis 207 befestigt sind. 49 Kammern sind in einem 7 × 7-Array angeordnet.
12 veranschaulicht eine Bank von Polymeren, die erfindungsgemäß verwendbar ist. Die Polymere besitzen eine Reihe von mit p_i bezeichneten Monomerpositionen. Die Monomere besitzen mindestens zwei Positionen von Interesse, p₁ und p₂, die bei einigen Ausführungsformen durch verschiedene dazwischen liegende Monomere getrennt sein können und an die auch verschiedene Endgruppen gebunden sein können. Die Monomere werden in eine Reihe physikalisch voneinander isolierter Behälter oder Gefäße 1002 eingebracht, die verbunden sein können, wie bei einer Mikrotiterplatte. Die Behälter/Gefäße können auch getrennte Behälter sein, wie Teströhrchen, Mikrotitertabletts oder dgl.
Ein erster Behälter 1002a enthält Polymere mit einem ersten Monomer M₁ in der ersten Position p₁ in jedem der Polymere darin. Die Polymermoleküle im ersten Behälter haben jedoch eine Reihe von Monomeren, wie M₁, M₂ und M₃, in der zweiten Position p₂. In dem zweiten Behälter 1002b befindet sich ein zweites Monomer M₂ in der ersten Position p₁ in jedem der Polymere darin, und unterschiedliche Monomere, wie M₁, M₂ und M₃, befinden sich in der zweiten Position p₂. In dem dritten Behälter 1002c befindet sich ein drittes Monomer M₃ in der ersten Position p₁ in jedem der Polymere darin, und unterschiedliche Monomere, wie M₁, M₂ und M₃, befinden sich in der zweiten Position p₂. Der erste, zweite und dritte Behälter umfasst alle oder einen Teil einer Kollektion von Behältern ...X₁...X_2p....
Dagegen enthält der vierte Behälter 1002d Polymere mit einem ersten Monomer M₁ in der zweiten Position p₂ in jedem der Polymere darin. Die Polymermoleküle im ersten Behälter haben eine Reihe verschiedener Monomere, wie M₁, M₂ und M₃, in ihrer ersten Position p₁. In dem fünften Behälter 1002e befindet sich ein zweites Monomer M₂ in der zweiten Position p₂ in jedem der Polymere darin, und unterschiedliche Monomere, wie M₁, M₂ und M₃, befinden sich in der ersten Position p₁. In dem sechsten Behälter 1002f befindet sich ein drittes Monomer M₃ in der zweiten Position p₂ in jedem der Polymere darin, und unterschiedliche Monomere, wie M₁, M₂ und M₃, befinden sich in der ersten Position p₁. Der vierte, fünfte und sechste Behälter umfasst alle oder einen Teil einer Kollektion von Behältern ...X_1p...X₂....
Bei Screening-Studien werden die Behälter 1002a, 1002b und 1002c zur Bestimmung der Identität des Monomers in Position 1 eines Polymers, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet. Die Behälter 1002d, 1002e und 1002f werden zur Bestimmung der Identität des Monomers in Position 2 eines Polymers, das zu einem Rezeptor von Interesse komplementär ist, verwendet.
Man erkennt, dass die Polymere, die einem Screening mit den obigen Verfahren unterzogen werden, eine breit schwankende Länge und Zusammensetzung haben können. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die Polymermoleküle zum Beispiel länger als 3 Monomereinheiten, vorzugsweise länger als 5 Monomereinheiten, stärker bevorzugt länger als 10 Monomereinheiten und am stärksten bevorzugt länger als 20 Monomereinheiten. In 12 ist zwar eine vereinfachte Bank gezeigt, aber man erkennt, dass bei den meisten Ausführungsformen die Bank zusätzliche Polymerbehälter enthält, so dass Monomere an mehr als 3 Positionen, vorzugsweise mehr als 5 Positionen, stärker bevorzugt mehr als 10 Positionen und am stärksten bevorzugt mehr als 20 Positionen in einem zu einem Rezeptor komplementären Polymer ermittelt werden können.
III. Auf das Screening angewendete polynomische Faktorierung
Bei einigen Ausführungsformen wird eine Population aller möglichen Polymere mit einer Länge n synthetisiert. Wird gefunden, dass ein Rezeptor an ein Polymer in dem Gemisch bindet, wird eine zweite Synthese ausgeführt, bei der die Polymere "faktoriert" werden, d.h. zwei Behälter gebildet werden, die jeweils die Hälfte der zu Beginn synthetisierten Population aufweisen. Dann wird bestimmt, welcher der beiden Behälter Bindung an den Rezeptor zeigt, wobei der Behälter, der Bindung zeigt, als "Zielgruppe" bezeichnet wird. Es wird noch eine Synthese durchgeführt, bei der zwei Behälter jeweils mit der Hälfte der Population der Zielgruppe in dem früheren Behälter erzeugt werden. Das Verfahren wird wiederholt, bis die Sequenz des Polymers oder der Polymere, die Bindung an die Rezeptoren zeigen, ermittelt worden ist.
Genauer gesagt, stellt die Erfindung die Synthese einer Population bereit:
Diese Lösung wird faktoriert als:
wobei:
Führt P₁ zu einem "Treffer", wird P₁ faktoriert. Führt P₂ zu einem "Treffer", wird P₂ faktoriert. Jede Synthese erfordert nur die Hälfte der Anzahl Polymere, die im vorhergehenden Schritte hergestellt wurde.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Polymerbank, umfassend: Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren X¹ und X² in einem ersten Basissatz an einzelne Substrate, wobei auf den Substraten wahlfrei ein Linker L vorhanden ist, und Mischen der Substrate unter Erhalt eines Pools erster Produkte der Struktur S-L-X_1p; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem ersten Basissatz an einzelne Substrate, wobei auf dem Substrat wahlfrei ein Linker vorhanden ist, und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalt von mindestens ersten und zweiten getrennten Produkten der Struktur S-L-X¹ bzw. S-L-X²; getrenntes Kuppeln von mindestens der ersten und der zweiten Monomeren X³ und X⁴ aus dem zweiten Basissatz an Substrate aus dem Pool erster Produkte S-L-X_1p und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalt von mindestens dritten und vierten getrennten Produkten der Struktur S-L-X_1p-X³ und S-L-X_1p-X⁴; getrenntes Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren X³ und X⁴ aus dem zweiten Basissatz an Substrate aus dem Pool erster Produkte S-L-X_1p und Mischen der Substrate unter Erhalt eines Pools zweiter Produkte der Struktur S-L-X_1p-X_2p; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem zweiten Basissatz an einzelnen Substraten aus den ersten getrennten Produkten S-L-X¹ und Mischen der Substrate unter Erhalt eines Pools dritter Produkte der Struktur S-L-X¹-X_2p; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem zweiten Basissatz an einzelnen Substraten aus dem zweiten getrennten Produkten S-L-X² und Mischen der Substrate unter Bildung eines Pools vierter Produkte der Struktur S-L-X²-X_2p; getrenntes Kuppeln von mindestens ersten und der zweiten Monomeren X⁵ und X⁶ aus dem dritten Basissatz an Substraten aus dem Pool zweiter Produkte S-L-X_1p-X_2p und Nicht-Mischen der Substrate unter Erhalt mindestens fünfter und sechster getrennter Produkte der Struktur S-L-X_1p-X_2p-X⁵ und S-L-X_1p-X_2p-X⁶; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem dritten Basissatz an einzelnen Substraten aus den dritten getrennten Produkten S-L-X_1p-X³ und Mischen der Substrate unter Bildung eines Pools fünfter Produkte der Struktur S-L-X_1p-X³-X_3p; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem dritten Basissatz an einzelnen Substraten aus den vierten getrennten Produkten S-L-X_1p-X⁴ und Mischen der Substrate unter Bildung eines Pools sechster Produkte der Struktur S-L-X_1p-X⁴-X_3p; Kuppeln von mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem dritten Basissatz an einzelnen Substraten aus dem Pool dritter Produkte S-L-X¹-X_2p und Mischen der Substrate unter Bildung eines Pools siebter Produkte der Struktur S-L-X¹-X_2p-X_3P; und Kuppeln der mindestens ersten und zweiten Monomeren aus dem dritten Basissatz an einzelnen Substraten aus dem Pool vierter Produkte S-L-X²-X_2p und Mischen der Substrate unter Bildung eines Pools achter Produkte der Struktur S-L-X²-X_2p-X_3p; wobei Zwischengruppen wahlfrei gekoppelt werden können zwischen benachbarten X-Resten der Polymere und einer Endgruppe, die wahlfrei an den letzten X-Rest des Polymers gekoppelt sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Monomere Aminosäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Monomere Nukleotide sind.