DE69826708T2

DE69826708T2 - Zusammenstellungen aus trägern und reporterkügelchen

Info

Publication number: DE69826708T2
Application number: DE69826708T
Authority: DE
Inventors: Mathias Trau; Edward Darryn BRYANT
Original assignee: Nanomics Biosystems Pty Ltd
Current assignee: Nanomics Biosystems Pty Ltd
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-12
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2018-11-13
Also published as: DE69826708D1; US7338768B1; WO1999024458A1; CA2309993A1; EP1034183B1; AUPP032897A0; ES2229546T3; EP1034183A1; CA2309993C; JP2001522861A; EP1034183A4

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Träger-Reporterkügelchen-Anordnungen und ihre Verwendung in Verbindung mit Oligomerbibliotheken, die durch ein kombinatorisches Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren gebildet werden können, sowie auf ein Verfahren zum Decodieren von Molekülen, die in solchen Oligomerbibliotheken hergestellt werden.
Hintergrund der Erfindung
Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren in der kombinatorischen Chemie sind bereits in Bezug auf die Bildung von Peptidbibliotheken bekannt, wie bei Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37, 1233-1251, diskutiert wird; dies bezieht sich auf die Synthese von Peptidbibliotheken durch die Verwendung von Polystyrolkügelchen, welche am Anfang als erste Charge vorhanden sind, die in kleinere Chargen aufgeteilt wird, wobei verschiedene Aminosäuren kovalent an eine primäre Linkergruppe gebunden sind, die sich auf der Oberfläche jedes Kügelchens befindet. Anschließend werden die Kügelchen rekombiniert und dann wieder aufgeteilt, so dass eine zweite Aminosäure an die Aminosäure, die an die primäre Linkergruppe gebunden ist, gebunden sein kann. Dieser Vorgang wird so oft wiederholt, wie es erforderlich ist, um die Peptidbibliothek herzustellen.
Ein ähnliches Verfahren, das sich auf die Herstellung einer Oligonucleotidbibliothek bezieht, ist bei Gallop et al., 1994 (siehe oben), beschrieben.
"Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-" oder "Aufteilungs-Synthese"-Verfahren, die Bibliotheken mit jeweils einer Verbindung an einem (Harz)Kügelchen erzeugen, wurden zuerst bei Furka et al., 1991, Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487-493, vorgeschlagen und werden auch diskutiert bei Eichler et al., 1995, Medicinal Research Reviews 15(6), 481-496, und Balkenhohl et al., 1996, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2288-2337.
Peptidbibliotheken werden hauptsächlich bei der Wirkstoffsuche verwendet, wie bei Gallop et al., 1994 (siehe oben), diskutiert wird, wobei potentiell nützliche Wirkstoffe durch Screening-Verfahren identifiziert werden, wie in der Technik bekannt ist. Dies wird auch berichtet bei Borman Chemical & Engineering News, Februar 1997, 43-62, Fruchtel et al., 1996, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35, 17-42, und Barany et al., 1987, In. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739.
Oligonucleotidbibliotheken andererseits sind nützlich als Werkzeug für die schnelle DNA-Sequenzierung durch Hybridisierung, wie es diskutiert wird bei Fodor et al., 1991, Science, 251, 767, Lysov et al., 1988, Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 303, 1508, Bains et al., 1988, J. Theor. Biol., 135, 303, Drmanac et al., 1989, Genomics 4, 114, und Drmanac et al., 1993, Science, 260, 1649.
Es wurde vorgeschlagen, Sequenzierung-durch-Hybridisierung (SBH) anstelle der herkömmlichen DNA-Sequenzierungstechnik zu verwenden, die ein aufwändiges Verfahren ist, das die elektrophoretische Trennung markierter DNA-Fragmente nach der Größe beinhaltet. SBH verwendet einen Satz kurzer Oligonucleotidsonden mit definierter Sequenz, um an einem längeren DNA-Zielstrang nach komplementären Sequenzen zu suchen. Das Hybridisierungsmuster wird verwendet, um die Ziel-DNA-Sequenz zu rekonstruieren.
Das Problem beim Einsatz von SBH-Techniken als praktikables Verfahren zur Sequenzierung von DNA besteht darin, dass eine äußerst große Zahl von Sonden erforderlich ist. Neue Verfahren sind vorgeschlagen worden, um dieses Problem zu überwinden, wie es bei Fodor et al., 1991 (siehe oben), Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 5022, Cho et al., 1993, Science 261, 1303, und Southern et al., 1992, Genomics 13, 1008, diskutiert ist. Diese neuen Verfahren beinhalten die Verwendung von Oligonucleotidrastern oder "biologischen Chips", wie es bei Fodor et al., 1991 (siehe oben), diskutiert ist; diese beherbergen spezielle chemische Verbindungen (d.h. die Sonden) an genauen Stellen in einem Rasterformat. Dann wird die Ziel-DNA zu dem Sondenraster gegeben. Das Hybridisierungsmuster, das in einem einzigen Experiment bestimmt wird, offenbart direkt die Identität aller komplementären Sonden, wie es bei Drmanac et al., 1989 (siehe oben), und Drmanac et al., 1993 (siehe oben), berichtet wird. Obwohl diese Technik vielversprechend ist, ist die Informationsdichte auf jedem Raster für den Zweck der DNA-Sequenzierung äußerst gering, und dies schränkt die Größe und Geschwindigkeit ein, mit der DNA-Fragmente sequenziert werden können. Die Schwierigkeiten, die mit der selektiven Verankerung von Oligonucleotidsequenzen an speziellen und räumlich angeordneten Stellen auf dem Substrat verbunden sind, bedeuten, dass die minimale Pixelgröße in den Rastern zur Zeit auf eine Fläche von ungefähr 0,4 mm × 0,4 mm beschränkt ist. Da die Pixelgröße direkt die Informationsdichte und damit die Sequenzierungseffizienz bestimmt, ist die Miniaturisierung der "biologischen Chips" ein größeres technisches Problem, um diese Technologie als schnelles Sequenzierungsverfahren einzusetzen. Ein Verfahren, um dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung einer Technik, die "feldinduzierte kolloidale Kristallisation" erfordert, wie es bei Trau et al., 1996, Science 272, 706, berichtet wird. Diese Technik verwendet miniaturisierte Chips von in Mustern angeordneten mikroskopischen kolloidalen Teilchen, die chemisorbierte Oligonucleotide auf einer transparenten Elektrode, die Indiumzinnoxid umfasst, enthalten. Fluoreszente Muster der Hybridisierung unbekannter DNA-Sequenzen mit den Rastern werden mit Hilfe eines Lichtmikroskops beobachtet.
Vor dem Aufkommen der Technik von Trau et al., 1996 (siehe oben), wurde SBH zuvor durchgeführt, indem man Ziel-DNA an einer Oberfläche befestigte und nacheinander mit einem Satz von Oligonucleotidsonden testete, jeweils nur eine auf einmal, wie es bei Drmanac et al., 1989 (siehe oben), Drmanac et al., 1993 (siehe oben), und Strezoska et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 10089, diskutiert wird; dies war zeitraubend und ineffizient.
Die Anwendung von herkömmlichen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren auf die Wirkstoffsuche und SBH ist jedoch zur Zeit durch die inhärente Schwierigkeit eingeschränkt, die einzigartige Sequenz von Ereignissen, die auf jedes gewählte multimere Molekül anwendbar ist, schnell und bequem zu identifizieren. Für große Zahlen von Trägern und große Zahlen von Schritten und/oder Verarbeitungsverfahren ist dieses "Identifizierungsverfahren" besonders schwierig. In vielen praktischen Fällen, wo ein hoher Durchsatz und eine schnelle Analyse erforderlich sind, lässt sich dieses Problem mit herkömmlichen Verfahren nicht lösen.
Die oben genannten herkömmlichen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Techniken machten Schwierigkeiten, wenn man ein interessierendes Molekül nachweisen und isolieren wollte. In dieser Hinsicht war es notwendig, das interessierende Molekül durch die Verwendung eines geeigneten Assay oder einer geeigneten Sonde nachzuweisen und dann das interessierende Molekül zu isolieren, indem man dieses Molekül von dem Kügelchen abspaltete und anschließend das Molekül durch Techniken wie Massenspektroskopie oder HPLC identifizierte. Dies war zeitraubend und aufwändig, und in manchen Fällen war das Abspalten nicht möglich.
Es sei Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung WO 93/06121, die sich auf ein allgemeines stochastisches Verfahren zum Synthetisieren von Bibliotheken von statistischen Oligomeren bezieht, die auf festen Trägern einschließlich Polystyrolkügelchen synthetisiert werden oder die von diesen Trägern abgespalten werden können, so dass man eine lösliche Bibliothek erhält. Die Oligomere bestehen aus einer Sequenz von Monomeren, die unter Bildung eines Oligomers oder Polymers miteinander verbunden sein können. Diese Literaturstelle beschreibt auch die Verwendung von Identifikationsmarkern, um die Sequenz von Monomeren in dem Oligomer zu identifizieren. Der Identifikationsmarker kann mit oder ohne begleitendes Teilchen direkt an das Oligomer, an einen an das Oligomer gebundenen Linker, an den Festphasenträger, an dem das Oligomer synthetisiert wird, oder an ein zweites Teilchen, das an das oligomertragende Teilchen gebunden ist, gebunden sein. Das einzige Befestigungs mittel, das in dieser Literaturstelle beschrieben ist, ist jedoch die kovalente Bindung. In dieser Literaturstelle wird der Identifikationsmarker sehr allgemein beschrieben als jedes erkennbare Merkmal; dazu gehören eine mikroskopisch unterscheidbare Form, Größe, Farbe oder optische Dichte; eine differentielle Extinktion oder Lichtemission; chemische Reaktivität; magnetisch oder elektronisch codierte Information; oder jedes andere Unterscheidungsmerkmal mit der erforderlichen Information, das auf dem Niveau von einem oder wenigen festen Trägern entzifferbar ist. In einer Form werden die Identifikationsmarker als kleine Kügelchen mit erkennbar unterschiedlichen Formen, Größen oder Farben oder mit Strichcodemarkierungen beschrieben.
Während sich die Beschreibung der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 jedoch sehr allgemein auf die Arten von Identifikationsmarkern bezieht, die bei dem Verfahren zur Bildung von Oligomerbibliotheken verwendet werden können, ist der einzige experimentelle Beweis, der in der Beschreibung genannt wird, die Verwendung von Oligonucleotiden. Es gibt also keine ausreichende Offenbarung speziell in Bezug auf die Verwendung von kleinen Kügelchen als Identifikationsmarker und darauf, wie diese besondere Technik in die Praxis umgesetzt werden kann.
In der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 wird eine Identifizierung der Marker durch Sequenzieren oder Hybridisierung erwähnt, falls der Marker ein Oligonucleotid ist. Man kann auch den Oligonucleotid-Marker durch PCR amplifizieren. Man wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass solche Identifizierungsverfahren zeitraubend und ineffizient sind. Zum Beispiel kann die Verwendung von PCR zu einer PCR-Produkt-Kontaminierung führen, die es notwendig macht, weitere Maßnahmen einzuführen, um dieses Problem zu überwinden, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 93/06121 beschrieben ist. Es ist auch notwendig, amplifizierte DNA zu sequenzieren, und dies beinhaltet einen zusätzlichen Schritt im Identifizierungsverfahren, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 93/06121 beschrieben ist.
Es sei auch Bezug genommen auf das US-Patent Nr. 5,721,099, das komplexe kombinatorische chemische Bibliotheken von mit Markern codierten Verbindungen beschreibt. Jede Verbindung in der Bibliothek wird durch eine einzige Reaktionsfolge hergestellt und ist an einen individuellen festen Träger gebunden, der Teilchen oder Kügelchen einschließlich Polystyrolkügelchen oder Silicagelkügelchen umfassen kann. An jeden festen Träger ist eine Kombination von vier unterscheidbaren Identifikatoren gebunden, die sich voneinander unterscheiden. Die Kombination liefert eine spezielle Formel, die eine Markerkomponente, die der Analyse zugänglich ist, und eine Verknüpfungskomponente, die selektiv unter Freisetzung der Markerkomponente gespalten werden kann, umfasst. Jeder Identifikator oder jede Kombination davon codiert Information in einem besonderen Stadium in der Reaktionsfolge für die an den festen Träger gebundene Verbindung. In dieser Bibliothek ist es jedoch wesentlich, dass jede Markerkomponente vor der Analyse vom Träger abgespalten werden muss, so dass wenigstens ein zusätzlicher Schritt entsteht, der zeitraubend und ineffizient ist, und somit gelten dieselben Nachteile wie bei der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 auch im Falle dieser Literaturstelle.
Was die Verwendung einzelsträngiger Identifikationsmarker zum Codieren einer kombinatorischen Peptidsynthese betrifft, wobei dieses Verfahren bei Needles et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10700-10704, diskutiert wird, so war dieses Verfahren wegen der Gründe, die oben bei der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 diskutiert wurden, nachteilig. Es wird jedoch auch festgestellt, dass es nach dem Nachweis eines Peptids oder Moleküls innerhalb der interessierenden Bibliothek in manchen Fällen notwendig war, den entsprechenden Marker vom Träger abzuspalten und den Marker durch PCR zu amplifizieren, da er nur in Spuren vorhanden war. Dies war ebenfalls zeitraubend und ineffizient.
Es sei auch Bezug genommen auf photolabile oder elektrophoretische Markierung, wie sie bei Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 890, 10922-10926, oder Gallop et al., 1994 (siehe oben), beschrieben ist, was wegen der Einführung von zusätzlichen Schritten vor der Identifizierung des Markers ebenfalls nachteilig war.
Ziel der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung aus einem Träger und einem oder mehreren Reporterkügelchen bereitzustellen, wobei die Anordnung verwendet werden kann, um eine synthetische Oligomerbibliothek zu bilden, zweckmäßigerweise, doch nicht ausschließlich, durch ein kombinatorisches Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Oligomerbibliothek bereitzustellen, wobei ein interessierendes Molekül in der Bibliothek direkt identifiziert oder decodiert werden kann, ohne dass ein vorausgehender Schritt erforderlich ist wie im Stand der Technik.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Anordnung aus einem Träger bereitgestellt, an den ein oder mehrere Reporterkügelchen nichtkovalent gebunden sind.
Eine solche Anordnung kann in vielen Anwendungen verwendet werden, wie in Verfahren der kombinatorischen Chemie, die kein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren beinhalten. Vorzugsweise jedoch werden solche Anordnungen in Verfahren der kombinatorischen Chemie verwendet, die ein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren beinhalten.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bildung der obigen Anordnung bereitgestellt, das den Schritt der nichtkovalenten Bindung von einem oder mehreren Reporterkügelchen an einen Träger umfasst.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von synthetischen Oligomeren, die eine Vielzahl an Molekülen umfasst, welche eine Vielzahl verschiedener chemischer Gruppen aufweisen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(i) Binden einer entsprechenden chemischen Gruppe an einen Träger in jedem von einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen,
(ii) Binden eines Reporterkügelchens an den Träger in nicht-kovalenter Weise in jedem Reaktionsgefäß, wobei jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker aufweist,
(iii) Vereinigen der Träger aus jedem Reaktionsgefäß, die aus den Stufen (i) und (ii) erhalten werden, in einem Rekombinationsgefäß,
(iv) Aufteilen der Träger aus dem Rekombinationsgefäß auf die Vielzahl von Reaktionsgefäßen, worin die Stufen (i) und (ii) wiederholt werden, und
(v) Wiederholen der Stufen (iii) und (iv), bis die Bibliothek von Molekülen ausgebildet ist, wobei jedes Molekül ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängig ist, um die direkte Identifizierung der Abfolge von chemischen Gruppen, welche das Molekül umfasst, zu erleichtern,

In Bezug auf das oben Gesagte wird man sich darüber im Klaren sein, dass sich der Ausdruck "chemische Gruppe" auf die chemischen Einheiten oder Struktureinheiten bezieht, die im Hinblick auf die Synthese des Moleküls eine nach der anderen hinzugefügt werden. In Bezug auf die Bildung eines Oligopeptids oder Polypeptids sind es zum Beispiel die einzelnen Aminosäuren, die die chemischen Gruppen ausmachen. In einem anderen Beispiel in Bezug auf die Synthese eines Oligonucleotids sind es die Grundnucleotide oder Bausteine des Oligonucleotids, die die chemischen Gruppen ausmachen.
Die Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf eine Oligomerbibliothek, die eine Vielzahl von verschiedenen Molekülen mit einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Gruppen umfasst und durch das oben genannte Verfahren hergestellt wurde.
Die Erfindung bezieht sich in noch einem weiteren Aspekt auf eine Oligomerbibliothek, die eine Vielzahl von verschiedenen Molekülen umfasst, wobei jedes Molekül an einen entsprechenden Träger gebunden ist und wobei außerdem eine Vielzahl von Reporterkügelchen bereitgestellt wird, die in nichtkovalenter Weise an den Träger und/oder an benachbarte Reporterkügelchen gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker zur Identifizierung der chemischen Gruppe, die an den Träger gebunden ist, sowie zur Identifizierung der Position in der Abfolge der chemischen Gruppe relativ zu anderen chemischen Gruppen in jedem Molekül aufweist, wobei jedes Molekül ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängig ist, um die direkte Identifizierung jedes Moleküls zu erleichtern.
Die Verwendung des Ausdrucks "direkt" in diesem Zusammenhang bedeutet, dass jedes Molekül identifiziert werden kann, ohne dass ein vorheriger Schritt notwendig ist einschließlich des Abspaltens des Moleküls von dem Träger und der Amplifikation durch PCR oder durch die Verwendung von Hybridisierung oder Sequenzierung, wie im Stand der Technik, insbesondere in der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121.
Der Vorteil der direkten Identifizierung jedes Moleküls bedeutet, dass ein solches Molekül dann in herkömmlicher Weise synthetisiert werden kann, sobald die einzigartige Kombination von chemischen Gruppen, die mit jedem Molekül verbunden sind, bekannt ist.
Im Hinblick auf den Stand der Technik wird man sich darüber im Klaren sein, dass eine effiziente direkte Identifizierung oder Decodierung eines interessierenden Moleküls nicht erfolgen konnte, da molekulare Marker, die kovalent an den Träger gebunden waren, gewöhnlich nicht nachweisbar waren, es sei denn, sie wurden vom Träger abgespalten oder im Falle von Nucleinsäuren amplifiziert. Die Verwendung von molekularen Markern schränkt auch die maximal mögliche Größe von chemischen Bibliotheken, die codiert werden kann, ein. Obwohl im Stand der Technik darauf hingewiesen wurde, dass kleine Reporterkügelchen an größeren Trägerkügelchen befestigt werden könnten, war dies nicht möglich, und abgesehen von kovalenter Bindung wurde kein Verfahren vorgeschlagen, um dieses Ergebnis zu erreichen. In Wirklichkeit konnte eine permanente Bindung von Reporterkügelchen an Träger nicht erreicht werden, es sei denn, nichtkovalente Kräfte wären in Betracht gezogen worden, wie im Falle der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jetzt bewiesen, dass durch nichtkovalente Bindung eines Reporterkügelchens an einen Träger eine effiziente Bindung oder Adhärenz des Reporterkügelchens an den Träger erreicht werden kann, so dass die direkte Identifizierung oder Decodierung eines interessierenden Moleküls innerhalb der Oligomerbibliothek erleichtert wird. Ein Beispiel für eine nichtkovalente Bindung ist die Verwendung von elektrostatischen Kräften, wobei Oberflächenladungen entweder am Träger, am Reporterkügelchen oder an beiden induziert werden können.
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit haben die Erfinder jedoch herausgefunden, dass die Verwendung von kolloidalen Teilchen als Reporterkügelchen die nichtkovalente Bindung der Reporterkügelchen an den Träger sehr erleichtert. Eine geeignete Definition von kolloidalen Teilchen ist bei Hunter genannt (R.J. Hunter, 1986, "Foundations of Colloid Science", Oxford University Press, Melbourne).
Wenn sich eine Substanz unter Bildung einer echten Lösung in einer anderen löst, haben die Teilchen des gelösten Stoffes also molekulare Abmessungen. Der Radius des gelösten Moleküls beträgt in diesen Fällen selten mehr als einen Nanometer und gewöhnlich weniger. Lösungsmittel- und gelöste Moleküle sind von vergleichbarer Größe, und die gelösten Moleküle werden gewöhnlich gleichmäßig im gesamten (kontinuierlichen) Lösungsmittel dispergiert. Es gibt jedoch eine wichtige Klasse von Materialien, bei denen die Einheiten, die im gesamten Lösungsmittel dispergiert sind, sehr viel größer sind als die Moleküle des Lösungsmittels. Solche Systeme werden kolloidale Dispersionen genannt. Die großen Teilchen, die in solchen Systemen vorhanden sind, werden als Kolloide bezeichnet.
Die Größe solcher Kolloide variiert stark (je nach dem untersuchten System). Typischerweise ist ein kolloidales Teilchen definiert als ein beliebiges Teilchen (d.h. Materieteilchen), das eine mikroskopische Abmessung hat (d.h. eine Abmessung, die kleiner ist als mit dem bloßen Auge sichtbar). Ein Merkmal von kolloidalen Systemen besteht darin, dass die Kontaktfläche zwischen den dispersen Teilchen und dem Dispersionsmedium oder zwischen mehr als einem dispergierten Teilchen relativ groß ist.
Wegen ihrer makroskopischen Natur zeigen kolloidale Teilchen Wechselwirkungskräfte, die von denen molekularer Systeme ganz verschieden sind. Für kolloidale Kräfte beziehen wir uns auf die Standarddefinition, die in Lehrbüchern verwendet wird, wie Hunter, 1986 (siehe oben), oder Russel et al., 1989, "Colloidal Dispersions", Cambridge University Press, Cambridge.
Wenn solche Teilchen sich einander nähern oder wenn sie sich einer anderen Oberfläche nähern, unterliegen sie einer Vielzahl von makroskopischen (d.h. nichtkovalenten) physikalischen Kräften. Beispiele für solche Kräfte, obwohl keineswegs eine vollständige Liste, sind die folgenden:

(i) van-der-Waals-Kräfte (Anziehungskräfte, die aus einer intrinsischen van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen Kolloiden resultieren);
(ii) elektrostatische Kräfte (anziehende oder abstoßende Wechselwirkung, die aus der Oberflächenladung auf den kolloidalen Teilchen resultiert);
(iii) sterische Kräfte (anziehende oder abstoßende Wechselwirkung, die aus der Oberflächenbeschichtung von Polymeren resultiert; und
(iv) Brückenbildungsausflockung (Anziehungskräfte, die aus dem Austausch von adsorbierten Polymersträngen von einem Kolloid zu einem anderen resultieren).

Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass die nichtkovalente Bindung von Reporterkügelchen an Träger im Vergleich zu einer kovalenten Bindung von Reporterkügelchen und molekularen Markern an Träger erhebliche Vorteile hat. Die nichtkovalente Bindung von Reporterkügelchen an Träger funktioniert also wegen der Nutzbarmachung von kolloidalen Kräften. Eine kovalente Bindung ohne Optimierung der beteiligten kolloidalen Kräfte zwischen Reportern und Trägern übersteht möglicherweise nicht die Vorgänge, die mit einer kombinatorischen Synthese verbunden sind. Reporter wie kleine Kügelchen müssen ausreichend groß sein, um genügend Fluorophore (zum Beispiel) zu enthalten, so dass man sie leicht nachweisen kann (d.h. wenigstens 500 Fluorophormoleküle pro Kügelchen). Dies bedeutet, die Kügelchen müssen viel größer sein als ein Molekül, das eine kovalente Bindung eingeht. Wenn die kleinen Kügelchen kovalent an einen Träger gebunden wären, gäbe es nur wenige Bindungen, die einen größeren Reporter halten. Die kleinen Kügelchen würden durch Reiben gegen andere Träger sehr schnell losgelöst, wenn keine kolloidalen (d.h. nichtkovalenten) Kräfte beteiligt wären.
Die nichtkovalente Bindung stört nicht die chemische Synthese, abgesehen davon, dass sie einen Teil der verfügbaren Oberfläche besetzt. Die kovalente Bindung von Markern wie in dem oben diskutierten Stand der Technik bedeutet die Durchführung von zusätzlichen chemischen Schritten in jedem Stadium des chemischen Verfahrens.
Die nichtkovalente Bindung von kleinen Kügelchen an den Träger kann relativ leicht durchgeführt werden, indem man Träger in einem Lösungsmittel mit Reportern mischt. Die Verwendung von nichtkovalent gebundenen Reportern bedeutet, dass keine Artefakte innerhalb der Marker oder Liganden durch Wechselwirkung zwischen denselben erzeugt werden. Außerdem müssen die kleinen Reporterkügelchen zum Decodieren nicht abgespalten und chemisch analysiert werden. Dadurch wird Zeit und Geld gespart.
Die Erfindung hat auch eine Kapazität, die Sequenz von Reaktionsschritten zu bestimmen, wenn eine größere Zahl von Vorgängen oder Schritten beteiligt sind, wie im Folgenden noch ausführlich beschrieben wird.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass die Zahl der Marker, die verwendet werden können, relativ klein ist und in den meisten Fällen gleich neun oder weniger sein kann, wie ebenfalls aus der folgenden Beschreibung hervorgeht.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligomer" hat dieselbe Bedeutung wie in der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 diskutiert und kann daher eine Sequenz von Monomeren umfassen, die beliebige Elemente einer Menge von Molekülen sind, die unter Bildung eines Oligomers oder Polymers miteinander verbunden werden können, d.h. Aminosäuren, Carbonate, Sulfone, Sulfoxide, Nucleoside, Kohlenhydrate, Harnstoffe, Phosphonate, Lipide, Ester oder Kombinationen davon.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligomer" umfasst auch eine Vielzahl von anorganischen Einheiten, die in einer besonderen Sequenz miteinander verbunden sind. Beispiele für anorganische Einheiten sind Silicate und Aluminosilicate.
Die Erfindung umfasst in einem anderen Aspekt auch ein Verfahren zum Decodieren von Molekülen, die vom Verfahren der Erfindung codiert werden, wobei das Verfahren den Schritt der Analyse der Reporterkügelchen, wie er im Folgen den beschrieben ist, umfasst, um die einzigartige Sequenz der chemischen Gruppen, die jedes der Moleküle ausmachen, zu bestimmen.
Man wird sich daher darüber im Klaren sein, dass in einem anderen Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines besonderen Moleküls, das eine bestimmte einzigartige Sequenz hat, durch das oben beschriebene Decodierungsverfahren bereitgestellt wird.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass sich die im Folgenden beschriebene bevorzugte Ausführungsform zwar auf die Bildung von Oligonucleotiden oder Oligopeptiden bezieht, wobei Nucleotide oder Aminosäuren den oben diskutierten chemischen Gruppen entsprechen, sich das Verfahren der Erfindung jedoch auf die Bildung von Oligomeren oder Polymeren aus identischen Monomereinheiten oder die Bildung von relativ komplexen Molekülen oder Makromolekülen aus individuellen oder verschiedenen chemischen Gruppen oder Komponenten anwenden lässt, wie aus der oben diskutierten Bedeutung von "Oligomer" hervorgeht.
Insbesondere lässt sich das Verfahren der Erfindung auf jeden Typ von chemischer Reaktion anwenden, die auf einem festen Träger durchgeführt werden kann, und umfasst daher zum Beispiel:

(i) [2+2]-Cycloadditionen einschließlich des Einfangs von Butadien;
(ii) [2+3]-Cycloadditionen einschließlich der Synthese von Isoxazolinen, Furanen und modifizierten Peptiden;
(iii) Acetalbildung einschließlich der Immobilisierung von Diolen, Aldehyden und Ketonen;
(iv) Aldolkondensation einschließlich der Derivatisierung von Aldehyden, Synthese von Propandiolen;
(v) Benzoinkondensation einschließlich der Derivatisierung von Aldehyden;
(vi) Cyclokondensationen einschließlich Benzodiazepinen und Hydantoinen, Thiazolidinen, β-Schleifen-Mimetika, Porphyrinen, Phthalocyaninen;
(vii) Dieckmann-Cyclisierung einschließlich der Cyclisierung von Diestern;
(viii) Diels-Alder-Reaktion einschließlich der Derivatisierung von Acrylsäure;
(ix) elektrophile Addition einschließlich der Addition von Alkoholen an Alkene;
(x) Grignard-Reaktion einschließlich der Derivatisierung von Aldehyden;
(xi) Heck-Reaktion einschließlich der Synthese von disubstituierten Alkenen;
(xii) Henry-Reaktion einschließlich der Synthese von Nitriloxiden in situ (siehe [2+3]-Cycloaddition);
(xiii) katalytische Hydrierung einschließlich der Synthese von Pheromonen und Peptiden (Hydrierung von Alkenen);
(xiv) Michael-Reaktion einschließlich der Synthese von Sulfanylketonen, Bicyclo[2.2.2]octanen;
(xv) Mitsunobu-Reaktion einschließlich der Synthese von Arylethern, Peptidylphosphonaten und Thioethern;
(xvi) nucleophile aromatische Substitutionen einschließlich der Synthese von Chinolonen;
(xvii) Oxidation einschließlich der Synthese von Aldehyden und Ketonen;
(xviii) Pausen-Khand-Cycloaddition einschließlich der Cyclisierung von Norbornadien mit Pentinol;
(xix) photochemische Cyclisierung einschließlich der Synthese von Helicenen;
(xx) Reaktionen mit metallorganischen Verbindungen einschließlich der Derivatisierung von Aldehyden und Acylchloriden;
(xxi) Reduktion mit komplexen Hydriden und Sn-Verbindungen einschließlich der Reduktion von Carbonyl, Carbonsäuren, Estern und Nitrogruppen;
(xxii) Soai-Reaktion einschließlich der Reduktion von Carboxygruppen;
(xxiii) Stille-Reaktionen einschließlich der Synthese von Biphenylderivaten;
(xxiv) Stork-Reaktion einschließlich der Synthese von substituierten Cyclohexanonen;
(xxv) reduktive Aminierung einschließlich der Synthese von Chinolonen;
(xxvi) Suzuki-Reaktion einschließlich der Synthese von Phenylessigsäure-Derivaten; und
(xxvii) Wittig-, Wittig-Horner-Reaktion einschließlich Reaktionen von Aldehyden, Pheromonen und Sulfanylketonen.

Es sei auch Bezug genommen auf Patel et al., April 1996, DDT 1(4), 134-144, das sich auf die Herstellung oder Synthese von N-substituierten Glycinen, Polycarbamaten, Mercaptoacylprolinen, Diketopiperazinen, HIV-Protease-Inhibitoren, 1,3-Diolen, Hydroxystilbenen, B-Lactamen, 1,4-Benzodiazepin-2,5-dionen, Dihydropyridinen und Dihydropyrimidinen bezieht.
Es sei auch Bezug genommen auf die Synthese von Polyketiden, wie sie bei Rohr, 1995, Angew. Int. Ed. Engl. 34, 881-884, diskutiert wird.
Die Träger zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung sind zweckmäßigerweise polymere Träger, wie polymere Kügelchen, die vorzugsweise aus Polystyrol, das mit 1 bis 5% Divinylbenzol vernetzt ist, gebildet werden. Trägerkügelchen können auch aus Hexamethylendiaminpolyacrylharzen und verwandten Polymeren, Poly[N-{2-(4-hydroxyphenyl)ethyl}]acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliciumdioxid, Cellulosekügelchen, Polystyrolkügelchen, Latexkügelchen, Kügelchen aus gepfropftem Copolymer, wie Polyethylenglycol/Polystyrol, Porenglaskügelchen, Polyacrylamid-Kügelchen, Dimethylacrylamid-Kügelchen, die wahlweise mit N,N'-Bis(acryloyl)ethylendiamin vernetzt sind, Glasteilchen, die mit einem hydrophoben Polymer einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer beschichtet sind, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly(N-acryloylpyrrolidin)-Harzen, Wang-Harzen, Pam-Harzen, Merrifield-Harzen, PAP- und SPARE-Polyamidharzen, mit Acrylsäure funktionalisiertem Polyethylen, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Copolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel und PEG-PS/DVB-Copolymeren gebildet werden.
Diese Trägermaterialien enthalten gewöhnlich Funktionen für die Bindung von Reporterkügelchen oder Linkern oder können dafür funktionalisiert werden. Zu den geeigneten Funktionen gehören -NH2, -COOH, -SOH, -SSH oder Sulfatgruppen.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass die polymeren Kügelchen auch durch andere geeignete Träger, wie Stifte oder Chips, ersetzt werden können, wie in der Technik bekannt ist, z.B. gemäß der Diskussion bei Gordon et al., 1994, J. Med. Chem. 37(10), 1385-1401. Die Kügelchen können auch Granulate, Scheibchen, Kapillaren, Hohlfasern oder Nadeln umfassen, wie in der Technik bekannt ist.
In Anbetracht dessen kann man sich auch darüber im Klaren sein, dass der Träger ein beliebiges festes Material umfassen kann, das als Basis für die kombinatorische Synthese dienen kann.
Es wird auch Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung WO 93/06121, die einen vollen Bereich von Trägern beschreibt, die Träger zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung bilden können und die irgendeine geeignete Form haben können und aus geeigneten Materialien einschließlich Latex, Glas, Gold oder anderen kolloidalen Metallteilchen und dergleichen gebildet sind.
Wegen Beispielen für geeignete Träger sei auch Bezug genommen auf die Internationale Veröffentlichung WO 95/25737 oder WO 97/15390.
Linker zur Verwendung mit den Trägern der Erfindung können aus basenstabilen Ankergruppen, wie sie in Tabelle 2 von Fruchtel et al., 1996 (siehe oben), beschrieben sind, oder säurestabilen Ankergruppen, wie sie in Tabelle 3 von Fruchtel et al., 1996 (siehe oben), beschrieben sind, ausgewählt werden. In dieser Hinsicht wird auf Fruchte) et al., 1996, Bezug genommen.
Linker zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung sind auch in der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 erwähnt.
Im Allgemeinen sind die für die Peptidchemie entwickelten Anker gegenüber Basen oder schwachen Säuren stabil, aber meistens sind sie nur für die Immobilisierung von Carbonsäuren geeignet.
Für die reversible Bindung von speziellen funktionellen Gruppen müssen jedoch bekannte Anker derivatisiert und optimiert werden, oder falls notwendig, müssen völlig neue Anker entwickelt werden. Eine Ankergruppe zur Immobilisierung von Alkoholen ist zum Beispiel (6-Hydroxymethyl)-3,4-dihydro-2H-pyran, wobei das Natriumsalz durch eine nucleophile Substitutionsreaktion kovalent an chlormethyliertes Merrifield-Harz gebunden wird. Der Alkohol wird durch elektrophile Addition in Gegenwart von Pyridiniumtoluol-4-sulfonat (PPTS) in Dichlormethan an den Träger gekoppelt. Der resultierende Tetrahydropyranylether ist basenstabil, kann jedoch durch Umetherung mit 95%iger Trifluoressigsäure abgespalten werden.
Benzylhalogenide können an einen photolabilen α-Sulfanyl-substituierten Phenylketon-Anker gekoppelt werden.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass die Marker zur Verwendung im Verfahren der Erfindung Fluorophore, Chromophore, Strichcodes oder radioaktive oder lumineszente Marker, wie sie in der Internationalen Veröffentlichung WO 93/06121 diskutiert sind, umfassen, aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt sind. Die Marker können auch nachweisbare physikalische Merkmale der Kügelchen, wie die Größe der Kügelchen, umfassen. Vorzugsweise umfassen die Marker Fluoreszenzfarbstoffe. Jeder geeignete Fluoreszenzfarbstoff kann zum Einbau in die Reporterkügelchen der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel sei Bezug genommen auf die US-Patente 5,573,909 (Singer et al.) und 5,326,692 (Brinkley et al.), die eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen beschreiben, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Es sei auch Bezug genommen auf die Fluoreszenzfarbstoffe, die in den US-Patenten Nr. 5,227,487, 5,274,113, 5,405,975, 5,433,896, 5,442,045, 5,451,663, 5,453,517, 5,459,276, 5,516,864, 5,648,270 und 5,723,218 beschrieben sind.
Ein oder mehrere der Fluoreszenzfarbstoffe werden vorzugsweise in ein Reporterkügelchen, wie ein polymeres oder keramisches Mikroteilchen, eingebaut. Das polymere Mikroteilchen kann aus einer Vielzahl von polymerisierbaren Monomeren hergestellt werden, einschließlich Styrolen, Acrylaten und ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden und Alkoholen; dazu gehören unter anderem Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latices, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluol, Polyvinylidenchlorid und Polyvinylbenzol. Die Mikroteilchen können aus Styrolmonomeren hergestellt werden. Keramische Mikroteilchen können aus Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Titanoxid oder irgendeinem anderen geeigneten transparenten Material bestehen.
Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Siliciumoxid-Mikroteilchen ist zum Beispiel in "The Colloid Chemistry of Silica and Silicates", Cornell University Press, von Ralph Keller, 1955, beschrieben.
Die Mikroteilchen können eine beliebige Größe oder Form haben. Zum Beispiel können die Mikroteilchen eine sphärische oder irreguläre Form haben. Typischerweise haben Mikroteilchen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, einen Durchmesser von etwa 0,01 μm bis etwa 50 μm.
Fluoreszenzfarbstoffe können nach jedem geeigneten, in der Technik bekannten Verfahren in Mikroteilchen eingebaut werden, wie Copolymerisation eines polymerisierbaren Monomers und eines farbstoffhaltigen Comonomers oder Zugabe eines geeigneten Farbstoffderivats in einem geeigneten organischen Lösungsmittel zu einer wässrigen Suspension, wie es zum Beispiel bei Singer et al. (siehe oben) einschließlich der dort zitierten Literatur offenbart ist. Alternativ dazu können auch fluoreszente Mikroteilchen hergestellt werden, die wenigstens eine fluoreszente sphärische Zone aufweisen. Solche Mikroteilchen können zum Beispiel so hergestellt werden, wie es im US-Patent Nr. 5,786,219 (Zhang et al.) beschrieben ist.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass man eine interessierende Verbindung in einer Verbindungsbibliothek der Erfindung mit einer einzigartigen Sequenz durch mehrere Screening-Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, nachweisen oder identifizieren kann, ohne dass man das interessierende Molekül vom Träger abspalten muss. Wenn die einzigartige Sequenz bestimmt wurde, kann ein Molekül, das eine solche Sequenz umfasst, mit herkömmlichen Mitteln, wie Aminosäure-Synthesizern oder Oligonucleotid-Synthesizern, wie in der Technik bekannt ist, synthetisiert werden.
Man kann das Verfahren der Erfindung auch auf SBH-Technik anwenden, wobei eine Bibliothek aus Trägerkügelchen, an die jeweils eine einzigartige Polynucleotid- oder Oligonucleotidsequenz gebunden ist, und Reporterkügelchen, die die einzigartige Sequenz identifizieren, gebildet wird. Eine wässrige Lösung von fluoreszenzmarkierter ssDNA von unbekannter Sequenz kann über die Bibliothek von Polynucleotid- und Oligonucleotidverbindungen geleitet werden, und es erfolgt eine Adsorption (Hybridisierung) der ssDNA nur an Trägerkügelchen, die Polynucleotid- oder Oligonucleotidsequenzen enthalten, die zu denjenigen auf der ssDNA komplementär sind. Diese Trägerkügelchen können zum Beispiel durch Fluoreszenz-Lichtmikroskopie identifiziert werden.
Zu den Liganden, die gemäß der Erfindung einem Screening unterzogen werden können, gehören Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren, Toxine, Tiergifte, virale Epitope, Hormone, Zucker, Cofaktoren, Peptide, Enzymsubstrate, Wirkstoffe einschließlich Opiaten und Steroiden, Proteine einschließlich Antikörpern, monoklonale Antikörper, Antiseren, die gegenüber spezifischen antigenen Determinanten reaktiv sind, Nucleinsäuren, Lectine, Polysaccharide, Zellmembranen und -organellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
In den beigefügten Zeichnungen wird Bezug auf eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung genommen:
1 ist eine schematische Darstellung eines Schritts in einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren, wie es z.B. im Stand der Technik in Bezug auf die Synthese von Peptidbibliotheken diskutiert wird;
2 ist eine schematische Darstellung des gesamten iterativen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren, auf das in 1 Bezug genommen wird;
3 ist eine schematische Darstellung eines Schritts im Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren der Erfindung, der die Markierung von Reporterkügelchen umfasst;
4 ist ein anschauliches Beispiel für Reporterkügelchen, die an ein Trägerteilchen gebunden sind, wobei ein lichtmikroskopisches Bild von drei 0,9 μm großen Siliciumoxid-Reporterkügelchen, die an ein 2,5 μm großes Siliciumoxid-Trägerkügelchen gebunden sind, gezeigt ist. In diesem Fall wurde die Bindung erreicht, indem man NaCl in einer gemischten wässrigen Suspension dieser Teilchen löste. Die Größe von Reporterkügelchen wäre typischerweise viel geringer als die des Trägerkügelchens. Das Bild ist einfach ein anschauliches Beispiel;
5 ist eine schematische Darstellung der Fluoreszenzmikroskopapparatur, die für die Decodierungsexperimente verwendet werden kann. Der Sperrfilter (F₁) und der Anregungsfilter (F₂) sind eindeutig markiert;
6 ist ein schematisches Diagramm von rot markierten und grün markierten Trägern, die im folgenden Beispiel 3 in Verfahren D unter Bildung der Population 3 miteinander kombiniert werden. Der Übersichtlichkeit halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
7 ist ein schematisches Diagramm von Population 4 in Verfahren E in Beispiel 3. Der Übersichtlichkeit halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
8 ist ein schematisches Diagramm von Population 5 in Verfahren E in Beispiel 3. Der Übersichtlichkeit halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
9 zeigt zwei Fluoreszenzmikroskopbilder (als 9(a) und 9(b)) einer Probe von Trägerkügelchen nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe von Population 4 in Verfahren F in Beispiel 3);
10 zeigt drei Fluoreszenzmikroskopbilder (als 10(a), 10(b) und 10(c)) einer Probe von Trägerkügelchen nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe von Population 5 in Verfahren F in Beispiel 3);
11 zeigt drei Fluoreszenzmikroskopbilder (als 11(a), 11(b) und 11(c)) einer Probe von Trägerkügelchen nach dem zweiten Markierungs- und Kopplungsschritt (eine Probe der kombinierten Populationen 4 und 5 in Verfahren G in Beispiel 3);
12 ist eine schematische Darstellung der kombinierten Populationen 4 und 5 in Verfahren G in Beispiel 3. Der Übersichtlichkeit halber sind die hier gezeichneten Reporter viel größer als die im Beispiel verwendeten, 1 μm großen Reporter;
13, als 13(a) und 13(b), zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von 0,2 μm großen Teilchen, die an aminomethylierte (ca. 100 μm große) Träger gebunden sind, und (c) zeigt 2,5 μm große Polyelektrolytbeschichtete Siliciumoxidteilchen, die an einen aminomethylierten (ca. 100 μm großen) Träger gebunden sind;
14 zeigt ein durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie erhaltenes Bild von drei Trägern, die jeweils mit 1 μm großen fluoreszenten roten, 1 μm großen fluoreszenten grünen und 2,0 μm großen tiefroten fluoreszenten Reportern markiert sind. Die roten Farben auf der Mikrophotographie bezeichnen die roten Reporter, die grünen Farben auf der Mikrophotographie bezeichnen die grünen Reporter, und die blauen Farben auf der Mikrophotographie bezeichnen die tiefroten Reporter;
15 ist eine schematische Darstellung des zweistufigen Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahrens in Beispiel 3; und
16 ist eine Massenspektrographie eines Peptids, das von den markierten Trägern abgespalten wurde, wie es in Verfahren J in Beispiel 4 beschrieben ist. Der größte Peak befindet sich bei 626,1, was dem Molekulargewicht von Fmoc-Alanin-Glycin-Lysin-Glycin-OH entspricht. Dies ist die genaue Peptidsequenz, die in diesem dreistufigen Aminosäure-Kopplungs- und -Markierungs-Beispiel auf den Trägern synthetisiert wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Ein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren, das n Verfahren und m Schritte beinhaltet, kann wie folgt definiert werden. Seien die n Verfahren P₁, P₂, ..., P_n. Das Ereignis der Durchführung von Verfahren P_j im i-ten Schritt wird durch P_j(i) bezeichnet. In jedem Stadium i = 1, 2, ..., m:

– werden die Träger in n Teilmengen S₁, S₂, ..., S_n aufgeteilt;
– wird das Verfahren P_j für j = 1, 2, ..., n auf den Trägern in Teilmenge S_j durchgeführt;
– werden die Träger rekombiniert.

Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in den 1 und 2 gezeigt.
Beispiele für solche Verfahren sind die kombinatorischen Synthesen von Oligonucleotid- und Oligopeptidketten. In diesen Beispielen können unlösliche Polymerkügelchen (kolloidale Teilchen, Durchmesser typischerweise 1-1000 μm) als Träger verwendet werden, auf denen Nuclein- oder Aminosäuremonomere ge- bunden und nacheinander angefügt werden. Indem man das Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren für eine große Zahl von Trägern wiederholt durchführt, kann eine große Vielfalt an zufällig erzeugten Oligonucleotid- oder Oligopeptidsequenzen synthetisiert werden. Jeder Träger enthält also ein gebundenes Polymer mit einer einzigartigen Sequenz, die durch die Abfolge der Verarbeitungsereignisse, die der Träger erfahren hat (d.h. den speziellen Weg, den der Träger in 2 befolgt hat), definiert ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues und zweckmäßiges Verfahren zur Bestimmung der Abfolge von Verfahren, die auf einen bestimmten Träger, der an einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren beteiligt ist, angewendet wurden. Dieses Verfahren beinhaltet nicht die chemische Markierung des Trägers und beinhaltet dagegen die Markierung von Trägern durch nichtkovalente Bindung von Reporterkügelchen. Dieses Verfahren hat gegenüber herkömmlichen Markierungsverfahren mehrere erhebliche Vorteile:

(1) Die Bindung von Kügelchen an den Träger kann durch einfache (physikalische) Vorgänge erreicht werden, die nicht notwendigerweise chemische Reaktionen beinhalten. Folglich ist es äußerst unwahrscheinlich, dass das Markierungsverfahren die untersuchten Reaktionsvorgänge stört.
(2) Die Reporterkügelchen können mit einer Vielzahl und einer hohen Konzentration von Reportermolekülen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffen) dotiert (d.h. getränkt) werden, um einen leichten Nachweis und mehrstufige Markierung zu ermöglichen, ohne dass chemisches Pfropfen, Spalten und/oder Amplifikation notwendig sind.
(3) Die Anwesenheit von Kügelchen, die an den Träger gebunden sind, ist mit mehreren Mitteln (z.B. Fluoreszenzemission, Infrarotspektroskopie) äußerst leicht nachzuweisen. Dies ermöglicht eine leichte und zweckmäßige Bestimmung der Verarbeitungssequenzen, die ein Träger erfahren hat.

Es wird jetzt ein Verfahren beschrieben, mit dem die Abfolge von Verfahren, die auf einen bestimmten Träger, der an einem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren beteiligt ist, angewendet wurden, schließlich bestimmt werden kann.
Für i = 1, 2, ..., m und für j = 1, 2, ..., n ist eine Charge B_j(i) von Reporterkügelchen erforderlich. Diese Reporterkügelchen haben die Eigenschaft, dass die Charge, zu der irgendein besonderes Reporterkügelchen gehört, anhand der Eigenschaften des Kügelchens bestimmt werden kann. Beispiele für mögliche Eigenschaften, die verwendet werden können, um die Charge zu identifizieren, zu der ein Reporterkügelchen gehört, sind (i) Farbe, (ii) Fluoreszenzsignal, (iii) Infrarotspektrum, (iv) radioaktive Marker und (v) nachweisbare physikalische Merkmale einschließlich der Größe, aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt.
In jedem Stadium i in dem Verfahren werden ein oder mehrere Reporterkügelchen aus Charge B_j(i) an jeden der Träger gebunden, der das Verfahren P_j(i) durchläuft. Dann am Ende des Verfahrens kann die Abfolge von Verfahren, die auf einen bestimmten Träger angewendet wurden, anhand der daran gebundenen Reporterkügelchen bestimmt werden, wie im Folgenden beschrieben wird. Die Reihenfolge der Schritte dafür ist in 3 schematisch gezeigt.
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Bindung der Reporterkügelchen an die Trägerkügelchen ist wie folgt. Man beachte, dass es möglich ist, die Reporterkügelchen aus Charge B_j(i) an die Träger zu binden, bevor das Verfahren P_j(i) durchgeführt wird, falls dies wünschenswert ist.
Die meisten der oben beschriebenen Systeme können unlösliche Polystyrolteilchen oder kolloidale Siliciumoxidteilchen als Träger verwenden. In einem Beispiel verwendeten wir ein 2,5 μm großes Siliciumoxidteilchen als Träger und 0,9 μm große Siliciumoxidteilchen (erhalten von Bangs Laboratories, Carmel, Indiana, USA) als Reporter. Wenn sie in wässriger Lösung (z.B. in Milli-Q-ionenausgetauschtem Wasser) suspendiert werden, bleiben diese Teilchen aufgrund der elektrostatischen Abstoßungskräfte, die aus der negativen Oberflächenladung auf jedem Teilchen resultieren, voneinander getrennt. Durch das Auflösen von Salz (z.B. Natriumchlorid) in der wässrigen Lösung wird die Wirkung der elektrostatischen Abstoßung zwischen den Teilchen abgeschirmt, und dies führt zu einer permanenten Koagulation (d.h. Ankleben) der kleinen Teilchen an den großen Teilchen (siehe 4). Unter solchen Bedingungen wird die Haftung der kleinen Teilchen an den großen Teilchen in erster Linie durch van-der-Waals-Anziehungskräfte verursacht, die zwischen den Teilchen auftreten (Hunter (siehe oben) und Russel et al. (siehe oben)). Wie außerdem von Healy et al. gezeigt wurde (1966, Transactions of the Faraday Society 62 1638; 1970, ibid., 66, 490), ist die Geschwindigkeit der Koagulation von kleinen Teilchen mit großen Teilchen stets größer als die von großen Teilchen mit großen Teilchen oder kleinen Teilchen mit kleinen Teilchen. Analog können die kleinen Teilchen an die großen Teilchen gebunden werden, indem man eine Kombination von sowohl elektrostatischen als auch van-der-Waals-Anziehungskräften verwendet. Dies ist zum Beispiel dann der Fall, wenn die kleinen und großen Teilchen entgegengesetzt geladen sind. Wenn eine Suspension von kleinen Teilchen in einer solchen Situation mit einer Suspension von großen Teilchen gemischt wird, erfolgt spontan eine Koagulation (permanente Anhaftung) von kleinen Teilchen an großen Teilchen und umgekehrt. Solche Verfahren des Koagulierens von Gemischen von kolloidalen Teilchen durch Verwendung von physikalischen/chemischen Wechselwirkungen sind in der Technik wohlbekannt und in Literaturstellen beschrieben, zu denen die oben genannte Literaturstelle von Hunter gehört. Um die Stärke und Selektivität der Teilchen-Teilchen-Haftung zu verstärken, können chemische Additive (z.B. Polyelektrolyte) und chemische Reaktionen (z.B. Polymerverbrückungsreaktion zwischen Teilchen) verwendet werden, doch sind diese nicht wesentlich. Wie oben beschrieben, gibt es in der Tat erhebliche Vorteile beim Markieren der Trägerkügelchen mit physikalisch gebundenen Markern anstelle von chemisch gebundenen Markern.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass Reporterkügelchen an die Oberfläche eines Trägers gebunden sein können, doch dies ist nicht wesentlich. In dieser Hinsicht erkennen die Erfinder an, dass es auch möglich wäre, Reporterkügel chen durch bestehende Poren des Trägers hindurch an die Innenseite eines Trägers zu binden.
Wir bemerken, dass es wünschenswert sein kann, Reporterkügelchen an bestehende Reporterkügelchen an dem Träger anstatt direkt an die Oberfläche des Trägers zu binden. Dies kann vorteilhaft sein bei der Lokalisierung der Reporterkügelchen während des Decodierungsvorgangs, oder es kann zusätzliche Informationen über die Reihenfolge liefern, in der die Reporterkügelchen gebunden wurden. Dies kann bewerkstelligt werden, indem man intrinsische physikalische Kräfte zwischen den Reporterkügelchen verwendet. Ein Beispiel dafür, wie dies bewerkstelligt werden kann, besteht darin, die Oberflächenladung auf den Reporterkügelchen abzuwechseln. Zum Beispiel haben die ersten Reporterkügelchen, die an die Trägerteilchen gebunden werden sollen, entweder eine positive oder eine negative Oberflächenladung. Die nächste Charge von Reporterkügelchen besitzen dann eine entgegengesetzte Ladung zu den zuvor gebundenen (d.h. positiv bei negativ geladenen Reporterkügelchen im ersten Markierungsschritt und umgekehrt). Indem man die Oberflächenladung der Reporterkügelchen in dieser Weise verändert, ermöglicht man, dass Reporterkügelchen sich an andere Reporterkügelchen sowie an die Trägerteilchen binden.
Es ist wünschenswert, dass alle Reporterkügelchen, die in Lösung bleiben (d.h. diejenigen, die nicht an einen Träger binden), vor dem nächsten Schritt im Verfahren aus der Lösung entfernt werden. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man die schwereren Trägerkügelchen auf dem Boden absitzen lässt und alle nicht gebundenen Reporterkügelchen entfernt, indem man die Lösung, die die suspendierten Reporterkügelchen enthält, dekantiert und mit klarer Lösung nachspült. Um dieses Verfahren zu unterstützen, kann ein geladenes Blech mit entgegengesetzter Polarität zu derjenigen der Trägerkügelchen verwendet werden, um die Trägerkügelchen (mit daran gebundenen Reporterkügelchen) anzuziehen, während die ungebundenen Reporterkügelchen abgestoßen werden.
Ein Beispiel dafür, wie die Bindung von Reporterkügelchen verwendet werden kann, um die Sequenz von Verfahren zu bestimmen, die mit jedem Trägerkügelchen durchgeführt wurden, ist im Folgenden erläutert.
Betrachten wir ein Verfahren, das 4 Schritte (i = 1, ..., 4) und 4 Verfahren (j = 1, ..., 4) enthält, zum Beispiel eine vierstufige kombinatorische Oligopeptidsynthese. Jede Stufe beinhaltet die Zugabe eines Aminosäuremonomers aus einer menge von vier Aminosäuren, die von Interesse sind (z.B. Alanin, Glycin, Lysin und Methionin). Jedes Verfahren definiert, welches der vier möglichen Aminosäuremonomere gebunden wird. Nach 4 Schritten enthält jeder Träger eine Oligopeptidkette mit 4 Aminosäuremonomeren in zufälliger Abfolge. In diesem Fall beträgt die Zahl der insgesamt möglichen Sequenzen 4⁴ (= 256).
Um jeden Schritt und jedes Verfahren einzigartig zu markieren, brauchen wir 16 Typen von Reporterkügelchen, die vor oder nach jedem Schritt an die Träger gebunden werden (gemäß 3) und später einzigartig identifiziert werden können. Die einfachste Methode, um dies zu erreichen, besteht in der Verwendung von Reporterkügelchen (z.B. 1 μm große Siliciumoxid-Kügelchen), die im Innern eine Kombination von 4 Fluoreszenzfarbstoffen enthalten. Vier zweckmäßige Fluoreszenzfarbstoffe sind Rot (R), Gelb (Y), Grün (G) und Blau (B). Mit 4 Farbstoffen gibt es 16 mögliche Kombinationen von Farbstofffarben, die in die Reporterkügelchen eingebaut werden können (d.h. RYGB, RYG, RGB, RYB, YGB, RY, RG, RB, YG, YB, GB, R, Y, G, B, kein Farbstoff), und so können 16 verschiedene Chargen von Reporterkügelchen hergestellt werden. Indem man eines dieser Kügelchen unmittelbar vor oder nach der Aminosäureaddition an den Träger bindet, codiert die Kombination von Farbstoffen innerhalb des Reporterkügelchens für ein einziges Verfahren und einen einzigen Schritt (d.h., sie definiert P_j(i) in 3).
Der Nachweis der Farbstoffkombination innerhalb der Kügelchen kann zweckmäßigerweise mit einem Fluoreszenzmikroskop erreicht werden, nachdem das gesamte Verfahren beendet ist. Das Mikroskop hat eine ausreichende Vergrößerung, um die einzelnen Reporterkügelchen zu beobachten, und geeignete Lichtfilter können verwendet werden, um zu bestimmen, welche Fluoreszenzfarben (falls überhaupt) von den an den Träger gebundenen Reporterkügelchen emittiert werden. Im Hinblick auf das obige Beispiel gibt es vier unterschiedliche Reporterpopulationen, die an jeden Träger gebunden sind, wenn jeder Träger eine Oligopeptidkette mit 4 Aminosäuremonomeren enthält. Dies bedeutet Folgendes: Sobald 4 unterschiedliche Reporterkügelchen auf einem Träger identifiziert sind, ist die von diesem Träger erfahrene Abfolge von Reaktionsschritten einzigartig bestimmt.
Im Allgemeinen ist für ein Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren mit m Schritten und n Verfahren eine Menge von m × n Chargen von Reporterkügelchen ausreichend, um das gesamte Verfahren einzigartig zu markieren. Im obigen Beispiel zeigten wir, wie aus einer Kombination von 4 Fluoreszenzfarbstoffen 16 einzigartige Marker hergestellt werden könnten. Diese Zahl kann durch mehrere einfache Schemata stark erhöht werden:

(I) Man erhöhe die Zahl der Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen, die in das Reporterteilchen eingebaut werden. Dies kann nicht nur dadurch erreicht werden, dass man Farbstoffe mit deutlich unterschiedlichen Emissionsfrequenzen wählt, sondern auch dadurch, dass man Farbstoffe mit ähnlichen Emissionsfrequenzen, aber deutlich unterschiedlichen Anregungsfrequenzen wählt. Für diesen Zweck stehen Fluoreszenz-Lichtmikroskopie-Techniken zur Verfügung (gemäß der Beschreibung in Fluorescent Microscopy von F.W.D. Rost, Cambridge University Press, Vol. 1, 1992, und Introduction to Fluorescent Microscopy von J.S. Ploem und H.J. Tanke, Oxford University Press, 1987). 5 zeigt, wie das Mikroskop aufgebaut sein kann. Zwei Teilchenfarbstoffe mit ähnlichen Emissionsfrequenzen können wegen ihrer unterschiedlichen Anregungsfrequenzen unterschieden werden. Angenommen, ein Farbstoff D1 emittiert rotes Licht nach Anregung mit grünem Licht, und ein anderer Farbstoff D2 emittiert rotes Licht nach Anregung mit blauem Licht. Der im Diagramm gezeigte Mikro skopaufbau kann die beiden Farbstoffe voneinander unterscheiden, indem der Filter F₂ gewechselt wird, so dass er nur grünes Licht oder nur blaues Licht durchlässt. Der Farbstoff D1 emittiert nur dann rotes Licht, wenn grünes Licht durch F₂ tritt. Der Farbstoff D2 emittiert nur dann rotes Licht, wenn blaues Licht durch F₂ tritt. Verschiedenfarbige Farbstoffe innerhalb der Teilchen können nachgewiesen werden, indem man die Durchlassfrequenz des Filters F₁ ändert. Durch geschickte Auswahl solcher Farbstoffe wird die Zahl der Reporterfarbstoffe von 4 auf über 20 erhöht.
(II) Die Größe des Reporterkügelchens kann variiert werden, um die mögliche Zahl der Marker zu erhöhen (wenn zum Beispiel zwei verschiedene Größen für Reporterkügelchen verwendet werden, wird die Zahl der möglichen Marker verdoppelt).
(III) Die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs innerhalb jedes Reporterkügelchens kann variiert werden. Verschiedene Konzentrationen ergeben verschiedene Emissionsintensitäten (zum Beispiel verdoppeln zwei verschiedene Farbstoffkonzentrationen innerhalb der Reporterkügelchen die Zahl der möglichen Marker).

Die Fähigkeit dieser Technik, die Abfolge von Reaktionsschritten zu bestimmen, wenn eine größere Zahl von Verfahren und Schritten beteiligt ist, wird durch das folgende Argument eindeutig belegt. Wenn x verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe in ein Reporterkügelchen eingebaut werden können, beträgt die Zahl der verschiedenen Chargen von Reporterkügelchen, die hergestellt werden können, 2^x. Mit 2^x unterschiedlichen Chargen von Reporterkügelchen ist es möglich, die Abfolge der mit einem Träger durchgeführten Reaktionsschritte nachzuvollziehen, vorausgesetzt, das Produkt n × m aus der Zahl der Verfahren und der Zahl der Schritte ist kleiner als 2^x. Obwohl die Zahl der möglichen Abfolgen von mit einem Träger durchgeführten Reaktionen n^m beträgt, erfordert die Technik höchstens log₂(n × m) verschiedene Farbstoffe. Dieser Wert oder diese Zahl wird auf die nächste ganze Zahl gerundet, die größer oder gleich diesem Wert ist.
Wenn zum Beispiel 20 Verfahren (was für 20 Aminosäuren, die an der Polypeptidsynthese beteiligt sind, der Fall sein würde) und 25 Reaktionsschritte beteiligt sind, dann gibt es 20²⁵ ≈ 3 × 10³² mögliche Abfolgen, aber es sind nur 9 verschiedene Farbstoffe erforderlich.
Obwohl dieses Beispiel Fluoreszenz als Nachweisverfahren für die Reporterkügelchen spezifiziert, können auch viele andere Reporter- und Nachweisverfahren ins Auge gefasst werden. Beispiele dafür sind die Dotierung der Reporterkügelchen mit Materialien, die einzigartige Infrarot- und radioaktive Signale aufweisen. Diese könnten entweder unabhängig oder in Kombination mit den Fluoreszenz-Reportermolekülen verwendet werden.
Für die oben beschriebene kombinatorische 4×4-Oligopeptidsynthese wird das folgende Verfahren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, zum Synthetisieren und Markieren verwendet.
Beispiele
Beispiel 1
Trägerkügelchen, die für dieses Verfahren verwendet werden, bestehen aus mit N-α-Boc (t-Butyloxycarbonyl) geschützter Aminosäure an PAM-Harz (erhältlich von Novabiochem). Diese Trägerteilchen (100-200 mesh) sind ein Standardträger für die kombinatorische Festphasensynthese. In diesem Beispiel wählen wir das N-α-Boc-Ala-OCH₂-PAM-Harz, das einen geschützten Alanin-Aminosäurerest enthält, der an die Oberfläche gebunden ist (es können auch andere Aminosäurereste gewählt werden, um die Sequenz zu beginnen). Alle Syntheseschritte in dem Aufteilungs-Verarbeitungs-Rekombinations-Verfahren wurden wie folgt im 0,2-mmol-Maßstab durchgeführt. Die N-α-Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit 100% TFA (Trifluoressigsäure) während 2 × 1 Minute mit anschließendem Durchflusswaschen während 30 Sekunden mit DMF (Dimethylformamid) entfernt. Boc-Aminosäuren (0,8 mmol) wurden ohne vorherige Neutralisation des Peptid-Harz-Salzes als aktive Ester, die in DMF entweder mit Hydroxybenzyltria zol (HOBt)/N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) (30 Minuten Aktivierung) oder mit einem HBTU/Diisopropylethylamin (DIEA) (2 Minuten Aktivierung) als Aktivierungsmittel vorgebildet wurden, angekoppelt. Bei Kopplungen mit aktiven Estern, die durch HOBt/DIC gebildet wurden, wurde die Neutralisation in situ durchgeführt, indem man 1,5 Äqu. DIEA relativ zur Menge des TFAO^-+NH₃-Peptidharzsalzes zu dem Gemisch aus aktivierter Boc-Aminosäure und Harz gegeben. Bei Kopplungen mit aktiven Estern, die durch HBTU/DIEA gebildet wurden, wurden weitere 2 Äqu. DIEA relativ zur Menge des TFAO^-+NH₃-Peptidharzsalzes zu dem Aktivierungsgemisch gegeben. Die Kopplungszeiten betrugen durchweg 10 Minuten ohne doppelte Kopplung. Proben (3-5 mg) des Peptidharzes wurden nach dem Kopplungsschritt entnommen, um die restlichen α-Aminogruppen durch das quantitative Ninhydrinverfahren zu bestimmen. Die Kopplungsausbeuten betragen typischerweise 99,9%. Alle Arbeitsschritte wurden manuell in einem 20-ml-Glasreaktionsgefäß mit einem teflonverkleideten Schraubverschluss durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch sachtes Auf-den-Kopf-Stellen auf einer Schüttelvorrichtung während der Schritte der N-α-Schutzgruppenentfernung und Kopplung gerührt. Vor dem Rekombinieren und Aufteilen der Kügelchen gemäß dem Diagramm in 2 wurden Reporterkügelchen (Siliciumoxid-Teilchen mit 1 μm Durchmesser) über das oben beschriebene Verfahren (d.h. Koagulation in wässriger Lösung, die mit hohen Konzentrationen (ungefähr 1 M) an Natriumchloridsalz induziert wurde) an die Harzpeptid-Trägerkügelchen gebunden. Nach den Peptidzugaben (d.h. 4-Schritten) blieben die Reporterteilchen an die Trägerkügelchen geheftet.
Ebenso wie auf dieses einschränkende Beispiel für die kombinatorische Polypeptidsynthese ist unser Codierungs/Decodierungs-Verfahren allgemein auf jede kombinatorische Festphasenchemie anwendbar. Weitere Beispiele für solche Verfahren sind Polynucleotidsynthese und die Synthese von cyclischen Polypeptiden.
Beispiel 2: Herstellung von Reportersuspensionen
Fluoreszente Siliciumoxid-Mikrokugeln (10 mg, 1 μm Durchmesser, rot oder blau oder grün oder gelb/rote Kombination, Microcaps) werden mit Polyelektrolyten beschichtet. Der erste Schritt besteht darin, das Siliciumoxid mit positiv geladenem Polyethylenimin (PEI) zu beschichten, indem man es 30 Minuten lang in einer 1%igen wässrigen Lösung von PEI (3 ml, Polysciences Inc., MW = 10 000 g/mol) mit Ultraschall behandelt und 24 Stunden lang äquilibriert. Nach dem Waschen mit Milli-Q-Wasser durch Zentrifugation (5 × 3 ml) wird das Siliciumoxid zu einer 1%igen wässrigen Lösung von negativ geladener Polyacrylsäure (PAA, 3 ml, Sigma-Aldrich, MW = 250 000 g/mol) gegeben, 24 Stunden lang äquilibriert und durch Zentrifugation (5 × 3 ml) mit Milli-Q-Wasser gewaschen.
Die mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Kügelchen werden mit Dimethylformamid (d.h. DMF) (5 × 10 ml) gewaschen und als Suspension in DMF (10 mg/ml) verwendet.
Beispiel 3: Herstellung einer markierten Bibliothek
Verfahren A: Markieren der Trägerkügelchen
Kügelchen aus vernetztem PS/DVB-Trockenharz (aminomethyliert, 75-150 μm Durchmesser, 200 mg, 0,26 mmol/g, Peptide Institute) werden in zwei 100-mg-Portionen aufgeteilt.
Eine Portion wird mit 0,25 ml mit rotem Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reportern (10 mg/ml) in DMF gemischt (Population 1), und ähnlich wird die andere Portion zu 0,250 ml mit rotem Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reportern (10 mg/ml) in DMF gegeben (Population 2). Die Herstellung der mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter ist in Beispiel 2 nachzulesen.
Verfahren B:
Das Harz wird mit überschüssigem DMF (20 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt. Nach dem endgültigen Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
Verfahren C:
Das Monomer Fmoc-Glycin-OH (150 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit N-[1H-(Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N-oxid (HBTU, 0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu den in Verfahren B hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population 1 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) gewaschen.
Das zweite Monomer Fmoc-Alanin-OH (160 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 130 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu den in Verfahren B hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population 2 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) gewaschen.
Verfahren D:
Population 1 in DMF wird mit Population 2 in DMF kombiniert, was Population 3 ergibt, ein Gemisch aus rot markierten und grün markierten Harzen. Population 3 wird 1 Minute lang in DMF geschüttelt, um ein gutes Durchmischen zu gewährleisten. 6 ist ein Schema der rot markierten und grün markierten Kügelchen in Population 3. Population 3 wird in zwei 100-mg-Portionen aufgeteilt, Population 4 und Population 5.
Verfahren E:
Eine 1-ml-Suspension von fluoreszenten gelb/roten Polyelektrolyt-beschichteten Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt in Beispiel 2) wird 5 Minuten lang mit Population 4 und 1 ml Piperidin geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF wird weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt. Ein Schema der Population 4 ist in 7 gezeigt.
Eine 1-ml-Suspension von fluoreszenten blauen Polyelektrolyt-beschichteten Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt in Beispiel 2) wird 5 Minuten lang mit Population 5 und 1 ml Piperidin geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF wird weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt. Ein Schema der Population 5 ist in 8 gezeigt.
Die Populationen 4 und 5 werden getrennt mit großen Mengen DMF (jeweils 20 × 20 ml) gewaschen, um überschüssige Reporter zu entfernen.
Verfahren F:
Das Monomer Fmoc-Lysin(Boc)-OH (235 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu den in Verfahren E hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population 4 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (5 × 20 ml) gewaschen. Die relevanten Bilder sind in 9 gezeigt.
Bei dem Verfahren zur Gewinnung der Bilder, auf die in 9(a) und 9(b) Bezug genommen wird, ist eine Trägerspezies mit Grün und Gelb/Rot markiert, was der Sequenz Lysin-Alanin-Träger entspricht, und die andere vorhandene Trägerspezies ist mit roten und gelb/roten Reportern markiert, was der Peptidsequenz Lysin-Glycin-Träger entspricht.
In der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit blauem Licht (λ = 450-480 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 515 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 515 nm beobachtet werden.
Die vorwiegend grünen Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen und fluoreszenten gelben Reporterkügelchen; wobei es sich bei letzteren um die gelben Signale von jedem kombinierten gelb/roten Reporter handelt.
Die vorwiegend gelben Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten gelben Reporterkügelchen; wobei es sich bei letzteren um die gelben Signale von jedem kombinierten gelb/roten Reporter handelt.
In der unteren Mikrophotographie (b) wird die Probe mit grünem Licht (λ = 510-550 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 590 nm beobachtet werden.
Die dunkleren (weniger roten) Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, aber das rote Signal von den kombinierten gelb/roten Reportern kann beobachtet werden.
Die helleren (röteren) Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten roten Reporter können von den kombinierten gelb/roten Reportern unterschieden werden, da die rote Fluoreszenz von jedem roten Reporter schwächer ist als die rote Fluoreszenz von jedem kombinierten gelb/roten Reporter.
Das Monomer Fmoc-Arginin(PMC)-OH (304 mg, 0,5 mmol, Bachem) wird mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und DIEA (0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu den in Verfahren E hergestellten Kügelchen (100 mg) der Population 5 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (5 × 20 ml) gewaschen. Die relevanten Bilder sind in den 10(a), 10(b) und 10(c) gezeigt.
Bei dem Verfahren zur Gewinnung der Bilder, auf die in 10 Bezug genommen wird, ist eine Trägerspezies mit roten und blauen Reportern markiert, was der Peptidsequenz Arginin-Glycin-Träger entspricht, und die andere vorhandene Trägerspezies ist mit grünen und blauen markiert, was der Sequenz Arginin-Alanin-Träger entspricht.
In der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit Licht der Wellenlänge λ = 330-385 nm angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 420 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 420 nm beobachtet werden.
Die grünen/wasserblauen Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen und fluoreszenten blauen Reporterkügelchen.
Die roten/rosafarbenen Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten blauen Reporterkügelchen.
In der Mikrophotographie (b) wird die Probe mit blauem Licht (λ = 450-480 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 515 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 515 nm beobachtet werden.
Die vorwiegend grünen Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten grünen Reporterkügelchen. Die fluoreszenten blauen Reporterkügelchen können bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
Die vorwiegend gelben Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten Reporterkügelchen. Die fluoreszenten blauen Reporterkügelchen können bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
In der unteren Mikrophotographie (c) wird die Probe mit grünem Licht (λ = 510-550 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 590 nm beobachtet werden.
Die dunklen Träger in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter und die fluoreszenten blauen Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, und daher erscheinen die Träger, die mit Grün und Blau markiert wurden, dunkel.
Die roten Träger in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Bei stärkerer Vergrößerung können die einzelnen roten Reporter beobachtet werden. Die fluoreszenten blauen Reporter können bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
Die roten Träger in (c) sind also in (b) vorwiegend gelb und in (a) rot/rosa, und die dunklen Träger in (c) sind in (b) vorwiegend grün und in (a) grünwasserblau.
Verfahren G:
Die Populationen 4 und 5 in DMF werden miteinander kombiniert. Siehe 11(a), 11(b) und 11(c). Eine schematische Ansicht ist in 12 gezeigt.
Im Vergleich zur Decodierung der in den 11(a), 11(b) und 11(c) gezeigten Bilder lassen sich die vier unterschiedlich markierten Trägerspezies leicht decodieren. Träger, die mit roten und blauen Reportern markiert sind, entsprechen der Peptidsequenz Arginin-Glycin-Träger; Träger, die mit Grün und Blau markiert sind, entsprechen der Sequenz Arginin-Alanin-Träger; Träger, die mit Grün und Gelb/Rot markiert sind, entsprechen der Sequenz Lysin-Alanin-Träger; und Träger, die mit Rot und Gelb/Rot markiert sind, entsprechen der Peptidsequenz Lysin-Glycin-Träger.
In der oberen Mikrophotographie (a) wird die Probe mit Licht der Wellenlänge λ = 330-385 nm angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 420 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 420 nm beobachtet werden.
Die roten/rosafarbenen Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Eine stärkere Vergrößerung erlaubt eine deutlichere Beobachtung der einzelnen fluoreszenten roten und fluoreszenten blauen Reporterkügelchen.
Die hellroten Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden.
Die grünen/wasserblauen Träger in (a) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern markiert wurden. Zusätzliche Informationen sind erforderlich (z.B. die Mikrophotographien (b) und (c)), um zwischen den Trägern, die sowohl mit grünen als auch mit blauen Reportern markiert sind, und den Trägern, die sowohl mit grünen als auch mit gelb/roten Reportern markiert sind, zu unterscheiden.
In der Mikrophotographie (b) wird die Probe mit blauem Licht (λ = 450-480 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 515 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 515 nm beobachtet werden.
Die vorwiegend grünen Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern markiert wurden. Von diesen vorwiegend grünen Trägern gibt es zwei verschiedene Trägerspezies, solche, die sowohl grüne als auch gelbe Reporter aufweisen, und solche, die nur grüne Reporter aufweisen. Die ersteren Träger sind solche, die mit grünen und gelb/roten Reportern markiert wurden. Die letzteren Träger sind solche, die mit grünen und blauen Reportern markiert wurden, aber die blauen Reporter können bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
Die vorwiegend gelben Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern markiert wurden. Von diesen vorwiegend gelben Trägern gibt es zwei verschiedene Trägerspezies, solche, die sowohl rote als auch gelbe Reporter aufweisen, und solche, die nur rote Reporter aufweisen. Die ersteren Träger sind solche, die mit grünen und gelb/roten Reportern markiert wurden. Die letzteren Träger sind solche, die mit roten und blauen Reportern markiert wurden, aber die blauen Reporter können bei dieser Anregung nicht beobachtet werden.
In der unteren Mikrophotographie (c) wird die Probe mit grünem Licht (λ = 510-550 nm) angeregt, und Emissionswellenlängen unterhalb von λ = 590 nm werden herausgefiltert, so dass nur Wellenlängen oberhalb von λ = 590 nm beobachtet werden.
Die dunklen Träger in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten blauen Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter und die fluoreszenten blauen Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, und daher erscheinen die Träger, die mit Grün und Blau markiert wurden, dunkel.
Die roten Träger in (c) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten roten Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten oder blauen Reportern markiert wurden. Diejenigen Träger, die sowohl mit roten als auch mit gelb/roten Reportern markiert sind, können von denjenigen, die sowohl mit Rot als auch mit Blau markiert sind, unterschieden werden, indem man auf Mikrophotographie (b) nachsieht.
Die dunkleren (weniger roten) Träger in (b) sind diejenigen, die in Verfahren A in Beispiel 3 mit fluoreszenten grünen Reportern und in Verfahren E in Beispiel 3 mit fluoreszenten gelb/roten Reportern markiert wurden. Die fluoreszenten grünen Reporter sind bei dieser Anregung nicht zu beobachten, aber das rote Signal von den kombinierten gelb/roten Reportern kann beobachtet werden.
Die roten Träger in (c) sind also in (b) vorwiegend gelb und in (a) rot/rosa, und die dunklen Träger in (c) sind in (b) vorwiegend grün und in (a) grünwasserblau.
Beispiel 4: Bestätigung der Codierung durch Massenspektrometrie
Verfahren A:
Fmoc-L-Glu-Wang-Harz (100 mg, 0,61 mmol/g, Auspep) wird durch 2 Minuten Schütteln mit überschüssigem (10 ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel wird durch Vakuumfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird hinzugefügt, und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) und DCM/Methanol (1:1) gewaschen und unter Stickstoffgas getrocknet.
Verfahren B:
Das Harz wird zu 0,25 ml roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern gegeben. Die Herstellung der mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter ist in Beispiel 1 nachzulesen. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (20 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt. Nach dem endgültigen Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
Verfahren C:
Das Monomer Fmoc-Glycin-OH (150 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit N-[1H-(Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N-oxid (HBTU, 0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu den in Verfahren B hergestellten rot markierten Kügelchen (100 mg) der Population 1 gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) gewaschen.
Verfahren D:
Das Harz wird durch 2 Minuten Schütteln mit überschüssigem (10 ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel wird durch Vaku umfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird hinzugefügt, und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Piperidin wird durch Waschen mit DMF (5 × 20 ml) entfernt.
Verfahren E:
Das Harz wird zu 0,25 ml grünen Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern gegeben. Die Herstellung der mit Polyelektrolyt beschichteten Siliciumoxid-Reporter ist in Beispiel 1 nachzulesen. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (20 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt. Nach dem endgültigen Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
Verfahren F:
Das Monomer Fmoc-Lysin(Boc)-OH (235 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu dem in Verfahren E hergestellten Harz (100 mg) gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) gewaschen.
Verfahren G:
Das Harz wird durch 2 Minuten Schütteln mit überschüssigem (10 ml) Piperidin/DMF (1:1) von Schutzgruppen befreit. Das Lösungsmittel wird durch Vakuumfiltration entfernt. Frisches Piperidin/DMF wird hinzugefügt, und das Harz wird weitere 2 Minuten lang geschüttelt. Das Piperidin wird durch Waschen mit DMF (5 × 20 ml) entfernt.
Verfahren H:
Das Harz wird zu 0,25 ml blauen Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern gegeben. Das Harz wird mit überschüssigem DMF (20 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel und die freien Reporter werden durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm entfernt. Nach dem endgültigen Waschvorgang bleibt das Harz in DMF.
Verfahren I:
Das Monomer Fmoc-Alanin-OH (160 mg, 0,5 mmol, Novabiochem) wird mit HBTU (0,5 mmol, 0,5 M, 1 ml) und Diisopropylethylamin (DIEA, 0,6 mmol, 120 μl) gemischt. Die aktivierte Aminosäure wird zu dem in Verfahren E hergestellten Harz (100 mg) gegeben, und es wird 10 Minuten lang geschüttelt. Das Harz wird mit DMF (5 × 20 ml) und DCM/Methanol (1:1) (5 × 20 ml) gewaschen und unter Stickstoffgas getrocknet.
Verfahren J:
Um die Natur des Peptids, das in den oben genannten Verfahren synthetisiert und markiert wurde, zu überprüfen, wurde das Peptid von dem Harz abgespalten und durch Massenspektroskopie untersucht. Die Probe für die Massenspektroskopie wurde in folgender Weise hergestellt:
Fünf mg des getrockneten Harzes aus Verfahren I wurden zu einer Lösung von 95% TFA in Wasser (300 ml) gegeben und eine Stunde lang stehen gelassen. Die Lösung wurde entfernt, indem man Stickstoffgas über das Harz leitete. Als es trocken war, wurde eine 50%ige Lösung von Acetonitril in Wasser (pH = 2, 100 μl) zu dem Harz gegeben, und 10 μl dieser Lösung wurden für die massenspektroskopische Analyse verwendet. Das Massenspektrum ist in 16 gezeigt. Der größte Peak liegt bei 626,1, was dem Molekulargewicht von Fmoc-Alanin-Glycin-Lysin-Glycin-OH entspricht. Dies ist die genaue Peptidsequenz, die in diesem dreistufigen Aminosäure-Kopplungs- und -Markierungs-Beispiel auf den Trägern synthetisiert wurde.
Beispiel 5
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die Beispiele 1-4 mit Reporterkügelchen wiederholt werden können, bei denen eine beliebige Zahl von verschiedenen Oberflächenbeschichtungen an verschiedene Typen von Trägerkügelchen gebunden sind. Die resultierende Kombination aus Trägerkügelchen und gebundenen Reporterkügelchen ist in DMF stabil. In diesem Beispiel hat sich gezeigt, dass Reporterkügelchen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Siliciumoxid-Kügelchen, die mit -COOH funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen, die mit PEI funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen, die mit PEI und Polyacrylsäure funktionalisiert sind, Siliciumoxid-Kügelchen, die mit -NH₂ funktionalisiert sind, unbeschichteten Siliciumoxid-Kügelchen und Polystyrol/DVB-Kügelchen, die mit Sulfatgruppen funktionalisiert sind, besteht, an Trägerkügelchen gebunden wurden, die aus Boc- und Fmoc-geschützten Harzen, aminomethyliertem Harz, Tentagel-SOH-Harz, MBHA-Harz und geschütztem PAM-Harz ausgewählt sind.
Beispiel 6: Variationen von Befestigungsverfahren
Die Zahl der Reporterkügelchen pro Träger kann manipuliert werden und hängt in gewissem Maße von der Reporterkonzentration, bevor die Träger hinzugefügt werden, der Größe der Reporterkügelchen, den funktionellen Gruppen an dem Reporterkügelchen und den Trägeroberflächen, ab und ist bis zu einem gewissen Grad zeitabhängig. Falls gewünscht, kann eine Polyelektrolyt-Beschichtung der Reporter verwendet werden, um die Haftung der Reporterkügelchen zu verbessern.
Eine erfolgreiche Befestigung kann durch mehrere Verfahren erreicht werden, wie im Folgenden beschrieben wird.
Verfahren A:
Trockene Trägerkügelchen können zu einer konzentrierten Lösung von Reportern in Lösungsmittel gegeben werden, wie zum Beispiel:
Aminomethyliertes Harz (100 mg, 0,26 mmol/g, Peptide Institute) wird zu 0,25 ml gemäß Beispiel 1 hergestellten roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern (10 mg/ml) in DMF gegeben.
Verfahren B:
Trägerkügelchen werden in überschüssigem Lösungsmittel aufquellen gelassen und zu einer konzentrierten Lösung von Reportern in Lösungsmittel gegeben, wie zum Beispiel:
Aminomethyliertes Harz (100 mg, 0,26 mmol/g, Peptide Institute) wird in DMF aufquellen gelassen und zu 1 ml gemäß Beispiel 1 hergestellten roten Polyelektrolyt-beschichteten Siliciumoxid-Reportern (10 mg/ml) in DMF gegeben.
Verfahren C:
Entfernung der Schutzgruppen und Markierung werden in einem einzigen Schritt durchgeführt, indem man die Reporter-DMF-Suspension (hergestellt wie in Beispiel 1) mit dem gleichen Volumen Piperidin mischt und zu aufgequollenen Fmoc-beschichteten Trägerkügelchen gibt, wie zum Beispiel:
1 ml einer Suspension von fluoreszenten roten Polyelektrolyt-beschichteten Reportern in DMF (10 mg/ml, hergestellt wie in Beispiel 1) wird 5 Minuten lang mit Fmoc-Glycin-Harz (100 mg) und 1 ml Piperidin geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und eine frische Lösung von Reportern in Piperidin/DMF wurde weitere 5 Minuten lang mit den Trägern geschüttelt.
Beispiel 7: Waschverfahren
Freie Reporterkügelchen können durch Vakuumfiltration durch eine Glasfritte der Porengröße 17-40 μm (nachzulesen bei Verfahren B in Beispiel 1) oder durch andere Verfahren, wie Zentrifugation oder durch die Verwendung von magnetischen Träger- oder Reporterkügelchen, aus dem Lösungsmittel entfernt werden.
Beispiel 8: Wirkung verschiedener organischer Lösungsmittel und Reaktionsbedingungen auf die Haftung und den Austausch von Reporterkügelchen
Verfahren A:
Untersuchung des Reporteraustauschs in Dichlormethan in Gegenwart von überschüssigem Pd(PPh₃)₄ und Diethylazodicarboxylat (DEAD).
Rot markierte Träger (100 mg) und grün markierte Träger (100 mg) werden gemäß Verfahren B in Beispiel 3 hergestellt und gewaschen. Die rot markierten und grün markierten Träger werden in DMF miteinander gemischt und anschließend mit DCM/Methanol gewaschen und dann unter Stickstoffgas getrocknet. 10 mg der trockenen Träger wird in DCM (0,3 ml) mit Pd(PPh₃)₄ und Diethylazodicarboxylat (DEAD) gegeben. Über einen Zeitraum von 24 Stunden wird kein nachweisbarer Austausch zwischen rot markierten und grün markierten Trägern beobachtet.
Verfahren B:
Die Haftung zwischen Reporter und Trägerkügelchen übersteht auch die folgenden Bedingungen ohne sichtbare Ablösung von Reportern von den Trägerkügelchen und ohne erheblichen Austausch von Reportern zwischen den Trägern:

(i) Rot markierte und grün markierte Trägerkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die aus DMF, THF, DCM, Acetonitril, Ethylacetat und Methanol ausgewählt sind;
(ii) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die aus DMF, THF, Acetonitril, Ethylacetat und Methanol ausgewählt sind, werden 45 Minuten lang auf 50°C erhitzt;
(iii) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die aus DMF und Diisopropylethylamin (DIEA), THF-NaH (einige Harzkügelchen brechen innerhalb von 2 Stunden auf, die meisten sind nach 20 h noch intakt mit Reportern) und Methanol-NaOCH₃ ausgewählt sind, in Gegenwart von Base;
(iv) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die aus DMF und Diisopropylethylamin (DIEA) und Methanol-NaOCH₃ ausgewählt sind, werden in Gegenwart von Base 45 Minuten lang auf 50°C erhitzt;
(v) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die aus DCM-TFA (4:1) und DCM-Essigsäure ausgewählt sind, in Gegenwart von Säure;
(vi) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln, die Methanol, das Natriumcyanborhydrid enthält, und DCM, das Pd(PPh₃)₄ enthält, umfassen;
(vii) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in organischen Lösungsmitteln mit Reduktionsmitteln, die aus DCM-Pyridindichromat (Harz neigt zum Aufbrechen, doch die Reporter sind noch gebunden), DMF-5-nitro-2-hydroxybenzaldehyd und DCM-Pd(PPh₃)₄-diethylazodicarboxylat (DEAD) ausgewählt sind; und
(viii) Rot markierte und grün markierte Harzkügelchen zusammen in DMF mit Peptidkopplungsreagentien, die Fmoc-Gly-OH, HBTU und DIEA umfassen.

Verfahren C:
Verfahren A von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass DMF durch verschiedene Lösungsmittel ersetzt wurde, die aus Wasser, Methanol, DCM, Essigsäure, Wasser/DMF (4:1), Piperidin/DMF (1.1) und Methanol/DCM (1:1) ausgewählt sind. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.
Beispiel 9: Gamma-Bestrahlung von Polyelektrolyt-beschichteten Reporterkügelchen
In diesem Beispiel wurden die Polyelektrolyt-beschichteten Reporterkügelchen hergestellt, indem man PEI und dann PAA auf die Siliciumoxid-Kügelchen adsorbieren ließ. Diese Reporterkügelchen zeigten eine ausgezeichnete Bindung an verschiedenen Typen von Trägern. Die Bindung konnte durch Schaffung eines größeren Gitters auf der Oberfläche des Reporters weiter verbessert werden. Dies kann durch γ-Bestrahlung der Polyelektrolyt-beschichteten Reporter in einer Polyelektrolytlösung während des Beschichtungsverfahrens erreicht werden. Die Bildung von Radikalen entlang der Polyelektrolytketten unter Gamma-Bestrahlung ermöglicht eine Vernetzung. Dadurch entsteht ein großes Gitter um den Reporter herum, was die Stärke der Bindung an die Träger verstärkt, indem es eine bessere Brückenbildungsausflockung ermöglicht. Ein Beispiel dafür ist das folgende Verfahren:
Fluoreszente rote Siliciumoxid-Mikrokugeln (10 mg, 1 μm Durchmesser, Microcaps GmbH) werden zu einer wässrigen Lösung von PEI (3 ml, 1,2 Gew.-%, MW 10 000 g/mol, Polysciences Inc.) gegeben und 30 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Die Reporterlösung wird 24 Stunden lang äquilibriert, um eine Adsorption von PEI auf den Reportern zu ermöglichen. Die Reporter werden in Milli-Q-Wasser gewaschen, um PEI (5 × 3 ml) zu entfernen, und werden in einer wässrigen Lösung von PAA (3 ml, 0,75%, MW = 250 000 g/mol, Sigma-Aldrich) resuspendiert. Stickstoffgas wird 30 Minuten lang durch die Lösung perlen gelassen, um Sauerstoff zu entfernen, der als Fänger für die unter Gamma-Bestrahlung ge bildeten radikale wirken kann. Dann wird die Lösung 1,5 Stunden lang in die Gammazelle gebracht und einer Dosisleistung von 8 kG/Stunde (d.h. einer Gesamtdosis von 11,5-12 kG) ausgesetzt. Die Reporter werden in Milli-Q-Wasser (5 × 3 ml) und DMF (5 × 3 ml) gewaschen und in 1 ml DMF gelassen (endgültige Reporterkonzentration = 10 mg/ml).
Beispiel 10: Kovalente Bindung zur Verstärkung der Reporter-Träger-Bindung
Sobald die Bindung von Reporterkügelchen an Trägern durch die Manipulation von kolloidalen Kräften induziert ist, kann die Stärke der Bindung durch die Bildung von zusätzlichen kovalenten Bindungen zwischen Oberflächengruppen der beiden Kolloide gefestigt werden. Zum Beispiel kann eine Peptidbindung zwischen NH₂, das von der Schutzgruppe befreit wurde, auf der Oberfläche eines Trägers und COOH-Gruppen auf der Oberfläche der Reporter gebildet werden (in Gegenwart des Kopplungsmittels HBTU und der Base DIEA). Alternativ dazu kann eine ähnliche kovalente Reaktion auch nach der Bindung von Teilchen durch Brückenbildungsausflockung induziert werden. Zum Beispiel können die Reporter mit PAA-Gitter beschichtet, ausgeflockt und mit einem Trägerkügelchen, das NH₂-Oberflächengruppen enthält, umgesetzt werden.
Beispiel 11: Dendrimere
Die Anwesenheit eines Gitters von dendritischen Makromolekülen auf einem Trägerkügelchen, Reporterkügelchen oder dergleichen kann die permanente Bindung von Reporterkügelchen am Träger verstärken. Dendritische Makromoleküle (Dendrimere) sind eine neue Stoffklasse (Tsukruk et al., 1997, Langmuir 13, 2171) und haben eine kaskadenartige verzweigte Struktur. Die Manipulation der Makromoleküleigenschaften von Dendrimeren kann durch systematische strukturelle Variation der "Kern-" und "Verzweigungseinheiten" (Monomere) erreicht werden. Die Oberflächenporosität, die Größe und die Position von speziellen Hohlräumen in der dendritischen Struktur und die endgültige Form des Dendrimers werden durch diese Variationen beeinflusst.
Beispiel für die Markierung von Dendrimeren mit Reportern
Polyamidoamin-Dendrimere in DMF (0,25 ml, 200 mg/ml, Generation 10, Dendritech) werden mit roten Reportern (1 μm Durchmesser, 0,25 ml, 10 mg/ml, Microcaps GmbH) gemischt, die mit Polyelektrolyt beschichtet sind (siehe Beispiel 2). Nach der Markierung werden freie Reporter durch Waschen mit DMF (20 × 20 ml) und Vakuumfiltration durch eine Glasfritte entfernt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von synthetischen Oligomeren, die eine Vielzahl an Molekülen umfaßt, welche eine Vielzahl verschiedener chemischer Gruppen aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (i) Binden einer entsprechenden chemischen Gruppe an einen Träger in jedem von einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen, (ii) Binden eines Reporterkügelchens an den Träger durch nicht-kovalente physikalische Kräfte in jedem Reaktionsgefäß, wobei jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker zur Identifizierung der chemischen Gruppe, die an den Träger gebunden ist, sowie zur Identifizierung der Position in der Abfolge der chemischen Gruppe relativ zu anderen chemischen Gruppen in jedem Molekül aufweist und wobei die nicht-kovalenten physikalischen Kräfte aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brükkenbildungsausflockung besteht, (iii) Vereinigen der Träger aus jedem Reaktionsgefäß, die aus den Stufen (i) und (ii) erhalten werden, in einem Rekombinationsgefäß, (iv) Aufteilen der Träger aus dem Rekombinationsgefäß auf die Vielzahl von Reaktionsgefäßen, worin die Stufen (i) und (ii) wiederholt werden, und (v) Wiederholen der Stufen (iii) und (iv), bis die Bibliothek von Molekülen ausgebildet ist, wobei jedes Molekül ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängig ist, um die direkte Identifzierung der Abfolge von chemischen Gruppen, welche das Molekül umfaßt, zu erleichtern, wobei Stufe (ii) vor oder gleichzeitig mit Stufe (i) durchgeführt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Reporterkügelchen ein kolloidales Teilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder Träger ein unlösliches Polymerkügelchen in der Form eines kolloidalen Teilchens mit einem Durchmesser von 1 bis 1000 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder Träger ein Kügelchen ist, das aus Polystyrol, vernetzt mit 1 bis 5% Divinylbenzol, Hexamethylendiaminpolyacrylharz und verwandten Polymeren, Poly-[N-{2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl}]-acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliziumdioxid, Zellulose, Polystyrol, Latex, gepfropften Kopolymeren, einschließlich Polyethylenglykol/Polystyrol, Porenglas, Polyacrylamid, Dimethylacrylamid, wahlweise vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin, Glasteilchen, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer, einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly- (N-acryloylpyrrolidin)-Harz, Wang-Harz, Pam-Harz, Merrifield-Harz, PAP-Harz, SPARE-Polyamidharz, Polyethylen, funktionalisiert mit Acrylsäure, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Kopolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel oder PEG-PS/DVB-Kopolymeren gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Träger Funktionalitäten enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus -NH₂, -COOH, -SOH, -SSH und Sulfat besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jeder Träger ein Kügelchen in der Form eines Pellets, einer Scheibe, einer Kapillare, einer Hohlfasernadel, einer Nadel oder eines Chips ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Marker unter Fluorophoren, Chromophoren, Strichcodes, radioaktiven oder lumineszenten Markierungen oder einem feststellbaren physikalischen Merkmal des Kügelchens, einschließlich der Größe, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Reporterkügelchen ein polymeres Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Mikroteilchen aus polymerisierbaren Monomeren gebildet ist, die unter Styrenen, Acrylaten und ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden und Alkoholen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mikroteilchen aus Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latexen, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluen, Polyvinylidenchlorid oder Polydivinylbenzen besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Reporterkügelchen ein keramisches Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das keramische Mikroteilchen ein Siliziumdioxidmikroteilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Größe des Reporterkügelchens von 0,1 % der Größe des Trägers bis zu der gleichen Größe wie der Träger reicht.
Oligomerbibliothek mit einer Vielzahl an verschiedenen Molekülen, wobei jedes dieser Moleküle eine Vielzahl verschiedener chemischer Gruppen aufweist und an einen Träger gebunden ist, an den ein oder mehrere Reporterkügelchen durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, gebunden sind und wobei die Bibliothek nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt ist.
Oligomerbibliothek mit einer Vielzahl an verschiedenen Molekülen, wobei jedes Molekül eine Vielzahl von verschiedenen Gruppen aufweist und an einen entsprechenden Träger gebunden ist, der eine Vielzahl an Reporterkügelchen daran und optional an benachbarte Reporterkügelchen durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, gebunden aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker zur Identifizierung einer einzelnen chemischen Gruppe, die an den Träger gebunden ist, als auch zur Identifizierung der Position in der Abfolge der chemischen Gruppe relativ zu anderen chemischen Gruppen in jedem Molekül aufweist, wobei jedes Molekül in der Bibliothek ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängig ist, um die direkte Identifizierung jedes Moleküls zu erleichtern.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei jedes Reporterkügelchen ein kolloidales Teilchen ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei jeder Träger ein unlösliches Polymerkügelchen in der Form eines kolloidalen Teilchens mit einer Größe von 1 bis 1000 μm im Durchmesser ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei jeder Träger ein Kügelchen ist, das aus Polystyrol, vernetzt mit 1 bis 5% Divinylbenzol, Hexamethylendiaminpolyacrylharz und verwandten Polymeren, Poly-[N-{2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl}]-acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliziumdioxid, Zellulose, Polystyrol, Latex, gepfropften Kopolymeren, einschließlich Polyethylenglykol/Polystyrol, Porenglas, Polyacrylamid, Dimethylacrylamid, wahlweise vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin, Glasteilchen, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer, einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly-(N-acryloylpyrrolidin)-Harz, Wang-Harz, Pam-Harz, Merrifield-Harz, PAP-Harz, SPARE-Polyamidharz, Polyethylen, funktionalisiert mit Acrylsäure, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Kopolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel oder PEG-PS/DVB-Kopolymeren gebildet ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei die Träger Funktionalitäten enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus -NH₂, -COOH, -SOH, -SSH und Sulfat besteht.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei der Träger ein Kügelchen in der Form eines Pellets, einer Scheibe, einer Kapillare, einer Hohlfasernadel, einer Nadel oder eines Chips ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei die Marker unter Fluorophoren, Chromophoren, Strichcodes oder radioaktiven oder lumineszenten Markierungen oder einem feststellbaren physikalischen Merkmal des Kügelchens, einschließlich der Größe, ausgewählt sind.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei jedes Reporterkügelchen ein polymeres Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 22, wobei das Mikroteilchen aus polymerisierbaren Monomeren hergestellt ist, die unter Styrenen, Acrylaten und ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden und Alkoholen ausgewählt sind.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 23, wobei das Mikroteilchen aus Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latexen, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluen, Polyvinylidenchlorid oder Polydivinylbenzen besteht.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 24, wobei die Größe des Reporterkügelchen von 0,1 % der Größe des Trägers bis zu der gleichen Größe des Trägers reicht.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 15, wobei jedes Reporterkügelchen ein keramisches Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,1 μm bis 50 μm ist.
Oligomerbibliothek nach Anspruch 26, wobei das keramische Mikroteilchen ein Siliziumdioxidmikroteilchen ist.
Anordnung eines Trägers mit einem oder mehreren Reporterkügelchen, die durch nichtkovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, gebunden sind.
Anordnung nach Anspruch 28, welche einen Träger und eine Vielzahl an Reporterkügelchen umfaßt.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker aufweist.
Anordnung nach Anspruch 30, wobei der Marker ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Strichcode, radioaktive oder lumineszente Markierungen oder ein feststellbares physikalisches Merkmal des Kügelchen, einschließlich der Größe, ist.
Anordnung nach Anspruch 29, wobei jedes Reporterkügelchen ein kolloidales Teilchen ist.
Anordnung nach Anspruch 29, wobei jedes Reporterkügelchen ein polymeres Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei der Träger ein polymeres Kügelchen in der Form eines kolloidalen Teilchens mit einem Durchmesser von 1 bis 1000 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei der Träger ein Kügelchen ist, das aus Polystyrol, vernetzt mit 1 bis 5% Divinylbenzol, Hexamethylendiaminpolyacrylharz und verwandten Polymeren, Poly-[N-{2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl}]-acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliziumdioxid, Zellulose, Polystyrol, Latex, gepfropften Kopolymeren, einschließlich Polyethylenglykol/Polystyrol, Porenglas, Polyacrylamid, Dimethylacrylamid, wahlweise vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin, Glasteilchen, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer, einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly-(N-acryloylpyrrolidin)-Harz, Wang-Harz, Pam-Harz, Merrifield-Harz, PAP-Harz, SPARE-Polyamidharz, Polyethylen, funktionalisiert mit Acrylsäure, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Kopolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel oder PEG-PS/DVB-Kopolymeren gebildet ist.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei der Träger Funktionalitäten enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus -NH₂, -COOH, -SOH, -SSH und Sulfat besteht.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei jeder Träger ein Kügelchen in der Form eines Pellets, einer Scheibe, einer Kapillare, einer Hohlfasernadel, einer Nadel oder eines Chips ist.
Anordnung nach Anspruch 33, wobei das Mikroteilchen aus polymerisierbaren Monomeren gebildet ist, die unter Styrenen, Acrylaten und ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden und Alkoholen ausgewählt sind.
Anordnung nach Anspruch 38, wobei das Mikroteilchen aus Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latexen, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadi en, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluen, Polyvinylidenchlorid oder Poiydivinylbenzen besteht.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei jedes Reporterkügelchen ein keramisches Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,1 μm bis 50 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 40, wobei das keramische Mikroteilchen ein Siliziumdioxidmikroteilchen ist.
Verfahren zur Herstellung einer Anordnung eines Trägers und einer oder mehrerer Reporterkügelchen, welches die Stufe umfaßt, bei der man das oder jedes Reporterkügelchen durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, an den Träger bindet.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Vielzahl an Reporterkügelchen durch nichtkovalente physikalische Kräfte an den Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei eine Suspension von Reporterkügelchen und eine Suspension von Trägerkügelchen in einem Lösungsmittel unter Ausbildung einer Vielzahl von Anordnungen von Trägerkügelchen mit einer Vielzahl von daran gebundenen Reporterkügelchen miteinander gemischt werden.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Trägerkügelchen größer sind als die Reporterkügelchen und die Vielzahl von Reporterkügelchen durch eine Kombination aus elektrostatischen und van der Waals-Kräften an einem damit verbundenen Trägerkügelchen anhaften.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei zur Erhöhung der elektrostatischen Anziehung zwischen den Trägerkügelchen und den Reporterkügelchen Polyelektrolyte zu der Lösung hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei ein Überschuß an Reporterkügelchen aus der Lösung entfernt wird, nachdem sich die Anordnungen gebildet haben.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Reporterkügelchen vor einer weiteren Ladungsinduktion zur Erhöhung der elektrostatischen Anziehung zwischen Reporterkügelchen und einem verbundenen Trägerkügelchen mit einem Polyelektrolyten überzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die kovalente Bindung von Reporterkügelchen an ein verbundenes Trägerkügelchen durch die Ausbildung von zusätzlichen kovalenten Bindungen zwischen Oberflächengruppen von sowohl Trägerkügelchen als auch Reporterkügelchen verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Bindung der Reporterkügelchen an ein verbundenes Trägerkügelchen durch Gammabestrahlung von mit Polyelektrolyt überzogenen Reporterkügelchen verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei Reporterkügelchen zur Verstärkung der Bindung von Reporterkügelchen an ein verbundenes Trägerkügelchen mit Dendrimeren überzogen werden.
Verfahren zur Durchmusterung einer Bibliothek von Verbindungen, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1, hinsichtlich einer Bindung an oder einer Reaktion mit einem Liganden, wobei jede Verbindung eine Vielzahl an chemischen Gruppen umfaßt und an einen entsprechenden Träger gebunden ist, der eine Vielzahl an Reporterkügelchen aufweist, die daran und optional an benachbarte Reporterkügelchen durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, gebunden sind, und wobei jedes Reporterkügelchen einen damit verbundenen Marker zur Identifizierung der chemischen Gruppe, die an den Träger gebunden ist, sowie zur Identifizierung der Position in der Abfolge der chemischen Gruppe relativ zu anderen chemischen Gruppen in jeder Verbindung aufweist, wobei jede einzigartige Verbindung in der Bibliothek ein damit verbundenes einzigartiges Signal aufweisen wird und wobei das Signal von verschiedenen Kombinationen von Markern abhängt, um eine direkte Identifizierung von jeder Verbindung zu erleichtern, und wobei das Verfahren folgendes umfaßt: – Inkontaktbringen des Liganden mit Verbindungsmitgliedern der Bibliothek und – Analysieren der Verbindungen hinsichtlich einer Bindung an oder einer Reaktion mit dem Liganden.
Anordnung zum Feststellen eines Liganden, welche einen Träger umfaßt, der eine Verbindung aufweist, die an den Liganden bindet oder mit diesem reagiert, und wenigstens ein Reporterkügelchen, das daran durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, gebunden ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei das wenigstens eine Reporterkügelchen ein kolloidales Teilchen ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei der Träger ein unlösliches Polymerkügelchen in der Form eines kolloidalen Teilchens mit einem Durchmesser von 1 bis 1000 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei der Träger ein Kügelchen ist, das aus Polystyrol, vernetzt mit 1 bis 5% Divinylbenzol, Hexamethylendiaminpolyacrylharz und verwandten Polymeren, Poly-[N-{2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl}]-acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliziumdioxid, Zellulose, Polystyrol, Latex, gepfropften Kopolymeren, einschließlich Polyethylenglykol/Polystyrol, Porenglas, Polyacrylamid, Dimethylacrylamid, wahlweise vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin, Glasteilchen, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer, einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly-(N-acryloylpyrrolidin)-Harz, Wang-Harz, Pam-Harz, Merrifield-Harz, PAP-Harz, SPARE-Polyamidharz, Polyethylen, funktionalisiert mit Acrylsäure, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Kopolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel oder PEG-PS/DVB-Kopolymeren gebildet ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei der Träger ein Kügelchen in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Pellet, einer Scheibe, einer Kapillare, einer Hohlfasernadel, einer Nadel und einem Chip ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei das wenigstens eine Reporterkügelchen Marker umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Fluorophoren, Chromophoren, Strichcodes, radioaktiven Markierungen, lumineszenten Markierungen und einem feststellbaren physikalischen Merkmal des Kügelchens.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei das wenigstens eine Reporterkügelchen ein polymeres Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 59, wobei das Mikroteilchen aus polymerisierbaren Monomeren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Styrenen, Acrylaten, ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden, Alkoholen, Silanen und anderen anorganischen Monomeren, gebildet ist.
Anordnung nach Anspruch 60, wobei das Mikroteilchen aus Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latexen, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluen, Polyvinylidenchlorid, Polysilanen oder Polydivinylbenzen besteht.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei das wenigstens eine Reporterkügelchen ein keramisches Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Anordnung nach Anspruch 62, wobei das keramische Mikroteilchen ein Siliziumdioxidmikroteilchen ist.
Anordnung nach Anspruch 53, wobei die Größe des wenigstens einen Reporterkügelchens von 0,1 % der Größe des Trägers bis zu der gleichen Größe wie der Träger reicht.
Verfahren zur Aufzeichnung einer Reaktionsvorgeschichte eines Trägers, welches folgendes umfaßt: (i) Umsetzen des Trägers mit einem ersten Reagenz unter einer ersten Reaktionsbedingung, (ii) Binden eines ersten Reporterkügelchens an den Träger durch nicht-kovalente physikalische Kräfte, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus van der Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, sterischen Kräften und Brückenbildungsausflockung, wobei das erste Reporterkügelchen das erste Reagenz oder die erste Reaktionsbedingung aufzeichnet, und danach (iii) Umsetzen des Trägers mit einem zweiten Reagenz unter einer zweiten Reaktionsbedingung und (iv) Binden eines zweiten Reporterkügelchen an den Träger in einer nicht-kovalenten Art und Weise, wobei sich das zweite Reporterkügelchen von dem ersten Reporterkügelchen gemäß ii) unterscheidet und das zweite Reagenz oder die zweite Reaktionsbedingung aufzeichnet, wobei eine Verbindung nach einem Verfahren, welches Stufe (i) und Stufe (iii) umfaßt, synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei die Reporterkügelchen kolloidale Teilchen sind.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei der Träger ein unlösliches polymeres Kügelchen in der Form eines kolloidalen Teilchens mit einem Durchmesser von 1 bis 1000 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei der Träger ein Kügelchen ist, das aus Polystyrol, vernetzt mit 1 bis 5% Divinylbenzol, Hexamethylendiaminpolyacrylharz und verwandten Polymeren, Poly-[N-{2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl}]-acrylamid (d.h. (ein Q)), Siliziumdioxid, Zellulose, Polystyrol, Latex, gepfropften Kopolymeren, einschließlich Polyethylenglykol/Polystyrol, Porenglas, Polyacrylamid, Dimethylacrylamid, wahlweise vernetzt mit N,N'-Bis-acryloylethylendiamin, Glasteilchen, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer, einschließlich vernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer, welches ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche liefert, Poly-(N-acryloylpyrrolidin)-Harz, Wang-Harz, Pam-Harz, Merrifield-Harz, PAP-Harz, SPARE-Polyamidharz, Polyethylen, funktionalisiert mit Acrylsäure, Kieselgur/Polyamid (Pepsin K), PolyHipe, PS/Polydimethylacrylamid-Kopolymeren, CPG, PS-Makrokügelchen, Tentagel oder PEG-PS/DVB-Kopolymeren gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei der Träger ein Kügelchen in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Pellet, einer Scheibe, einer Kapillare, einer Hohlfasernadel, einer Nadel und einem Chip ist.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei ein einzelnes Reporterkügelchen Marker umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Fluorophoren, Chromophoren, Strichcodes, radioaktiven oder lumineszenten Markierungen und einem feststellbaren physikalischen Merkmal des Kügelchens.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei ein einzelnes Reporterkügelchen ein polymeres Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 71, wobei das Mikroteilchen ein polymerisierbares Monomer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Styrenen, Acrylaten, ungesättigten Chloriden, Estern, Acetaten, Amiden, Alkoholen, Silanen und anderen anorganischen Monomeren, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 72, wobei das Mikroteilchen aus Polystyrol (einschließlich hochgradig dichten Polystyrol-Latexen, wie bromiertem Polystyrol), Polymethylmethacrylat und anderen Polyacrylsäuren, Polyacrylnitril, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polydimethylsiloxan, Polybutadien, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluen, Polyvinylidenchlorid, Polysilanen oder Polydivinylbenzen besteht.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei ein einzelnes Reporterkügelchen ein keramisches Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 0,01 μm bis 50 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei das keramische Mikroteilchen ein Siliziumdioxidmikroteilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 65, wobei die Größe eines einzelnen Reporterkügelchens von 0,1 % der Größe des Trägers bis zu der gleichen Größe wie der Träger reicht.