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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich allgemein auf Träger-Reporterkügelchen-Anordnungen
und ihre Verwendung in Verbindung mit Oligomerbibliotheken, die
durch ein kombinatorisches Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
gebildet werden können,
sowie auf ein Verfahren zum Decodieren von Molekülen, die in solchen Oligomerbibliotheken
hergestellt werden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
in der kombinatorischen Chemie sind bereits in Bezug auf die Bildung
von Peptidbibliotheken bekannt, wie bei Gallop et al., 1994, J.
Med. Chem. 37, 1233-1251, diskutiert wird; dies bezieht sich auf
die Synthese von Peptidbibliotheken durch die Verwendung von Polystyrolkügelchen,
welche am Anfang als erste Charge vorhanden sind, die in kleinere
Chargen aufgeteilt wird, wobei verschiedene Aminosäuren kovalent
an eine primäre
Linkergruppe gebunden sind, die sich auf der Oberfläche jedes
Kügelchens
befindet. Anschließend
werden die Kügelchen
rekombiniert und dann wieder aufgeteilt, so dass eine zweite Aminosäure an die
Aminosäure,
die an die primäre
Linkergruppe gebunden ist, gebunden sein kann. Dieser Vorgang wird
so oft wiederholt, wie es erforderlich ist, um die Peptidbibliothek
herzustellen.
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Ein ähnliches
Verfahren, das sich auf die Herstellung einer Oligonucleotidbibliothek
bezieht, ist bei Gallop et al., 1994 (siehe oben), beschrieben.
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"Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-" oder "Aufteilungs-Synthese"-Verfahren, die Bibliotheken
mit jeweils einer Verbindung an einem (Harz)Kügelchen erzeugen, wurden zuerst
bei Furka et al., 1991, Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487-493, vorgeschlagen
und werden auch diskutiert bei Eichler et al., 1995, Medicinal Research
Reviews 15(6), 481-496, und Balkenhohl et al., 1996, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 35, 2288-2337.
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Peptidbibliotheken
werden hauptsächlich
bei der Wirkstoffsuche verwendet, wie bei Gallop et al., 1994 (siehe
oben), diskutiert wird, wobei potentiell nützliche Wirkstoffe durch Screening-Verfahren
identifiziert werden, wie in der Technik bekannt ist. Dies wird
auch berichtet bei Borman Chemical & Engineering News, Februar 1997,
43-62, Fruchtel et al., 1996, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35, 17-42, und Barany et
al., 1987, In. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739.
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Oligonucleotidbibliotheken
andererseits sind nützlich
als Werkzeug für
die schnelle DNA-Sequenzierung durch Hybridisierung, wie es diskutiert
wird bei Fodor et al., 1991, Science, 251, 767, Lysov et al., 1988,
Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 303, 1508, Bains et al., 1988, J. Theor.
Biol., 135, 303, Drmanac et al., 1989, Genomics 4, 114, und Drmanac
et al., 1993, Science, 260, 1649.
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Es
wurde vorgeschlagen, Sequenzierung-durch-Hybridisierung (SBH) anstelle
der herkömmlichen
DNA-Sequenzierungstechnik zu verwenden, die ein aufwändiges Verfahren
ist, das die elektrophoretische Trennung markierter DNA-Fragmente
nach der Größe beinhaltet.
SBH verwendet einen Satz kurzer Oligonucleotidsonden mit definierter Sequenz,
um an einem längeren
DNA-Zielstrang nach komplementären
Sequenzen zu suchen. Das Hybridisierungsmuster wird verwendet, um
die Ziel-DNA-Sequenz zu rekonstruieren.
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Das
Problem beim Einsatz von SBH-Techniken als praktikables Verfahren
zur Sequenzierung von DNA besteht darin, dass eine äußerst große Zahl von
Sonden erforderlich ist. Neue Verfahren sind vorgeschlagen worden,
um dieses Problem zu überwinden,
wie es bei Fodor et al., 1991 (siehe oben), Pease et al., 1994,
Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 5022, Cho et al., 1993, Science 261,
1303, und Southern et al., 1992, Genomics 13, 1008, diskutiert ist.
Diese neuen Verfahren beinhalten die Verwendung von Oligonucleotidrastern
oder "biologischen
Chips", wie es bei
Fodor et al., 1991 (siehe oben), diskutiert ist; diese beherbergen
spezielle chemische Verbindungen (d.h. die Sonden) an genauen Stellen
in einem Rasterformat. Dann wird die Ziel-DNA zu dem Sondenraster
gegeben. Das Hybridisierungsmuster, das in einem einzigen Experiment
bestimmt wird, offenbart direkt die Identität aller komplementären Sonden,
wie es bei Drmanac et al., 1989 (siehe oben), und Drmanac et al.,
1993 (siehe oben), berichtet wird. Obwohl diese Technik vielversprechend
ist, ist die Informationsdichte auf jedem Raster für den Zweck
der DNA-Sequenzierung äußerst gering,
und dies schränkt
die Größe und Geschwindigkeit
ein, mit der DNA-Fragmente sequenziert werden können. Die Schwierigkeiten,
die mit der selektiven Verankerung von Oligonucleotidsequenzen an
speziellen und räumlich
angeordneten Stellen auf dem Substrat verbunden sind, bedeuten,
dass die minimale Pixelgröße in den
Rastern zur Zeit auf eine Fläche
von ungefähr
0,4 mm × 0,4
mm beschränkt
ist. Da die Pixelgröße direkt
die Informationsdichte und damit die Sequenzierungseffizienz bestimmt,
ist die Miniaturisierung der "biologischen
Chips" ein größeres technisches
Problem, um diese Technologie als schnelles Sequenzierungsverfahren
einzusetzen. Ein Verfahren, um dieses Problem zu überwinden,
ist die Verwendung einer Technik, die "feldinduzierte kolloidale Kristallisation" erfordert, wie es
bei Trau et al., 1996, Science 272, 706, berichtet wird. Diese Technik
verwendet miniaturisierte Chips von in Mustern angeordneten mikroskopischen
kolloidalen Teilchen, die chemisorbierte Oligonucleotide auf einer
transparenten Elektrode, die Indiumzinnoxid umfasst, enthalten. Fluoreszente
Muster der Hybridisierung unbekannter DNA-Sequenzen mit den Rastern
werden mit Hilfe eines Lichtmikroskops beobachtet.
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Vor
dem Aufkommen der Technik von Trau et al., 1996 (siehe oben), wurde
SBH zuvor durchgeführt,
indem man Ziel-DNA an einer Oberfläche befestigte und nacheinander
mit einem Satz von Oligonucleotidsonden testete, jeweils nur eine
auf einmal, wie es bei Drmanac et al., 1989 (siehe oben), Drmanac
et al., 1993 (siehe oben), und Strezoska et al., 1991, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 88, 10089, diskutiert wird; dies war zeitraubend
und ineffizient.
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Die
Anwendung von herkömmlichen
Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren auf die Wirkstoffsuche und
SBH ist jedoch zur Zeit durch die inhärente Schwierigkeit eingeschränkt, die
einzigartige Sequenz von Ereignissen, die auf jedes gewählte multimere
Molekül
anwendbar ist, schnell und bequem zu identifizieren. Für große Zahlen
von Trägern
und große
Zahlen von Schritten und/oder Verarbeitungsverfahren ist dieses "Identifizierungsverfahren" besonders schwierig.
In vielen praktischen Fällen,
wo ein hoher Durchsatz und eine schnelle Analyse erforderlich sind,
lässt sich
dieses Problem mit herkömmlichen
Verfahren nicht lösen.
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Die
oben genannten herkömmlichen
Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Techniken machten Schwierigkeiten, wenn
man ein interessierendes Molekül
nachweisen und isolieren wollte. In dieser Hinsicht war es notwendig,
das interessierende Molekül
durch die Verwendung eines geeigneten Assay oder einer geeigneten
Sonde nachzuweisen und dann das interessierende Molekül zu isolieren, indem
man dieses Molekül
von dem Kügelchen
abspaltete und anschließend
das Molekül
durch Techniken wie Massenspektroskopie oder HPLC identifizierte.
Dies war zeitraubend und aufwändig,
und in manchen Fällen
war das Abspalten nicht möglich.
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Es
sei Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung WO 93/06121, die
sich auf ein allgemeines stochastisches Verfahren zum Synthetisieren
von Bibliotheken von statistischen Oligomeren bezieht, die auf festen
Trägern
einschließlich
Polystyrolkügelchen
synthetisiert werden oder die von diesen Trägern abgespalten werden können, so
dass man eine lösliche
Bibliothek erhält.
Die Oligomere bestehen aus einer Sequenz von Monomeren, die unter
Bildung eines Oligomers oder Polymers miteinander verbunden sein
können.
Diese Literaturstelle beschreibt auch die Verwendung von Identifikationsmarkern,
um die Sequenz von Monomeren in dem Oligomer zu identifizieren.
Der Identifikationsmarker kann mit oder ohne begleitendes Teilchen
direkt an das Oligomer, an einen an das Oligomer gebundenen Linker,
an den Festphasenträger,
an dem das Oligomer synthetisiert wird, oder an ein zweites Teilchen, das
an das oligomertragende Teilchen gebunden ist, gebunden sein. Das
einzige Befestigungs mittel, das in dieser Literaturstelle beschrieben
ist, ist jedoch die kovalente Bindung. In dieser Literaturstelle
wird der Identifikationsmarker sehr allgemein beschrieben als jedes
erkennbare Merkmal; dazu gehören
eine mikroskopisch unterscheidbare Form, Größe, Farbe oder optische Dichte;
eine differentielle Extinktion oder Lichtemission; chemische Reaktivität; magnetisch
oder elektronisch codierte Information; oder jedes andere Unterscheidungsmerkmal
mit der erforderlichen Information, das auf dem Niveau von einem oder
wenigen festen Trägern
entzifferbar ist. In einer Form werden die Identifikationsmarker
als kleine Kügelchen
mit erkennbar unterschiedlichen Formen, Größen oder Farben oder mit Strichcodemarkierungen
beschrieben.
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Während sich
die Beschreibung der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 jedoch
sehr allgemein auf die Arten von Identifikationsmarkern bezieht,
die bei dem Verfahren zur Bildung von Oligomerbibliotheken verwendet
werden können,
ist der einzige experimentelle Beweis, der in der Beschreibung genannt
wird, die Verwendung von Oligonucleotiden. Es gibt also keine ausreichende
Offenbarung speziell in Bezug auf die Verwendung von kleinen Kügelchen
als Identifikationsmarker und darauf, wie diese besondere Technik
in die Praxis umgesetzt werden kann.
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In
der Internationalen Veröffentlichung
WO 93/06121 wird eine Identifizierung der Marker durch Sequenzieren
oder Hybridisierung erwähnt,
falls der Marker ein Oligonucleotid ist. Man kann auch den Oligonucleotid-Marker
durch PCR amplifizieren. Man wird sich jedoch darüber im Klaren
sein, dass solche Identifizierungsverfahren zeitraubend und ineffizient sind.
Zum Beispiel kann die Verwendung von PCR zu einer PCR-Produkt-Kontaminierung
führen,
die es notwendig macht, weitere Maßnahmen einzuführen, um
dieses Problem zu überwinden,
wie in der Internationalen Veröffentlichung
Nr. WO 93/06121 beschrieben ist. Es ist auch notwendig, amplifizierte DNA
zu sequenzieren, und dies beinhaltet einen zusätzlichen Schritt im Identifizierungsverfahren,
wie in der Internationalen Veröffentlichung
Nr. WO 93/06121 beschrieben ist.
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Es
sei auch Bezug genommen auf das US-Patent Nr. 5,721,099, das komplexe
kombinatorische chemische Bibliotheken von mit Markern codierten
Verbindungen beschreibt. Jede Verbindung in der Bibliothek wird
durch eine einzige Reaktionsfolge hergestellt und ist an einen individuellen
festen Träger
gebunden, der Teilchen oder Kügelchen
einschließlich
Polystyrolkügelchen
oder Silicagelkügelchen
umfassen kann. An jeden festen Träger ist eine Kombination von
vier unterscheidbaren Identifikatoren gebunden, die sich voneinander
unterscheiden. Die Kombination liefert eine spezielle Formel, die eine
Markerkomponente, die der Analyse zugänglich ist, und eine Verknüpfungskomponente,
die selektiv unter Freisetzung der Markerkomponente gespalten werden
kann, umfasst. Jeder Identifikator oder jede Kombination davon codiert
Information in einem besonderen Stadium in der Reaktionsfolge für die an den
festen Träger
gebundene Verbindung. In dieser Bibliothek ist es jedoch wesentlich,
dass jede Markerkomponente vor der Analyse vom Träger abgespalten
werden muss, so dass wenigstens ein zusätzlicher Schritt entsteht,
der zeitraubend und ineffizient ist, und somit gelten dieselben
Nachteile wie bei der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 auch im
Falle dieser Literaturstelle.
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Was
die Verwendung einzelsträngiger
Identifikationsmarker zum Codieren einer kombinatorischen Peptidsynthese
betrifft, wobei dieses Verfahren bei Needles et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90, 10700-10704, diskutiert wird, so war dieses Verfahren
wegen der Gründe,
die oben bei der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 diskutiert wurden,
nachteilig. Es wird jedoch auch festgestellt, dass es nach dem Nachweis
eines Peptids oder Moleküls
innerhalb der interessierenden Bibliothek in manchen Fällen notwendig
war, den entsprechenden Marker vom Träger abzuspalten und den Marker durch
PCR zu amplifizieren, da er nur in Spuren vorhanden war. Dies war
ebenfalls zeitraubend und ineffizient.
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Es
sei auch Bezug genommen auf photolabile oder elektrophoretische
Markierung, wie sie bei Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 890, 10922-10926,
oder Gallop et al., 1994 (siehe oben), beschrieben ist, was wegen
der Einführung von
zusätzlichen
Schritten vor der Identifizierung des Markers ebenfalls nachteilig
war.
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Ziel der Erfindung
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung aus
einem Träger
und einem oder mehreren Reporterkügelchen bereitzustellen, wobei
die Anordnung verwendet werden kann, um eine synthetische Oligomerbibliothek
zu bilden, zweckmäßigerweise,
doch nicht ausschließlich, durch
ein kombinatorisches Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Oligomerbibliothek
bereitzustellen, wobei ein interessierendes Molekül in der
Bibliothek direkt identifiziert oder decodiert werden kann, ohne
dass ein vorausgehender Schritt erforderlich ist wie im Stand der Technik.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird eine Anordnung aus einem Träger bereitgestellt,
an den ein oder mehrere Reporterkügelchen nichtkovalent gebunden
sind.
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Eine
solche Anordnung kann in vielen Anwendungen verwendet werden, wie
in Verfahren der kombinatorischen Chemie, die kein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
beinhalten. Vorzugsweise jedoch werden solche Anordnungen in Verfahren
der kombinatorischen Chemie verwendet, die ein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
beinhalten.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bildung der
obigen Anordnung bereitgestellt, das den Schritt der nichtkovalenten Bindung
von einem oder mehreren Reporterkügelchen an einen Träger umfasst.
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Gemäß noch einem
anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung
einer Bibliothek von synthetischen Oligomeren, die eine Vielzahl
an Molekülen
umfasst, welche eine Vielzahl verschiedener chemischer Gruppen aufweisen,
bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
- (i) Binden einer entsprechenden chemischen Gruppe
an einen Träger
in jedem von einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen,
- (ii) Binden eines Reporterkügelchens
an den Träger
in nicht-kovalenter Weise in jedem Reaktionsgefäß, wobei jedes Reporterkügelchen
einen damit verbundenen Marker aufweist,
- (iii) Vereinigen der Träger
aus jedem Reaktionsgefäß, die aus
den Stufen (i) und (ii) erhalten werden, in einem Rekombinationsgefäß,
- (iv) Aufteilen der Träger
aus dem Rekombinationsgefäß auf die
Vielzahl von Reaktionsgefäßen, worin
die Stufen (i) und (ii) wiederholt werden, und
- (v) Wiederholen der Stufen (iii) und (iv), bis die Bibliothek
von Molekülen
ausgebildet ist, wobei jedes Molekül ein damit verbundenes einzigartiges Signal
aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen
von Markern abhängig
ist, um die direkte Identifizierung der Abfolge von chemischen Gruppen,
welche das Molekül umfasst,
zu erleichtern,
wobei Stufe (ii) vor oder gleichzeitig
mit Stufe (i) durchgeführt
werden kann.
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In
Bezug auf das oben Gesagte wird man sich darüber im Klaren sein, dass sich
der Ausdruck "chemische
Gruppe" auf die
chemischen Einheiten oder Struktureinheiten bezieht, die im Hinblick
auf die Synthese des Moleküls
eine nach der anderen hinzugefügt
werden. In Bezug auf die Bildung eines Oligopeptids oder Polypeptids
sind es zum Beispiel die einzelnen Aminosäuren, die die chemischen Gruppen
ausmachen. In einem anderen Beispiel in Bezug auf die Synthese eines Oligonucleotids
sind es die Grundnucleotide oder Bausteine des Oligonucleotids,
die die chemischen Gruppen ausmachen.
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Die
Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf eine Oligomerbibliothek,
die eine Vielzahl von verschiedenen Molekülen mit einer Vielzahl von verschiedenen
chemischen Gruppen umfasst und durch das oben genannte Verfahren
hergestellt wurde.
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Die
Erfindung bezieht sich in noch einem weiteren Aspekt auf eine Oligomerbibliothek,
die eine Vielzahl von verschiedenen Molekülen umfasst, wobei jedes Molekül an einen
entsprechenden Träger gebunden
ist und wobei außerdem
eine Vielzahl von Reporterkügelchen
bereitgestellt wird, die in nichtkovalenter Weise an den Träger und/oder
an benachbarte Reporterkügelchen
gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Reporterkügelchen
einen damit verbundenen Marker zur Identifizierung der chemischen
Gruppe, die an den Träger
gebunden ist, sowie zur Identifizierung der Position in der Abfolge
der chemischen Gruppe relativ zu anderen chemischen Gruppen in jedem
Molekül
aufweist, wobei jedes Molekül
ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei
das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängig ist,
um die direkte Identifizierung jedes Moleküls zu erleichtern.
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Die
Verwendung des Ausdrucks "direkt" in diesem Zusammenhang
bedeutet, dass jedes Molekül
identifiziert werden kann, ohne dass ein vorheriger Schritt notwendig
ist einschließlich
des Abspaltens des Moleküls
von dem Träger
und der Amplifikation durch PCR oder durch die Verwendung von Hybridisierung
oder Sequenzierung, wie im Stand der Technik, insbesondere in der
Internationalen Veröffentlichung
WO 93/06121.
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Der
Vorteil der direkten Identifizierung jedes Moleküls bedeutet, dass ein solches
Molekül
dann in herkömmlicher
Weise synthetisiert werden kann, sobald die einzigartige Kombination
von chemischen Gruppen, die mit jedem Molekül verbunden sind, bekannt ist.
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Im
Hinblick auf den Stand der Technik wird man sich darüber im Klaren
sein, dass eine effiziente direkte Identifizierung oder Decodierung
eines interessierenden Moleküls
nicht erfolgen konnte, da molekulare Marker, die kovalent an den
Träger
gebunden waren, gewöhnlich
nicht nachweisbar waren, es sei denn, sie wurden vom Träger abgespalten
oder im Falle von Nucleinsäuren
amplifiziert. Die Verwendung von molekularen Markern schränkt auch
die maximal mögliche
Größe von chemischen
Bibliotheken, die codiert werden kann, ein. Obwohl im Stand der
Technik darauf hingewiesen wurde, dass kleine Reporterkügelchen
an größeren Trägerkügelchen befestigt
werden könnten,
war dies nicht möglich, und
abgesehen von kovalenter Bindung wurde kein Verfahren vorgeschlagen,
um dieses Ergebnis zu erreichen. In Wirklichkeit konnte eine permanente
Bindung von Reporterkügelchen
an Träger
nicht erreicht werden, es sei denn, nichtkovalente Kräfte wären in Betracht
gezogen worden, wie im Falle der vorliegenden Erfindung.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde jetzt bewiesen, dass durch nichtkovalente Bindung eines
Reporterkügelchens
an einen Träger
eine effiziente Bindung oder Adhärenz
des Reporterkügelchens
an den Träger
erreicht werden kann, so dass die direkte Identifizierung oder Decodierung
eines interessierenden Moleküls
innerhalb der Oligomerbibliothek erleichtert wird. Ein Beispiel
für eine
nichtkovalente Bindung ist die Verwendung von elektrostatischen
Kräften,
wobei Oberflächenladungen
entweder am Träger,
am Reporterkügelchen
oder an beiden induziert werden können.
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Aus
Gründen
der Zweckmäßigkeit
haben die Erfinder jedoch herausgefunden, dass die Verwendung von
kolloidalen Teilchen als Reporterkügelchen die nichtkovalente
Bindung der Reporterkügelchen an
den Träger
sehr erleichtert. Eine geeignete Definition von kolloidalen Teilchen
ist bei Hunter genannt (R.J. Hunter, 1986, "Foundations of Colloid Science", Oxford University
Press, Melbourne).
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Wenn
sich eine Substanz unter Bildung einer echten Lösung in einer anderen löst, haben
die Teilchen des gelösten
Stoffes also molekulare Abmessungen. Der Radius des gelösten Moleküls beträgt in diesen
Fällen
selten mehr als einen Nanometer und gewöhnlich weniger. Lösungsmittel-
und gelöste
Moleküle
sind von vergleichbarer Größe, und
die gelösten
Moleküle
werden gewöhnlich
gleichmäßig im gesamten
(kontinuierlichen) Lösungsmittel
dispergiert. Es gibt jedoch eine wichtige Klasse von Materialien, bei
denen die Einheiten, die im gesamten Lösungsmittel dispergiert sind,
sehr viel größer sind
als die Moleküle
des Lösungsmittels.
Solche Systeme werden kolloidale Dispersionen genannt. Die großen Teilchen,
die in solchen Systemen vorhanden sind, werden als Kolloide bezeichnet.
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Die
Größe solcher
Kolloide variiert stark (je nach dem untersuchten System). Typischerweise
ist ein kolloidales Teilchen definiert als ein beliebiges Teilchen
(d.h. Materieteilchen), das eine mikroskopische Abmessung hat (d.h.
eine Abmessung, die kleiner ist als mit dem bloßen Auge sichtbar). Ein Merkmal
von kolloidalen Systemen besteht darin, dass die Kontaktfläche zwischen
den dispersen Teilchen und dem Dispersionsmedium oder zwischen mehr
als einem dispergierten Teilchen relativ groß ist.
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Wegen
ihrer makroskopischen Natur zeigen kolloidale Teilchen Wechselwirkungskräfte, die
von denen molekularer Systeme ganz verschieden sind. Für kolloidale
Kräfte
beziehen wir uns auf die Standarddefinition, die in Lehrbüchern verwendet
wird, wie Hunter, 1986 (siehe oben), oder Russel et al., 1989, "Colloidal Dispersions", Cambridge University Press,
Cambridge.
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Wenn
solche Teilchen sich einander nähern oder
wenn sie sich einer anderen Oberfläche nähern, unterliegen sie einer
Vielzahl von makroskopischen (d.h. nichtkovalenten) physikalischen
Kräften.
Beispiele für
solche Kräfte,
obwohl keineswegs eine vollständige
Liste, sind die folgenden:
- (i) van-der-Waals-Kräfte (Anziehungskräfte, die aus
einer intrinsischen van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen Kolloiden
resultieren);
- (ii) elektrostatische Kräfte
(anziehende oder abstoßende
Wechselwirkung, die aus der Oberflächenladung auf den kolloidalen
Teilchen resultiert);
- (iii) sterische Kräfte
(anziehende oder abstoßende Wechselwirkung,
die aus der Oberflächenbeschichtung
von Polymeren resultiert; und
- (iv) Brückenbildungsausflockung
(Anziehungskräfte,
die aus dem Austausch von adsorbierten Polymersträngen von
einem Kolloid zu einem anderen resultieren).
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Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass die nichtkovalente Bindung von Reporterkügelchen
an Träger
im Vergleich zu einer kovalenten Bindung von Reporterkügelchen
und molekularen Markern an Träger
erhebliche Vorteile hat. Die nichtkovalente Bindung von Reporterkügelchen
an Träger funktioniert
also wegen der Nutzbarmachung von kolloidalen Kräften. Eine kovalente Bindung
ohne Optimierung der beteiligten kolloidalen Kräfte zwischen Reportern und
Trägern übersteht
möglicherweise nicht
die Vorgänge,
die mit einer kombinatorischen Synthese verbunden sind. Reporter
wie kleine Kügelchen
müssen
ausreichend groß sein,
um genügend Fluorophore
(zum Beispiel) zu enthalten, so dass man sie leicht nachweisen kann
(d.h. wenigstens 500 Fluorophormoleküle pro Kügelchen). Dies bedeutet, die
Kügelchen
müssen
viel größer sein
als ein Molekül,
das eine kovalente Bindung eingeht. Wenn die kleinen Kügelchen
kovalent an einen Träger
gebunden wären,
gäbe es
nur wenige Bindungen, die einen größeren Reporter halten. Die
kleinen Kügelchen würden durch
Reiben gegen andere Träger
sehr schnell losgelöst,
wenn keine kolloidalen (d.h. nichtkovalenten) Kräfte beteiligt wären.
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Die
nichtkovalente Bindung stört
nicht die chemische Synthese, abgesehen davon, dass sie einen Teil
der verfügbaren
Oberfläche
besetzt. Die kovalente Bindung von Markern wie in dem oben diskutierten
Stand der Technik bedeutet die Durchführung von zusätzlichen
chemischen Schritten in jedem Stadium des chemischen Verfahrens.
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Die
nichtkovalente Bindung von kleinen Kügelchen an den Träger kann
relativ leicht durchgeführt
werden, indem man Träger
in einem Lösungsmittel
mit Reportern mischt. Die Verwendung von nichtkovalent gebundenen
Reportern bedeutet, dass keine Artefakte innerhalb der Marker oder
Liganden durch Wechselwirkung zwischen denselben erzeugt werden.
Außerdem
müssen
die kleinen Reporterkügelchen
zum Decodieren nicht abgespalten und chemisch analysiert werden.
Dadurch wird Zeit und Geld gespart.
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Die
Erfindung hat auch eine Kapazität,
die Sequenz von Reaktionsschritten zu bestimmen, wenn eine größere Zahl
von Vorgängen
oder Schritten beteiligt sind, wie im Folgenden noch ausführlich beschrieben
wird.
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Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass die Zahl der Marker, die verwendet werden können, relativ
klein ist und in den meisten Fällen
gleich neun oder weniger sein kann, wie ebenfalls aus der folgenden
Beschreibung hervorgeht.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Oligomer" hat dieselbe Bedeutung
wie in der Internationalen Veröffentlichung
WO 93/06121 diskutiert und kann daher eine Sequenz von Monomeren
umfassen, die beliebige Elemente einer Menge von Molekülen sind, die
unter Bildung eines Oligomers oder Polymers miteinander verbunden
werden können,
d.h. Aminosäuren,
Carbonate, Sulfone, Sulfoxide, Nucleoside, Kohlenhydrate, Harnstoffe,
Phosphonate, Lipide, Ester oder Kombinationen davon.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Oligomer" umfasst auch eine
Vielzahl von anorganischen Einheiten, die in einer besonderen Sequenz
miteinander verbunden sind. Beispiele für anorganische Einheiten sind
Silicate und Aluminosilicate.
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Die
Erfindung umfasst in einem anderen Aspekt auch ein Verfahren zum
Decodieren von Molekülen,
die vom Verfahren der Erfindung codiert werden, wobei das Verfahren
den Schritt der Analyse der Reporterkügelchen, wie er im Folgen den
beschrieben ist, umfasst, um die einzigartige Sequenz der chemischen
Gruppen, die jedes der Moleküle
ausmachen, zu bestimmen.
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Man
wird sich daher darüber
im Klaren sein, dass in einem anderen Aspekt der Erfindung ein Verfahren
zur Identifizierung eines besonderen Moleküls, das eine bestimmte einzigartige
Sequenz hat, durch das oben beschriebene Decodierungsverfahren bereitgestellt
wird.
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Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass sich die im Folgenden beschriebene bevorzugte Ausführungsform
zwar auf die Bildung von Oligonucleotiden oder Oligopeptiden bezieht,
wobei Nucleotide oder Aminosäuren
den oben diskutierten chemischen Gruppen entsprechen, sich das Verfahren
der Erfindung jedoch auf die Bildung von Oligomeren oder Polymeren
aus identischen Monomereinheiten oder die Bildung von relativ komplexen
Molekülen oder
Makromolekülen
aus individuellen oder verschiedenen chemischen Gruppen oder Komponenten
anwenden lässt,
wie aus der oben diskutierten Bedeutung von "Oligomer" hervorgeht.
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Insbesondere
lässt sich
das Verfahren der Erfindung auf jeden Typ von chemischer Reaktion anwenden,
die auf einem festen Träger
durchgeführt werden
kann, und umfasst daher zum Beispiel:
- (i) [2+2]-Cycloadditionen
einschließlich
des Einfangs von Butadien;
- (ii) [2+3]-Cycloadditionen einschließlich der Synthese von Isoxazolinen,
Furanen und modifizierten Peptiden;
- (iii) Acetalbildung einschließlich der Immobilisierung von
Diolen, Aldehyden und Ketonen;
- (iv) Aldolkondensation einschließlich der Derivatisierung von
Aldehyden, Synthese von Propandiolen;
- (v) Benzoinkondensation einschließlich der Derivatisierung von
Aldehyden;
- (vi) Cyclokondensationen einschließlich Benzodiazepinen und Hydantoinen,
Thiazolidinen, β-Schleifen-Mimetika,
Porphyrinen, Phthalocyaninen;
- (vii) Dieckmann-Cyclisierung einschließlich der Cyclisierung von
Diestern;
- (viii) Diels-Alder-Reaktion einschließlich der Derivatisierung von
Acrylsäure;
- (ix) elektrophile Addition einschließlich der Addition von Alkoholen
an Alkene;
- (x) Grignard-Reaktion einschließlich der Derivatisierung von
Aldehyden;
- (xi) Heck-Reaktion einschließlich der Synthese von disubstituierten
Alkenen;
- (xii) Henry-Reaktion einschließlich der Synthese von Nitriloxiden
in situ (siehe [2+3]-Cycloaddition);
- (xiii) katalytische Hydrierung einschließlich der Synthese von Pheromonen
und Peptiden (Hydrierung von Alkenen);
- (xiv) Michael-Reaktion einschließlich der Synthese von Sulfanylketonen,
Bicyclo[2.2.2]octanen;
- (xv) Mitsunobu-Reaktion einschließlich der Synthese von Arylethern,
Peptidylphosphonaten und Thioethern;
- (xvi) nucleophile aromatische Substitutionen einschließlich der
Synthese von Chinolonen;
- (xvii) Oxidation einschließlich
der Synthese von Aldehyden und Ketonen;
- (xviii) Pausen-Khand-Cycloaddition einschließlich der Cyclisierung von
Norbornadien mit Pentinol;
- (xix) photochemische Cyclisierung einschließlich der Synthese von Helicenen;
- (xx) Reaktionen mit metallorganischen Verbindungen einschließlich der
Derivatisierung von Aldehyden und Acylchloriden;
- (xxi) Reduktion mit komplexen Hydriden und Sn-Verbindungen einschließlich der
Reduktion von Carbonyl, Carbonsäuren,
Estern und Nitrogruppen;
- (xxii) Soai-Reaktion einschließlich der Reduktion von Carboxygruppen;
- (xxiii) Stille-Reaktionen einschließlich der Synthese von Biphenylderivaten;
- (xxiv) Stork-Reaktion einschließlich der Synthese von substituierten
Cyclohexanonen;
- (xxv) reduktive Aminierung einschließlich der Synthese von Chinolonen;
- (xxvi) Suzuki-Reaktion einschließlich der Synthese von Phenylessigsäure-Derivaten; und
- (xxvii) Wittig-, Wittig-Horner-Reaktion einschließlich Reaktionen
von Aldehyden, Pheromonen und Sulfanylketonen.
-
Es
sei auch Bezug genommen auf Patel et al., April 1996, DDT 1(4),
134-144, das sich auf die Herstellung oder Synthese von N-substituierten
Glycinen, Polycarbamaten, Mercaptoacylprolinen, Diketopiperazinen,
HIV-Protease-Inhibitoren, 1,3-Diolen, Hydroxystilbenen, B-Lactamen,
1,4-Benzodiazepin-2,5-dionen, Dihydropyridinen und Dihydropyrimidinen
bezieht.
-
Es
sei auch Bezug genommen auf die Synthese von Polyketiden, wie sie
bei Rohr, 1995, Angew. Int. Ed. Engl. 34, 881-884, diskutiert wird.
-
Die
Träger
zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung sind zweckmäßigerweise
polymere Träger,
wie polymere Kügelchen,
die vorzugsweise aus Polystyrol, das mit 1 bis 5% Divinylbenzol
vernetzt ist, gebildet werden. Trägerkügelchen können auch aus Hexamethylendiaminpolyacrylharzen
und verwandten Polymeren, Poly[N-{2-(4-hydroxyphenyl)ethyl}]acrylamid
(d.h. (ein Q)), Siliciumdioxid, Cellulosekügelchen, Polystyrolkügelchen,
Latexkügelchen,
Kügelchen
aus gepfropftem Copolymer, wie Polyethylenglycol/Polystyrol, Porenglaskügelchen, Polyacrylamid-Kügelchen,
Dimethylacrylamid-Kügelchen,
die wahlweise mit N,N'-Bis(acryloyl)ethylendiamin
vernetzt sind, Glasteilchen, die mit einem hydrophoben Polymer einschließlich vernetztem
Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer beschichtet sind,
welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert,
Poly(N-acryloylpyrrolidin)-Harzen, Wang-Harzen, Pam-Harzen, Merrifield-Harzen,
PAP- und SPARE-Polyamidharzen, mit Acrylsäure funktionalisiertem Polyethylen,
Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Copolymeren,
CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel
und PEG-PS/DVB-Copolymeren
gebildet werden.
-
Diese
Trägermaterialien
enthalten gewöhnlich
Funktionen für
die Bindung von Reporterkügelchen
oder Linkern oder können
dafür funktionalisiert werden.
Zu den geeigneten Funktionen gehören -NH2,
-COOH, -SOH, -SSH oder Sulfatgruppen.
-
Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass die polymeren Kügelchen auch durch andere geeignete
Träger,
wie Stifte oder Chips, ersetzt werden können, wie in der Technik bekannt
ist, z.B. gemäß der Diskussion
bei Gordon et al., 1994, J. Med. Chem. 37(10), 1385-1401. Die Kügelchen
können auch
Granulate, Scheibchen, Kapillaren, Hohlfasern oder Nadeln umfassen,
wie in der Technik bekannt ist.
-
In
Anbetracht dessen kann man sich auch darüber im Klaren sein, dass der
Träger
ein beliebiges festes Material umfassen kann, das als Basis für die kombinatorische
Synthese dienen kann.
-
Es
wird auch Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung
WO 93/06121, die einen vollen Bereich von Trägern beschreibt, die Träger zur Verwendung
bei dem Verfahren der Erfindung bilden können und die irgendeine geeignete
Form haben können
und aus geeigneten Materialien einschließlich Latex, Glas, Gold oder
anderen kolloidalen Metallteilchen und dergleichen gebildet sind.
-
Wegen
Beispielen für
geeignete Träger
sei auch Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung
WO 95/25737 oder WO 97/15390.
-
Linker
zur Verwendung mit den Trägern
der Erfindung können
aus basenstabilen Ankergruppen, wie sie in Tabelle 2 von Fruchtel
et al., 1996 (siehe oben), beschrieben sind, oder säurestabilen
Ankergruppen, wie sie in Tabelle 3 von Fruchtel et al., 1996 (siehe
oben), beschrieben sind, ausgewählt
werden. In dieser Hinsicht wird auf Fruchte) et al., 1996, Bezug
genommen.
-
Linker
zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung sind auch in der
Internationalen Veröffentlichung
WO 93/06121 erwähnt.
-
Im
Allgemeinen sind die für
die Peptidchemie entwickelten Anker gegenüber Basen oder schwachen Säuren stabil,
aber meistens sind sie nur für
die Immobilisierung von Carbonsäuren
geeignet.
-
Für die reversible
Bindung von speziellen funktionellen Gruppen müssen jedoch bekannte Anker
derivatisiert und optimiert werden, oder falls notwendig, müssen völlig neue
Anker entwickelt werden. Eine Ankergruppe zur Immobilisierung von
Alkoholen ist zum Beispiel (6-Hydroxymethyl)-3,4-dihydro-2H-pyran,
wobei das Natriumsalz durch eine nucleophile Substitutionsreaktion
kovalent an chlormethyliertes Merrifield-Harz gebunden wird. Der
Alkohol wird durch elektrophile Addition in Gegenwart von Pyridiniumtoluol-4-sulfonat
(PPTS) in Dichlormethan an den Träger gekoppelt. Der resultierende
Tetrahydropyranylether ist basenstabil, kann jedoch durch Umetherung
mit 95%iger Trifluoressigsäure
abgespalten werden.
-
Benzylhalogenide
können
an einen photolabilen α-Sulfanyl-substituierten
Phenylketon-Anker gekoppelt werden.
-
Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass die Marker zur Verwendung im Verfahren der Erfindung
Fluorophore, Chromophore, Strichcodes oder radioaktive oder lumineszente
Marker, wie sie in der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 diskutiert
sind, umfassen, aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt sind.
Die Marker können auch
nachweisbare physikalische Merkmale der Kügelchen, wie die Größe der Kügelchen,
umfassen. Vorzugsweise umfassen die Marker Fluoreszenzfarbstoffe.
Jeder geeignete Fluoreszenzfarbstoff kann zum Einbau in die Reporterkügelchen
der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel sei Bezug genommen
auf die US-Patente 5,573,909 (Singer et al.) und 5,326,692 (Brinkley
et al.), die eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen beschreiben,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
-
Es
sei auch Bezug genommen auf die Fluoreszenzfarbstoffe, die in den
US-Patenten Nr. 5,227,487,
5,274,113, 5,405,975, 5,433,896, 5,442,045, 5,451,663, 5,453,517,
5,459,276, 5,516,864, 5,648,270 und 5,723,218 beschrieben sind.
-
Ein
oder mehrere der Fluoreszenzfarbstoffe werden vorzugsweise in ein
Reporterkügelchen,
wie ein polymeres oder keramisches Mikroteilchen, eingebaut. Das
polymere Mikroteilchen kann aus einer Vielzahl von polymerisierbaren
Monomeren hergestellt werden, einschließlich Styrolen, Acrylaten und ungesättigten Chloriden,
Estern, Acetaten, Amiden und Alkoholen; dazu gehören unter anderem Polystyrol
(einschließlich
hochgradig dichten Polystyrol-Latices, wie bromiertem Polystyrol),
Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid,
Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan,
Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid,
Polyvinyltoluol, Polyvinylidenchlorid und Polyvinylbenzol. Die Mikroteilchen
können
aus Styrolmonomeren hergestellt werden. Keramische Mikroteilchen
können
aus Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Titanoxid oder irgendeinem anderen
geeigneten transparenten Material bestehen.
-
Ein
geeignetes Verfahren zur Herstellung von Siliciumoxid-Mikroteilchen
ist zum Beispiel in "The
Colloid Chemistry of Silica and Silicates", Cornell University Press, von Ralph
Keller, 1955, beschrieben.
-
Die
Mikroteilchen können
eine beliebige Größe oder
Form haben. Zum Beispiel können
die Mikroteilchen eine sphärische
oder irreguläre
Form haben. Typischerweise haben Mikroteilchen, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
einen Durchmesser von etwa 0,01 μm
bis etwa 50 μm.
-
Fluoreszenzfarbstoffe
können
nach jedem geeigneten, in der Technik bekannten Verfahren in Mikroteilchen
eingebaut werden, wie Copolymerisation eines polymerisierbaren Monomers
und eines farbstoffhaltigen Comonomers oder Zugabe eines geeigneten
Farbstoffderivats in einem geeigneten organischen Lösungsmittel
zu einer wässrigen
Suspension, wie es zum Beispiel bei Singer et al. (siehe oben) einschließlich der
dort zitierten Literatur offenbart ist. Alternativ dazu können auch
fluoreszente Mikroteilchen hergestellt werden, die wenigstens eine fluoreszente
sphärische
Zone aufweisen. Solche Mikroteilchen können zum Beispiel so hergestellt
werden, wie es im US-Patent Nr. 5,786,219 (Zhang et al.) beschrieben
ist.
-
Man
wird sich auch darüber
im Klaren sein, dass man eine interessierende Verbindung in einer Verbindungsbibliothek
der Erfindung mit einer einzigartigen Sequenz durch mehrere Screening-Verfahren,
die in der Technik wohlbekannt sind, nachweisen oder identifizieren
kann, ohne dass man das interessierende Molekül vom Träger abspalten muss. Wenn die
einzigartige Sequenz bestimmt wurde, kann ein Molekül, das eine
solche Sequenz umfasst, mit herkömmlichen
Mitteln, wie Aminosäure-Synthesizern oder
Oligonucleotid-Synthesizern, wie in der Technik bekannt ist, synthetisiert
werden.
-
Man
kann das Verfahren der Erfindung auch auf SBH-Technik anwenden,
wobei eine Bibliothek aus Trägerkügelchen,
an die jeweils eine einzigartige Polynucleotid- oder Oligonucleotidsequenz
gebunden ist, und Reporterkügelchen,
die die einzigartige Sequenz identifizieren, gebildet wird. Eine
wässrige Lösung von
fluoreszenzmarkierter ssDNA von unbekannter Sequenz kann über die
Bibliothek von Polynucleotid- und Oligonucleotidverbindungen geleitet werden,
und es erfolgt eine Adsorption (Hybridisierung) der ssDNA nur an
Trägerkügelchen,
die Polynucleotid- oder Oligonucleotidsequenzen enthalten, die zu
denjenigen auf der ssDNA komplementär sind. Diese Trägerkügelchen
können
zum Beispiel durch Fluoreszenz-Lichtmikroskopie identifiziert werden.
-
Zu
den Liganden, die gemäß der Erfindung einem
Screening unterzogen werden können,
gehören
Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren, Toxine, Tiergifte,
virale Epitope, Hormone, Zucker, Cofaktoren, Peptide, Enzymsubstrate,
Wirkstoffe einschließlich
Opiaten und Steroiden, Proteine einschließlich Antikörpern, monoklonale Antikörper, Antiseren,
die gegenüber
spezifischen antigenen Determinanten reaktiv sind, Nucleinsäuren, Lectine,
Polysaccharide, Zellmembranen und -organellen.
-
Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
-
In
den beigefügten
Zeichnungen wird Bezug auf eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung genommen:
-
1 ist
eine schematische Darstellung eines Schritts in einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren,
wie es z.B. im Stand der Technik in Bezug auf die Synthese von Peptidbibliotheken
diskutiert wird;
-
2 ist
eine schematische Darstellung des gesamten iterativen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren,
auf das in 1 Bezug genommen wird;
-
3 ist
eine schematische Darstellung eines Schritts im Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
der Erfindung, der die Markierung von Reporterkügelchen umfasst;
-
4 ist
ein anschauliches Beispiel für
Reporterkügelchen,
die an ein Trägerteilchen
gebunden sind, wobei ein lichtmikroskopisches Bild von drei 0,9 μm großen Siliciumoxid-Reporterkügelchen,
die an ein 2,5 μm
großes
Siliciumoxid-Trägerkügelchen
gebunden sind, gezeigt ist. In diesem Fall wurde die Bindung erreicht,
indem man NaCl in einer gemischten wässrigen Suspension dieser Teilchen
löste.
Die Größe von Reporterkügelchen
wäre typischerweise viel
geringer als die des Trägerkügelchens.
Das Bild ist einfach ein anschauliches Beispiel;
-
5 ist
eine schematische Darstellung der Fluoreszenzmikroskopapparatur,
die für
die Decodierungsexperimente verwendet werden kann. Der Sperrfilter
(F1) und der Anregungsfilter (F2)
sind eindeutig markiert;
-
6 ist
ein schematisches Diagramm von rot markierten und grün markierten
Trägern,
die im folgenden Beispiel 3 in Verfahren D unter Bildung der Population
3 miteinander kombiniert werden. Der Übersichtlichkeit halber sind
die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
-
7 ist
ein schematisches Diagramm von Population 4 in Verfahren E in Beispiel
3. Der Übersichtlichkeit
halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als
die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
-
8 ist
ein schematisches Diagramm von Population 5 in Verfahren E in Beispiel
3. Der Übersichtlichkeit
halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als
die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
-
9 zeigt zwei Fluoreszenzmikroskopbilder
(als 9(a) und 9(b))
einer Probe von Trägerkügelchen
nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe von
Population 4 in Verfahren F in Beispiel 3);
-
10 zeigt drei Fluoreszenzmikroskopbilder
(als 10(a), 10(b) und 10(c)) einer Probe von Trägerkügelchen
nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe von
Population 5 in Verfahren F in Beispiel 3);
-
11 zeigt drei Fluoreszenzmikroskopbilder
(als 11(a), 11(b) und 11(c)) einer Probe von Trägerkügelchen
nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe der
kombinierten Populationen 4 und 5 in Verfahren G in Beispiel 3);
-
12 ist
eine schematische Darstellung der kombinierten Populationen 4 und
5 in Verfahren G in Beispiel 3. Der Übersichtlichkeit halber sind
die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten,
1 μm großen Reporter;
-
13, als 13(a) und 13(b), zeigt rasterelektronenmikroskopische
Aufnahmen von 0,2 μm großen Teilchen,
die an aminomethylierte (ca. 100 μm
große)
Träger
gebunden sind, und (c) zeigt 2,5 μm
große
Polyelektrolytbeschichtete Siliciumoxidteilchen, die an einen aminomethylierten
(ca. 100 μm großen) Träger gebunden
sind;
-
14 zeigt
ein durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie erhaltenes Bild von drei
Trägern, die
jeweils mit 1 μm
großen
fluoreszenten roten, 1 μm großen fluoreszenten
grünen
und 2,0 μm
großen
tiefroten fluoreszenten Reportern markiert sind. Die roten Farben
auf der Mikrophotographie bezeichnen die roten Reporter, die grünen Farben
auf der Mikrophotographie bezeichnen die grünen Reporter, und die blauen
Farben auf der Mikrophotographie bezeichnen die tiefroten Reporter;
-
15 ist
eine schematische Darstellung des zweistufigen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahrens
in Beispiel 3; und
-
16 ist
eine Massenspektrographie eines Peptids, das von den markierten
Trägern
abgespalten wurde, wie es in Verfahren J in Beispiel 4 beschrieben
ist. Der größte Peak
befindet sich bei 626,1, was dem Molekulargewicht von Fmoc-Alanin-Glycin-Lysin-Glycin-OH
entspricht. Dies ist die genaue Peptidsequenz, die in diesem dreistufigen Aminosäure-Kopplungs-
und -Markierungs-Beispiel auf den Trägern synthetisiert wurde.
-
Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
-
Ein
Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren, das n Verfahren
und m Schritte beinhaltet, kann wie folgt definiert werden. Seien
die n Verfahren P1, P2,
..., Pn. Das Ereignis der Durchführung von
Verfahren Pj im i-ten Schritt wird durch
Pj(i) bezeichnet. In jedem Stadium i = 1,
2, ..., m:
- – werden die Träger in n
Teilmengen S1, S2,
..., Sn aufgeteilt;
- – wird
das Verfahren Pj für j = 1, 2, ..., n auf den Trägern in
Teilmenge Sj durchgeführt;
- – werden
die Träger
rekombiniert.
-
Eine
schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in den 1 und 2 gezeigt.
-
Beispiele
für solche
Verfahren sind die kombinatorischen Synthesen von Oligonucleotid-
und Oligopeptidketten. In diesen Beispielen können unlösliche Polymerkügelchen
(kolloidale Teilchen, Durchmesser typischerweise 1-1000 μm) als Träger verwendet
werden, auf denen Nuclein- oder Aminosäuremonomere ge- bunden und nacheinander
angefügt werden.
Indem man das Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
für eine
große
Zahl von Trägern
wiederholt durchführt,
kann eine große Vielfalt
an zufällig
erzeugten Oligonucleotid- oder
Oligopeptidsequenzen synthetisiert werden. Jeder Träger enthält also
ein gebundenes Polymer mit einer einzigartigen Sequenz, die durch
die Abfolge der Verarbeitungsereignisse, die der Träger erfahren
hat (d.h. den speziellen Weg, den der Träger in 2 befolgt
hat), definiert ist.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues und zweckmäßiges Verfahren
zur Bestimmung der Abfolge von Verfahren, die auf einen bestimmten
Träger,
der an einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
beteiligt ist, angewendet wurden. Dieses Verfahren beinhaltet nicht
die chemische Markierung des Trägers
und beinhaltet dagegen die Markierung von Trägern durch nichtkovalente Bindung
von Reporterkügelchen.
Dieses Verfahren hat gegenüber
herkömmlichen
Markierungsverfahren mehrere erhebliche Vorteile:
- (1)
Die Bindung von Kügelchen
an den Träger kann
durch einfache (physikalische) Vorgänge erreicht werden, die nicht
notwendigerweise chemische Reaktionen beinhalten. Folglich ist es äußerst unwahrscheinlich,
dass das Markierungsverfahren die untersuchten Reaktionsvorgänge stört.
- (2) Die Reporterkügelchen
können
mit einer Vielzahl und einer hohen Konzentration von Reportermolekülen (z.B.
Fluoreszenzfarbstoffen) dotiert (d.h. getränkt) werden, um einen leichten
Nachweis und mehrstufige Markierung zu ermöglichen, ohne dass chemisches
Pfropfen, Spalten und/oder Amplifikation notwendig sind.
- (3) Die Anwesenheit von Kügelchen,
die an den Träger
gebunden sind, ist mit mehreren Mitteln (z.B. Fluoreszenzemission,
Infrarotspektroskopie) äußerst leicht
nachzuweisen. Dies ermöglicht eine
leichte und zweckmäßige Bestimmung
der Verarbeitungssequenzen, die ein Träger erfahren hat.
-
Es
wird jetzt ein Verfahren beschrieben, mit dem die Abfolge von Verfahren,
die auf einen bestimmten Träger,
der an einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren
beteiligt ist, angewendet wurden, schließlich bestimmt werden kann.
-
Für i = 1,
2, ..., m und für
j = 1, 2, ..., n ist eine Charge Bj(i) von
Reporterkügelchen
erforderlich. Diese Reporterkügelchen
haben die Eigenschaft, dass die Charge, zu der irgendein besonderes
Reporterkügelchen
gehört,
anhand der Eigenschaften des Kügelchens
bestimmt werden kann. Beispiele für mögliche Eigenschaften, die verwendet
werden können, um
die Charge zu identifizieren, zu der ein Reporterkügelchen
gehört,
sind (i) Farbe, (ii) Fluoreszenzsignal, (iii) Infrarotspektrum,
(iv) radioaktive Marker und (v) nachweisbare physikalische Merkmale
einschließlich
der Größe, aber
nicht notwendigerweise auf diese beschränkt.
-
In
jedem Stadium i in dem Verfahren werden ein oder mehrere Reporterkügelchen
aus Charge Bj(i) an jeden der Träger gebunden,
der das Verfahren Pj(i) durchläuft. Dann
am Ende des Verfahrens kann die Abfolge von Verfahren, die auf einen
bestimmten Träger
angewendet wurden, anhand der daran gebundenen Reporterkügelchen
bestimmt werden, wie im Folgenden beschrieben wird. Die Reihenfolge
der Schritte dafür
ist in 3 schematisch gezeigt.
-
Ein
Beispiel für
ein Verfahren zur Bindung der Reporterkügelchen an die Trägerkügelchen
ist wie folgt. Man beachte, dass es möglich ist, die Reporterkügelchen
aus Charge Bj(i) an die Träger zu binden,
bevor das Verfahren Pj(i) durchgeführt wird, falls
dies wünschenswert
ist.
-
Die
meisten der oben beschriebenen Systeme können unlösliche Polystyrolteilchen oder
kolloidale Siliciumoxidteilchen als Träger verwenden. In einem Beispiel
verwendeten wir ein 2,5 μm
großes
Siliciumoxidteilchen als Träger
und 0,9 μm
große
Siliciumoxidteilchen (erhalten von Bangs Laboratories, Carmel, Indiana,
USA) als Reporter. Wenn sie in wässriger
Lösung
(z.B. in Milli-Q-ionenausgetauschtem Wasser) suspendiert werden,
bleiben diese Teilchen aufgrund der elektrostatischen Abstoßungskräfte, die
aus der negativen Oberflächenladung
auf jedem Teilchen resultieren, voneinander getrennt. Durch das
Auflösen
von Salz (z.B. Natriumchlorid) in der wässrigen Lösung wird die Wirkung der elektrostatischen
Abstoßung
zwischen den Teilchen abgeschirmt, und dies führt zu einer permanenten Koagulation
(d.h. Ankleben) der kleinen Teilchen an den großen Teilchen (siehe 4).
Unter solchen Bedingungen wird die Haftung der kleinen Teilchen
an den großen
Teilchen in erster Linie durch van-der-Waals-Anziehungskräfte verursacht, die zwischen
den Teilchen auftreten (Hunter (siehe oben) und Russel et al. (siehe
oben)). Wie außerdem
von Healy et al. gezeigt wurde (1966, Transactions of the Faraday
Society 62 1638; 1970, ibid., 66, 490), ist die Geschwindigkeit
der Koagulation von kleinen Teilchen mit großen Teilchen stets größer als
die von großen
Teilchen mit großen
Teilchen oder kleinen Teilchen mit kleinen Teilchen. Analog können die
kleinen Teilchen an die großen
Teilchen gebunden werden, indem man eine Kombination von sowohl
elektrostatischen als auch van-der-Waals-Anziehungskräften verwendet.
Dies ist zum Beispiel dann der Fall, wenn die kleinen und großen Teilchen
entgegengesetzt geladen sind. Wenn eine Suspension von kleinen Teilchen
in einer solchen Situation mit einer Suspension von großen Teilchen
gemischt wird, erfolgt spontan eine Koagulation (permanente Anhaftung)
von kleinen Teilchen an großen
Teilchen und umgekehrt. Solche Verfahren des Koagulierens von Gemischen
von kolloidalen Teilchen durch Verwendung von physikalischen/chemischen
Wechselwirkungen sind in der Technik wohlbekannt und in Literaturstellen
beschrieben, zu denen die oben genannte Literaturstelle von Hunter
gehört.
Um die Stärke und
Selektivität
der Teilchen-Teilchen-Haftung zu verstärken, können chemische Additive (z.B.
Polyelektrolyte) und chemische Reaktionen (z.B. Polymerverbrückungsreaktion
zwischen Teilchen) verwendet werden, doch sind diese nicht wesentlich.
Wie oben beschrieben, gibt es in der Tat erhebliche Vorteile beim
Markieren der Trägerkügelchen
mit physikalisch gebundenen Markern anstelle von chemisch gebundenen
Markern.
-
Man
wird sich darüber
im Klaren sein, dass Reporterkügelchen
an die Oberfläche
eines Trägers gebunden
sein können,
doch dies ist nicht wesentlich. In dieser Hinsicht erkennen die
Erfinder an, dass es auch möglich
wäre, Reporterkügel chen
durch bestehende Poren des Trägers
hindurch an die Innenseite eines Trägers zu binden.
-
Wir
bemerken, dass es wünschenswert
sein kann, Reporterkügelchen
an bestehende Reporterkügelchen
an dem Träger
anstatt direkt an die Oberfläche
des Trägers
zu binden. Dies kann vorteilhaft sein bei der Lokalisierung der
Reporterkügelchen während des
Decodierungsvorgangs, oder es kann zusätzliche Informationen über die
Reihenfolge liefern, in der die Reporterkügelchen gebunden wurden. Dies
kann bewerkstelligt werden, indem man intrinsische physikalische
Kräfte
zwischen den Reporterkügelchen
verwendet. Ein Beispiel dafür,
wie dies bewerkstelligt werden kann, besteht darin, die Oberflächenladung
auf den Reporterkügelchen
abzuwechseln. Zum Beispiel haben die ersten Reporterkügelchen,
die an die Trägerteilchen
gebunden werden sollen, entweder eine positive oder eine negative Oberflächenladung.
Die nächste
Charge von Reporterkügelchen
besitzen dann eine entgegengesetzte Ladung zu den zuvor gebundenen
(d.h. positiv bei negativ geladenen Reporterkügelchen im ersten Markierungsschritt
und umgekehrt). Indem man die Oberflächenladung der Reporterkügelchen
in dieser Weise verändert,
ermöglicht
man, dass Reporterkügelchen
sich an andere Reporterkügelchen
sowie an die Trägerteilchen
binden.
-
Es
ist wünschenswert,
dass alle Reporterkügelchen,
die in Lösung
bleiben (d.h. diejenigen, die nicht an einen Träger binden), vor dem nächsten Schritt
im Verfahren aus der Lösung
entfernt werden. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass
man die schwereren Trägerkügelchen
auf dem Boden absitzen lässt
und alle nicht gebundenen Reporterkügelchen entfernt, indem man
die Lösung,
die die suspendierten Reporterkügelchen
enthält,
dekantiert und mit klarer Lösung
nachspült.
Um dieses Verfahren zu unterstützen,
kann ein geladenes Blech mit entgegengesetzter Polarität zu derjenigen
der Trägerkügelchen
verwendet werden, um die Trägerkügelchen
(mit daran gebundenen Reporterkügelchen) anzuziehen,
während
die ungebundenen Reporterkügelchen
abgestoßen
werden.
-
Ein
Beispiel dafür,
wie die Bindung von Reporterkügelchen
verwendet werden kann, um die Sequenz von Verfahren zu bestimmen,
die mit jedem Trägerkügelchen
durchgeführt
wurden, ist im Folgenden erläutert.
-
Betrachten
wir ein Verfahren, das 4 Schritte (i = 1, ..., 4) und 4 Verfahren
(j = 1, ..., 4) enthält,
zum Beispiel eine vierstufige kombinatorische Oligopeptidsynthese.
Jede Stufe beinhaltet die Zugabe eines Aminosäuremonomers aus einer menge
von vier Aminosäuren,
die von Interesse sind (z.B. Alanin, Glycin, Lysin und Methionin).
Jedes Verfahren definiert, welches der vier möglichen Aminosäuremonomere
gebunden wird. Nach 4 Schritten enthält jeder Träger eine Oligopeptidkette mit
4 Aminosäuremonomeren
in zufälliger
Abfolge. In diesem Fall beträgt
die Zahl der insgesamt möglichen
Sequenzen 44 (= 256).
-
Um
jeden Schritt und jedes Verfahren einzigartig zu markieren, brauchen
wir 16 Typen von Reporterkügelchen,
die vor oder nach jedem Schritt an die Träger gebunden werden (gemäß 3)
und später
einzigartig identifiziert werden können. Die einfachste Methode,
um dies zu erreichen, besteht in der Verwendung von Reporterkügelchen
(z.B. 1 μm große Siliciumoxid-Kügelchen),
die im Innern eine Kombination von 4 Fluoreszenzfarbstoffen enthalten. Vier
zweckmäßige Fluoreszenzfarbstoffe
sind Rot (R), Gelb (Y), Grün
(G) und Blau (B). Mit 4 Farbstoffen gibt es 16 mögliche Kombinationen von Farbstofffarben,
die in die Reporterkügelchen
eingebaut werden können
(d.h. RYGB, RYG, RGB, RYB, YGB, RY, RG, RB, YG, YB, GB, R, Y, G,
B, kein Farbstoff), und so können
16 verschiedene Chargen von Reporterkügelchen hergestellt werden.
Indem man eines dieser Kügelchen
unmittelbar vor oder nach der Aminosäureaddition an den Träger bindet,
codiert die Kombination von Farbstoffen innerhalb des Reporterkügelchens
für ein
einziges Verfahren und einen einzigen Schritt (d.h., sie definiert
Pj(i) in 3).
-
Der
Nachweis der Farbstoffkombination innerhalb der Kügelchen
kann zweckmäßigerweise
mit einem Fluoreszenzmikroskop erreicht werden, nachdem das gesamte
Verfahren beendet ist. Das Mikroskop hat eine ausreichende Vergrößerung,
um die einzelnen Reporterkügelchen
zu beobachten, und geeignete Lichtfilter können verwendet werden, um zu
bestimmen, welche Fluoreszenzfarben (falls überhaupt) von den an den Träger gebundenen
Reporterkügelchen
emittiert werden. Im Hinblick auf das obige Beispiel gibt es vier
unterschiedliche Reporterpopulationen, die an jeden Träger gebunden
sind, wenn jeder Träger
eine Oligopeptidkette mit 4 Aminosäuremonomeren enthält. Dies
bedeutet Folgendes: Sobald 4 unterschiedliche Reporterkügelchen
auf einem Träger
identifiziert sind, ist die von diesem Träger erfahrene Abfolge von Reaktionsschritten
einzigartig bestimmt.
-
Im
Allgemeinen ist für
ein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren mit m Schritten und
n Verfahren eine Menge von m × n
Chargen von Reporterkügelchen
ausreichend, um das gesamte Verfahren einzigartig zu markieren.
Im obigen Beispiel zeigten wir, wie aus einer Kombination von 4 Fluoreszenzfarbstoffen
16 einzigartige Marker hergestellt werden könnten. Diese Zahl kann durch
mehrere einfache Schemata stark erhöht werden:
- (I)
Man erhöhe
die Zahl der Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen,
die in das Reporterteilchen eingebaut werden. Dies kann nicht nur
dadurch erreicht werden, dass man Farbstoffe mit deutlich unterschiedlichen
Emissionsfrequenzen wählt,
sondern auch dadurch, dass man Farbstoffe mit ähnlichen Emissionsfrequenzen,
aber deutlich unterschiedlichen Anregungsfrequenzen wählt. Für diesen
Zweck stehen Fluoreszenz-Lichtmikroskopie-Techniken zur Verfügung (gemäß der Beschreibung
in Fluorescent Microscopy von F.W.D. Rost, Cambridge University
Press, Vol. 1, 1992, und Introduction to Fluorescent Microscopy
von J.S. Ploem und H.J. Tanke, Oxford University Press, 1987). 5 zeigt,
wie das Mikroskop aufgebaut sein kann. Zwei Teilchenfarbstoffe mit ähnlichen
Emissionsfrequenzen können
wegen ihrer unterschiedlichen Anregungsfrequenzen unterschieden
werden. Angenommen, ein Farbstoff D1 emittiert rotes Licht nach
Anregung mit grünem
Licht, und ein anderer Farbstoff D2 emittiert rotes Licht nach Anregung mit
blauem Licht. Der im Diagramm gezeigte Mikro skopaufbau kann die
beiden Farbstoffe voneinander unterscheiden, indem der Filter F2 gewechselt wird, so dass er nur grünes Licht
oder nur blaues Licht durchlässt.
Der Farbstoff D1 emittiert nur dann rotes Licht, wenn grünes Licht
durch F2 tritt. Der Farbstoff D2 emittiert
nur dann rotes Licht, wenn blaues Licht durch F2 tritt.
Verschiedenfarbige Farbstoffe innerhalb der Teilchen können nachgewiesen
werden, indem man die Durchlassfrequenz des Filters F1 ändert. Durch geschickte
Auswahl solcher Farbstoffe wird die Zahl der Reporterfarbstoffe
von 4 auf über
20 erhöht.
- (II) Die Größe des Reporterkügelchens
kann variiert werden, um die mögliche
Zahl der Marker zu erhöhen
(wenn zum Beispiel zwei verschiedene Größen für Reporterkügelchen verwendet werden, wird
die Zahl der möglichen
Marker verdoppelt).
- (III) Die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs innerhalb
jedes Reporterkügelchens
kann variiert werden. Verschiedene Konzentrationen ergeben verschiedene
Emissionsintensitäten
(zum Beispiel verdoppeln zwei verschiedene Farbstoffkonzentrationen
innerhalb der Reporterkügelchen
die Zahl der möglichen
Marker).
-
Die
Fähigkeit
dieser Technik, die Abfolge von Reaktionsschritten zu bestimmen,
wenn eine größere Zahl
von Verfahren und Schritten beteiligt ist, wird durch das folgende
Argument eindeutig belegt. Wenn x verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe
in ein Reporterkügelchen
eingebaut werden können,
beträgt
die Zahl der verschiedenen Chargen von Reporterkügelchen, die hergestellt werden
können,
2x. Mit 2x unterschiedlichen
Chargen von Reporterkügelchen
ist es möglich,
die Abfolge der mit einem Träger
durchgeführten
Reaktionsschritte nachzuvollziehen, vorausgesetzt, das Produkt n × m aus
der Zahl der Verfahren und der Zahl der Schritte ist kleiner als
2x. Obwohl die Zahl der möglichen
Abfolgen von mit einem Träger
durchgeführten
Reaktionen nm beträgt, erfordert die Technik höchstens
log2(n × m)
verschiedene Farbstoffe. Dieser Wert oder diese Zahl wird auf die nächste ganze
Zahl gerundet, die größer oder
gleich diesem Wert ist.
-
Wenn
zum Beispiel 20 Verfahren (was für
20 Aminosäuren,
die an der Polypeptidsynthese beteiligt sind, der Fall sein würde) und
25 Reaktionsschritte beteiligt sind, dann gibt es 2025 ≈ 3 × 1032 mögliche Abfolgen,
aber es sind nur 9 verschiedene Farbstoffe erforderlich.
-
Obwohl
dieses Beispiel Fluoreszenz als Nachweisverfahren für die Reporterkügelchen
spezifiziert, können
auch viele andere Reporter- und Nachweisverfahren ins Auge gefasst
werden. Beispiele dafür
sind die Dotierung der Reporterkügelchen
mit Materialien, die einzigartige Infrarot- und radioaktive Signale
aufweisen. Diese könnten
entweder unabhängig
oder in Kombination mit den Fluoreszenz-Reportermolekülen verwendet werden.
-
Für die oben
beschriebene kombinatorische 4×4-Oligopeptidsynthese
wird das folgende Verfahren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist,
zum Synthetisieren und Markieren verwendet.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Trägerkügelchen,
die für
dieses Verfahren verwendet werden, bestehen aus mit N-α-Boc (t-Butyloxycarbonyl)
geschützter
Aminosäure
an PAM-Harz (erhältlich
von Novabiochem). Diese Trägerteilchen
(100-200 mesh) sind ein Standardträger für die kombinatorische Festphasensynthese.
In diesem Beispiel wählen
wir das N-α-Boc-Ala-OCH2-PAM-Harz, das einen geschützten Alanin-Aminosäurerest
enthält,
der an die Oberfläche
gebunden ist (es können
auch andere Aminosäurereste
gewählt
werden, um die Sequenz zu beginnen). Alle Syntheseschritte in dem
Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren wurden wie folgt
im 0,2-mmol-Maßstab
durchgeführt.
Die N-α-Boc-Gruppe
wurde durch Behandlung mit 100% TFA (Trifluoressigsäure) während 2 × 1 Minute
mit anschließendem
Durchflusswaschen während
30 Sekunden mit DMF (Dimethylformamid) entfernt. Boc-Aminosäuren (0,8
mmol) wurden ohne vorherige Neutralisation des Peptid-Harz-Salzes
als aktive Ester, die in DMF entweder mit Hydroxybenzyltria zol (HOBt)/N,N'-Diisopropylcarbodiimid
(DIC) (30 Minuten Aktivierung) oder mit einem HBTU/Diisopropylethylamin
(DIEA) (2 Minuten Aktivierung) als Aktivierungsmittel vorgebildet
wurden, angekoppelt. Bei Kopplungen mit aktiven Estern, die durch
HOBt/DIC gebildet wurden, wurde die Neutralisation in situ durchgeführt, indem
man 1,5 Äqu.
DIEA relativ zur Menge des TFAO-+NH3-Peptidharzsalzes
zu dem Gemisch aus aktivierter Boc-Aminosäure und Harz gegeben. Bei Kopplungen
mit aktiven Estern, die durch HBTU/DIEA gebildet wurden, wurden
weitere 2 Äqu.
DIEA relativ zur Menge des TFAO-+NH3-Peptidharzsalzes zu dem Aktivierungsgemisch
gegeben. Die Kopplungszeiten betrugen durchweg 10 Minuten ohne doppelte
Kopplung. Proben (3-5 mg) des Peptidharzes wurden nach dem Kopplungsschritt
entnommen, um die restlichen α-Aminogruppen
durch das quantitative Ninhydrinverfahren zu bestimmen. Die Kopplungsausbeuten
betragen typischerweise 99,9%. Alle Arbeitsschritte wurden manuell
in einem 20-ml-Glasreaktionsgefäß mit einem
teflonverkleideten Schraubverschluss durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch
sachtes Auf-den-Kopf-Stellen
auf einer Schüttelvorrichtung
während
der Schritte der N-α-Schutzgruppenentfernung
und Kopplung gerührt.
Vor dem Rekombinieren und Aufteilen der Kügelchen gemäß dem Diagramm in 2 wurden
Reporterkügelchen
(Siliciumoxid-Teilchen mit 1 μm Durchmesser) über das
oben beschriebene Verfahren (d.h. Koagulation in wässriger
Lösung,
die mit hohen Konzentrationen (ungefähr 1 M) an Natriumchloridsalz
induziert wurde) an die Harzpeptid-Trägerkügelchen
gebunden. Nach den Peptidzugaben (d.h. 4-Schritten) blieben die
Reporterteilchen an die Trägerkügelchen
geheftet.
-
Ebenso
wie auf dieses einschränkende
Beispiel für
die kombinatorische Polypeptidsynthese ist unser Codierungs/Decodierungs-Verfahren
allgemein auf jede kombinatorische Festphasenchemie anwendbar. Weitere
Beispiele für
solche Verfahren sind Polynucleotidsynthese und die Synthese von
cyclischen Polypeptiden.
-
Beispiel 2: Herstellung
von Reportersuspensionen
-
Fluoreszente
Siliciumoxid-Mikrokugeln (10 mg, 1 μm Durchmesser, rot oder blau
oder grün
oder gelb/rote Kombination, Microcaps) werden mit Polyelektrolyten
beschichtet. Der erste Schritt besteht darin, das Siliciumoxid mit
positiv geladenem Polyethylenimin (PEI) zu beschichten, indem man
es 30 Minuten lang in einer 1%igen wässrigen Lösung von PEI (3 ml, Polysciences
Inc., MW = 10 000 g/mol) mit Ultraschall behandelt und 24 Stunden
lang äquilibriert. Nach
dem Waschen mit Milli-Q-Wasser durch Zentrifugation (5 × 3 ml)
wird das Siliciumoxid zu einer 1%igen wässrigen Lösung von negativ geladener
Polyacrylsäure
(PAA, 3 ml, Sigma-Aldrich, MW = 250 000 g/mol) gegeben, 24 Stunden
lang äquilibriert
und durch Zentrifugation (5 × 3
ml) mit Milli-Q-Wasser gewaschen.
-
Die
mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Kügelchen werden mit Dimethylformamid
(d.h. DMF) (5 × 10
ml) gewaschen und als Suspension in DMF (10 mg/ml) verwendet.
-
Beispiel 3: Herstellung
einer markierten Bibliothek
-
Verfahren A: Markieren
der Trägerkügelchen
-
Kügelchen
aus vernetztem PS/DVB-Trockenharz (aminomethyliert, 75-150 μm Durchmesser, 200
mg, 0,26 mmol/g, Peptide Institute) werden in zwei 100-mg-Portionen aufgeteilt.
-
Eine
Portion wird mit 0,25 ml mit rotem Polyelektrolyt beschichteten
Siliciumoxid-Reportern (10 mg/ml) in DMF gemischt (Population 1),
und ähnlich wird
die andere Portion zu 0,250 ml mit rotem Polyelektrolyt beschichteten
Siliciumoxid-Reportern
(10 mg/ml) in DMF gegeben (Population 2). Die Herstellung der mit
Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter ist in Beispiel
2 nachzulesen.
-
Verfahren B:
-
Das
Harz wird mit überschüssigem DMF
(20 × 20
ml) gewaschen. Das Lösungsmittel
und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine
Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt. Nach
dem endgültigen
Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
-
Verfahren C:
-
Das
Monomer Fmoc-Glycin-OH (150 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit
N-[1H-(Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N-oxid
(HBTU, 0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6
mmol, 120 μl)
gemischt. Die aktivierte Aminosäure
wird zu den in Verfahren B hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population
1 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml)
gewaschen.
-
Das
zweite Monomer Fmoc-Alanin-OH (160 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird
mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 130 μl) gemischt.
Die aktivierte Aminosäure
wird zu den in Verfahren B hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population
2 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF
(5 × 20
ml) gewaschen.
-
Verfahren D:
-
Population
1 in DMF wird mit Population 2 in DMF kombiniert, was Population
3 ergibt, ein Gemisch aus rot markierten und grün markierten Harzen. Population
3 wird 1 Minute lang in DMF geschüttelt, um ein gutes Durchmischen
zu gewährleisten. 6 ist
ein Schema der rot markierten und grün markierten Kügelchen
in Population 3. Population 3 wird in zwei 100-mg-Portionen aufgeteilt,
Population 4 und Population 5.
-
Verfahren E:
-
Eine
1-ml-Suspension von fluoreszenten gelb/roten Polyelektrolyt-beschichteten
Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt in Beispiel 2) wird 5 Minuten
lang mit Population 4 und 1 ml Piperidin geschüttelt. Das Lösungsmittel
wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF
wird weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt. Ein Schema der Population
4 ist in 7 gezeigt.
-
Eine
1-ml-Suspension von fluoreszenten blauen Polyelektrolyt-beschichteten
Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt in Beispiel 2) wird 5 Minuten
lang mit Population 5 und 1 ml Piperidin geschüttelt. Das Lösungsmittel
wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF
wird weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt. Ein Schema der Population
5 ist in 8 gezeigt.
-
Die
Populationen 4 und 5 werden getrennt mit großen Mengen DMF (jeweils 20 × 20 ml)
gewaschen, um überschüssige Reporter
zu entfernen.
-
Verfahren F:
-
Das
Monomer Fmoc-Lysin(Boc)-OH (235 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird
mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 120 μl) gemischt.
Die aktivierte Aminosäure
wird zu den in Verfahren E hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population
4 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit überschüssigem DMF
(5 × 20
ml) gewaschen. Die relevanten Bilder sind in 9 gezeigt.
-
Bei
dem Verfahren zur Gewinnung der Bilder, auf die in 9(a) und 9(b) Bezug genommen wird, ist eine Trägerspezies
mit Grün
und Gelb/Rot markiert, was der Sequenz Lysin-Alanin-Träger entspricht,
und die andere vorhandene Trägerspezies
ist mit roten und gelb/roten Reportern markiert, was der Peptidsequenz
Lysin-Glycin-Träger
entspricht.
-
In
der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit blauem Licht
(λ = 450-480 nm) angeregt, und
Emissionswellenlängen
unterhalb von λ =
515 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb
von λ =
515 nm beobachtet werden.
-
Die
vorwiegend grünen
Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten
Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen und fluoreszenten gelben
Reporterkügelchen;
wobei es sich bei letzteren um die gelben Signale von jedem kombinierten
gelb/roten Reporter handelt.
-
Die
vorwiegend gelben Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
gelb/roten Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten
gelben Reporterkügelchen;
wobei es sich bei letzteren um die gelben Signale von jedem kombinierten
gelb/roten Reporter handelt.
-
In
der unteren Mikrophotographie (b) wird die Probe mit grünem Licht
(λ = 510-550 nm) angeregt, und
Emissionswellenlängen
unterhalb von λ =
590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb
von λ =
590 nm beobachtet werden.
-
Die
dunkleren (weniger roten) Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten
Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter sind bei dieser
Anregung nicht zu beobachten, aber das rote Signal von den kombinierten
gelb/roten Reportern kann beobachtet werden.
-
Die
helleren (röteren)
Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
gelb/roten Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten roten Reporter können von den
kombinierten gelb/roten Reportern unterschieden werden, da die rote
Fluoreszenz von jedem roten Reporter schwächer ist als die rote Fluoreszenz
von jedem kombinierten gelb/roten Reporter.
-
Das
Monomer Fmoc-Arginin(PMC)-OH (304 mg, 0,5 mmol, Bachem) wird mit
HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die
aktivierte Aminosäure
wird zu den in Verfahren E hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population
5 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit überschüssigem DMF
(5 × 20
ml) gewaschen. Die relevanten Bilder sind in den 10(a), 10(b) und 10(c) gezeigt.
-
Bei
dem Verfahren zur Gewinnung der Bilder, auf die in 10 Bezug
genommen wird, ist eine Trägerspezies
mit roten und blauen Reportern markiert, was der Peptidsequenz Arginin-Glycin-Träger entspricht,
und die andere vorhandene Trägerspezies
ist mit grünen
und blauen markiert, was der Sequenz Arginin-Alanin-Träger entspricht.
-
In
der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit Licht der Wellenlänge λ = 330-385
nm angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 420 nm
werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 420 nm
beobachtet werden.
-
Die
grünen/wasserblauen
Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen
Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen und fluoreszenten blauen
Reporterkügelchen.
-
Die
roten/rosafarbenen Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten
blauen Reporterkügelchen.
-
In
der Mikrophotographie (b) wird die Probe mit blauem Licht (λ = 450-480
nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 515 nm werden
herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 515 nm
beobachtet werden.
-
Die
vorwiegend grünen
Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen
Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen Reporterkügelchen.
Die fluoreszenten blauen Reporterkügelchen können bei dieser Anregung nicht
beobachtet werden.
-
Die
vorwiegend gelben Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten Reporterkügelchen.
Die fluoreszenten blauen Reporterkügelchen können bei dieser Anregung nicht
beobachtet werden.
-
In
der unteren Mikrophotographie (c) wird die Probe mit grünem Licht
(λ = 510-550 nm) angeregt, und
Emissionswellenlängen
unterhalb von λ =
590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb
von λ =
590 nm beobachtet werden.
-
Die
dunklen Träger
in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen Reportern
und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern
markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter und die fluoreszenten blauen
Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, und daher
erscheinen die Träger,
die mit Grün
und Blau markiert wurden, dunkel.
-
Die
roten Träger
in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen
Reportern markiert wurden. Bei stärkerer Vergrößerung können die
einzelnen roten Reporter beobachtet werden. Die fluoreszenten blauen Reporter
können
bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
-
Die
roten Träger
in (c) sind also in (b) vorwiegend gelb und in (a) rot/rosa, und
die dunklen Träger in
(c) sind in (b) vorwiegend grün
und in (a) grünwasserblau.
-
Verfahren G:
-
Die
Populationen 4 und 5 in DMF werden miteinander kombiniert. Siehe 11(a), 11(b) und 11(c). Eine schematische Ansicht ist in 12 gezeigt.
-
Im
Vergleich zur Decodierung der in den 11(a), 11(b) und 11(c) gezeigten
Bilder lassen sich die vier unterschiedlich markierten Trägerspezies
leicht decodieren. Träger,
die mit roten und blauen Reportern markiert sind, entsprechen der
Peptidsequenz Arginin-Glycin-Träger;
Träger,
die mit Grün und
Blau markiert sind, entsprechen der Sequenz Arginin-Alanin-Träger; Träger, die
mit Grün
und Gelb/Rot markiert sind, entsprechen der Sequenz Lysin-Alanin-Träger; und
Träger,
die mit Rot und Gelb/Rot markiert sind, entsprechen der Peptidsequenz
Lysin-Glycin-Träger.
-
In
der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit Licht der Wellenlänge λ = 330-385
nm angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 420 nm
werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 420 nm
beobachtet werden.
-
Die
roten/rosafarbenen Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere
Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten
blauen Reporterkügelchen.
-
Die
hellroten Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
gelb/roten Reportern markiert wurden.
-
Die
grünen/wasserblauen
Träger
in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern markiert wurden. Zusätzliche
Informationen sind erforderlich (z.B. die Mikrophotographien (b)
und (c)), um zwischen den Trägern,
die sowohl mit grünen
als auch mit blauen Reportern markiert sind, und den Trägern, die
sowohl mit grünen
als auch mit gelb/roten Reportern markiert sind, zu unterscheiden.
-
In
der Mikrophotographie (b) wird die Probe mit blauem Licht (λ = 450-480
nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 515 nm werden
herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 515 nm
beobachtet werden.
-
Die
vorwiegend grünen
Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern markiert wurden. Von diesen vorwiegend grünen Trägern gibt
es zwei verschiedene Trägerspezies,
solche, die sowohl grüne als
auch gelbe Reporter aufweisen, und solche, die nur grüne Reporter
aufweisen. Die ersteren Träger sind
solche, die mit grünen
und gelb/roten Reportern markiert wurden. Die letzteren Träger sind
solche, die mit grünen
und blauen Reportern markiert wurden, aber die blauen Reporter können bei
dieser Anregung nicht beobachtet werden.
-
Die
vorwiegend gelben Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern markiert wurden. Von diesen vorwiegend gelben Trägern gibt
es zwei verschiedene Trägerspezies,
solche, die sowohl rote als auch gelbe Reporter aufweisen, und solche,
die nur rote Reporter aufweisen. Die ersteren Träger sind solche, die mit grünen und
gelb/roten Reportern markiert wurden. Die letzteren Träger sind
solche, die mit roten und blauen Reportern markiert wurden, aber die
blauen Reporter können
bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
-
In
der unteren Mikrophotographie (c) wird die Probe mit grünem Licht
(λ = 510-550 nm) angeregt, und
Emissionswellenlängen
unterhalb von λ =
590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb
von λ =
590 nm beobachtet werden.
-
Die
dunklen Träger
in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen Reportern
und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern
markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter und die fluoreszenten blauen
Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, und daher
erscheinen die Träger,
die mit Grün
und Blau markiert wurden, dunkel.
-
Die
roten Träger
in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten
gelb/roten oder blauen Reportern markiert wurden. Diejenigen Träger, die
sowohl mit roten als auch mit gelb/roten Reportern markiert sind,
können von
denjenigen, die sowohl mit Rot als auch mit Blau markiert sind,
unterschieden werden, indem man auf Mikrophotographie (b) nachsieht.
-
Die
dunkleren (weniger roten) Träger
in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten
grünen
Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten
Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter sind bei dieser
Anregung nicht zu beobachten, aber das rote Signal von den kombinierten
gelb/roten Reportern kann beobachtet werden.
-
Die
roten Träger
in (c) sind also in (b) vorwiegend gelb und in (a) rot/rosa, und
die dunklen Träger in
(c) sind in (b) vorwiegend grün
und in (a) grünwasserblau.
-
Beispiel 4: Bestätigung der
Codierung durch Massenspektrometrie
-
Verfahren A:
-
Fmoc-L-Glu-Wang-Harz
(100 mg, 0,61 mmol/g, Auspep) wird durch 2 Minuten Schütteln mit überschüssigem (10
ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel
wird durch Vakuumfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird
hinzugefügt,
und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Lösungsmittel
wird entfernt, und das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) und DCM/Methanol (1:1)
gewaschen und unter Stickstoffgas getrocknet.
-
Verfahren B:
-
Das
Harz wird zu 0,25 ml roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern
gegeben. Die Herstellung der mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter ist in Beispiel
1 nachzulesen. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (20 × 20 ml) gewaschen.
Das Lösungsmittel
und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine
Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt.
Nach dem endgültigen
Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
-
Verfahren C:
-
Das
Monomer Fmoc-Glycin-OH (150 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit
N-[1H-(Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N-oxid
(HBTU, 0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6
mmol, 120 μl)
gemischt. Die aktivierte Aminosäure
wird zu den in Verfahren B hergestellten rot markierten Kügelchen
(100 mg) der Population 1 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz
wird mit DMF (5 × 20
ml) gewaschen.
-
Verfahren D:
-
Das
Harz wird durch 2 Minuten Schütteln
mit überschüssigem (10
ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel
wird durch Vaku umfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird
hinzugefügt,
und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Piperidin wird durch
Waschen mit DMF (5 × 20
ml) entfernt.
-
Verfahren E:
-
Das
Harz wird zu 0,25 ml grünen
Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern gegeben. Die
Herstellung der mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter
ist in Beispiel 1 nachzulesen. Das Harz wird mit überschüssigem DMF
(20 × 20
ml) gewaschen. Das Lösungsmittel
und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine
Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt.
Nach dem endgültigen
Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
-
Verfahren F:
-
Das
Monomer Fmoc-Lysin(Boc)-OH (235 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird
mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6
mmol, 120 μl)
gemischt. Die aktivierte Aminosäure
wird zu dem in Verfahren E hergestellten Harz (100 mg) gegeben,
und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF
(5 × 20
ml) gewaschen.
-
Verfahren G:
-
Das
Harz wird durch 2 Minuten Schütteln
mit überschüssigem (10
ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel
wird durch Vakuumfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird
hinzugefügt,
und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Piperidin wird durch
Waschen mit DMF (5 × 20
ml) entfernt.
-
Verfahren H:
-
Das
Harz wird zu 0,25 ml blauen Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern
gegeben. Das Harz wird mit überschüssigem DMF
(20 × 20
ml) gewaschen. Das Lösungsmittel
und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine
Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt.
Nach dem endgültigen
Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
-
Verfahren I:
-
Das
Monomer Fmoc-Alanin-OH (160 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit
HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6
mmol, 120 μl)
gemischt. Die aktivierte Aminosäure
wird zu dem in Verfahren E hergestellten Harz (100 mg) gegeben,
und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF
(5 × 20
ml) und DCM/Methanol (1:1) (5 × 20
ml) gewaschen und unter Stickstoffgas getrocknet.
-
Verfahren J:
-
Um
die Natur des Peptids, das in den oben genannten Verfahren synthetisiert
und markiert wurde, zu überprüfen, wurde
das Peptid von dem Harz abgespalten und durch Massenspektroskopie
untersucht. Die Probe für
die Massenspektroskopie wurde in folgender Weise hergestellt:
Fünf mg des
getrockneten Harzes aus Verfahren I wurden zu einer Lösung von
95% TFA in Wasser (300 ml) gegeben und eine Stunde lang stehen gelassen.
Die Lösung
wurde entfernt, indem man Stickstoffgas über das Harz leitete. Als es
trocken war, wurde eine 50%ige Lösung
von Acetonitril in Wasser (pH = 2, 100 μl) zu dem Harz gegeben, und
10 μl dieser
Lösung
wurden für
die massenspektroskopische Analyse verwendet. Das Massenspektrum
ist in 16 gezeigt. Der größte Peak
liegt bei 626,1, was dem Molekulargewicht von Fmoc-Alanin-Glycin-Lysin-Glycin-OH
entspricht. Dies ist die genaue Peptidsequenz, die in diesem dreistufigen
Aminosäure-Kopplungs- und -Markierungs-Beispiel
auf den Trägern
synthetisiert wurde.
-
Beispiel 5
-
Man
wird sich darüber
im Klaren sein, dass die Beispiele 1-4 mit Reporterkügelchen
wiederholt werden können,
bei denen eine beliebige Zahl von verschiedenen Oberflächenbeschichtungen
an verschiedene Typen von Trägerkügelchen
gebunden sind. Die resultierende Kombination aus Trägerkügelchen
und gebundenen Reporterkügelchen
ist in DMF stabil. In diesem Beispiel hat sich gezeigt, dass Reporterkügelchen,
die aus der Gruppe ausgewählt sind,
die aus Siliciumoxid-Kügelchen,
die mit -COOH funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen,
die mit PEI funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen,
die mit PEI und Polyacrylsäure
funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen, die mit -NH2 funktionalisiert sind, unbeschichteten
Siliciumoxid-Kügelchen
und Polystyrol/DVB-Kügelchen,
die mit Sulfatgruppen funktionalisiert sind, besteht, an Trägerkügelchen
gebunden wurden, die aus Boc- und Fmoc-geschützten Harzen, aminomethyliertem
Harz, Tentagel-SOH-Harz, MBHA-Harz und geschütztem PAM-Harz ausgewählt sind.
-
Beispiel 6: Variationen
von Befestigungsverfahren
-
Die
Zahl der Reporterkügelchen
pro Träger kann
manipuliert werden und hängt
in gewissem Maße
von der Reporterkonzentration, bevor die Träger hinzugefügt werden,
der Größe der Reporterkügelchen,
den funktionellen Gruppen an dem Reporterkügelchen und den Trägeroberflächen, ab
und ist bis zu einem gewissen Grad zeitabhängig. Falls gewünscht, kann
eine Polyelektrolyt-Beschichtung der Reporter verwendet werden,
um die Haftung der Reporterkügelchen
zu verbessern.
-
Eine
erfolgreiche Befestigung kann durch mehrere Verfahren erreicht werden,
wie im Folgenden beschrieben wird.
-
Verfahren A:
-
Trockene
Trägerkügelchen
können
zu einer konzentrierten Lösung
von Reportern in Lösungsmittel
gegeben werden, wie zum Beispiel:
Aminomethyliertes Harz (100
mg, 0,26 mmol/g, Peptide Institute) wird zu 0,25 ml gemäß Beispiel
1 hergestellten roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern
(10 mg/ml) in DMF gegeben.
-
Verfahren B:
-
Trägerkügelchen
werden in überschüssigem Lösungsmittel
aufquellen gelassen und zu einer konzentrierten Lösung von
Reportern in Lösungsmittel gegeben,
wie zum Beispiel:
Aminomethyliertes Harz (100 mg, 0,26 mmol/g,
Peptide Institute) wird in DMF aufquellen gelassen und zu 1 ml gemäß Beispiel
1 hergestellten roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern
(10 mg/ml) in DMF gegeben.
-
Verfahren C:
-
Entfernung
der Schutzgruppen und Markierung werden in einem einzigen Schritt
durchgeführt, indem
man die Reporter-DMF-Suspension (hergestellt wie in Beispiel 1)
mit dem gleichen Volumen Piperidin mischt und zu aufgequollenen
Fmoc-beschichteten Trägerkügelchen
gibt, wie zum Beispiel:
1 ml einer Suspension von fluoreszenten
roten Polyelektrolyt-beschichteten Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt
wie in Beispiel 1) wird 5 Minuten lang mit Fmoc-Glycin-Harz (100
mg) und 1 ml Piperidin geschüttelt.
Das Lösungsmittel
wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF wurde
weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt.
-
Beispiel 7: Waschverfahren
-
Freie
Reporterkügelchen
können
durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm (nachzulesen
bei Verfahren B in Beispiel 1) oder durch andere Verfahren, wie
Zentrifugation oder durch die Verwendung von magnetischen Träger- oder
Reporterkügelchen,
aus dem Lösungsmittel
entfernt werden.
-
Beispiel 8: Wirkung verschiedener
organischer Lösungsmittel
und Reaktionsbedingungen auf die Haftung und den Austausch von Reporterkügelchen
-
Verfahren A:
-
Untersuchung
des Reporteraustauschs in Dichlormethan in Gegenwart von überschüssigem Pd(PPh3)4 und Diethylazodicarboxylat
(DEAD).
-
Rot
markierte Träger
(100 mg) und grün
markierte Träger
(100 mg) werden gemäß Verfahren
B in Beispiel 3 hergestellt und gewaschen. Die rot markierten und
grün markierten
Träger
werden in DMF miteinander gemischt und anschließend mit DCM/Methanol gewaschen
und dann unter Stickstoffgas getrocknet. 10 mg der trockenen Träger wird in
DCM (0,3 ml) mit Pd(PPh3)4 und
Diethylazodicarboxylat (DEAD) gegeben. Über einen Zeitraum von 24 Stunden
wird kein nachweisbarer Austausch zwischen rot markierten und grün markierten
Trägern beobachtet.
-
Verfahren B:
-
Die
Haftung zwischen Reporter und Trägerkügelchen übersteht
auch die folgenden Bedingungen ohne sichtbare Ablösung von
Reportern von den Trägerkügelchen
und ohne erheblichen Austausch von Reportern zwischen den Trägern:
- (i) Rot markierte und grün markierte Trägerkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
aus DMF, THF, DCM, Acetonitril, Ethylacetat und Methanol ausgewählt sind;
- (ii) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
aus DMF, THF, Acetonitril, Ethylacetat und Methanol ausgewählt sind,
werden 45 Minuten lang auf 50°C
erhitzt;
- (iii) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
aus DMF und Diisopropylethylamin (DIEA), THF-NaH (einige Harzkügelchen
brechen innerhalb von 2 Stunden auf, die meisten sind nach 20 h
noch intakt mit Reportern) und Methanol-NaOCH3 ausgewählt sind,
in Gegenwart von Base;
- (iv) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
aus DMF und Diisopropylethylamin (DIEA) und Methanol-NaOCH3 ausgewählt
sind, werden in Gegenwart von Base 45 Minuten lang auf 50°C erhitzt;
- (v) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
aus DCM-TFA (4:1) und DCM-Essigsäure ausgewählt sind,
in Gegenwart von Säure;
- (vi) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln, die
Methanol, das Natriumcyanborhydrid enthält, und DCM, das Pd(PPh3)4 enthält, umfassen;
- (vii) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in organischen Lösungsmitteln mit
Reduktionsmitteln, die aus DCM-Pyridindichromat
(Harz neigt zum Aufbrechen, doch die Reporter sind noch gebunden),
DMF-5-nitro-2-hydroxybenzaldehyd und DCM-Pd(PPh3)4-diethylazodicarboxylat (DEAD) ausgewählt sind;
und
- (viii) Rot markierte und grün
markierte Harzkügelchen
zusammen in DMF mit Peptidkopplungsreagentien, die Fmoc-Gly-OH,
HBTU und DIEA umfassen.
-
Verfahren C:
-
Verfahren
A von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass DMF durch
verschiedene Lösungsmittel
ersetzt wurde, die aus Wasser, Methanol, DCM, Essigsäure, Wasser/DMF
(4:1), Piperidin/DMF (1.1) und Methanol/DCM (1:1) ausgewählt sind. Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten.
-
Beispiel 9: Gamma-Bestrahlung
von Polyelektrolyt-beschichteten Reporterkügelchen
-
In
diesem Beispiel wurden die Polyelektrolyt-beschichteten Reporterkügelchen
hergestellt, indem man PEI und dann PAA auf die Siliciumoxid-Kügelchen
adsorbieren ließ.
Diese Reporterkügelchen zeigten
eine ausgezeichnete Bindung an verschiedenen Typen von Trägern. Die
Bindung konnte durch Schaffung eines größeren Gitters auf der Oberfläche des
Reporters weiter verbessert werden. Dies kann durch γ-Bestrahlung
der Polyelektrolyt-beschichteten Reporter in einer Polyelektrolytlösung während des Beschichtungsverfahrens
erreicht werden. Die Bildung von Radikalen entlang der Polyelektrolytketten unter
Gamma-Bestrahlung ermöglicht
eine Vernetzung. Dadurch entsteht ein großes Gitter um den Reporter
herum, was die Stärke
der Bindung an die Träger
verstärkt,
indem es eine bessere Brückenbildungsausflockung
ermöglicht.
Ein Beispiel dafür
ist das folgende Verfahren:
Fluoreszente rote Siliciumoxid-Mikrokugeln
(10 mg, 1 μm
Durchmesser, Microcaps GmbH) werden zu einer wässrigen Lösung von PEI (3 ml, 1,2 Gew.-%,
MW 10 000 g/mol, Polysciences Inc.) gegeben und 30 Minuten lang
mit Ultraschall behandelt. Die Reporterlösung wird 24 Stunden lang äquilibriert,
um eine Adsorption von PEI auf den Reportern zu ermöglichen. Die
Reporter werden in Milli-Q-Wasser gewaschen, um PEI (5 × 3 ml)
zu entfernen, und werden in einer wässrigen Lösung von PAA (3 ml, 0,75%,
MW = 250 000 g/mol, Sigma-Aldrich) resuspendiert. Stickstoffgas
wird 30 Minuten lang durch die Lösung
perlen gelassen, um Sauerstoff zu entfernen, der als Fänger für die unter
Gamma-Bestrahlung ge bildeten radikale wirken kann. Dann wird die
Lösung
1,5 Stunden lang in die Gammazelle gebracht und einer Dosisleistung von
8 kG/Stunde (d.h. einer Gesamtdosis von 11,5-12 kG) ausgesetzt.
Die Reporter werden in Milli-Q-Wasser (5 × 3 ml) und DMF (5 × 3 ml)
gewaschen und in 1 ml DMF gelassen (endgültige Reporterkonzentration
= 10 mg/ml).
-
Beispiel 10: Kovalente
Bindung zur Verstärkung
der Reporter-Träger-Bindung
-
Sobald
die Bindung von Reporterkügelchen an
Trägern
durch die Manipulation von kolloidalen Kräften induziert ist, kann die
Stärke
der Bindung durch die Bildung von zusätzlichen kovalenten Bindungen
zwischen Oberflächengruppen
der beiden Kolloide gefestigt werden. Zum Beispiel kann eine Peptidbindung
zwischen NH2, das von der Schutzgruppe befreit
wurde, auf der Oberfläche
eines Trägers
und COOH-Gruppen auf der Oberfläche
der Reporter gebildet werden (in Gegenwart des Kopplungsmittels
HBTU und der Base DIEA). Alternativ dazu kann eine ähnliche
kovalente Reaktion auch nach der Bindung von Teilchen durch Brückenbildungsausflockung
induziert werden. Zum Beispiel können
die Reporter mit PAA-Gitter beschichtet, ausgeflockt und mit einem
Trägerkügelchen,
das NH2-Oberflächengruppen enthält, umgesetzt
werden.
-
Beispiel 11: Dendrimere
-
Die
Anwesenheit eines Gitters von dendritischen Makromolekülen auf
einem Trägerkügelchen, Reporterkügelchen
oder dergleichen kann die permanente Bindung von Reporterkügelchen
am Träger verstärken. Dendritische
Makromoleküle
(Dendrimere) sind eine neue Stoffklasse (Tsukruk et al., 1997, Langmuir
13, 2171) und haben eine kaskadenartige verzweigte Struktur. Die
Manipulation der Makromoleküleigenschaften
von Dendrimeren kann durch systematische strukturelle Variation
der "Kern-" und "Verzweigungseinheiten" (Monomere) erreicht
werden. Die Oberflächenporosität, die Größe und die
Position von speziellen Hohlräumen
in der dendritischen Struktur und die endgültige Form des Dendrimers werden
durch diese Variationen beeinflusst.
-
Beispiel für die Markierung
von Dendrimeren mit Reportern
-
Polyamidoamin-Dendrimere
in DMF (0,25 ml, 200 mg/ml, Generation 10, Dendritech) werden mit
roten Reportern (1 μm
Durchmesser, 0,25 ml, 10 mg/ml, Microcaps GmbH) gemischt, die mit
Polyelektrolyt beschichtet sind (siehe Beispiel 2). Nach der Markierung
werden freie Reporter durch Waschen mit DMF (20 × 20 ml) und Vakuumfiltration
durch eine Glasfritte entfernt.