DE69630881T2

DE69630881T2 - Fernprogrammierbare matrizen mit speichern und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69630881T2
Application number: DE69630881T
Authority: DE
Inventors: P. Michael NOVA; E. Andrew SENYEI; Zahra Parandoosh; S. Gary DAVID; Xiao-Yi Xiao
Original assignee: Discovery Partners International Inc
Current assignee: Discovery Partners International Inc
Priority date: 1995-04-25
Filing date: 1996-04-25
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2016-04-26
Also published as: EA199700257A1; AU5918596A; WO1996036436A1; US20070248957A1; CN1181720A; US20090226891A2; EP0822861A1; US7935659B2; ATE254965T1; EP0822861B1; US8219327B2; KR19990008052A; CA2216645A1; US20110212857A1; US20120238466A1; US20110237459A1; DE69630881D1; US20130090260A1; JPH11511238A; AU707444B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung von Datenspeichertechnologie auf molekulare Verfolgung und Identifizierung und biologische, chemische, immunologische, und biochemische Tests.
Arzneimittelentdeckung beruht auf der Fähigkeit Verbindungen zu identifizieren, die mit einem ausgewählten Ziel bzw. Target interagieren, wie Zellen, einem Antikörper, Rezeptor, Enzym, Transkripitionsfaktor oder ähnlichem. Traditionelle Arzneimittelentdeckung beruhte auf Sammlungen oder Bibliotheken, die aus proprietären Datenbanken von Verbindungen erhalten wurden, die über viele Jahre angesammelt worden waren, natürlichen Produkten, Fermentationsbrühen, und rationalem Arzneimitteldesign. In Verbindung mit Hochdurchsatz-Screening (HTS) sind Verfahren zum Herstellen molekularer Unterschiedlichkeit und zum Nachweisen, Identifizieren und Quantifizieren von biologischem oder chemischem Material entwickelt worden. Diese Fortschritte wurden durch fundamentale Entwicklungen in der Chemie gefördert, einschließlich der Entwicklung von hochsensitiven analytischen Verfahren, chemischen Festphasensynthesen und sensitiven und spezifischen biologischen Testsystemen.
Analysen von biologischen Interaktionen und chemischen Reaktionen erfordern jedoch die Verwendung von Markierungen oder Kennzeichen (engl: „tags") um die Ergebnisse solcher Analysen zu verfolgen und zu identifizieren. Es gibt einen Bedarf geeignete Verfahren zum Verfolgen und Identifizieren von Analyten in biologischen Interaktionen, und den Reaktionsteilnehmern und Produkten von chemischen Reaktionen zu entwickeln.
Kombinatorische Chemie ist zu einem leistungsstarken Werkzeug in der Arzneimittelentdeckung und Werkstoffkunde geworden. Die sich ergebenden kombinatorischen Bibliotheken enthalten potentiell Millionen von pharmazeutisch relevanten Verbindungen, die durchsucht werden können um Verbindungen zu identifizieren, die eine ausgewählte Aktivität zeigen.
Es gibt der drei kritische Aspekte bei jeder kombinatorischen Bibliothek: (i) die chemischen Einheiten, aus denen die Bibliothek zusammengesetzt ist; (ii) Herstellung und Klassifizierung der Bibliothek, und (iii) Identifizierung von Bibliotheksmitgliedern, die mit dem Target von Interesse interagieren, und Verfolgung von intermediären Syntheseprodukten und der Vielzahl von Molekülen in einem einzelnen Behälter.
Ein wesentliches Element des Hochdurchsatz-Screenings für ein Arzneimittelentdeckungs- verfahren und Gebieten, in denen Moleküle identifiziert und verfolgt werden, ist die Fähigkeit, die Informationen zu extrahieren, die während der Synthese und dem Screening einer Bibliothek erhältlich werden, die Identifizierung der aktiven Komponenten von intermediären Strukturen, und der Reaktionsteilnehmer und Produkte von Tests. Während es verschiedene Techniken zur Identifizierung von intermediären Produkten und Endprodukten gibt, gibt es keine idealen Lösungen für die Probleme der Identifikation, Verfolgung und Klassifizierung.
EP 0637750 A offenbart die Verwendung eines Speicherchips, der in einer Glasmatrix eingekapselt ist.
WO 89/08264 offenbart die Verwendung eines elektrischen Codeträgers, der an einem Gefäß befestigt ist.
DE U 9416270 offenbart die Verwendung eines Speicherchips, der an einem Gefäß befestigt ist.
FR A 2536169 offenbart die Verwendung einer Glasröhre, die einen optisch lesbaren Barcode stützt und die, der inneren Oberfläche, die zur Verknüpfung von biologischen Molekülen sensitiviert werden kann.
Daher ist es hier ein Ziel, Verfahren bereitzustellen zur Identifizierung, Verfolgung und Klassifizierung der Komponenten einer komplexen Mischung von verschiedenen Molekülen. Es ist hier auch ein Ziel Produkte für eine solche Identifizierung, Verfolgung und Klassifizierung bereitzustellen, und Tests, diagnostische und Screening Protokolle bereitzustellen, die solche Produkte verwenden.
Erfindungsgemäß wird eine Kombination von einer Matrix mit Speicher zur Verwendung in der chemischen Festphasensynthese bereitgestellt, umfassend

(A) eine Speichervorrichtung, die einen elektromagnetisch lesbaren Speicher zum Speichern codierter Daten umfasst; und
(B) eine Matrix, die an die Speichervorrichtung gekoppelt oder in physikalischem Kontakt mit dieser ist und zum Koppeln biologischer Partikel oder Moleküle angepasst ist; wobei die codierten Daten Identifizierungsinformationen umfassen, die in unverwechselbarer Weise die Matrix und somit die biologischen Partikel oder Moleküle identifizieren, die daran gekoppelt sind; gekennzeichnet durch ein im Wesentlichen starres Gefäß, das aus Inertmaterial gebildet ist, wobei mindestens ein Teil dieses Gefäßes porös ist, und dadurch, dass die Matrix eine Vielzahl von Matrixpartikeln umfasst, die zum Koppeln biologischer Partikel oder Moleküle angepasst sind, die in einem Hohlraum in dem Gefäß enthalten sind.

Die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen schließen die folgenden bevorzugten Merkmale ein.
Kombinationen von Matrixmaterialien mit programmierbaren Datenspeicher- oder Aufzeichnungsvorrichtungen, hier bezeichnet als Speicher, und Tests, die diese Kombinationen verwenden, werden bereitgestellt. Diese Kombinationen werden hier als Matrizes mit Speicher bezeichnet. Aufgrund dieser Speicher mit Matrixkombination können Moleküle wie Antigene, Antikörper, Liganden, Proteine und Nukleinsäuren, und biologische Partikel, wie Phagen und virale Partikel und Zellen, die assoziiert sind, wie in der Nähe von oder in physikalischen Kontakt mit der Matrixkombination, elektromagnetisch gekennzeichnet werden, durch Programmieren des Speichers mit Daten, die identifizierenden Informationen entsprechen. Programmieren und Lesen des Speichers wird aus der Ferne bewirkt, vorzugsweise unter Verwendung elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Hochfrequenz oder Radar. Speicher können auch von der Matrix entfernt sein, wie bei Beispielen, bei denen die Speichervorrichtung mit einem Kennzeichen oder Identifikationsmittel vorcodiert ist oder die Matrix mit einem Barcode codiert ist. Die Identität (d. h. das Kennzeichen oder der Code) jeder Vorrichtung wird in einen Speicher geschrieben, der ein Computer, oder ein Stück Papier oder jede Aufzeichnungsvorrichtung sein kann, und Information, die mit jeder Matrix assoziiert ist, wird in dem entfernten Speicher gespeichert und mit dem Code oder anderen Identifikationsmittel verknüpft.
Die Moleküle und biologische Partikel, die mit der Matrixkombination assoziiert sind, wie in der Nähe zu oder in physikalischen Kontakt mit der Matrixkombination, können identifiziert und die Ergebnisse der Tests durch Abrufen der gespeicherten Datenpunkte aus den Speichern bestimmt werden. Abfragen des Speichers wird assoziierte Moleküle oder biologische Partikel, die reagiert haben, identifizieren.
Die Kombinationen, die hier bereitgestellt werden, haben daher eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich kombinatorischer Chemie, Isolierung und Aufreinigung von Targetmakromolekülen, Einfangen und Nachweisen von Makromolekülen für analytische Zwecke, Hochdurchsatz-Screening, selektive Entfernung von Verunreinigungen, enzymatische Katalyse, Arzneimittelapplikationen, chemische Modifizierung, Informationssammlung und -management und andere Verwendungen. Diese Kombinationen sind besonders vorteilhaft zur Verwendung in Multianalyt-Analysen, Tests, in denen ein elektromagnetisches Signal durch die Reaktionsteilnehmer oder Produkte in dem Test erzeugt wird, zur Verwendung in homogenen Tests, und zur Verwendung in Multiplexprotokollen.
In bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese Matrix mit Speicherkombinationen (i) eine Miniatur-Aufzeichnungsvorrichtung, die eine oder mehrere programmierbare Datenspeichervorrichtungen (Speicher) einschließt, die aus der Ferne gelesen und in bevorzugten Ausführungsformen auch aus der Ferne programmiert werden können; und (ii) einen teilchenförmigen Träger, der in chemischen Synthesen verwendet wird.
Die Matrixmaterialien ("Matrizes") sind jede beliebigen Materialien, die routinemäßig in chemischen und biochemischen Synthesen verwendet werden.
In Ausführungsformen hierin, in denen die Matrizes mit Speicher in Tests verwendet werden, wie Szintillationsproximitätstests (SPA), FP- (Fluoreszenz-Polarisierung) Tests, FET- (Fluoreszenzenergie-Transfer) Tests, FRET-(Fluoreszenzresonanzenergie-Transfer) Tests und HTRF- (homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz) Tests, können die Matrizes beschichtet werden mit, eingebettet werden in oder auf andere Weise kombiniert werden mit oder in Kontakt gebracht werden mit Testmaterial, wie Szintilationsmittel, einer Fluorophore oder anderer fluoreszierender Markierung. Die daraus resultierenden Kombinationen werden lumineszierende Speicher mit Matrix genannt.
Die Speichervorrichtung oder der Speicher wird programmiert oder codiert mit Informationen, die Moleküle oder biologische Partikel identifizieren, entweder durch ihr Herstellungsverfahren, ihre Identität, ihre Chargennummer, Kategorie, physikalische oder chemische Eigenschaften, Kombinationen von irgendwelchen dieser Informationen, oder anderen solchen identifizierenden Informationen. Die Moleküle oder biologischen Partikel sind in physikalischem Kontakt mit, direkt oder indirekt, oder in der Nähe von der Matrix, die wiederum in physikalischem Kontakt oder in der Nähe der Aufzeichnungsvorrichtung ist, die den Datenspeicher enthält.
Die Aufzeichnungsvorrichtung wird in oder auf der Matrix platziert oder wird in das Matrixmaterial eingebettet durch Einschließen der Vorrichtung und des Matrixmaterials in einem versiegelten Behälter (MICROKAN^TM), hergestellt vorzugsweise aus porösem Material wie TEFLON^® oder Polypropylen, herge stellt mit Poren, das inaktiv gegenüber der Reaktion von Interesse ist und das Poren von einer Größe aufweist, die durchlässig für die gewünschten Komponenten des Reaktionsmediums ist.
Die Mikrogefäße weisen vorzugsweise ein Volumen von ungefähr 200–500 mm³ auf, können aber auch größere Volumina aufweisen, wie größer als 500 mm³ (oder 1000 mm³) mindestens ausreichend um mindestens 200 mg der Matrixpartikel zu enthalten, wie ungefähr 500–3000 mm³, wie 1000–2000 oder 1000 bis 1500, mit bevorzugten Abmessungen von ungefähr 1–10 mm im Durchmesser und 5 bis 20 mm in Höhe, weiter bevorzugt ungefähr 5 mm mal 15 mm, oder größer, wie ungefähr 1–6 cm mal 1–6 cm. Die poröse Wand sollte nicht-kollabierbar mit einer Porengröße im Bereich von 70 μM bis ungefähr 100 μM sein, kann aber so gewählt sein, dass sie semi-permeabel für ausgewählte Komponenten des Mediums ist, in dem das Mikrogefäß platziert wird. Die bevorzugte Geometrie dieser Kombinationen ist zylindrisch.
Diese Mikrogefäße können mit einem Code markiert werden, wie einem Barcode, alphanumerischen Code oder einem anderen Kennzeichen, zur Identifikation.
Im Einzelnen werden Verfahren zum Kennzeichnen von Bestandteilen von kombinatorischen Bibliotheken und anderen Bibliotheken oder Mischungen von unterschiedlichen Molekülen oder biologischen Partikeln bereitgestellt. Diese Verfahren schließen das elektromagnetische Kennzeichnen von Molekülen ein, durch in Kontakt bringen der Moleküle oder biologischen Partikel mit oder in die Nähe bringen solcher Moleküle oder Partikel von einer Matrix mit Speicher, und Programmieren des Speichers mit abrufbaren Informationen, aus denen die Identität, Synthesegeschichte, Chargennummer, oder andere identifizierenden Informationen erlangt werden können.
Wenn die Matrizes für die Synthese von den Bestandteilsmolekülen verwendet wird, wird der Speicher jedes Partikels angesprochen, und die Identität der zugefügten Komponente wird in dem Speicher codiert bei (vor, während, oder vorzugsweise nach) jedem Schritt in der Synthese. Am Ende der Synthese enthält der Speicher eine rückgewinnbare Aufzeichnung aller der Komponenten des resultierenden Moleküls, welches dann verwendet werden kann, entweder verbunden mit dem Träger, oder nach einer Spaltung vom Träger in einem Test oder für Screening oder eine andere solche Anwendung. Wenn das Molekül vom Träger mit Speicher abgespalten wird, muss der Speicher in der Nähe des Moleküls verbleiben oder muss in einer Weise auf das Molekül zurückzuführen sein (d. h. assoziiert mit). Solche Syntheseschritte können automatisiert werden.
Die Systeme für Aufzeichnung und Lesen von Daten schließen ein: einen zentralen Computer oder anderes Codierungs/Decodierungsinstrument, das einen Speicher für das Speichern von Daten aufweist, welche die Identität oder Synthese der Moleküle betreffen, und ein Übertragungsmittel zum Empfangen eines Datensignals, und Erzeugung eines Signal für die Übertragung eines Datensignals; und eine Aufzeichnungsvorrichtung, die einen aus der Ferne programmierbaren, vorzugsweise nicht-flüchtigen Speicher einschließt, und Übertragungsmittel zum Empfangen eines Datensignals und Erzeugen von mindestens einem übertragenen Signal und zum Bereitstellen eines Schreibsignals zum Speicher in der Aufzeichnungsvorrichtung. Der zentrale Computer speichert übertragene Signale aus den Speichern mit Matrizen und decodiert die übertragene Information.
Verfahren zum Lesen identifizierender Informationen aus den Aufzeichnungsvorrichtungen schließen die Schritte ein, die Aufzeichnungsvorrichtung, die den Speicher enthält in dem die Daten gespeichert sind, elektromagnetischer Strahlung (EM) auszusetzen; und Übertragen auf den zentralen Computer oder Codierungs/Dekodierungsinstrument eines Indikators, der die Identität eines Moleküls oder eines biologischen Partikel repräsentiert, oder Identifizierung des Moleküls oder biologischen Partikel, das verknüpft ist, in der Nähe von oder assoziiert ist mit der Aufzeichnungsvorrichtung.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die kombinatorische Synthese von chemischen Bibliotheken auf Matrixträgern mit Speichern dar. A, B, C ... entsprechen den chemischen Bausteinen; a, b, c ... entsprechen den Codes, die im Speicher gespeichert sind, die jeweils A, B, beziehungsweise C ... entsprechen. S_a, S_b, S_c ... entsprechen den jeweiligen Signalen, die an den Speicher gesandt wurden.
2 stellt die kombinatorische Synthese von Peptiden auf einer Matrix mit Speicher dar. Jede Aminosäure weist einen entsprechenden Code, a, b, c ..., in dem Matrixspeicher auf, und L entspricht einem Linker zwischen der Speichervorrichtung und der pharmakologischen Wirkgruppe.
3 stellt die kombinatorische Synthese von Oligonukleotiden auf Matrixträgern mit Speicher dar. A, G, T und C entsprechen Nukleotiden, und a, g, t und c entsprechen den elektronischen Codes, die im Speicher gespeichert sind, die jeweils A, G, T beziehungsweise C entsprechen.
4 stellt die Herstellung einer chemischen Bibliothek dar, wie einer Bibliothek von organischen Molekülen, in der R₁, R₂, R₃ Substituenten auf einem ausgewählten Molekül sind, wie dem Monomer einer pharmakologischen Wirkgruppe, jeweils identifiziert durch ein unterschiedliches Signal, dargestellt als 1, 2, oder 3 aus den Klassen S₁, S₂, beziehungsweise S₃. Der Kreis entspricht einer organischen pharmakologischen Wirkgruppe Wenn R₁–R₃ gleich sind, und ausgewählt aus den 50 gleichen Wahlmöglichkeiten, dann enthält in die vollständige Bibliothek 50³ = 125.000 Mitglieder. Wenn R₁–R₃ aus einer unterschiedlichen Reihe von Wahlmöglichkeiten ausgewählt werden, dann weist die sich daraus ergebende Bibliothek entsprechend mehr Mitglieder auf. Jeder Matrixspeicher kann mit Informationen codiert werden, die dem zugefügten R_n und der Klasse (S_n) entsprechen und daher einen unverwechselbaren Code für jedes Bibliotheksmitglied bereitstellen.
5 ist ein Blockdiagramm des Datenspeichermittels und der unterstützenden elektrischen Bestandteile einer bevorzugten Ausführungsform.
6 ist eine Diagrammansicht der Speicheranordnung innerhalb der Aufzeichnungsvorrichtung, und der entsprechenden Daten, die im zentralen Computerspeicher gespeichert werden.
7 ist eine Darstellung eines beispielhaften Apparates zur Trennung der Matrixpartikel mit Speicher um sie individuell einem EM Signal auszusetzen.
8 ist eine Darstellung einer zweiten beispielhaften Ausführungsform eines Apparates zur Trennung von Matrixpartikel, um sie individuell einem optischen Signal auszusetzen.
9 ist eine Diagrammansicht der Speicheranordnung innerhalb der Aufzeichnungsvorrichtung, der entsprechenden Daten die im zentralen Computerspeicher gespeichert werden, und eines angeschlossenen Photodetektors mit Verstärker und Signalauswertungstransistor.
10 ist ein Schema für die Synthese der 8-teiligen RF-codierten kombinatorischen Dekamer-Peptidbibliothek, beschrieben in BEISPIEL 4. Alle Kopplungen wurden in DMF bei Umgebungstemperatur für 1 Std. durchgeführt (zwei Kopplungen pro Aminosäure), unter Verwendung von PyBOP und EDIA oder DIEA. Entschützungsbedingungen: 20% Piperidin in DMF, Umgebungstemperatur, 30 min; Spaltungsbedingungen: 1,2-Ethandithiol : Thioanisol : Wasser : Phenol: Trifluoressigsäure (1,5 : 3 : 3 : 4,5 : 88, w/w) Umgebungstemperatur, 1,5 Std.
11 ist ein Seitenaufriss einer bevorzugten Ausführungsform eines Mikrogefäßes.
12 ist eine Ausschnittsansicht, mit weggeschnittenen Anteilen, genommen entlang der Linie 12-12 von 11.
13 ist eine Ausschnittsansicht, genommen entlang der Linie 13-13 von 12.
14 ist eine perspektivische Ansicht einer alternativen Ausführungsform eines Mikrogefäßes mit einem getrennten Endverschluss.
15 ist eine Seitenaufrissansicht des Mikrogefäßes von 14 mit einem weggeschnittenen Anteil.
16 ist eine Ausschnittsansicht, genommen entlang der Linie 16-16 von 15.
Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie im allgemeinen von einem Fachmann auf dem Gebiet zu dem diese Erfindung gehört verstanden wird. Alle Patente und Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wird, werden, falls nicht anders gesagt, durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Matrix auf jeden festen, halbfesten oder unlöslichen Träger mit dem die Speichervorrichtung und/oder das Molekül von Interesse, typischerweise ein biologisches Molekül, organisches Molekül oder biospezifischer Ligand, verbunden oder in Kontakt ist. Typischerweise ist eine Matrix ein Substratmaterial, das eine starre oder halbstarre Oberfläche aufweist.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein Lumineszenzanteil auf ein Szintillationsmittel oder Fluorophore, die in Szintillationsproximitätstests oder in nicht-radioaktiven Energietransfertests, wie dem HTRF Test, verwendet wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Matrix mit Speicher auf eine Kombination von einer Matrix mit einer Miniatur-Aufzeichnungsvorrichtung, die mehrere Datenbits speichert, durch welche die Matrix identifiziert werden kann, vor zugsweise in einem nicht-flüchtigen Speicher, der beschrieben und gelesen werden kann, durch Übertragung von elektromagnetischer Strahlung von einer entfernten Zentrale, wie einem Computer.
Wie hier verwendet, bezieht sich elektromagnetische (EM) Strahlung auf Strahlung, die von Fachleuten als EM Strahlung verstanden wird und schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Hochfrequenz (RF), infrarot (IR), sichtbare, ultraviolette (UV) Strahlung, Schallwellen, Röntgenstrahlen und Laserlicht.
Wie hier verwendet, beziehen sich Informationen, die ein biologisches Partikel oder Molekül identifizieren oder verfolgen, auf jede Information, die das Molekül oder biologische Partikel identifiziert, wie, aber nicht beschränkt auf, dem Identitätspartikel (d. h. seine chemische Formel oder Name), seine Sequenz, seinen Typ, seine Klasse, seine Reinheit, seine Eigenschaften, wie seine Bindungsaffinität für einen bestimmten Liganden. Verfolgen bedeutet die Fähigkeit einem biologischen Molekül oder Partikel durch Synthese und/oder Verarbeitungsschritte zu folgen.
Wie hier verwendet, ist „kombinatorische Chemie" eine Synthesestrategie, die verschiedene, normalerweise große, chemische Bibliotheken hervorbringt.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein „ biologisches Partikel" auf ein Virus, wie einem viralen Vektor oder viralen Capsid, mit oder ohne verpackter Nukleinsäure, einen Phagen, einschließlich eines Phagenvektors oder Phagencapsids, mit oder ohne eingekapselter Nukleinsäure, eine einzelne Zelle, einschließlich eukaryotischer und prokaryotischer Zellen oder Fragmenten davon, ein Liposom oder micellenartiges Agens oder andere Verpackungspartikel, und andere solche biologischen Materialien.
Wie hier verwendet, schließen die Moleküle in den Kombinationen jedes Molekül ein, einschließlich Nukleinsäuren, Aminosäuren, andere Biopolymere, und andere organische Moleküle, einschließlich Peptidmimetika und Monomere oder Polymere von kleinen organischen molekularen Bestandteilen von nicht-peptidischen Bibliotheken, die durch die Verfahren hier identifiziert und/oder wie hier beschrieben auf Matrizes mit Speicher synthetisiert werden können.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Bibliothek" auf eine Sammlung von im Wesentlichen zufälligen Verbindungen oder biologischen Partikeln, die Zufallspeptide oder -proteine exprimieren, oder auf eine Sammlung verschiedener Verbindungen.
A. Matrizes
Matrizes schließen jedes Material ein, das als Trägermatrix für das Befestigen von Molekülen oder biologischen Partikeln von Interesse dienen kann, einschließlich biokompatiblen Polymeren. Das Matrixmaterial sollte so ausgewählt sein, dass es die Chemie oder biologische Reaktion von Interesse nicht stört, während der Zeit, in der das Molekül oder Partikel verknüpft oder in der Nähe von dem ist, an das die Datenspeichervorrichtung mit Speicher angebracht, in der Nähe platziert, imprägniert, eingeschlossen, oder auf andere Weise verbunden, verknüpft oder in physikalischen Kontakt gebracht werden kann. Diese Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, anorganische Moleküle, natürliche Polymere und synthetische Polymere. Matrizes, die ebenfalls für eine Verwendung hierin in Betracht gezogen werden, schließen Fluorophoren-enthaltende oder damit imprägnierte Matrizes ein, wie Mikroplatten und Kügelchen (kommerziell erhältlich zum Beispiel von Amersham, Arlington Heights, IL; Plastik-Szintillationskügelchen von NE (Nuclear Technology Inc., San Carlos, CA) Packard, Meriden, CT)
Die Matrizes können jede erforderliche Struktur und Geometrie aufweisen, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Kügelchen und Pellets.
Die Auswahl der Matrizes wird zumindest teilweise durch ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften geleitet werden, wie Löslichkeit, funktionellen Gruppen, mechanischer Stabilität, Neigung zum Anschwellen der Oberfläche, hydrophobe oder hydrophile Eigenschaften und der beabsichtigten Verwendung.
Die Datenspeichervorrichtung kann physikalisch in das Matrixmaterial oder – partikel eingefügt werden. Wenn das Matrixmaterial eine poröse Membran ist, kann sie innerhalb der Membran platziert werden. Es versteht sich, dass wenn die Speichervorrichtung in der Matrix eingeschlossen oder mit schützendem Material beschichtet ist, eine solche Matrix oder Material durchlässig für das Signal sein muss, das verwendet wird, um den Speicher zum Schreiben und Lesen von Daten zu programmieren.
1. Natürliche Matrix-Trägermaterialen
Natürlich vorkommende Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Agarose, andere Polysaccharide, Kollagen, Zellulosen und Derivaten davon, Glas, Silikongel, Latexgel, Gummi, Silizium, natürliche Schwämme und Tonerde. Verfahren zur Isolierung, Modifizierung und Behandlung, um sie zur Verwendung als Träger geeignet zu machen, sind Fachleuten gut bekannt. Natürliche Polymere wie Polypeptide, Proteine und Kohlenhydrate, Metalloide, wie Silizium und Germanium, die Halbleiter-Eigenschaften haben, können ebenfalls zur Verwendung hierin angepasst werden, solange sie nicht dem Betrieb der Daten-speichervorrichtung stören. Auch Metalle wie Platin, Gold, Nickel, Kupfer, Zink, Zinn, Palladium, Silber und Oxide davon können zur Verwendung hierin angepasst werden. Auch zusammengesetzte Halbleiter, wie Lithiumniobat, Galliumarsenid und Indiumphosphid und Nickel-beschichtete Glimmeroberflächen können als Matrizes verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von solchen Matrixmaterialien sind gut bekannt.
2. Synthetische Matrizes
Synthetische Matrizes werden typischerweise durch Polymerisierung von funktionellen Matrizes hergestellt, oder durch Kopolymerisierung von zwei oder mehr Monomeren aus einem synthetischen Monomer und natürlich vorkommenden Matrixmonomer oder Polymer, wie Agarose. Bevor solche Polymere sich verfestigen, werden sie mit der Datenspeichervorrichtung mit Speicher in Kontakt gebracht, die in das Material gegeben oder eingetaucht werden kann. Als Alternative kann die Aufzeichnungsvorrichtung, welche die Datenspeichereinheit(en) enthält nach der Herstellung der Partikel manuell in das Matrixmaterial eingefügt werden.
Synthetische Matrizes schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Plastikarten, Acrylamide, Dextranderivate und Dextran-Kopolymere, Agarose-Polyacrylamid-Mischungen, andere Polymere und Kopolymere mit verschiedenen funktionellen Gruppen, Methylacrylat-Derivate und -Kopolymere, Polystyrole und Polystyrol-Kopolymere, z. B. Merrifield Harze. Verfahren zur Herstellung von solchen Matrizes sind Fachleuten gut bekannt.
3. Immobilisierung und Aktivierung
Es sind zahlreiche Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen an festen Trägern entwickelt worden. Unter den am häufigsten verwendeten Verfahren sind Absorption und Adsorption oder kovalente Bindung an den Träger, entweder direkt oder über einen Linker, wie die zahlreichen Disulfid-Verbindungen, Thioether-Bindungen, behinderte Disulfid-Bindungen, und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie Amin- und Thiolgruppen, die Fachleuten bekannt sind.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Modifizierung einer Polymeroberfläche durch das sukzessive Auftragen von mehreren Schichten von Biotin, Avidin und Verlängerungen. Andere Linker schließen Säure-spaltbare Linker, Kreuzvernetzer, die gespalten werden, nachdem sie UV oder sichtbarem Licht ausgesetzt wurden, Fluorid-labile Linker, und Säure-labile Linker ein. Die ausgewählten Linker werden von der jeweiligen Anwendung abhängig sein, und können, falls nötig, empirisch ausgewählt werden.
B. Datenspeichereinheiten mit Speicher
Bevorzugte Vorrichtungen sind schnell und einfach programmierbar unter Verwendung von durchdringender elektromagnetischer Strahlung, wie Hochfrequenz oder sichtbares Laserlicht, arbeiten mit relativ geringer Energie, weisen einen schnellen Zugriff auf (vorzugsweise 1 Sek. oder weniger, weiter bevorzugt 10²–10³ Sek.) und sind aus der Ferne programmierbar, so dass Informationen gespeichert oder programmiert und später aus der Distanz abgerufen werden können, wie es die Form des elektromagnetischen Signals, das für die Übertragung verwendet wird, erlaubt.
Aufzeichnungsvorrichtungen können aktiv sein, die eine Energiequelle enthalten, wie eine Batterie, und passiv, die keine Energiequelle einschließen. In einer passiven Vorrichtung, die keine unabhängige Energiequelle aufweist, liefert das Übertragungs/Empfängersystem auch die Energie zum Programmieren und Abrufen der Daten, die im Speicher gespeichert sind. Dies wird durch Einfügen eines Gleichrichterschaltkreises auf dem Substrat erreicht, um das empfangene Signal in eine Betriebsspannung umzuwandeln. Als Alternative kann eine aktive Vorrichtung eine Batterie einschließen, um die Energie zuzuführen, um die Speichervorrichtung mit einer Betriebsspannung zu versorgen.
1. Elektromagnetisch programmierbare Vorrichtungen
Die programmierbaren Vorrichtungen, die für die Verwendung hierin vorgesehen sind, schließen jede Vorrichtung ein, die Daten aufzeichnen oder Speichern kann. Eine bevorzugte Vorrichtung wird aus der Ferne programmierbar und klein sein, typischerweise in der Größenordnung von 10–20 mm³ (oder 10–20 mm in der größten Ausdehnung) oder vorzugsweise kleiner. Jedes Mittel zum Programmieren und Speichern von Daten aus der Ferne, einschließlich Halbleiter und optische Speichermedien, sind zur Verwendung hierin vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Datenspeichervorrichtung einen Halbleiter-Chip einschließlich eines Speichers und des unterstützenden Schaltsystems ein. Ein Hochfrequenz- Übertragungs/Empfängersystem liefert Energie zum Programmieren und Abrufen von Daten. Im Einzelnen schließt die Datenspeichereinheit vorzugsweise einen programmierbaren nur lesbaren bzw. read-only Halbleiterspeicher (PROM) ein, vorzugsweise einen nicht-flüchtigen Speicher oder einen anderen Speicher, der Daten für zukünftiges Abrufen speichern kann, der Informationen aufweisen wird, welche die Moleküle oder biologischen Partikel beschreibt oder identifiziert, die mit der Matrix verbunden oder in ihrer Nähe sind.
Kommerziell erhältliche, vorcodierte Vorrichtungen können verwendet werden, wie die Identifizierungs- und Verfolgungsvorrichtungen für Tiere und Waren, wie solche die mit und als Sicherheitssysteme verwendet werden, z. B. US Patente Nr. 4,652,528 und 5,266,926, und Vorrichtungen, die verwendet werden um Tiere zu markieren. Diese Vorrichtungen können auch unter Verwendung eines RF Signals programmierbar sein. Von besonderem Interesse sind hier die IPTT-100, erworben von BioMedic Data Systems, Inc., Maywood, NJ und die IDT150 Lese/Schreib-Transponder von ITDAG^TM Ltd., Bracknell, Berks RG12 3XQ, UK. In diesen Vorrichtungen leitet der Transponder seine Energiequelle von einer Frequenz ab, die im Signal des Lesegeräts emittiert wird, zu dem der Transponder eine Antwort emittiert. Diese Transponder sind in Glas oder Polystyrol oder einem anderen solchen Material verpackt. Ebenfalls hier bevorzugt sind Kennzeichen, die hergestellt werden und erhältlich sind von MIKRON unter dem Namen HITAG^®. In einigen Ausführungsformen werden die Vorrichtungen zur Verwendung hierin durch Verändern der Geometrie modifiziert.
5 zeigt eine Aufzeichnungsvorrichtung, die einen nicht-flüchtigen elektrisch-programmierbaren read-only Speicher (ROM) 102 enthält, die auf einem einzelnen Substrat 100 mit einer planaren Dünnschichtantenne 110 kombiniert ist, zum Empfangen/Übertragen eines RF Signals 104, einem Gleichrichter 112 zum Ableiten einer Spannung von einem empfangenen Hochfrequenz (RF)-Signals, einem Analog-zu-Digital-Wandler (ADC) 114 zum Umwandeln der Spannung in ein digitales Signal zum Speichern von Daten im Speicher, und ein Digital-zu-Analog-Wandler (DAC) 116 zum Umwandeln der digitalen Daten in ein Spannungssignal für die Übertragung zurück zum zentralen Computer wird bereitgestellt. Ein einzelnes Substrat 100 wird bevorzugt, um den kleinst-möglichen Chip bereitzustellen und Einkapselung des Chips in eine schützende Polymerhülle (oder Hülle plus Matrix oder Matrixmaterial) 106 zu erleichtern. Hülle 106 darf nicht reaktiv und muss unempfindlich gegenüber den verschiedenen Verfahren sein, zu deren Verfolgung die Aufzeichnungsvorrichtung verwendet wird.
Antenne 110 wird während des Herstellungsverfahrens unter Verwendung von konventionellen photolithographischen Techniken gebildet, um eine oder mehrere Metallstrukturen bereitzustellen, um eine RF Übertragung mit vorbestimmter Wellenlänge zu empfangen. In einer alternativen Ausführungsform kann die Antenne außerhalb des Halbleiter-Substrats gebildet werden. In dieser letzteren Konfiguration wird ein getrennter, leitfähiger Draht, der als eine Antenne wirkt, an ein Bond-Pad befestigt, das auf dem Chip gebildet wird. Der Draht wird dann stabilisiert, wenn der Chip in der schützenden Hülle eingeschlossen wird, so dass die Antenne in einem gewissen Winkel zum Chip herausragt.
Der Betrieb des Programmierens des Speichers, um die Verfahrensschritte aufzuzeichnen, denen das verbundene oder benachbarte Matrixpartikel- träger und das verbundene oder nahegelegene Molekül oder biologische Partikel ausgesetzt ist, beinhaltet das Plazieren der Speichervorrichtung ziemlich nahe (ein Abstand in der Größenordnung von ungefähr 1 inch (25,4 mm) wird gegenwärtig beabsichtigt, aber längere Abstände sollten möglich sein und kürzere Abstände werden ebenfalls erwogen (geeignete Abstände können empirisch bestimmt werden) am RF Sender 108. Der RF Sender emittiert eine Trägerwelle, die durch ein Signal moduliert wird, das durch zentralen Computer 122 unter Verwendung von konventioneller RF Technologie hervorgerufen wird. Die Trägerwelle selbst kann die Energie bereitstellen, um die Programmierungsspannung und die Betriebsspannung für die verschiedenen Vorrichtungen über den Gleichrichter zu erzeugen, während das Modulierungssignal die adressierenden Instruktionen bereitstellt.
Da der Speicher nur „markiert" werden muss, um aufzuzeichnen, dass das nahegelegene oder verbundene Molekül oder biologische Partikel einem gegebenen Verfahren ausgesetzt wurde, muss das Sendesignal nur Informationen tragen, die einen einzelnen Speicherort anschalten, während der zentrale Computer 122 in dem Speicher 120 die Informationen speichert, die die Verfahrensinformationen mit dem einzelnen Speicherort verbindet, der „markiert" wurde um das Aussetzen gegenüber den Verfahrensschritten aufzuzeichnen. Bezug nehmend auf 1, in der die chemischen Bausteine A, C und E zu einem Molekül hinzugefügt werden, das mit einer Matrix mit Speicher verbunden ist. 6 veranschaulicht ein Beispiel dafür, wie Information auf ein Partikel mit einem Speicher, der ein X-Register 124 und ein Y-Register 126 aufweist, geschrieben wird. Das RF Signal wird zur Matrix mit Speicher übertragen, um einen Datenpunkt A, auf z. B. X, Y-Adresse 1,8 zu schreiben. Der zentrale Computer 122 würde in seinen Speicher 120 schreiben, dass die Aufzeichnung für Verfahren A auf der X, Y-Adresse 1,8 gespeichert ist. Für den Schritt in dem C hinzugefügt wird, würde ein Datenpunkt, der das Aussetzen gegenüber C anzeigt, auf der X, Y-Adresse 2,4 gefunden werden und eine entsprechende Aufzeichnung wird in Speicher 120 geschaffen. Für Schritt E wird ein Datenpunkt auf der X, Y-Adresse 3,2 gespeichert, wobei eine entsprechende Aufzeichnung in Speicher 120 gemacht wird.
Nachdem die Verarbeitung abgeschlossen ist, wird der zentrale Computer, um die Informationen zu lesen, die im Speicher der Datenspeichereinheit aufgezeichnet wurde, die Identität des Partikels erforschen, durch Erzeugen eines Befehlssignals an die Register, um die entsprechenden Adressenorte auszuwählen.
Ein Apparat zum Abtrennen der Partikel, um sie individuell einem RF Signal aussetzen zu können, wird in 7 dargestellt. Hier werden die Partikel in einem Gefäß 140 platziert, das einen Trichter 142 oder einen anderen verengten Teil aufweist, der nur ein Partikel auf einmal durchlässt. Während die Partikel kugelförmig dargestellt sind, können sie von jeder Form sein, einschließlich unsymmetrischer Formen. Wenn eine bestimmte Orientierung des Partikels erwünscht oder für effektive Übertragung erforderlich ist, sollten die Röhre und der Trichterausgang so ausgestaltet und orientiert sein, dass nur Partikel in der richtigen Ausrichtung zur Röhre austreten dürfen.
Der RF Sender 108 wird benachbart zu einer Röhre 144 positioniert, die Einspeisung von Trichter 142 erhält. Wenn ein Partikel durch die Röhre 144 tritt, stellt der RF Sender ein Signal zum Schreiben oder Lesen aus dem Speicher des Partikels bereit. Mittel zum Einleiten der RF Übertragung können eine Verbindung zu einem mechanischen Durchgang oder Klappe 145 im Trichter 142 einschließen, welche den Zugang des Partikels in die Röhre kontrolliert. Wie in 7 dargestellt, werden optische Mittel zum Entdecken der Anwesenheit des Matrixpartikels mit Speicher bereitgestellt, um die RF Übertragung einzuleiten, in der Form eines Lasers 146, der auf die Röhre 144 gerichtet ist, die transparent für die Wellenlänge des Lichts ist, das der Laser emittiert. Wenn das Laserlicht auf das Partikel auftrifft (gezeigt durch die gestrichelten Linien) wird es in Richtung eines optischen Detektors 148 reflektiert, der ein Signal an den zentralen Computer 122 liefert, um die RF Übertragung einzuleiten. Als Alternative können magnetische Mittel oder jede anderen Mittel zum Entdecken der Anwesenheit des Partikels in der Röhre 144 verwendet werden, mit der Einschränkung, dass jede verwendete beliebige elektromagnetische Strahlung keinerlei Reaktionen in den Substanzen auf der Oberfläche des Partikels auslöst. Nachdem das individuelle Partikel dem RF Signal ausgesetzt war, kann das Partikel in einem oder mehreren Gefäßen zur weiteren Verarbeitung aufgenommen werden. Wie dargestellt, weist Röhre 144 einen beispielhaften drei-Wege-Trenner und Auswahlmittel auf, hier in gestrichelten Linien als mechanische Durchgänge gezeigt, um die Partikel zu dem gewünschten Bestimmungsort zu steuern.
Andere Speicher- oder codierte Vorrichtungen
Speichervorrichtungen
Andere Arten von elektrisch-programmierbaren read-only Speichern, vorzugsweise nicht-flüchtigen Speichern, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können verwendet werden. Vorprogrammierte, aus der Ferne ansprechbare Identifikationsmarkierungen, wie solche, die für das Verfolgen von Objekten oder Tieren verwendet werden, wie jene die von AVID, Norco, CA erhältlich sind, und aus der Ferne beschreibbare Versionen davon, werden ebenfalls für die Verwendung hierin vorgesehen. Vorprogrammierte Markierungen können in Ausführungsformen verwendet werden, wie in solchen in denen Verfolgen von verbundenen Molekülen erwünscht ist.
Als Alternative können die daran befestigten Matrizes mit einem vorprogrammierten, identifizierenden Bar Code codiert werden, wie einem optischen Bar Code, der auf der Matrix codiert sein und durch Laser gelesen wird. Solche vorcodierten Vorrichtungen können in Ausführungsformen verwendet werden, in denen Parameter überwacht werden, wie ein Ort in einem automatischen Synthetisiergerät. Die Identität eines Produkts oder Reaktionspartners, die durch seinen Aufenthaltsort oder Weg bestimmt wird, wird überwacht durch Lesen des Chips in jeder Vorrichtung, und Speichern solcher Informationen in einem entfernten Computer.
Unter den besonders bevorzugten Vorrichtungen ist der IPTT-100 (Bio Medic Data Systems Inc., oder „BMDS") und andere, die aus der Ferne codiert und aus der Ferne gelesen werden können. Die IPTT-100 Transponder, die ungefähr 8 mm lang sind, schließen eine Aufzeichnungsvorrichtung ein, ein EEPROM, einen passiven Transponder zum Empfangen eines Eingabesignals und Übertragen eines Ausgangssignals als Antwort. Bei einigen Ausführungsformen hier werden die Vorrichtungen durch Falten auf die Hälfte und Wickeln der Antenne um die sich ergebende gefaltete Struktur zur Verwendung modifiziert. Dies erlaubt ein geeignetes Einsetzen in die Mikrogefäße und die Bildung von anderen Kombinationen. Andere passende Markierungen schließen den IDT150 Lese/Schreib-Transponder von IDTAG^TM Ltd. Racknell, Berks RG123XQ, UK ein.
Die Vorrichtungen schließen eine Leistungsantenne zum Empfangen des Eingabesignals, Frequenzgenerator- und Modulationsmittel zum Empfangen des Eingabesignals und Erzeugen des Ausgabesignals ein. Daten werden innerhalb des Transponders gespeichert, innerhalb eines wiederprogrammierbaren Speicherschaltkreises, der vom Anwender programmiert wird. Ein Transponder-Scanner zum Scannen und Programmieren des Transponders ist ebenfalls erhältlich (BMDS DAS-5001 CONSOLE^TM System, z. B. US Patent Nr. 5,252,962 und US Patent Nr. 5,262,772)
Codierte Vorrichtungen
Es ist hier ebenfalls vorgesehen, dass der Speicher nicht nahe an der Matrix ist, sondern getrennt vorliegt, wie ein entfernter Computer oder andere Aufzeichnungsvorrichtung. Bei diesen Ausführungsformen werden die Matrizes mit einem unverwechselbaren Code markiert oder einer irgendwie gestalteten Markierung. Die Identität jeder Markierung wird im entfernten Speicher bewahrt und dann wird jedes mal wenn etwas mit dem Molekül oder biologischen Partikel, das mit jeder Matrix verbunden ist, getan wird, die Information, die dieses Ereignis betrifft, aufgezeichnet und mit der codierten Identität assoziiert. Nach Abschluss von zum Beispiel einem Syntheseprotokoll wird jede Matrix untersucht oder gelesen, um den Code zu identifizieren. Abrufen von Informationen vom entfernten Speicher, der mit dem Identifizierungscode gespeichert ist, wird die Identifizierung oder das Abrufen von jeder anderen gespeicherten Information ermöglichen, welche die Matrix betrifft.
Zum Beispiel werden auch einfache Codes, einschließlich Bar Codes, alphanumerische Zeichen oder andere sichtbare oder identifizierbare Codes oder Markierungen auf Matrizes zur Verwendung hierin vorgesehen. Wenn Bar Codes oder andere vorcodierte Vorrichtungen verwendet werden, kann die Information in einen assoziierten, aber entfernten Speicher, wie einem Computer oder sogar auf ein Stück Papier geschrieben werden. Der Computer speichert den Bar Code, der ein Matrixpartikel identifiziert, oder einen anderen Code und Informationen, die das Molekül oder biologische Partikel betreffen, das mit der Matrix verbunden ist, oder andere relevante Informationen, welche die verbundenen Materialen oder Synthese oder Test betreffen.
Optisch programmierte Vorrichtungen
Zusätzlich zu elektrisch programmierbaren Mitteln zum Speichern von Informationen auf den Matrixpartikeln können optische oder magnetische Mittel verwendet werden. Ein Beispiel für ein optisches Speichermittel wird durch US Patent Nr. 5,136,572 bereitgestellt, in dem eine Anordnung von stabilisierten Diodenlasern eine festgelegte Wellenlänge emittiert, wobei jeder Laser Licht bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert. Als Alternative kann ein einstellbarer Diodenlaser oder ein einstellbarer Farblaser verwendet werden, von denen jeder in der Lage ist, Licht über ein relativ breites Band von Wellenlängen zu emittieren. Das Aufzeichnungsmedium ist photochemisch aktiv, so dass ein Aussetzen gegenüber Laserlicht der passenden Wellenlänge Spektrallöcher bilden wird.
Wie in 8 dargestellt, emittiert der Laser 200 um auf das Aufzeichnungsmedium 204 zu schreiben, Licht einer ausgewählten Wellenlänge um ein Spektralloch in dem Medium zu bilden. Das Licht wird durch Linse 208 fokussiert, um einen Punkt auf Aufzeichnungsmedium 204 zu beleuchten. Die Laserenergie muss ausreichend sein, um das Spektralloch zu bilden. Zum Lesen wird die gleiche Wellenlänge bei einer geringeren Energie gewählt. Nur diese Wellenlänge wird durch das Spektralloch dringen, wo sie durch Detektor 210 festgestellt wird, der ein Signal an Computer 202 liefert, das für die aufgezeichnete Wellenlänge kennzeichnend ist. Weil verschieden Wellenlängen verwendet werden, können mehrere Spektrallöcher übereinander gelegt werden, so dass das Aufzeichnungsmedium sehr klein für Zwecke des Markierens sein kann.
Zum Lesen wird der Laser mit der gleichen Wellenlänge, die verwendet wurde um das Spektralloch zu erzeugen, das einzige Licht sein, das durch das Loch übertragen wird.
Schreibtechniken können auch die Bildung von Vertiefungen im Medium einschließen. Um diese Vertiefungen zu lesen wird der Detektor 210 auf der gleichen Seite der Schreib/Leseröhre 206 positioniert sein wie der Laser 200, um Licht nachzuweisen, das vom Medium zurückreflektiert wird. Andere Arten von optischen Datenspeicher- und Aufzeichnungsmedien wie sie im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Zum Beispiel können optische Scheiben, die typischerweise in Plastik verkapselte Metalle sind, wie Aluminium, verkleinert werden, und beschrieben und gelesen werden unter Verwendung konventioneller optischer Scheiben-Technologie. In einem solchen System muss die Miniaturscheibe in einer planaren Weise ausgerichtet werden, um das Schreiben und Lesen zu ermöglichen. Bei der Verwendung irgendeiner Form von optischer Aufzeichnung, müssen Überlegungen angestellt werden um sicherzustellen, dass die ausgewählte Lichtwellenlänge die Reaktionen der Moleküle oder biologischen Partikel, die mit Matrixpartikeln verbunden oder in ihrer Nähe sind, nicht beeinflußt oder stört.
C. Die Kombinationen und deren Herstellungen
Kombinationen von Matrixmaterial mit Datenspeichereinheit (oder Aufzeichnungsvorrichtung einschließlich der Einheit) werden hier als Matrizes mit Speicher bezeichnet.
Die Kombinationen enthalten (i) eine Miniaturaufzeichnungsvorrichtung, die einen oder mehrere programmierbare Datenspeichervorrichtungen (Speicher) enthält, die aus der Ferne gelesen werden können; und (ii) eine Matrix wie oben beschrieben, wie ein teilchenförmiger Träger, der bei chemischen Synthesen verwendet wird. Das Programmieren und Lesen aus der Ferne wird vorzugsweise unter Verwendung elektromagnetischer Strahlung bewirkt, insbesondere Hochfrequenz oder Radar.
1. Herstellung von Matrix-Speicher-Kombinationen
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Aufzeichnungsvorrichtung in einem ausgewählten Matrixmaterial während der Herstellung eingebaut. Als Alternative können die Vorrichtungen physikalisch in das Matrixmaterial, die verformbaren Gel-ähnlichen Materialien, eingesetzt werden, oder kann auf dem Matrixmaterial platziert und mit einem Verbindungselement, wie einem Plastik oder Wachs oder anderem solchen Material, befestigt werden. Als Alternative kann die Vorrichtung oder die Vorrichtungen) in einem inerten Behälter eingeschlossen sein, in der Nähe von oder in Kontakt mit Matrixmaterial.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden eine oder mehrere Aufzeichnungsvorrichtungen mit Speicher und Matrixpartikel in einem porösen, nicht-reaktivem Material eingeschlossen, wie Polypropylen oder TEFLON^®-Netz, mit einer Porengröße, die kleiner ist als die Partikelgröße der Matrix und der Vorrichtung. Typischerweise wird eine Vorrichtung auf ungefähr 1 bis 50 mg, vorzugsweise 5 bis 30, weiter bevorzugt 5 bis 20 mg Matrixmaterial, oder bei einigen Ausführungsformen bis zu Gramm, im allgemeinen 50 bis 250 mg, vorzugsweise 150 bis ungefähr 200 mg und eine Vorrichtung werden in einem porösen Gefäß (MICROKAN^TM) eingeschlossen. Die Menge des Matrixmaterials ist eine Funktion der Größe der Vorrichtung und der Anwendung, in der die sich ergebende Matrix mit Speicher verwendet wird, und kann, wenn nötig, empirisch ermittelt werden. Im Allgemeinen werden kleinere Größen gewünscht, und die Materialmenge wird abhängig von der Größe der ausgewählten Aufzeichnungsvorrichtung sein.
Die sich ergebenden Mikrogefäße werden dann codiert, Reaktionen, wie Synthesereaktionen werden durchgeführt und gelesen, und wenn erwünscht, in gewünschten Tests oder anderen Verfahren verwendet.
2. Kombinationen zur Verwendung in Proximitätstests
Bei anderen Ausführungsformen wird der Speicher oder die Aufzeichnungsvorrichtung beschichtet mit oder eingekapselt in einem Medium, wie einem Gel, das ein oder mehrere Fluorophoren oder ein oder mehrere Szintillationsmittel enthält, wie 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und/oder 1,4-Bis-(5-Phenyl(oxazolyl))benzol (POPOP) oder FlexiScint (einem Gel mit Szintillationsmittel erhältlich von Packard, Meriden, CT) oder Yttriumsilikate. Jede dem Fachmann bekannte Fluorophore oder Szintillationsmittel oder Szintillationscocktail kann verwendet werden. Die mit Gel beschichtete oder eingeschlossene Vorrichtung wird dann zur beabsichtigten Anwendung oder Anwendungen) mit einer geeigneten Matrix beschichtet, wie Glas oder Polystyrol. Die sich ergebende Vorrichtung ist besonders geeignet zur Verwendung als eine Matrix für Synthesen von Bibliotheken und deren nachfolgender Verwendung in Szintillationsproximitätstests.
D. Systeme zum Aufzeichnen und Lesen
Die Systeme schließen einen zentralen Computer oder ein Decodierungs/Codierungs-Instrument, einen Sender, einen Empfänger und die Datenspeichervorrichtung ein. Die Systeme können auch eine trichterähnliche Vorrichtung oder etwas Ähnliches zur Verwendung beim Abtrennen, und/oder Markieren einzelner Speichervorrichtungen einschließen. Beim Ausüben wird ein EM Signal, vorzugsweise ein Hochfrequenzsignal zur Datenspeicher vorrichtung übertragen. Die Antenne oder ein anderes Empfangsmittel in der Vorrichtung stellt das Signal fest und überträgt es zum Speicher, wobei die Daten in den Speicher geschrieben und an einem Speicherort abgelegt werden.
Das gegenwärtig bevorzugte manuelle System schließt einen Transponder ein, z. B. den BMDS oder IDTAG^TM Transponder, und verwendet die passende Lese- und Schreibvorrichtung, die rekonfiguriert und erneut verpackt wurde, wie in 17, beschrieben in den BEISPIELEN. Ein Beispiel für den Betrieb des Systems von 17 wird in 18 dargestellt und in BEISPIEL 4 beschrieben. Kurz gesagt stellt der Anwender ein Mikrogefäß 180 manuell in die Einbuchtung 176, so dass das Abfragesignal 185 den Reglern eine Antwort liefert, welche die Anwesenheit des Mikrogefäßes anzeigt, und Informationen werden vom Transponder gelesen oder in ihn geschrieben.
Dies wird Mikrogefäße einschließen, wie MICROKANS^TM oder MICROTUBES^TM, Lese/Schreib Hardware (wie die, die von BMDS oder IDTAG^TM erhältlich ist) verbunden mit einem PC und Software, die auf dem PC läuft, welche die Benutzeroberfläche und die Systemkontrollfunktion ausführt. Die Software ist so ausgestaltet, dass sie eine Reihe von Aspekten von synthetischen kombinatorischen Bibliotheken fördert, einschließlich Organisierung, Planung und Design, Bestimmung von Formeln der Synthesekomponenten, Molekulargewichtsberechnung, Berichten von Plänen, Stand und Ergebnissen.
Insbesondere erzeugt die Software für jede chemische Bibliothek einen Datenbankordner. Dieser Ordner enthält all die zur Bibliothek gehörigen Informationen, einschließlich zu verwendender chemischer Bausteine, des Designs der Bibliothek in Bezug auf Schritte und Aufteilungen, und welche Synthese durchgeführt worden ist. Dieser Ordner-orientierte Ansatz ermöglicht es, dass viele verschiedene chemische Bibliotheksprojekte gleichzeitig ausgeführt werden. Die Software ermöglicht es dem Anwender festzulegen, welche chemischen Bausteine verwendet werden sollen und deren Molekulargewichte. Der Anwender legt die Anzahl der Schritte, die Anzahl der Aufteilungen nach jedem Schritt, und welche chemischen Bausteine bei jeder Aufteilung verwendet werden sollen, fest. Der Anwender kann auch den Namen der pharmakologischen Wirkgruppe und ihr Molekulargewicht eingeben. Zusätzlich kann der Anwender graphische, chemische Diagramme für die Bausteine und die pharmakologische Wirkgruppe festlegen. Diese Informationen sind nützlich beim Zeigen der sich ergebenden Verbindungen. Die Software zeichnet alle der obigen „Design"-Informationen auf, berechnet und zeigt die Größe der Bibliothek, und kann auch den Bereich der Molekulargewichte der sich ergebenden Verbindungen voraussagen.
Bevor die Synthese beginnt, werden die Mikrogefäße mit Polymerharz gefüllt. Die Mikrogefäßvorrichtungen werden eine nach der anderen auf den Scanner gestellt. Die Vorrichtung und Software liest den Inhalt der Daten, die codiert sind in der Aufzeichnungsvorrichtung, Transponder wie dem BMDS oder IDTAG^TM, enthalten in jedem Mikrogefäß. Die Software wählt aus, welcher Baustein zu der Verbindung, die in jedem Mikrogefäß enthalten ist, hinzugefügt werden soll. Sie weist den Sender/Empfänger an die codierten Daten in den Transponder zu schreiben, anzeigend um welchen Baustein es sich handelt. Die Software zeigt eine Meldung, die den Anwender anweist, dass Mikrogefäß in das entsprechende Reaktionsgefäß zu stellen, so dass der gewählte Baustein hinzugefügt wird. Dieses Verfahren wird vielfach mit jedem Mikrogefäß wiederholt und für jeden Syntheseschritt der geplanten Schritte der Bibliothek.
Die Software verwendet dann den Scanner um eine Markierung zu lesen und seine codierte Information zu empfangen. Unter Verwendung der vom Anwender eingegebenen Verbindungsnamen, die in der Datenbank der Bibliothek gespeichert sind, übersetzt die Software die codierte Information in die Namen der chemischen Bausteine. Die Software kann Verbindungen auch graphisch darstellen, unter Verwendung der graphischen Information, die der Anwender festgelegt hat. Die Software berechnet das Molekulargewicht der Verbindungen aus den Daten, die für die pharmakologische Wirkgruppe und die Bausteine bereitgestellt werden. Die Software erleichtert die Aufzeichnung des Fortschritts durch das obigen Verfahren, erzeugt dann Darstellungen und Berichte, die dies und all die obige Planung, Design, Verbindungsdaten und graphische Abbildungen der Verbindungen darstellen.
E. Anwendungen unter Verwendung von Matrizes mit Speicher
1. Szintillationsproximitätstests (SPAs) und Szintillationsmittel-enthaltende Matrizes mit Speicher
Szintillationsproximitätstests (SPAs) bezeichnen homogene Tests, in denen quantifizierbare Lichtenergie erzeugt wird und im Bezug steht zur Menge von radioaktiv markierten Produkten im Medium. Das Licht wird erzeugt durch ein Szintillationsmittel, das eingebaut, imprägniert oder in anderer Weise Teil einer Trägermatrix ist. Die Trägermatrix wird beschichtet mit einem Rezeptor, Liganden oder einem anderen Einfangmolekül, das spezifisch an einen radioaktiv markierten Analyten binden kann, wie einem Liganden.
Speicher mit Matrizes zur Verwendung in Szintillationsproximitätstests (SPA) werden durch Assoziieren eines Speichers mit einer Matrix, die ein Szintillationsmittel enthält, hergestellt. In der einfachsten Ausführungsform werden Matrixpartikel mit Szintillationsmittel (Fluoromikrokugeln) von Amersham, Packard, NE Technologies ((früher Nuclear Enterprises, Inc.) San Carlos, CA) oder einer anderen solchen Quelle gekauft, und mit einem Speicher assoziiert, wie durch Einschließen von einer oder mehreren solcher Kügelchen in einem Mikrogefäß mit einer Aufzeichnungsvorrichtung. Typischerweise sind solche Kügelchen, wie gekauft, derivatisiert und beschichtet mit ausgewählten Anteilen, wie Streptavidin, Protein A, Biotin, Weizenkeim-Agglutinin (WGA), und Polylysin. Ebenfalls erhältlich sind anorganische Fluoromikrokugeln basierend auf Cer-dotiertem Yttriumsilikat oder Polyvinyltoluol (PVT). Diese enthalten Szintillationsmittel und können beschichtet und derivatisiert werden. Solche Kügelchen werden hier „lumineszierende Matrizes mit Speicher" genannt und wenn sie in SPA Formaten verwendet werden, als „Szintillationsmatrizes mit Speicher" bezeichnet.
Die sich ergebenden Matrizes mit Speicher-Partikel mit verbundenen Molekülen oder biologischen Partikeln können zu jeder Anwendung verwendet werden, für die SPA geeignet ist. Solche Anwendungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Radioimmun-Tests, Rezeptorbindungs-Tests, Enzym-Tests, und Zellbiochemie-Tests.
2. Nukleinsäure-Sequenzierung
Frühere Verfahren, die verwendet wurden um DNA-Synthese zu erreichen, haben mikroskopische Anordnungen von Nukleotid-Oligomeren, die auf kleinen Silizium-basierten Chips synthetisiert wurden, eingeschlossen. Es ist schwierig solche Anordnungen zu synthetisieren und die Qualität der großen Zahl von Punkten auf jedem Chip (ungefähr 64.000 Punkte für 8-mer Oligonukleotide, die Zahl, die notwendig ist um Sequenzierung durch Hybridisierung zu erreichen) zu kontrollieren. Im vorliegenden Verfahren wird jedes Oligonukleotid unabhängig auf einem Satz von individuellen Chips synthetisiert, diese Chips werden auf Richtigkeit und Reinheit ihrer jeweiligen Oligomere getestet, dann wird ein Chip aus jedem Satz zu einem großen Gemisch zugefügt, das Oligomere enthält, die alle möglichen Sequenzen aufweisen. Nach Hybridisierung im Batchverfahren mit dem Gensegment, das sequenziert werden soll, normalerweise amplifiziert durch ein Verfahren wie PCR unter Verwendung geeigneter Primer, und markiert mit einer nachweisbaren, z. B. fluoreszierender Markierung, können die Chips durch einen Detektor geleitet werden, wie oben beschrieben zum Verarbeiten von Vielfachtests, einschließlich Vielfach-Immuntests, und der Grad der Bindung an jedes Oligomer kann bestimmt werden. Nachdem die Charge verschiedenen Graden von Dissoziierungsbedingungen ausgesetzt wurde, können die Vorrichtungen erneut auf den Grad der Bindung getestet werden, und die Stärke der Bindung zu verwandten Sequenzen wird die Sequenz des Gensegments offenbaren (siehe, z. B. internationale PCT Anmeldung WO 95/00530).
F. Anwendungen der Speicher mit Matrizes und lumineszierende Matrizes mit Speicher in kombinatorischen Synthesen und Herstellung von Bibliotheken
Bibliotheken von verschiedenen Molekülen sind entscheidend für die Identifizierung neuer Pharmazeutika. Eine Diversitätsbibliothek weist drei Bestandteile auf: feste Trägermatrix, Linker und Synthesetarget. Der Träger ist ein Matrixmaterial wie hier beschrieben, das stabil gegenüber einem weitem Bereich von Reaktionsbedingungen und Lösungsmitteln ist; der Linker ist selektiv spaltbar und lässt kein funktionalisiertes Anhängsel an dem Synthesetarget zurück; und das Target wird mit hoher Ausbeute und Reinheit synthetisiert. Besonders bevorzugte Bibliotheken sind kombinatorische Bibliotheken, die Matrizes mit Speicher enthalten, die Hochfrequenzen zum Lesen und Schreiben einsetzen.
1. Oligomer- und Polypeptidbibliotheken
a. Bio-Oligomerbibliotheken
Ein beispielhaftes Verfahren zum Herstellen einer Bibliothek (siehe US Patent Nr. 5,382,513) schließt ein das Wiederholen der Schritte von (1) Bereitstellen von mindestens zwei Aliquots eines Festphasenträgers; getrenntes Einführen eines Satzes von Untereinheiten in die Aliquots des Festphasenträgers; vollständiges Koppeln der Untereinheiten mit im wesentlichen allen Stellen des Festphasenträgers um eine Festphasenträger/neue-Untereinheit-Kombination zu bilden, Einschätzen der Vollständigkeit der Kopplung und, wenn notwendig, die Reaktion zur Vollständigkeit zwingen; gründlich Mischen der Aliquots der Festphasenträger/neue-Untereinheit-Kombination; und nach Wiederholen der vorstehenden Schritte für ein gewünschte Zahl, Entfernen der Schutzgruppen so dass das Bio-Oligomer mit dem Festphasenträger verbunden bleibt. In einer Ausführungsform kann die Untereinheit eine Aminosäure sein, und das Bio-Oligomer kann ein Peptid sein. In einer anderen Ausführungsform kann die Untereinheit ein Nukleosid sein, und das Bio-Oligomer kann ein Oligonukleotid sein. In einer weiteren Ausführungsform ist das Nukleosid Desoxyribonukleinsäure; in noch einer weiteren Ausführungsform ist das Nukleosid Ribonukleinsäure. In einer weiteren Ausführungsform kann die Untereinheit eine Aminosäure, Oligosaccharid, Oligoglykosid oder ein Nukleosid sein, und das Bio-Oligomer kann eine Peptid-Oligonukleotid-Chimäre oder andere Chimäre sein. Jeder Festphasenträger ist an einer einzelnen Art von Bio-Oligomer befestigt und alle möglichen Kombinationen von Monomer-(oder Multimer in bestimmten Ausführungsform) Untereinheiten, aus denen sich die Bio-Oligomere zusammensetzen, sind in der Sammlung enthalten.
Beim Ausführen dieses Verfahrens hier weist die Trägermatrix eine Aufzeichnungsvorrichtung mit programmierbarem Speicher auf, die eingeschlossen, verbunden oder auf andere Weise am Matrixmaterial befestigt ist, und bei jedem Schritt in der Synthese ist die Trägermatrix, an der das entstehende Polymer befestigt ist, programmiert die Identität der Untereinheit aufzuzeichnen, die zugefügt wird. Bei der Beendigung der Synthese jedes Biopolymers werden die sich ergebenden Biopolymere, die mit den Trägern verbunden sind, gemischt.
Nach dem Mischen wird ein Akzeptormolekül oder Substratmolekül von Interesse zugefügt. Das Akzeptormolekül ist eines, dass an eine oder mehrere Arten von Festphasenmatrizes mit Speicher/Bio-Oligomer innerhalb der Mischung bindet, oder das Substratmolekül wird eine chemische Reaktion durchmachen, die durch eine oder mehrere Arten von Festphasenmatrizes mit Speicher/Bio-Oligomer innerhalb der Bibliothek katalysiert wird. Die sich ergebenden Kombinationen, die an das Akzeptormolekül binden oder eine Reaktion katalysieren, werden ausgewählt. Der Speicher in der Matrix- Speicher-Kombination wird gelesen und die Identität der Art des aktiven Bio-Oligomers wird bestimmt.
b. Sequentielle Synthese auf aufgeteilten Kügelchen
Verschiedene Schemata für Synthese von Polymeren (1), Peptiden (2), Nukleinsäuren (3) und organischen Molekülen, die auf einem Monomer einer pharmakologischen Wirkgruppe basieren (4) auf aufgeteilten Kügelchen werden bereitgestellt. Ausgewählte Matrizes mit Speicher-Partikel werden in einem geeigneten Abtrennungssystem platziert, wie einem Trichter (siehe 5). Nach jedem Syntheseschritt wird jedes Partikel gescannt (d. h. gelesen) wenn es am RF Sender vorbeikommt und Informationen, welche die hinzugefügte Komponente oder Klasse von Komponenten identifiziert werden im Speicher gespeichert. Für jede Art von Synthese kann ein Code programmiert werden (d. h. eine 1 an Position 1,1 im Speicher könnte beispielsweise Alanin an der ersten Position im Peptid darstellen). Ein zentraler Computer oder Decodierer/Codierer wird programmiert das entsprechende Signal an einen Sender zu senden, woraus sich ergibt, dass die entsprechende Information im Speicher gespeichert wird (d. h. für Alanin als Aminosäure 1 wird eine 1 an Position 1,1 gespeichert). Wenn gelesen, kann der zentrale Computer oder Decodierer/Codierer das Signal interpretieren, das aus dem Speicher gelesen und übertragen wurde.
In einer beispielhaften Ausführungsform werden eine ausgewählte Anzahl von Kügelchen (d. h. Matrixpartikel verbunden mit Aufzeichnungsvorrichtungen) ausgewählt und vorbereitet. Die Kügelchen werden dann in Gruppen, abhängig von der Anzahl der Wahlmöglichkeiten für die erste Komponente des Moleküls, und in eine Anzahl von Behältern aufgeteilt, die gleich ist oder geringer (für vereinigtes Screening, ineinandergesetzte (engl. „nested") Bibliotheken und andere solche Verfahren) ist, als die Anzahl der Wahlmöglichkeiten.
Die geeigneten Reagenzien und Monomer werden zugefügt zu jedem Behälter und die Kügelchen im ersten Behälter werden mit elektromagnetischer Strahlung gescannt um Information zu übertragen, und den Speicher zu codieren das erste Monomer zu identifizieren. Die Kügelchen im zweiten Behälter werden ebenso behandelt. Die Kügelchen werden dann vereinigt und getrennt, gemäß dem kombinatorischen Protokoll, und bei jeder Stufe von zugefügtem Monomer wird jede getrennte Gruppe markiert durch Eingeben von Daten, die spezifisch für das Monomer sind. Am Ende des Syntheseprotokolls weist jedes Kügelchen ein angeheftetes Oligomer auf und hat Informationen, die das Oligomer identifizieren, im Speicher gespeichert in einer Form, die abgerufen und decodiert werden kann, um die Identität jedes Oligomers zu zeigen.
2. Protokolle für „ineinandergesetzte" kombinatorische Bibliotheken
Bei dieser Art von Protokoll werden Bibliotheken von Unterbibliotheken durchsucht, und eine Unterbibliothek für weiteres Screening ausgewählt. Bei diesem Verfahren wurden drei Sätze von Monomeren aus kommerziell erhältlichen Monomeren ausgewählt, ein Satz von vier aromatischen, hydrophoben Monomeren, ein Satz von drei hydroxilischen Monomeren, ein Satz von siebzehn verschiedenen Monomeren und drei N-Termini wurden ausgewählt. Die Auswahl basierte auf einer Analyse des Target-Rezeptors und bekannten Liganden. Eine Bibliothek, die achtzehn Mischungen enthielt, hergestellt aus den sechs Permutationen der drei Monomersätze, mal drei N-Termini wurde hergestellt. Jede Mischung von allen Kombinationen der drei Sätze von Aminen, vier Sätzen von hydrophoben Monomeren und siebzehn verschiedenen Monomeren wurde dann getestet. Die wirksamste Mischung wurde ausgewählt zur Dekonvolution durch Synthese von Gruppen von kombinatorischen Mischungen, der Komponenten der ausgewählten Gruppe. Dieses Verfahren wurde wiederholt bis individuelle Verbindungen ausgewählt waren.
Die folgenden Beispiele sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken enthalten und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIEL 1
Formulierung eines Polystyrolpolymers auf Glas und Derivatisierung von Polystyrol
Eine Glasoberfläche jeder Konformation (Kügelchen für beispielhaften Erläuterungszwecke (1)), die eine ausgewählte Speichervorrichtung enthält, welche die Vorrichtung überschichtet, oder die in der Nähe der Vorrichtung verwendet, oder die nachfolgend mit der Vorrichtung verbunden werden kann, wird mit einer Schicht von Polystyrol beschichtet, das so derivatisiert ist, dass es einen spaltbaren Linker enthält, wie einen Säure-spaltbaren Linker. Um eine solche Beschichtung zu erzielen, wird zum Beispiel ein Kügelchen mit einer Schicht von einer Lösung aus Styrol, chlormethyliertem Styrol, Divinylbenzol, Benzoylperoxid (88/10/1/1/, molares Verhältnis) beschichtet und bei 70°C für 24 Std. erhitzt. Das Ergebnis ist ein kreuzvernetztes chloromethyliertes Polystyrol auf Glas (2). Behandlung von (2) mit Ammoniak (2 M in 1,4-Dioxan, über Nacht) erzeugt aminomethylierte beschichtete Kügelchen (3). Die Aminogruppe auf (3) wird mit Polyethylenglycol-dicarboxymethylether (4) (n >> 20) unter Standardbedingungen (PyBop/DIEA) verbunden, um Carboxylsäure-derivatisierte Kügelchen zu erhalten (5). Verbinden von (5) mit modifiziertem PAL-linker (PAL ist Pyridylalanin) unter den gleichen Bedingungen erzeugt ein Kügelchen, das mit Polystyrol beschichtet ist, welches einen Säure-spaltbaren Linker (7) aufweist.
Die sich ergebenden beschichteten Kügelchen mit Speicher werden dann als fester Träger für molekulare Synthesen oder zum Verbinden mit jedem gewünschten Substrat verwendet.
BEISPIEL 2
MIKROGEFÄßE
A. 11–13
11–13 erläutern eine Ausführungsform eines Mikrogefäßes 20, das hier bereitgestellt wird. Das Mikrogefäß 20 ist ein allgemein verlängerter Körper mit Wänden 22 aus porösem oder semipermeablen, nicht-reaktivem Material, die an beiden Enden mit einer oder mehreren Verschlussbaugruppen aus festem Material 42, 44 verschlossen sind. Das Mikrogefäß 20 hält teilchenförmige Matrixmaterialien 40 und einen oder mehrere Aufzeichnungsvorrichtungen 34 zurück. In der in 11–13 erläuterten, bevorzugten Ausführungsform schließt die Aufzeichnungsvorrichtung eine Hülle 36 ein, die undurchlässig für die Verarbeitungsschritte oder Lösungen ist, mit denen das Mikrogefäß in Kontakt kommen könnte, aber die das Senden von elektromagnetischen Signalen erlaubt, einschließlich Hochfrequenz, magnetischer oder optischer Signale, zu und von den Aufzeichnungsmedien der Aufzeichnungsvorrichtung.
Das bevorzugte Mikrogefäß 20 ist im allgemeinen zylindrisch geformt, und weist zwei Verschlussbaugruppen aus festem Material 42, 44 auf. Die Verschlussbaugruppe kann aus jedem Material gebildet werden, das nicht-reaktiv ist gegenüber den Lösungen mit denen das Mikrogefäß in Kontakt kommen wird. Solche geeigneten Materialien schließen zum Beispiel ein Plastik, Polytetrafluorethylen (hier nachfolgend PTFE) oder Polypropylen. Jede Verschlussbaugruppe 42, 44 schließt vorzugsweise eine Trägerbasis 26 beziehungsweise 28 und einen Endverschluss 24 beziehungsweise 30 auf. Jede Trägerbasis 26, 28 ist dauerhaft an den Wänden 22 des Gefäßes befestigt durch bekannte Mittel wie Verbinden mit geeigneten Klebemitteln oder Hitzebehandlung, entweder durch Schrumpfen des Wandmaterials durch Hitze auf die unteren Anteile der Trägerbasen 26, 28 oder durch Fusionieren des Wandmaterials mit dem Trägerbasismaterial.
Vorzugsweise ist mindestens einer der Verschlüsse 24, 30 entfernbar an seiner Verschlussbasis 26 befestigt, zum Beispiel durch Bereitstellen von komplementären Gewinden an der Trägerbasis und dem Endverschluss, so dass der Endverschluss in die Trägerbasis geschraubt werden kann, wie in 12 erläutert. Andere mögliche Mittel zum Befestigen des Endverschlusses an der Trägerbasis werden für den Fachmann offensichtlich sein und können unter anderem Sprengringe (engl.: „snap rings"), Federlaschen (engl.: „spring tabs"), und Bajonettverbindungselemente einschließen. Der Endverschluss 24 weist ein oder mehrere Schlitze, Bohrungen oder Aussparungen 32 auf, gebildet in seiner äußeren Oberfläche, um Entfernen oder Ersetzen durch die Finger des Anwenders und/oder unter Verwendung eines geeigneten Werkzeugs zu erleichtern. Für das erläuterte Beispiel kann ein Schlüssel, der Stifte im gleichen Abstand wie die Aussparungen 32 aufweist, verwendet werden durch Einstecken der Stifte in die Aussparungen. Für einen einzelnen Schlitz kann Entfernen und Ersetzen des Endverschlusses durch Verwenden eines Schraubendrehers erreicht werden. Hervorstehende Nasen, Ränder, gerändelte Kanten oder andere Mittel zum Verstärken der Fähigkeit den Endverschluss zu greifen, können zum manuellen Zusammensetzen/Auseinanderbauen des Mikrogefäßes verwendet werden. Die Verschlussbaugruppe 42, am gegenüberliegenden Ende des Mikrogefäßes, kann dauerhaft verschlossen werden, unter Verwendung eines Klebemittels oder von Hitzebehandlung um die Trägerbasis 28 an den Endverschluss 30 zu befestigen, oder die Verschlussbaugruppe 42 kann in einem Stück geformt werden, was die Trägerbasis 28 mit dem Endverschluss 30 verbindet.
Zurückgehalten werden innerhalb des Mikrogefäßes teilchenförmige Matrixmaterialien 40 und eine Speichervorrichtung 34. Die Aufzeichnungsvorrichtung 34, in der erläuterten bevorzugten Ausführungsform, schließt eine Datenspeichereinheit(en) 38 und eine Hülle 36 ein, welche die Aufzeichnungsvorrichtung 38 vor den Verfahrensschritten und/oder Lösungen schützt, denen die Mikrogefäße ausgesetzt sind. Diese Hülle 36 ist vorzugsweise aus Material konstruiert, das nicht-reaktiv gegenüber und undurchlässig für die Lösungen ist, mit denen das Mikrogefäß in Kontakt kommen könnte, und das durchlässig ist für elektromagnetische Strahlung oder ähnliche Mittel, die zum Lesen aus und Schreiben in die Speichervorrichtung verwendet werden. Die bevorzugte Vorrichtung ist gegenwärtig eine modifizierte Form des BMDS IPTT-100, die im allgemeinen einen elektrisch programmierbaren Speicherchip 130 und ein Decodierungs- und Energieumwandlungs-Schaltsystem 132, befestigt auf einer verlängerten keramischen Platine und verbunden mit einem LC Oszillator enthält, umfassend Kondensator 138 und Spule 136, die um einen Eisenkern gewickelt ist, welcher induktiv ein frequenzmoduliertes magnetisches Signal, das durch einen ähnlichen LC Oszillator in der Schreibvorrichtung erzeugt wird, empfängt und darauf antwortet, was der Vorrichtung ermöglicht aus der Ferne codiert und aus der Ferne gelesen zu werden, bei einer Entfernung in der Größenordnung von 1 cm oder weniger. Die Vorrichtung wurde aus der kommerziell erhältlichen Standardform des Herstellers modifiziert, um physikalische Abmessungen bereitzustellen, um das Stellen in das Mikrogefäß 20 zu erleichtern. Die Modifizierung schließt die Anwendung der einfachen und gut bekannten Beziehung zwischen Induktionskernfläche und -länge, der Permeabilität des Kernmaterials, der Anzahl von Windungen, d. h. L (Induktivität) = N²μA/ I, wobei N die Anzahl der Windungen, μ die Permeabilität des Kerns ist, A die Kernfläche ist und / die Kernlänge ist.
Andere aus der Ferne programmierbare und lesbare Markierungen, die in dem erfindungsgemäßen System verwendet werden können, sind kommerziell erhältlich, wie solche die durch Identification Device Technology, UK hergestellt werden. Diese Vorrichtungen weisen Schaltsystem- und Bedienungsparameter auf, ähnlich denen der oben beschriebenen Vorrichtung, es kann aber notwendig sein die Spule zu modifizieren, um den Zugriffsbereich auf weniger oder gleich 1 cm zu verringern. Es wird im allgemeinen bevorzugt, dass das Ansprechgerät, d. h. die Speichervorrichtung, und der Empfänger/Sender im Kontrollsystem vom gleichen Hersteller sind, um vollständige Kompatibilität sicherzustellen.
Das erläuterte Mikrogefäß, wie erläutert in 11–13, ist von einer ausreichenden Größe um mindestens eine Aufzeichnungsvorrichtung und ein Matrixpartikel, wie ein TENTAGEL^TM Kügelchen, zu enthalten. Die Vorrichtung ist typischerweise 20 mm lang (d. h. die größte Abmessung) oder kleiner, mit einem Durchmesser von ungefähr 5 mm oder weniger, obwohl andere Größen auch vorgesehen sind. Diese Größen sind ausreichend um von ungefähr 1 mg bis ungefähr 1 g Matrixpartikel zu enthalten, und daher der Bereich von ungefähr 1 mm bis zu 100 mm in der größten Abmessung, vorzugsweise ungefähr 15 bis 25 mm. Das Wandmaterial des Mikrogefäßes ist PFTE-Netz, das vorzugsweise eine Lochgröße von ungefähr 50 μM bis 100 μM, im allgemeinen 50 bis 70 μM aufweist, die kommerziell erhältlich ist. Die Größe ist natürlich so gewählt, dass sie ausreichend klein ist um die Matrixpartikel zurückzuhalten.
Das Matrixmaterial wird basierend auf der einzelnen Verwendung des Mikrogefäßes ausgewählt; zum Beispiel ein funktionalisiertes Harz, wie TENTAGEL^TM-Harz, wird zur Verwendung in Peptidsynthese und ähnlichen Verfahren bevorzugt. Das Matrixmaterial kann hier auch Fluorophoren und Szintillationsmittel einschließen.
B. 14–16
14–16 erläutern eine alternative Ausführungsform eines Mikrogefäßes, das hier bereitgestellt wird. Wie das Mikrogefäß, das in Beispiel 2 beschrieben wird, hält diese Ausführungsform des Mikrogefäßes teilchenförmige Matrixmaterialien und eine oder mehrere Aufzeichnungsvorrichtungen zurück (nicht gezeigt). Das Mikrogefäß weist einen Rahmen aus festem Material aus einem Stück 82 auf, einschließlich eines oberen Rings 84, zwei Stützrippen 88, 89, die sich diametral gegenüber liegen, und einen Bodenverschluss 86. Der Rahmen aus festem Material 82 kann aus jedem Material hergestellt werden, das nicht-reaktiv gegenüber den Lösungen ist, mit denen das Mikrogefäß in Kontakt kommt. Solche geeigneten Materialien schließen beispielsweise ein Plastik, PFTE, oder Polypropylen und die Bildung kann durch Formen oder maschinelles Herstellen aus dem gewählten Material erfolgen, wobei das erstere wegen der Wirtschaftlichkeit der Herstellung bevorzugt wird.
Die Seitenwand des Mikrogefäßes 98 wird aus porösem oder semipermeablen nicht-reaktivem Material gebildet, wie PFTE-Netz, das vorzugsweise eine 70 μM Porengröße aufweist. Die Seitenwand ist vorzugsweise am oberen Ring 84 und am unteren Verschluss 86 des Rahmens aus festem Material 82 befestigt. Solch eine Befestigung kann durch bekannte Mittel erfolgt sein, wie Verbinden mit geeigneten Klebern oder anderen Chemikalien oder Hitze, wobei Hitze bevorzugt wird.
In der Ausführungsform der 14–16, sind die beiden Stützrippen 88, 89 einander gegenüber positioniert, es kann jedoch jede Anzahl von Stützrippen, d. h. eine oder mehrere bereitgestellt werden. Die Seitenwand 98 des Mikrogefäßes braucht nicht vollständig an den Stützrippen 88, 89 befestigt sein, das Formungsverfahren durch das die Mikrogefäße gebildet werden, kann jedoch zur Befestigung an allen Kontaktpunkten zwischen dem Rahmen und der Seitenwand führen.
Bei einem bevorzugten Herstellungsverfahren wird das Seitenwandmaterial, ein flaches Blatt aus Netz, zu einem Zylinder gerollt und in die Form gelegt. Das Rahmenmaterial wird in die Form um das Netz eingespritzt, was bewirkt, dass der Rahmen an allen Kontaktpunkten mit dem Netz fusioniert, und was die Ränder des Netzes verschließt um den Zylinder zu schließen.
In der Ausführungsform, dargestellt in 14-15, ist das Mikrogefäß mit einem entfernbaren Endverschluss 90 ausgestaltet. Der Endverschluss 90 wird vorzugsweise aus dem gleichen Material hergestellt wie der Rahmen aus festem Material 82. Ein Sprengring oder wie dargestellt, vorspringende Teile 92, 94 erstrecken sich von der inneren Oberfläche des Endverschlusses 90 nach unten. Die vorspringenden Teile 92, 94 weisen eine Flansch auf, die in eine Grube 96 passt, welche sich in der inneren Wand des oberen Rings 84 bildet, wenn sie in den oberen Ring gepresst wird um den Endverschluss 90 abnehmbar auf dem Mikrogefäß 80 zu befestigen. Wie offensichtlich sein wird, können auch andere Mittel zum abnehmbaren Befestigen des Endverschlusses 90 am oberen Ring 84 verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, jenen Alternativen, die für die Ausführungsform von 11–13 angegeben wurden. Die Abmessungen variieren, wie beschrieben für das Mikrogefäß von 11–13 oder anderswo hierin.
In anderen Ausführungsformen werden die Gefäße in jeder gewünschten oder geeigneten Geometrie hergestellt, wie konischen Formen. Sie können an einem Ende fest sein und benötigen nur einen einzelnen Verschluss oder verschließbares Ende.
Diese Mikrogefäße werden vorzugsweise wie folgt hergestellt. Die festen Anteile, wie der feste Verschluss und Körper, werden aus einem Polypropylenharz oder Moplen-Harz hergestellt. Der Netzanteil wird aus einem Polypropylen-Polyester-, Polyethylen- oder Fluorophoren-enthaltendem Netz hergestellt (z. B. PROPYLTEX^®, FLUOROTEX^®, und anderen solchen Netzen, einschließlich Kat. Nr. 9-70/22 erhältlich von TETKC^® Inc., Briarcliff Manor, NY, die gewebte Screening Medien, Polypropylennetz, ETF-Netz, PFTE-Netz, Polymere von W. L. Gore herstellen. Die Poren sind von jeder geeigneten Größe (typischerweise ungefähr 50–100 μM, abhängig von der Größe des teilchenförmigen Matrixmaterials) die Kontakt zwischen den Synthesekomponenten im Medium erlaubt, aber die teilchenförmigen Matrixpartikel zurückhält.
BEISPIEL 3
Herstellung einer Bibliothek und Codieren der Matrizes mit Speicher
Eine Mischung der Matrizes mit Speicher wurde auf zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde dann angesprochen und schreibcodiert mit einem einzigartigem Hochfrequenzsignal entsprechend dem Baustein, in diesem Fall einer Aminosäure, der dieser Gruppe zugefügt werden sollte.
Die Matrizes mit Speicher wurden dann vereinigt und gemeinsame Reaktionen und Manipulationen, wie Waschen und Trocknen wurden durchgeführt. Die Mischung wurde dann erneut aufgeteilt und jede Gruppe wurde mit einem zweiten Satz von Hochfrequenzsignalen codiert, die dem nächsten Satz von Bausteinen, der eingefügt werden soll, entsprechen, und die Reaktionen wurden entsprechend durchgeführt. Dieses Verfahren wurden wiederholt bis die Synthese beendet war. Die Halbleitervorrichtungen zeichneten auch Temperatur auf, und können so modifiziert werden, dass sie andere Reaktionsbedingungen und Parameter für jeden Syntheseschritt zur Speicherung und späterem Abrufen aufzeichnen.
Sechsundneunzig Matrizes mit Speicher wurden verwendet um eine 24-teilige Peptidbibliothek herzustellen, unter Verwendung einer 3 × 2 × 2. × 2 „Teilen-und-Vereinigen" Strategie. Die Reaktionen, Standard-Fmoc-Peptidsynthesen wurden getrennt mit jeder Gruppe durchgeführt. Alle Reaktionen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt; Fmoc-Entschützungsreaktionen wurden 0,5 Std. laufen gelassen; Bindungsschritte wurden für 1 Std. laufen gelassen; und Spaltung für 2 Std. Diese Anzahl wurde gewählt um statistisch die Bildung einer 24-teiligen Bibliothek sicherzustellen.
Jede Matrix mit Speicher in der 96-teiligen Mischung wurde unter Verwendung einer spezifisch ausgestalteten Hochfrequenzspeicher-Abrufvorrichtung decodiert, um die Peptide auf jeder Matrix mit Speicher zu identifizieren (Tabelle 2). Die strukturelle Identität jedes Peptids wurde durch Massenspektroskopie und ¹H-NMR-Spektroskopie bestätigt. Der Peptidinhalt in jeder nicht-verarbeiteten Probe wurde durch HPLC bestimmt, vor jeder Aufreinigung über 90% zu liegen, und konnte durch Standard-Chromatographietechniken weiter erhöht werden.
Anmerkung: HPLC-Bedingungen: Shimadzu SCL 10A mit einer MICROSORB-MV^TM C-18 Säule (5 μM, 100 Ǻ; isokratische Elution mit Acetonitril/Wasser.
BEISPIEL 4
Synthese einer Dekapeptid-Bibliothek
Material und Methoden
(1) Eine Speichervorrichtung (BMDS IPTT-100), die 8 × 1 × 1 mm groß ist, und TENTAGEL^® Kügelchen (20 mg) wurden unter Verwendung einer porösen Membranwand eingekapselt und verschlossen (Endgröße >> 10 × 2 × 2 mm). Im Einzelnen enthielt jedes Matrix mit Speicher-Mikrogefäß 20 mg TENTAGEL^®-Harz, das den säurespaltbaren Linker PAL trug.
(2) Lösungsmittel und Reagenzien (DMF, DCM, MeOH, Fmoc-Aminosäuren, PyBOP, HATU, DIEA, und anderen Reagenzien) wurden verwendet wie erhalten. Massenspektren wurden auf einem API I Perkin Elmer SCIEX Massenspektrometer unter Verwendung von Elektrospray-Probenzufuhr aufgezeichnet. HPLC wurde mit einem Shimadzu SCL 10A mit einer AXXIOM C-18 Säule (5 μM, 100 Ǻ; Gradient: 0–20 Min., 25–100% Acetonitril/Wasser (0,1% TFA). UV-Spektren wurden auf einem Shimadzu UV-1601 Gerät aufgezeichnet. Peptidsequenzierung wurde unter Verwendung eines Beckmann Modell 6300 Aminosäure-Analysegeräts durchgeführt. Chemikalien, Lösungsmittel und Reagenzien wurden von den folgenden Firmen erhalten: Aminosäure-Derivate (CalBiochem); Lösungsmittel (VWR); Reagenzien (Aldrich-Sigma).
(3) Allgemeines Verfahren für Fmoc-Aminosäure-Kopplung
Die Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden in eine Flasche mit flachem Boden gestellt. Ausreichend DMF (v_r ml, 0,75 ml pro Mikrogefäß) um vollständig alle Matrix mit Speicher-Mikrogefäße zu bedecken wurde hinzugefügt. Fmoc Aminosäuren, EDIA, and PyBOP (oder HATU für die gehinderten Aminosäuren Pro und Ile) wurden nacheinander zugefügt, mit Endkonzentrationen von 0,1, 0,2, beziehungsweise 0,1 M. Die Flasche wurde verschlossen und sanft bei Umgebungstemperatur für 1 Std. geschüttelt. Die Lösung wurde entfernt und die Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden mit DMF (4 × v_r) gewaschen und denselben Kopplungsbedingungen mit der halben Menge der Reagenzien erneut ausgesetzt. Sie wurden mit DMF (4 × v_r), MeOH (4 × v₄), DCM (4 × v₄) zum letzten Mal gewaschen, und unter Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet.
(4) Fmoc-Entschützung
Die Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden in eine Flasche mit flachem Boden gestellt. Ausreichend 20% Piperidinlösung in DMF (v_r ml, 0,75 ml/Matrix mit Speicher-Mikrogefäß) um die Mikrogefäße vollständig zu bedecken wurde hinzugefügt. Die Flasche wurde verschlossen und sanft bei Umgebungstemperatur für 30 Min. geschüttelt. Aliquots wurden entnommen, und die UV-Absorption der Lösung wurde bei 302 nm gemessen um die Fmoc-Zahl zu bestimmen. Die Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden dann mit DMF (6 × v_r) und DCM (6 × v_r) gewaschen und unter Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet.
(5) Verfahren zur Abspaltung von Peptid vom festen Träger
Die TENTAGEL® Kügelchen (20–120 mg) aus jedem Matrix mit Speicher-Mikrogefäß wurden mit 1 ml TFA-Spaltungsmischung (EDT : Thioanisol : H₂O : PhOH : TFA, 1,5 : 3 : 3 : 4,5 : 88, w/w) bei Umgebungstemperatur für 1,5 Std. behandelt. Die Harzkügelchen wurden durch Filtration durch einen Glaswollestopfen entfernt, die Lösung wurde konzentriert, mit Wasser (2 ml) verdünnt, mit Diethylether (8 × 2 ml) extrahiert und lyophilisiert, um das Peptid als weißes Pulver zu erhalten (4–20 mg).
(6) Herstellung polyklonaler Antikörper
Das Peptid (SEQUENZ ID Nr. 25) mit einem Cystein am N-Terminus wurde durch Standard-Festphasesyntheseverfahren unter Verwendung eines automatischen Applied Biosystems 430A Peptidsynthesegerätes synthetisiert. Das synthetische Peptid wurde mit Schlüsselloch-Napfschnecken (engl.: „Keyhole limpet") Hämocyanin unter Verwendung von Maleimidohexanoyl-N-Hydroxysuccinimid als Kreuzvernetzungsagens konjugiert. Kaninchen wurden mit 500 μg Peptid, das in kompletten Freundschen Adjuvans emulgiert war, an mehreren dorsalen intradermalen Stellen injiziert. Die Tiere wurden regelmäßig in 3–6 Wochen Intervallen mit 200 μg des in inkompletten Freundschen Adjuvans emulgierten Peptidkonjugats erneut geimpft. Der Titer des Antiserums betrug nach wenigen Auffrischungsinjektionen ungefähr 1 : 50.000 bis 1 : 100.000, wie bestimmt durch ELISA unter Verwendung des nicht-konjugierten Peptids als dem Antigen.
(7) Enzym-gekoppelter Immunoabsorptionstest (ELISA)
Platten wurden mit 100 μl/Vertiefung von einer 0,5 μg/μl Lösung des Peptids verdünnt in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) beschichtet, dadurch dass man sie über Nacht bei 4°C inkubierte. Die Platten wurden gründlich mit PBS gewaschen und mit 200 μl 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann mit PBS gewaschen und 100 μl Blut, das vor der Immunisierung abgenommen wurde, oder Kaninchen anti-Peptidantikörper (Peptid von SEQ ID NO 25)(1 : 100.000) wurde den Duplikatvertiefungen zugefügt. Nach einer 1 Std.-Inkubation bei Umgebungstemperatur wurden die Platten mit PBS gewaschen und 100 μl Peroxidase-Ziegen-anti-Kanninchen-IgG verdünnt in PBS, ergänzt mit 0,1% BSA wurden hinzugefügt. Nach Inkubation für eine weitere Stunde bei Umgebungstemperatur wurden die Platten gründlich mit PBS gewaschen und 100 μl Peroxidasesubstratlösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Platten wurden dann für 15 Min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Peroxidasereaktion wurde durch den Anstieg der Absorption bei 405 nm gemessen.
Die Bibliothek
Die Bibliothek schloss das Peptid, das die Sequenz Met-Leu-Asp-Ser-Ile-Trp-Lys-Pro-Asp-Leu (MLDSIWKPDL; SEQ ID NO 25) aufweist, ein, gegen die ein Antikörper in Kaninchen hergestellt wurde (das Peptid, das für die Kaninchen verwendet wurde, wies zur Verbindung einen zusätzlichen N-terminalen Cys-Rest auf) und sieben andere Peptide, die sich an den Resten L, P und/oder I (SEQ ID NO 26–32 und das Schema, das in 10 bekannt gegeben wurde) unterscheiden.
Die mit TENTAGEL^® Kügelchen, die PAL-Linker (jeweils 20 mg) tragen, beladenen Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe wurde mit dem Hochfrequenzcode L oder A (die Einbuchstabensymbole für die Aminosäuren Leucin beziehungsweise Alanin) codiert und die erste Kopplung wurde getrennt durchgeführt, unter Verwendung von Fmoc-Leu-OH oder beziehungsweise Fmoc-Ala-OH und ByBOP, oder HATU für die sterisch gehinderten Aminosäuren (SCHRITT 1, FIGUR 10). Die Mikrogefäße wurden dann zusammengegeben, mit 20% Piperidin in DMF entschützt (Entfernung von Fmoc), mit dem Code D codiert und einer Kopplung mit Fmoc-Asp(OtBu)-OH und Entschützung wie oben ausgesetzt (SCHRITT 2). Die Mikrogefäße wurden dann erneut aufgeteilt in zwei gleiche und völlig zufällige Gruppen und eine Codierung wurde mit beiden Gruppen durchgeführt mit den Codes P oder F, und Aminosäurederivate Fmoc-Pro-OH beziehungsweise Fmoc-Phe-OH wurden gekoppelt (SCHRITT 3). Die Mikrogefäße wurden erneut zusammengegeben und Aminosäurederivate Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Trp(Boc)-OH wurden nacheinander gekoppelt, mit geeigneten Codierungs- und Entschützungsverfahren (SCHRITTE 4 und 5), und dann erneut in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt, entsprechend codiert und die Aminosäurederivate Fmoc-Ile-OH oder Fmoc-Gly-OH wurden getrennt angekoppelt (SCHRITT 6). Die Matrix mit Speicher-Mikrogefäße wurden zusammengegeben, die Aminosäuren entschützt und die verbliebenen Aminosäuren (Ser, Asp, Leu und Met) wurden nacheinander mit geeigneten Codierungen und Entschützungen unter Verwendung geeigneter geschützter Fmoc-derivate eingefügt (SCHRITTE 7–10). Das Einfügen jeder Aminosäure wurde durch doppelte Kopplung bei jedem Schritt ausgeführt. Die Kopplungseffizienz für jeden Schritt lag im allgemeinen über 90%, wie durch die Bestimmung der Fmoc-Zahl nach Fmoc-Entschützung gemessen wurde (UV Spektroskopie).
Decodierung jeder Matrix mit Speicher ermöglichte die Identifikation von identischen Einheiten. Es wurde beobachtet, dass eine ziemlich gleichmäßige Verteilung von Matrix mit Speichern über den gesamten Bibliotheksraum erhalten worden war. Die Praxis des Aussortierens der Matrizes mit Speichern bei jeder Aufteilung durch Decodierung, ermöglicht es diesem Zufallsprozess ein exaktes „Eine Komponente-eine Matrix mit Speicher"-Verfahren zu werden.
TENTAGEL^® Kügelchen von Matrizes mit Speichern mit identischen Codes wurden zusammengegeben und die Peptide wurden getrennt vom Harz mit EDT : Thioanisol : H₂O : PhOH : TFA (1,5 : 3 : 3 : 4,5 : 88 m, w/w) gespalten. Die Aufarbeitungs- und Isolierungsverfahren schlossen Filtration, Evaporation, Verdünnung mit Wasser, gründliche Extraktion mit Diethylether und Lyophilisation ein. Die vollständig entschützten Peptide wurden als weiße Festkörper erhalten, ihre Strukturen wurden durch Massenspektroskopie bestätigt, und ihre Reinheit wurde durch HPLC bestimmt. Die Peptidsequenz von Eintrag 2 (SEQ ID NO 26) wurde durch Peptidaminosäure-Sequenzanalyse bestätigt. Die Umgebungs temperatur des Reaktionsraums wurde ebenfalls an bestimmten Syntheseschritten gemessen durch die eigene Temperatursonde
Biologisches Screening der Peptidbibliothek
Ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, hergestellt spezifisch gegen das Peptid SEQ ID NO 25, wurde dazu verwendet, diese spezifische Sequenz in der REC^TM-Peptidbibliothek durch das ELISA-Verfahren nachzuweisen. Der ELISA-Test identifizierte die Bibliotheksmitglieder mit der SEQ ID NR 25 richtig (100% Bindung). Die Sequenz dieses Peptids wurde auch durch den Hochfrequenzcode, Massenspektroskopie, und Aminosäure-Sequenzanalyse bestätigt.
Es war ebenfalls von Interesse, Tendenzen in der Bindung des Antikörpers an die anderen Mitglieder der Bibliothek zu beobachten. Die Bindung jedes Peptids war abhängig von der Art, Position, und Anzahl der Modifikationen von der Elternsequenz. Ersetzen von I durch G veränderte daher die Antigenität des Peptids nicht signifikant. Substitution von L durch A reduzierte die Antikörperbindung um ≈ 40% und Ersetzen von P durch F wandelte das Peptid im wesentlichen in eine nicht-erkennbare Sequenz um. Das Ersetzen von zwei Aminosäuren ergab einen signifikanten Verlust der Bindung. Daher verringerten die gleichzeitigen Substitutionen ( → G und P → F), (I → G und L → A), und (P → F und L → A) die Antikörperbindung um ~ 40, 60, beziehungsweise 92%. Schließlich wurde das Peptidbibliotheksmitglied, in dem I, P und L durch G, F beziehungsweise A ersetzt worden waren, nicht durch den Antikörper erkannt. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Aminosäuren am C-Terminus des Peptids, insbesondere P, eine wichtige Rolle bei dieser besonderen Antikörper-Peptid Erkennung spielen.
BEISPIEL 5
Verfahren zur Beschichtung von in Glaseingeschlossenen Speichervorrichtungen mit silyliertem Polystyrol
Ein Verfahren zur Beschichtung von in Glas eingeschlossenen Speichervorrichtungen, wie der IPTT-100, wird schematisch wie folgt dargestellt:
A. Verfahren A

1. Vor Beschichtung wurde die Glasoberfläche des IPTT-100 Transponders gereinigt, unter Verwendung von nacheinander Base, Chloroform, Ethanol, und Wasser, und dann auf 200°C (oder 300°C) erhitzt um Wasser zu entfernen.
2. Die Reste der Lösungsmittel aus Schritt 1 wurden unter Vakuum entfernt.
3. N-Styrylethyltrimethoxy-Silan HCl, Chlormethylstyrol, Divinylbenzol und Benzoylperoxid (9 : 1 : 0,1 : 0,2 mol) wird für 10 Min gerührt.
4. Die sich ergebende Mischung wurde auf das gereinigte Glas geschichtet, das dann bei 150–200°C für 5 bis 10 Minuten an Luft oder unter Stickstoff gebacken wurde.
5. Das beschichtete Glas wurde dann nacheinander mit DCM, DMF und Wasser gewaschen. Die sich ergebende Beschichtung war stabil in DCM, DMF, Säure und Base für zwei Wochen bei 70°C.

B. Verfahren B

1. Vor Beschichtung wird die Glasoberfläche gereinigt, unter Verwendung von nacheinander Base, Chloroform, Ethanol, und Wasser, und dann auf 200°C (oder 300°C) erhitzt um Wasser zu entfernen.
2. Die Reste der Lösungsmittel aus Schritt 1 werden unter Vakuum entfernt.
3. N-Styrylethyltrimethoxy-Silan HCl (10–15%) wird unter Rückfluss in Toluol mit der gereinigten Glasoberfläche in Kontakt gebracht.
4. Nach Reaktion wird die Glasoberfläche nacheinander mit Toluol, DCM, Ethanol und Wasser gewaschen.
5. Eine Mischung aus Chlormethylstyrol, Divinylbenzol und Benzoylperoxid (das molare Verhältnis von N-Styrylethyltrimethoxy-Silan HCl (zu den anderen Komponenten beträgt 9 : 1 : 0,1 : 0,2 mol) wird auf das Glas geschichtet, das dann bei 150–200°C für 10 bis 60 Minuten gebacken wird.
6. Das beschichtete Glas wird dann nacheinander mit Toluol, DCM, DMF und Wasser gewaschen.

BEISPIEL 6
Herstellung von Glaskügelchen und Chips mit eingeschlossenem Szintillationsmittel Materialien:
POPOP (Aldrich) oder PPO (Konzentrationen ungefähr 5 bis 6 g/l), und/oder p-Bis-o-Methylstyrylbenzol (bis-MSB) oder Diphenylanthrazen (DPA) (Konzentrationen ungefähr 1 g/l), oder Szintillationswachs (FlexiScint von Packard). Genaue Konzentrationen können empirisch bestimmt werden, abhängig von der ausgewählten Mischung der Komponenten.
Poröse Glaskügelchen (Sigma)
IPTT-100 Transponder (siehe Beispiel 2)
A. Herstellung von mit Szintillationsmittel beschichteten Kügelchen
Poröse Glaskügelchen werden in einer Mischung aus PPO (22-25 Gewichts %) und bis-MBP (bis zu 1 Gewichts %) in einer Monomerlösung, wie Styrol oder Vinyltoluol, oder in heißem verflüssigtem Szintillationswachs (3–5 Volumen/Kügelchenvolumen) eingeweicht. Eine Schicht von Polystyrol (ungefähr 2 bis 4 μM) wird dann aufgetragen. Ein Peptid wird dann entweder an dem Polystyrol synthetisiert, wie oben beschrieben, oder wird geschichtet (adsorbiert) oder über einen spaltbaren Linker an das Polystyrol gebunden.
B. Herstellung von Matrix mit Speicher-Kügelchen, die mit Szintillationsmittel beschichtet sind
1. Die porösen Glaskügelchen werden durch Transponder, die in Glas eingeschlossen sind, (vor Gebrauch geätzt) ersetzt und wie in A behandelt. Die sich ergebenden Kügelchen werden mit Polystyrol (2 bis 5 μM) verschlossen und dann mit einem ausgewählten Akzeptormolekül beschichtet, wie einem Antigen, Antikörper oder Rezeptor, an das ein radioaktiv markierter Ligand oder Antiköper selektiv bindet. Die Identität der gebundenen Peptide oder Proteine wird in jedem Speicher codiert. Nach Reagieren und Zählen in einem Flüssigkeitszintillationszähler, werden die Kügelchen, die Akzeptormoleküle gebunden haben, gelesen um das gebundene Protein zu identifizieren.
2. Die porösen Glaskügelchen werden durch Transponder, die in Glas eingeschlossen sind, (vor Gebrauch geätzt) ersetzt und wie in A behandelt und wie in A mit Polystyrol verschlossen. Eine Peptid-, kleine organische- oder andere Bibliothek wird auf der Polystyroloberfläche jedes Kügelchens synthetisiert, und die Identität jedes Mitglieds der Bibliothek wird in dem Speicher codiert. Die Kügelchen mit verbundenen Molekülen werden mit markiertem Rezeptor zur Reaktion gebracht und in einem Flüssigkeitszintillationszähler gezählt. Nach Zählen in einem Flüssigkeitszintillationszähler werden die Kügelchen, die Rezeptormoleküle gebunden haben, gelesen um das Protein zu identifizieren, das an den Rezeptor gebunden ist.
BEISPIEL 7
Verwendung von Partikeln, die mit Szintillationsmittel beschichtet oder darin eingeschlossen sind, in Tests
In Experimenten 1–3 als Modellsystem wurde die Bindung von Biotin an funktionelle Amingruppen unter Verwendung von ¹²⁵J-Streptavidin nachgewiesen. In Experiment 4 wurde die Bindung von (Met⁵)-Enkephalin an die funktionelle Amingruppen unter Verwendung von ¹²⁵J-Antikörper nachgewiesen.
Experiment #1

1. Szintillationsmittel (PPO 2% und DPA 0,05%) wurden eingeführt (Emerald Diagnostics, Eugene, OR) und in die innere Oberfläche von Polystyrolkügelchen (Bang Laboratories) eingebaut. Die Konzentration der Polystyrolkügelchen betrug 3,1 μM, mit 20% Kreutzvernetzung, und sie waren mit Amingruppen derivatisiert.
2. Es wurde geschätzt, dass die Konzentration der funktionellen Amingruppen auf den Oberflächen der Kügelchen ungefähr 0,04125 μmol/mg betrug. Die Amingruppen waren kovalent an das N-hydroxysuccinimid-Derivat von Biotin (CalBiochem 203112) gebunden, im molaren Verhältnis von 1 : 10 beziehungsweise. Dies wurde durch Resuspendieren der Kügelchen für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer Hepes (pH 8,0) gepufferten Lösung aus 50% Acetonitril: Wasser, die Biotin enthielt, ausgeführt. Nach 2 Stunden wurden die Kügelchen 6 mal mit 10 ml 50% Acetonitril in Wasser gewaschen. Kügelchen wurden in PBS (pH 7,2) resuspendiert und über Nacht bei 4°C gelagert.
3. Unter Verwendung eines SPA-Formats wurde Biotin nachgewiesen, unter Verwendung von ¹²⁵J-Streptavidin, das an das Biotin gebunden war. Dies wurde ausgeführt durch Verdünnen der Kügelchen auf 20 mg/ml und ihrem Einfüllen in 96-Vertiefungsplatten bei 4, 2, 1, 0,5, 0,25, und 0,125 mg pro Vertiefung. Volumina wurden auf 100 μl pro Vertiefung eingestellt. ¹²⁵J-Streptavidin wurde bis zur Endkonzentration von 0,1 μCi pro Vertiefung zugefügt. Die Platten wurden in einem Wallac MicroBeta Trilux Szintillationszähler nach 2 Std. gezählt. Gebundenes Biotin wurde nachgewiesen.

Experiment #2

1. Szintillationsmittel (Pyrenbuttersäure und 9-Anthrazenpropionsäure) wurden kovalent an die TENTAGEL^®-Kügelchen gebunden, mit 0,25 mmol/g verfügbaren funktionellen Amingruppen bei einem Verhältnis von 2% : beziehungsweise 0,05%. Das Fluorophor war an 15% dieser Stellen gebunden.
2. Die funktionellen Amingruppen auf den TENTAGEL®-Kügelchen wurden kovalent mit dem N-Hydroxysuccinimid-Derivat von Biotin verbunden. Die freien funktionellen Aminogruppen auf den Kügelchen (0,21 μmol/mg) wurden kovalent an Biotin (CalBiochem 203112) gebunden. Kurz gesagt wurde Biotin mit den Kügelchen in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 in 6 ml 50% Acetonitril mit Hepes (pH 8,0) gemischt und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Kügelchen 3 mal mit 10 ml 100 Acetonitril gewaschen, gefolgt durch 3 Waschschritte mit 50% Acetonitril in Wasser. Die Kügelchen wurden in PBS (pH 7,2) resuspendiert und über Nacht bei 4°C gelagert.
3. Biotin wurde unter Verwendung von ¹²⁵J-Streptavidin in einem SPA-Format nachgewiesen. Dies wurde ausgeführt durch Verdünnen der Kügelchen auf 20 mg/ml und ihrem Einfügen in 96-Vertiefungsplatten bei 4, 2, 1, 0,5, 0,25, und 0,125 mg pro Vertiefung. Volumina wurden auf 100 μl pro Vertiefung eingestellt. ¹²⁵J-Streptavidin (Amersham IM236) wurde jeder Vertiefung bei einer Konzentration von 0,05 μCi/Vertiefung zugefügt. Nach ungefähr 2 Stunden wurde zusätzliches ¹²⁵J-Streptavidin für eine Endkonzentration von 0,1 μCi pro Vertiefung zugefügt. Die Platten wurden in einem Wallac MicroBeta Trilux Szintillationszähler nach 2 Std. gezählt. Gebundenes Biotin wurde nachgewiesen.

Experiment #3

1. BMDS Chips (und IDTAG Chips) wurden mit einem Szintillationsmittel beschichtet (PPO 2% und DPA 0,5% in Polystyrol (10% in Dichlormethan).
2. Die Chips wurden dann mit einer Schicht von derivatisiertem Silan beschichtet.
3. Die funktionellen Amingruppen wurden kovalent mit dem N-Hydroxysuccinimid-Derivat von Biotin verbunden. Die freien funktionellen Amingruppen auf dem Silan (375 nmol/Chip) wurden kovalent an Biotin (CalBiochem 203112) gebunden. Kurz gesagt wurde Biotin in 1 ml 30% Acetonitril mit Hepes (pH 8,0) gelöst und mit dem Chip für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde der Chip 3 mal mit 50% Acetonitril in Wasser gewaschen, in PBS (pH 7,2) resuspendiert und über Nacht bei 4°C gelagert.
4. Biotin wurde in einem SPA-Format durch ¹²⁵J-Streptavidin nachgewiesen. Die Chips wurden in 96-Vertiefungsplatten mit 500 μl ¹²⁵J-Streptavidin (0,1 μCi/Vertiefung, Amersham IM236) platziert. Nach einer 2 Stunden Inkubation wurden die Platten in einem Wallac MicroBeta Trilux Szintillationszähler gezählt. Bindung wurde nachgewiesen.

Experiment #4

1. Die Chips wurden mit Szintillationsmittel beschichtet (PPO 2% und DPA 0,05% in Polystyrol (10% in Dichlormethan).
2. Die funktionelle Amingruppe wurde zur spontanen kovalenten Bindung von Amingruppen (Xenopore, NJ) derivatisiert.
3. (Met⁵)-Enkephalin (tyr-gly-gly-phe-met; SEQ ID NO 33)-Peptid (R & D Antibodies) wurde kovalent an die Amingruppe gebunden, durch Inkubieren des beschichteten Chips mit dem Peptid in 500 μl PBS (160 μg Peptid/ml, pH 8) über Nacht bei Raumtemperatur.
4. Am Ende der Inkubation wurden die Chips gewaschen und dann in 3 Rinderserumalbumin für 2 Stunden inkubiert.
5. Gebundenes Peptid wurden in einem SPA-Format nachgewiesen. Die Chips wurden in einer 24-Vertiefungsplatte platziert, die 500 μl ¹²⁵J-anti-(Met⁵)-Enkephalin Antikörper enthielt (0,1 μCi/Vertiefung, R & D Antibodies). Der Antikörper ist polyklonaler Kaninchenantikörper gegen die C-terminale Region des Peptids. Nach einer 2 Stunden Inkubation wurden die Platten in einem Wallac MicroBeta Trilux Szintillationszähler gezählt und gebundenes Peptid nachgewiesen.

Weil Modifikationen für den Fachmann offensichtlich sein werden, ist beabsichtigt, dass diese Erfindung nur durch den Schutzumfang der angehängten Ansprüche begrenzt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Kombination von einer Matrix mit Speicher zur Verwendung in der chemischen Festphasensynthese, umfassend: (A) eine Speichervorrichtung, die einen elektromagnetisch lesbaren Speicher zum Speichern kodierter Daten umfasst; und (B) eine Matrix, die an die Speichervorrichtung gekoppelt oder in physikalischem Kontakt mit dieser ist und zum Koppeln biologischer Partikel oder Moleküle angepasst ist; wobei die kodierten Daten Identifizierungsinformationen umfassen, die in unverwechselbarer Weise die Matrix und somit die biologischen Partikel oder Moleküle identifizieren, die daran gekoppelt sind; gekennzeichnet durch ein im Wesentlichen starres Gefäß, das aus Inertmaterial gebildet ist, wobei mindestens ein Teil dieses Gefäßes porös ist, und dadurch, dass die Matrix eine Vielzahl von Matrixpartikeln umfasst, die zum Koppeln biologischer Partikel oder Moleküle angepasst sind, die in einem Hohlraum in dem Gefäß enthalten sind.
Kombination nach Anspruch 1, bei der die Vielzahl von Matrixpartikeln ein funktionalisiertes Harz umfasst.
Kombination nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Speichervorrichtung in den Hohlraum eingeschlossen ist.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Speichervorrichtung in den Hohlraum eingesetzt und aus diesem entfernt werden kann.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Speichervorrichtung einen elektronischen Schaltkreis umfasst, der einen Transponder zum Empfangen eines frequenzmodulierten Signals und Reagieren auf dasselbe sowie einen elektronischen Speicher einschließt.
Kombination nach Anspruch 5, bei der der elektronische Schaltkreis mit einer Schutzhülle ummantelt ist.
Kombination nach Anspruch 1, bei der die Speichervorrichtung eine optisch lesbare Identifizierungsmarke auf der Matrix ist.
Kombination nach Anspruch 7, bei der die Speichervorrichtung ein optisches Aufzeichnungsmedium mit mindestens einem optisch lesbaren Loch oder einer optisch lesbaren Grube umfasst, das bzw. die darin gebildet wird.
Kombination nach Anspruch 7, bei der die Speichervorrichtung einen Barcode umfasst.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der die Matrix Lumineszenzanteile umfasst.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der die Matrix Material umfasst, das ausgewählt ist aus Polystyrol, Cellulose, Glas, Polyacrylamid, Polysaccharid, Kautschuk, Silikon, Kunststoff, Sand, Bimsstein, Agarose, halogenierten Kohlenwasserstoffpolymeren und Polyvinyltoluol.
Verfahren zum elektronischen Markieren von Molekülen und biologischen Partikeln während Synthese und/oder Screening, umfassend: Kodieren innerhalb einer Speichervorrichtung in einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10 gekoppelt an das Molekül oder biologische Partikel mit einem oder mehreren Indikatoren, die für die Identität des Moleküls oder biologischen Partikels, oder die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Moleküls oder biologischen Partikels, oder andere Identifizierungsinformationen zum Verfolgen des Moleküls oder biologischen Partikels repräsentativ sind.
Bibliothek, die eine Vielzahl von Kombinationen nach Anspruch 1 umfasst.
Bibliothek nach Anspruch 13, die eine kombinatorische Bibliothek ist.