BR112015012239B1 - Método in vitro de diagnóstico de câncer de tireoide - Google Patents

Abstract

MÉTODO E KIT PARA O DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DE TIROIDE. A presente invenção fornece ensaios de diagnóstico para a identificação câncer de tiroide em uma amostra biológica, incluindo um aspirado de agulha fina, bem como composições e kits relacionados úteis na prática dos métodos da invenção.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[01] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos EUA de número de Série No 61/730.391 depositado em 27 de novembro de 2012 e Pedido de Patente Provisório dos EUA de No de Série 61/775.419 depositado em 08 de março de 2013. Estas aplicações estão aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[02] Listagem de Sequências associada com este pedido é fornecida, em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e é aqui incorporada por referência na especificação. O nome do arquivo de texto que contém a lista de sequências é BMRC_001_02WO_ST25.txt. O arquivo de texto é de cerca de 57 KB, foi criado em 26 de Novembro de 2013 e está sendo submetido por via eletrônica através de EFS-Web.

FUNDAMENTOS Campo

[03] A presente invenção é direcionada a composições e métodos para o diagnóstico de câncer de tiroide e avaliação de nódulos para determinar se eles são benignos ou cancerosos.

Descrição da Técnica Relacionada

[04] Aproximadamente, 350.000 biópsias de punção aspirativa por agulha fina (PAAF) de nódulos da tireoide são realizadas a cada ano nos EUA, dos quais 20% são relatados como indeterminado com relação a se os nódulos são cancerosos ou não. Estes pacientes, na maioria dos casos, são submetidos a uma cirurgia tendo em conta o risco de câncer, que varia entre apenas 15 a 30%. Isto significa que a maioria dos pacientes não precisam da remoção cirúrgica da tiroide. Considerando os riscos graves e de longo termo associados à cirurgia da tireoide, bem como os custos para os pacientes e para o sistema de saúde, há uma necessidade urgente de uma ferramenta que vai melhorar a acurácia diagnóstica das biópsias PAAF de tireoide.

[05] Recentemente, novos testes têm sido colocados no mercado dos EUA que, em grau variável, melhoram o diagnóstico de nódulos tireoidianos indeterminados. Estes incluem o teste de análise de PAAF de tiroide Afirma® (Veracyte, South San Francisco, CA), que é um teste classificador de expressão de gene baseado em 167 genes. No entanto, o teste Afirma® mudaria a conduta cirúrgica corretamente em apenas cerca de 50% dos casos. Outros dois testes incluem os desenvolvidos pela Quest Diagnostics e Asuragen, que são baseadas na análise mutacional de biomarcadores conhecidos aceites pela Associação de Tireoide Americana (American Thyroid Association). No entanto, a validação adequada de estudo clínico está faltando. Infelizmente, o teste Afirma® exige a análise de um grande número de biomarcadores, todos os testes devem ser realizados em laboratórios centrais, e requerem que a amostra seja enviada para análise. Além disso, uma segunda PAAF deve ser realizada para se obter uma amostra adequada para realizar estes testes.

[06] Claramente, existe uma necessidade na técnica de métodos e composições melhorados para a avaliação de nódulos e diagnosticar o câncer de tiroide. A presente invenção satisfaz esta necessidade, oferecendo uma abordagem de diagnóstico novo e simplificado para a avaliação de nódulos da tireoide que foram relatados serem indeterminados por uma punção aspirativa por agulha fina (PAAF), e oferece vantagens adicionais.

BREVE RESUMO

[07] A presente invenção fornece composições, métodos e kits para determinar a presença ou ausência de tecido maligno ou benigno em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide ou nódulo da tiroide.

[08] Em certas formas de realização, a presente invenção fornece um método de diagnóstico de câncer de tiroide em um indivíduo, que compreende: a determinação de níveis de expressão de três ou mais produtos de genes de uma amostra de tecido da tiroide obtida a partir do indivíduo, em que os três ou mais produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso pelo gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7; e identificação da amostra de tecido da tiroide como canceroso ou benigno, correlacionando os níveis de expressão determinados com a presença ou ausência de câncer de tiroide na amostra de tecido da tiroide. Em várias formas de realização, o método é utilizado para determinar se a amostra de tecido é cancerosa ou benigna, por exemplo, para determinar se o indivíduo tem um câncer, tal como, por exemplo, um câncer de tiroide.

[09] Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, o passo de correlação é realizado por comparação dos níveis de expressão de três ou mais produtos de genes com os níveis normais de expressão de controle para cada um dos produtos de gene, em que a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerígena se houver uma diferença nos níveis de três ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de controle normais. Em formas de realização relacionadas, a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa se existe uma diferença nos níveis de quatro ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de controle normais. Em certas formas de realização, o nível de expressão de controle normal é um nível de expressão em uma amostra de tecido normal da tiroide, enquanto que em certas formas de realização, o nível de expressão de controle normal é um valor predeterminado com base nos níveis de expressão de uma pluralidade de amostras de tecidos normais da tiroide. Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, a amostra de tecido da tiroide é identificada como maligna ou cancerosa se o nível de expressão de qualquer uma ou mais dos genes CXCR3, CXCL 11, SPAG-9, CAR, Nectin-1, XB-130 e/ou CXCL4 é reduzido; e/ou o nível de expressão de qualquer um ou mais dos genes CXCR3, CXCR3B, CXCR4, CCR3, CXCL9, CXCL10, CK-19, TIMP-1, CLDN-1 e/ou CCR7 é aumentado na amostra de tecido da tiroide em comparação com o nível de expressão de controle normal, em que o número total de genes com expressão aumentada ou reduzida é, pelo menos, três.

[010] Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, o passo de correlação é realizado por comparação do nível de expressão de três ou mais produtos de genes com um nível de expressão de controle de câncer para cada produto de gene, em que a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa se não houver, substancialmente, nenhuma diferença no nível de expressão dos três ou mais produtos de genes entre os níveis de expressão da amostra de tecido da tiroide e o controle de câncer. Em formas de realização particulares, a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa se não há, substancialmente, nenhuma diferença no nível de expressão de quatro ou mais produtos de genes entre os níveis de expressão da amostra de tecido da tiroide e o controle de câncer. Em certas formas de realização, o nível de expressão de controle de câncer é um nível de expressão em uma amostra de tecido canceroso da tiroide. Em formas de realização particulares, o nível de expressão de controle de câncer é um valor predeterminado com base nos níveis de expressão em uma pluralidade de amostras de tecido da tiroide cancerosas.

[011] Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, o passo de correlação compreende a comparação do nível de expressão com dados de expressão de genes determinados para os três ou mais produtos de genes nos seguintes dois conjuntos de amostras biológicas: (i) uma pluralidade de amostras de tecidos normais da tiroide; e (ii) uma pluralidade de amostras de tecido canceroso da tiroide, em que a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa se houver uma diferença no nível de expressão dos três ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os dados de expressão de gene (i), ou se não há substancialmente qualquer diferença no nível de expressão do gene de um ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os dados de expressão de gene (ii).

[012] Em formas de realização particulares de métodos da presente invenção, o passo de correlação é realizado utilizando um classificador que identifica os valores de CT atípicos e/ou valores de CT não-atípicos. Em certas formas de realização, o classificador foi gerado utilizando os dados de expressão de genes determinados para os três ou mais produtos de genes a partir de uma pluralidade de amostras de tecidos normais da tiroide e/ou amostras de tecido canceroso da tiroide.

[013] Em formas de realização particulares de métodos da presente invenção, a amostra de tecido da tireoide foi obtida por punção aspirativa por agulha, punção aspirativa por agulha fina, biópsia por agulha de fragmento, biópsia assistida por vácuo, biópsia de fragmento grande, biópsia incisional, biópsia excisional ou biópsia dirigida.

[014] Em várias formas de realização dos métodos da presente invenção, o produto de gene é RNA, por exemplo, RNAm, RNAr, RNAt ou miRNA. Em certas formas de realização, o nível de expressão de RNA é determinado utilizando micro arranjos (micro arranjos), SAGE, blotting, RT-PCR, PCR quantitativa ou qNPA. Em várias formas de realização da presente invenção, o produto de gene é proteína. Em certas formas de realização, a expressão de gene da proteína é determinada por meio de ELISA, espectrofotometria de massa, blotting, técnicas proteômicas ou imuno-histoquímica.

[015] Em várias formas de realização de métodos, composições e kits da presente invenção, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem de: três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; os produtos dos genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; os produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou os produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CLDN-1 e CCR7. Em formas de realização particulares de métodos, composições e kits relacionados com qualquer um destes conjuntos de genes, o nível de expressão dos genes CXCR3, CXCL11, SPAG-9, CAR, Nectin-1, XB- 130 e/ou CXCL4 é reduzido; e/ou o nível de expressão dos genes CXCR3A, CXCR3B, CXCR4, CCR3, CXCL9, CXCL10, CK- 19, TIMP-1, CLDN-1, HO-1 e/ou CCR7 é aumentado. Por conseguinte, em formas de realização particulares, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7, em que os níveis de expressão de um ou mais, dois ou mais, ou todos os genes CXCR3, CAR e XB130 são reduzidos e/ou os níveis de expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos dos genes CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, HO-1, e CCR7 são aumentados. Em outras formas de realização particulares, o três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7, em que os níveis de expressão de um ou ambos os genes CXCR3 e CAR são reduzidos e/ou os níveis de expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os genes CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, os de HO-1, e CCR7 são aumentados. Em outras formas de realização particulares, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130, em que os níveis de expressão de um ou mais ou ambos os genes CAR e XB130 são reduzidos e/ou os níveis de expressão de um ou mais, ou ambos os genes CCR3 e TIMP-1 são aumentados. Em outras formas de realização particulares, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7, em que os níveis de expressão do gene CAR é reduzido e/ou os níveis de expressão de um ou mais, dois ou mais, ou todas os genes CXCL10, TIMP-1, e CCR7 são aumentados. Em outras formas de realização particulares, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7, em que os níveis de expressão do gene CAR é reduzido e/ou os níveis de expressão de um ou mais ou ambos os genes TIMP-1 e CCR7 são aumentados. Em outras formas de realização particulares, os três ou mais produtos de genes compreendem ou consistem em produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CLDN-1 e CCR7, em que os níveis de expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todos os genes CXCL10, TIMP- 1, CLDN-1 e CCR7 são aumentados.

[016] Em certas formas de realização, os métodos da presente invenção compreendem ainda o passo de realizar uma análise citológica em uma amostra de tecido da tiroide obtida a partir do indivíduo para obter um diagnóstico preliminar. Em formas de realização particulares, as amostras com um diagnóstico preliminar de intermediário ou indeterminado são ainda analisadas por determinação dos níveis de expressão do produto de gene e correlacionando-as com tecido benigno ou maligno de acordo com os métodos da presente invenção. Em formas de realização particulares, a amostra de tecido citologicamente analisada e a amostra de tecido utilizada na determinação dos níveis de expressão de produto de gene são a mesma amostra de tecido. Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, a amostra de tecido foi obtida por punção aspirativa por agulha fina.

[017] Em formas de realização particulares de métodos, composição, ou kits da presente invenção, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma sensibilidade maior do que ou igual a 92% ou maior do que ou igual a 97%, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticado como cancerosa ou benigna com uma especificidade maior do que ou igual a 60% ou maior do que ou igual a 90%, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna, com um valor preditivo positivo maior do que ou igual a 50% ou maior que ou igual a 90%, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna, com um valor preditivo negativo maior do que ou igual a 92% ou maior do que ou igual a 94%, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma razão de probabilidade positiva maior do que ou igual a 2 ou maior do que ou igual a 10, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma probabilidade pós-teste positivo maior do que ou igual a 50% ou maior do que ou igual a 80%, a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma razão de probabilidade negativa de menos do que ou igual a 0,14 ou menos do que a ou igual a 0,08, e/ou a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma probabilidade pós-teste negativa de menos do que ou igual a 7,0% ou menos do que ou igual a 3,0%.

[018] As formas de realização particulares de métodos da presente invenção compreendem ainda a obtenção da amostra de tecido da tiroide do indivíduo.

[019] As formas de realização particulares de métodos da presente invenção ainda compreendem a remoção cirúrgica da tiroide do indivíduo, ou uma porção da mesma, se a amostra de tecido da tiroide é diagnosticada como cancerosa.

[020] Em formas de realização relacionadas, a presente invenção inclui um kit para o diagnóstico de câncer de tiroide, o referido kit compreendendo três ou mais reagentes para a detecção de produtos de genes, em que os três ou mais reagentes, cada um, detectam um produto de gene diferente, em que os produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1, e em que pelo menos um dos produtos de gene é expresso pelo gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em certas formas de realização, os reagentes são anticorpos, e cada um anticorpo se liga especificamente a um produto de gene de polipeptídeo. Em certas formas de realização, os reagentes são oligonucleotídeos ou conjuntos de oligonucleotídeos, e cada oligonucleotídeo se liga especificamente a um produto de gene de ácido nucleico. Em certas formas de realização, os reagentes são, cada um, ligados a um substrato. Em formas de realização particulares, os reagentes são ligados de forma covalente ao substrato. Em formas de realização particulares, os reagentes são, cada um, ligados a uma região discreta de um substrato sólido. Em formas de realização particular, os reagentes são oligonucleotídeos ou conjuntos de oligonucleotídeos ligados covalentemente a um substrato sólido, o substrato sólido é opcionalmente uma matriz, e a matriz é, opcionalmente, um micro arranjo. Em formas de realização particulares, os reagentes são conjuntos de oligonucleotídeos, e os conjuntos de oligonucleotídeos de compreendem DNA. Em formas de realização particulares, os reagentes são conjuntos de oligonucleotídeos, e cada conjunto de oligonucleotídeos hibridiza especificamente com um dos produtos de genes. Em uma forma de realização, cada conjunto de iniciadores de amplificação compreendem oligonucleotídeos capazes de amplificar por PCR um dos produtos de genes. Em certas formas de realização de vários kits da presente invenção, os produtos de gene compreendem ou consistem de: três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; os produtos de genes dos genes CXCL10, CAR e CCR7 TIMP-1; os produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou os produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP- 1, CLDN-1 e CCR7.

[021] Em certas formas de realização de métodos, composições e kits da presente invenção, os reagentes são rotulados. Em formas de realização particulares, um kit da presente invenção compreende ainda uma ou mais soluções adequadas para ligação dos referidos reagentes para os referidos produtos de genes. Em certas formas de realização de kits da presente invenção, os reagentes são conjuntos de oligonucleotídeos, e o kit compreende ainda um ou mais reagentes adicionais para a realização de um ensaio de PCR. Em formas de realização particulares, o um ou mais reagentes adicionais são selecionados a partir de uma polimerase termoestável, uma mistura de desoxinucleotídeos e uma sonda marcada de forma detectável. Em certas formas de realização, a sonda marcada de forma detectável compreende um fluoróforo e um radical de têmpera. Em formas de realização particulares, a sonda marcada de forma detectável emite um sinal detectável quando a sonda é clivada, mas não quando a sonda está intacta.

[022] Em várias formas de realização de kits da presente invenção, o kit compreende ainda um ou mais reagentes para o processamento de uma amostra de tecido da tiroide. Em formas de realização particulares, o processamento da amostra de tecido da tiroide compreende a extração dos produtos de genes a partir da amostra de tecido da tiroide, e em certas formas de realização os produtos do gene são proteínas ou ácidos nucleicos.

[023] Em várias formas de realização, um kit da presente invenção compreende ainda um ou mais produtos de genes de controle.

[024] Em formas de realização particulares de kits da presente invenção, um ou mais dos seguintes (quando presente no kit) estão presentes em recipientes separados: reagentes para a detecção de produtos de genes, a solução, qualquer reagente adicional e produtos de gene de controle.

[025] Em outras formas de realização relacionadas, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer de tiroide que compreende: a identificação de uma amostra de tecido da tiroide obtida a partir do indivíduo como cancerosa de acordo com um método da presente invenção ou utilizando um kit da presente invenção; e a remoção cirúrgica da tiroide do indivíduo ou uma sua porção, ou realização de radioterapia, quimioterapia ou terapia hormonal no indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[026] A Figura 1 apresenta um gráfico que mostra a expressão diferencial entre amostras de câncer (100) e nódulos benignos (56) de 18 genes, tal como determinado por PCR em tempo real quantitativa e analisadas pelo modelo de quantificação relativa proposto por Pfaffl. O valor zero corresponde à expressão do gene de nódulos benignos e barras correspondem à variação da expressão do gene em amostras de câncer (razão de mudança relativa). Os 18 genes são identificados no Exemplo 1.

[027] A Figura 2 proporciona a recepção de dados da curva de características de funcionamento (COR - do inglês ROC) de cada um dos 18 genes individuais identificados no Exemplo 1. ASC: área sob a curva, PF: Falso positivo, TP: Positivo verdadeiro.

[028] A Figura 3 fornece um diagrama esquemático dos métodos utilizados para gerar (3A) e utiliza diferentes algoritmos (3B) para desenvolver novos classificadores. Dois algoritmos diferentes foram treinados; um para identificar e classificar valores de CT atípicos (inconsistentes) e um para classificar valores de CT não atípicos (análise discriminante linear e não-linear) (3A). Novos classificadores são desenvolvidos utilizando a algoritmos sequencialmente em dois passos seguidos por integração dos dados de saída para o desenvolvimento do novo classificador (3B).

[029] Figura 4 fornece gráficos de curva COR de novos classificadores desenvolvidos pela identificação e classificação de valores de CT atípicos seguido de análise discriminante linear (LDA) ou análise discriminante não linear (NLDA). ASC: área sob a curva, FP: Falso positivo, TP: Positivo verdadeiro.

[030] A Figura 5 proporciona uma comparação da ASC do novo classificador (SV) com os melhores genes individuais classificadores e uma combinação dos mesmos (Genes 10, 11, 12) seguido do método descrito na Figura 3. *corresponde a valores de p <0,05 mostrando que o classificador SV é significativamente superior ao dos genes individuais ou uma combinação dos mesmos.

[031] A Figura 6 fornece uma análise de correlação de Spearman dos melhores genes de classificação individuais, mostrando que eles estão intimamente relacionados, explicando por que a combinação deles não melhora seu desempenho como classificadores de genes.

[032] A Figura 7 fornece uma tabela de comparação do desempenho de classificação de três novos classificadores desenvolvidos com o conjunto de treinamento (SV, FM72, FM208), melhores genes individuais (Gene 10, Gene 11, Gene 12), combinação dos melhores genes (Genes (10, 11, 12)) e o classificador Afirma® por Veracyte (Affirma).

[033] A Figura 8 fornece gráficos de curva COR e os dados que comparam o desempenho de um conjunto de teste independente com o conjunto de treinamento utilizando o classificador SV.

[034] A Figura 9 fornece um quadro comparativo mostrando os valores de sensibilidade, especificidade, VPP e VPN obtidos utilizando o algoritmo SV em amostras cirúrgicas e PAAF.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[035] A presente invenção é baseada, em parte, na identificação de um pequeno painel de genes e várias subcombinações dos mesmos, que permite que a classificação precisa de amostras da tiroide como maligna ou benigna. As combinações de genes utilizadas de acordo com a presente invenção resultam em uma melhoria surpreendente na capacidade de classificar os nódulos da tiroide, em comparação com a utilização de genes individuais ou combinações de genes previamente descritos. Além disso, o painel de genes fornece resultados de diagnóstico e de classificação de qualidade superior em comparação com os conjuntos de genes e métodos relacionados anteriormente disponíveis. Por exemplo, os conjuntos de genes e métodos da presente invenção demonstram uma melhor previsibilidade e fiabilidade do que o classificador de gene Afirma®. O uso dos conjuntos de genes da presente invenção com um algoritmo de passo a passo bifásico evita o sobre-ajuste e é capaz de classificar os pacientes de forma adequada com os perfis de gene inconsistentes, tendo em conta as variações de expressão de perfil de genes da população. Além disso, o pequeno painel de genes da presente invenção permite um kit que pode ser distribuído para laboratórios de patologia, reduzindo assim os custos, bem como simplifica e acelera o processo de diagnóstico. Uma outra vantagem do pequeno painel de genes é que ele requer uma quantidade reduzida de amostra de tecido, permitindo potencialmente suficiente RNAm para ser extraído da amostra de PAAF original, evitando assim a necessidade de sujeitar o paciente a uma segunda PAAF.

[036] Na descrição que se segue, certos pormenores específicos são estabelecidos de modo a proporcionar um entendimento completo das várias formas de realização da invenção. No entanto, aquele versado na técnica entenderá que a invenção pode ser praticada sem estes pormenores.

Definições

[037] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por aqueles versados na técnica à qual o invento pertence. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

[038] As palavras "um" e "uma" significam um ou mais, a menos que especificamente indicado.

[039] Por "cerca de" significa-se uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia de acordo por tanto quanto 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% de uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, comprimento ou peso de referência. Em qualquer forma de realização discutida no contexto de um valor numérico utilizado em conjunção com o termo "cerca de", é especificamente contemplado que o termo “cerca de” pode ser omitido.

[040] Por "sequência de codificação" entende-se qualquer sequência de polinucleotídeos que contribui para o código para o produto polipeptídico de um gene. Em contraste, o termo "sequência de não codificação" refere-se a qualquer sequência de polinucleotídeos que não contribui para o código para o produto polipeptídico de um gene.

[041] A menos que o contexto exija de outra forma, ao longo da presente especificação e reivindicações, a palavra "compreendem" e suas variações, tais como, "compreende" e "compreendendo" devem ser interpretadas em um sentido inclusivo aberto, isto é, como "incluindo mas não limitado a".

[042] Por "consistindo de" se entende incluindo, e limitado a, o que quer que siga a frase "consistindo de". Assim, a frase "consistindo de" indica que os elementos enumerados são necessários ou obrigatórios, e que nenhum outro elemento pode estar presente.

[043] Por "consistindo essencialmente de" entende-se incluindo quaisquer elementos enumerados, após a expressão, e limitado a outros elementos que não interfiram com ou contribuam para a atividade ou ação especificada na divulgação dos elementos listados. Assim, a expressão "consistindo essencialmente de" indica que os elementos mencionados são necessários ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presente, dependendo se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.

[044] Uma quantidade "reduzida" ou "reduzida" ou "menor" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significativa", e pode incluir um decréscimo que é de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, ou 50 ou mais vezes (por exemplo, 100, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os pontos inteiros e decimais entre e acima de 1, por exemplo 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) de uma quantidade ou nível aqui descrito.

[045] Referência ao longo desta especificação como "uma forma de realização" ou "um modelo de realização" significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrita em ligação com a forma de realização está incluído em, pelo menos, uma forma de realização da presente invenção. Assim, o aparecimento das frases "em uma forma de realização" ou "numa forma de realização", em vários lugares ao longo desta especificação, não estão todos necessariamente referindo-se à mesma forma de realização. Além disso, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer forma adequada em uma ou mais formas de realização.

[046] Por "gene" entende-se uma unidade de herança que ocupa um determinado lócus em um cromossoma e é composto por sequências reguladoras transcricionais e/ou transducionais e/ou uma região de codificação e/ou sequências não traduzidas (ou seja, íntrons, sequências 5' e 3' não traduzidas).

[047] Uma quantidade "aumentada" ou "melhorada" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significativa", e pode incluir um aumento que é de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, ou 50 ou mais vezes (por exemplo, 100, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os pontos inteiros e decimais entre e acima de 1, por exemplo, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, etc.) em uma quantidade ou nível aqui descrito.

[048] Por "isolado" entende-se o material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham no seu estado nativo. Por exemplo, um "polinucleotídeo isolado", tal como aqui utilizado, inclui um polinucleotídeo que tenha sido purificado a partir das sequências que flanqueiam, no seu estado de ocorrência natural, por exemplo, um fragmento de DNA que tenha sido removido a partir das sequências que são normalmente adjacentes ao fragmento. Alternativamente, um "peptídeo isolado" ou um "polipeptídeo isolado" e semelhantes, como aqui utilizado, inclui o isolamento e/ou purificação in vitro de um peptídeo ou polipeptídeo de molécula a partir do seu ambiente celular natural, e de associação com outros componentes de células; isto é, não está significativamente associado com substâncias in vivo.

[049] O termo "mRNA" ou às vezes referido por "transcritos de mRNA" tal como aqui utilizados, incluem, mas não estão limitados a transcrito (s) de pré-mRNA, intermediários de processamento de transcrição, mRNA 9s) maduro (s) pronto para tradução e transcrições do gene ou genes ou ácidos nucleicos derivados do (s) RNAm (s) transcrito (s). O processamento de transcrição pode incluir união, edição e degradação. Tal como é aqui utilizado, um ácido nucleico derivado de um transcrito de RNAm refere-se a um ácido nucleico para cuja síntese do transcrito de RNAm ou uma sua subsequência tem, por fim, servido como um molde. Um DNAc reverso transcrito a partir de um RNAm, um RNA transcrito a partir desse cDNA, um DNA amplificado a partir do DNAc, um RNA transcrito a partir do DNA amplificado, etc., são todos derivados a partir do transcrito de RNAm e detecção de tais produtos derivados é indicativo da presença e/ou a abundância do transcrito original, em uma amostra. Assim, RNAm derivado de amostras inclui, mas não está limitado a, transcritos de RNAm do gene ou genes, DNAc reverso transcrito a partir do RNAm, RNAc transcrito a partir do DNAc, DNA amplificado a partir dos genes, RNA transcrito a partir do DNA amplificado e semelhantes.

[050] Por "obtido a partir de" significa-se que uma amostra, tal como, por exemplo um tecido, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo, é isolada a partir de, ou derivada de, uma fonte particular, tal como um organismo desejado (por exemplo, indivíduo) ou um específico tecido dentro de um organismo desejado. Por exemplo, uma amostra de tecido pode ser obtida de um indivíduo, ou um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser obtido a partir de um tecido ou de um fluido biológico isolado diretamente a partir de um indivíduo. "Derivado de" ou "obtida a partir de" também pode referir-se a fonte de um tecido ou de uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo.

[051] A recitação "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como aqui utilizado, designa RNAm, RNA, RNAc, RNAr, DNA ou DNAc. O termo tipicamente refere-se a forma polimérica de nucleotídeos com, pelo menos, 10 bases de comprimento, quer ribonucleotídeos quer desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de cadeia simples e dupla de DNA e RNA. Tal como será entendido pelos versados na técnica, em várias formas de realização, as sequências de polinucleotídeos da presente invenção podem incluir sequências genômicas, sequências extra genômicas e codificadas por plasmídeo e segmentos de genes menores manipulados que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e semelhantes. Esses segmentos podem ser naturalmente isolados ou modificados sinteticamente pela mão do homem. Os polinucleotídeos da presente invenção, independentemente do comprimento da própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, locais de enzimas de restrição adicionais, locais de clonagem múltipla, outros segmentos codificantes, e afins, tal que o seu comprimento total pode variar consideravelmente. Por conseguinte, é contemplado que um fragmento de polinucleotídeo de praticamente qualquer comprimento possa ser empregue, com o comprimento total de um modo preferido a ser limitado pela facilidade de preparação e utilização no protocolo de DNA recombinante pretendido.

[052] O termo "variante de polinucleotídeo" refere-se a polinucleotídeos que exibem identidade de sequências substancial com uma sequência polinucleotídica de referência, ou polinucleotídeos que hibridizam com uma sequência de referência, em condições rigorosas que são definidas a seguir. Este termo abrange também polinucleotídeos que são distinguidos a partir de um polinucleotídeo de referência pela adição, deleção ou substituição de, pelo menos, um nucleotídeo. Por conseguinte, o termo "variante de polinucleotídeo" inclui polinucleotídeos em que um ou mais nucleotídeos foram adicionados ou eliminados, ou substituídos com diferentes nucleotídeos. A este respeito, é bem entendido na técnica que certas alterações inclusivas de mutações, adições, deleções e substituições podem ser feitas de um polinucleotídeo de referência em que o polinucleotídeo modificado retém a função biológica ou atividade do polinucleotídeo de referência, ou tem maior atividade em relação ao polinucleotídeo de referência (isto é, otimizado). As variantes de polinucleotídeos incluem, por exemplo, polinucleotídeos tendo, pelo menos, 50% (e, pelo menos, de 51% a, pelo menos 99%, e todas as percentagens inteiras entre eles, por exemplo, 90%, 95% ou 98%) de identidade de sequência com uma sequência polinucleotídica de referência aqui descrita. Os termos "variante de polinucleotídeo" e "variante" também incluem variantes alélicas de ocorrência natural e ortólogas que codificam estas enzimas.

[053] As recitações "identidade de sequência", ou, por exemplo, que compreende uma "sequência 50% idêntica à", tal como aqui utilizado, referem-se à medida em que as sequências são idênticas em uma base de nucleotídeo-por- nucleotídeo ou uma base de aminoácido-por-aminoácido sobre uma janela de comparação. Assim, uma "percentagem de identidade de sequência" pode ser calculada por comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Vai, Leu, He, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para obter o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência.

[054] Os termos utilizados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos incluem "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é de, pelo menos, 12 mas frequentemente 15 a 18 e, frequentemente, pelo menos 25 unidades monoméricas, inclusive de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, em comprimento. Como dois polinucleotídeos podem compreender, cada um, (1) uma sequência (ou seja, apenas uma porção da sequência de polinucleotídeo completa) que é semelhante entre os dois polinucleotídeos e (2) uma sequência que é divergente entre os dois polinucleotídeos, as comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos são tipicamente realizadas comparando as sequências dos dois polinucleotídeos ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" refere-se a um segmento conceptual de, pelo menos, seis posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 100, mais habitualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência é comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de forma ótima. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, intervalos) em cerca de 20% ou menos, em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções), para um alinhamento ótimo das duas sequências. O alinhamento ótimo de sequências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programa de computador Wisconsin Genetics Versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (ou seja, que resulta na percentagem mais elevada de homologia sobre a janela de comparação) gerado por qualquer um dos vários métodos selecionados. Referência também pode ser feita para a família de programas BLAST como, por exemplo, descritos por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Uma discussão detalhada da análise da sequência pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, capítulo 15.

[055] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e a variantes e sintéticos e análogos de ocorrência natural dos mesmos. Assim, estes termos se aplicam a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são aminoácidos de ocorrência não natural sintética tais como um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e derivados químicos que ocorrem naturalmente dos mesmos.

[056] Um "indivíduo", tal como aqui utilizado, inclui qualquer animal que apresenta um sintoma, ou está em risco de exibir um sintoma, que pode ser tratado ou diagnosticado de acordo com a invenção. Também estão incluídos os indivíduos para os quais seja desejável fazer o perfil dos níveis de produtos de gene da invenção, para fins de diagnóstico ou outros. Indivíduos (pacientes) adequados incluem animais de laboratório (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou porquinho da índia), animais de quinta, e animais domésticos ou animais de estimação (por exemplo, um gato ou um cão). Mamíferos, incluindo primatas humanos e seres humanos, estão incluídos.

[057] "Tratamento" ou "tratar", tal como aqui utilizado, inclui qualquer efeito desejável sobre os sintomas ou a patologia de uma doença ou condição, por exemplo, câncer de tiroide, e pode incluir até mesmo alterações mínimas ou melhorias em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou condição a ser tratada. "Tratamento" ou "tratar" não indica, necessariamente, a erradicação total ou cura da doença ou condição, ou dos sintomas a ela associados. O indivíduo que recebe este tratamento é qualquer indivíduo em necessidade do mesmo. Exemplos de marcadores de melhoria clínica será aparente para as pessoas versadas na técnica.

[058] O termo " tipo selvagem", tal como aqui utilizado, refere-se a um microrganismo (por exemplo, uma espécie ou estirpe bacteriana), gene ou produto de gene que tenha as características do microrganismo (por exemplo, espécie ou estirpe de bactérias), gene ou gene produto, quando isolado a partir de uma fonte de ocorrência natural. Um gene de tipo selvagem ou produto de gene (por exemplo, um polipeptídeo) é aquele que é mais frequentemente observado em uma população e é, portanto, arbitrariamente designado como forma "normal" ou "do tipo selvagem" do gene.

[059] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado especificamente ao contrário, métodos convencionais da biologia molecular e técnicas de DNA recombinante dentro da perícia na técnica, muitas das quais são descritas abaixo para fins de ilustração. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonagem Molecular: Um manual de Laboratório) (3a Edição, 2000); DNA Cloning: A practical Approach (Clonagem de DNA: Uma Abordagem Prática), vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (Síntese de oligonucleotídeos) (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Síntese: Methods & Applications (Síntese de Oligonucleotídeos: Métodos e Aplicações), P. Herdewijn, ed., 2004; Nucleic Acid Hybridization (Hibridização de Ácido Nucleico) (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Hibridização de Ácido Nucleico: Aplicações Modernas) (Buzdin e Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (Transcrição e Tradução) (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (Cultura de Células Animais) (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, RI (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique (Cultura de Células Animais, um Manual de Técnica Básica), 5th Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (Um Guia Prático para Clonagem Molecular) (3a Edição 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (Metodologias de RNA: Um Guia de laboratório para isolamento e caracterização) (3a Edição 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology (Métodos de Enzimologia: Estrutura de DNA Parte A: Síntese e Análise Física de Métodos de DNA em Enzimologia, Academic Press; Using Antibodies: A laboratory Manual: Portable Protocol NO. I (Utilizando Anticorpos: Um Manual de Laboratório: Protocolo portátil NO. I) por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual (Anticorpos: Um Manual de Laboratório) por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3, 4-2), 1855. Manual de Rastreio de drogas, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nova Iorque, Nova Iorque, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); e Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tolls for Use at the Bench (Ref. Lab.: Um Manual de Receitas, reagentes e outras Ferramentas de referência para uso na bancada), Editado Jane Roskams e Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

[060] Certas formas de realização podem empregar métodos, programas de computador e sistemas convencionais de biologia para fins de diagnóstico da presente invenção. Produtos de programas de computador para computador da invenção incluem tipicamente meio legível por computador tendo instruções executáveis por computador para executar os passos lógicos do método da invenção. Meio legível por computador adequado inclui disquete, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, unidade de disco rígido, memória flash, ROM/RAM, fitas magnéticas e etc. As instruções de computador executáveis podem ser escritas em uma linguagem de computador adequada ou combinação de várias línguas. Métodos de biologia computacional básicos são descritos em, por exemplo Setubal e Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (Introdução a Métodos de Biologia Computacional) (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology (Métodos Computacionais em Biologia Molecular), (Elsevier, Amsterdã, 1998); Rashidi e Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (Bioinformática básica: Aplicação em Ciências Biológicas e Medicina) (CRC Press, London, 2000) e Ouelette e Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of gene and proteins (Bioinformática: Um Guia Prático para Análise de Gene e Proteínas) (Wiley & Sons, Inc., 2a ed., 2001) . Ver Pat. dos EUA No. 6.420.108.

[061] Certas formas de realização podem empregar vários produtos de programas de computador e programas de computador para uma variedade de propósitos, tais como a concepção da sonda, gestão de dados, análise e operação do instrumento. Veja, Pat. dos EUA Nos 5.593.839, 5.795.716, 5.733.729, 5.974.164, 6.066.454, 6.090.555, 6.185.561, 6.188.783, 6.223.127, 6.229.911 e 6.308.170. Os ensaios de diagnóstico

[062] A presente invenção é baseada, em parte, na identificação de novos biomarcadores de câncer de tiroide, os quais permitem a classificação de um tumor da tiroide ou do nódulo como benigno ou canceroso, ou seja, maligno. Por conseguinte, a presente invenção proporciona ensaios de diagnóstico e kits relacionados para análise de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, a fim de determinar se o indivíduo tem câncer de tiroide ou não. Em várias formas de realização, métodos e kits da presente invenção são utilizados para o diagnóstico ou detecção da presença ou ausência de câncer de tiroide em um indivíduo, por exemplo, através da determinação da presença ou ausência de células de câncer de tiroide em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo. Em formas de realização particulares, os métodos e os kits da presente invenção são utilizados para diagnosticar a presença ou ausência de câncer de tiroide em um indivíduo previamente diagnosticado como indeterminado, por exemplo, pela análise citológica.

[063] O crescimento anormal na tiroide pode resultar na formação de nódulos, que podem ser benignos ou cancerosos (por exemplo, malignos). O câncer de tireoide inclui, pelo menos, quatro diferentes tipos de tumores malignos da glândula tireoidiana: papilar, folicular, medular e anaplásico; subtipos malignos incluem, por exemplo, carcinoma folicular (FC), carcinoma papilar da tiroide (PTC), variante folicular do carcinoma papilífero (FVPTC), carcinoma medular da tiroide (MTC), carcinoma de células Hurthle (HC) e carcinoma de tireoide anaplásico (ATC). Exemplos de tumores ou nódulos benignos (não cancerosos) da tireoide incluem, por exemplo, adenoma folicular (FA), hiperplasia nodular (NHP), tireoidite linfocítica (LCT) e adenoma das células Hurthle (HA). Em aspectos da invenção, o câncer de tiroide é um câncer agressivo ou tem potencial metastático, por exemplo, um câncer de tiroide medular ou folicular agressivo ou um câncer de tiroide medular ou folicular com potencial metastático. Em formas de realização particulares da invenção, o câncer de tiroide é o carcinoma da tiroide anaplásico (ATC). "Potencial metastático" refere-se à capacidade ou possibilidade de uma célula de câncer mover a partir do local inicial (isto é, da tiroide) para outros locais no corpo. Uma pessoa versada na técnica irá apreciar que os métodos da presente invenção podem ser prontamente utilizados para diagnosticar ou detectar a presença ou ausência de qualquer destes tumores cancerosos ou condições não-cancerosas da tiroide, utilizando um painel apropriado de amostras de controle de referência.

[064] O termo "diagnose" ou "diagnóstico" ou "diagnosticado" inclui identificação da presença ou natureza de uma condição patológica, tal como o câncer de tiroide, caracterizando o risco de desenvolver uma tal condição, e/ou medindo a alteração (ou nenhuma alteração) de uma condição patológica em resposta à terapia. Os métodos de diagnóstico podem diferir quanto à sua sensibilidade e especificidade. Em certas formas de realização, a "sensibilidade" de um ensaio de diagnóstico refere-se à percentagem de células doentes, tecidos ou indivíduos que testam positivo (por cento de "positivos verdadeiros"). Células doentes, tecidos ou matérias não detectadas pelo ensaio são geralmente referidos como "falsos negativos". Células, tecidos ou matérias que não estão doentes e que testam negativo no ensaio podem ser chamados de "negativos verdadeiros". Em certas formas de realização, a "especificidade" de um ensaio de diagnóstico pode ser definida como um (1) menos a taxa de falsos positivos, em que a taxa de "falso positivo" é definida como a proporção destas amostras ou matérias sem a doença e que apresentem resultados positivos. Enquanto um método de diagnóstico particular pode não proporcionar um diagnóstico definitivo de uma condição, é suficiente se o método fornece uma indicação positiva que auxilie no diagnóstico.

[065] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma sensibilidade maior do que ou igual a 90%, maior do que ou igual a 91%, maior do que ou igual a 92%, maior do que ou igual a 93%, maior do que ou igual a 94%, maior do que ou igual a 95%, maior do que ou igual a 96%, maior do que ou igual a 97%, maior do que ou igual a 98%, ou maior do que ou igual a 99%.

[066] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa com uma especificidade maior do que ou igual a 50%, maior do que ou igual a 60%, maior do que ou igual a 70%, maior do que ou igual a 80%, maior do que ou igual a 90%, ou maior do que ou igual a 95%.

[067] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa, com um valor preditivo positivo maior do que ou igual a 50%, maior do que ou igual a 60%, maior do que ou igual a 70%, maior do que ou igual a 80%, maior do que ou igual a 90%, ou maior do que ou igual a 95%.

[068] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa, com um valor preditivo negativo maior do que ou igual a 90%, maior do que ou igual a 91%, maior do que ou igual a 92%, maior do que ou igual a 93%, maior do que ou igual a 94%, maior do que ou igual a 95%, maior do que ou igual a 96%, maior do que ou igual a 97%, maior do que ou igual a 98%, ou maior do que ou igual a 99%.

[069] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa, com uma razão de probabilidade positiva maior do que ou igual a 2, maior do que ou igual a 3, maior do que ou igual a 4, maior do que ou igual a 5, maior do que ou igual a 6, maior do que ou igual a 7, maior do que ou igual a 8, maior do que ou igual a 10, maior do que ou igual a 15, maior do que ou igual a 20, ou maior do que ou igual a 25.

[070] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa com uma probabilidade de pós-teste positivo maior do que ou igual a 50%, maior do que ou igual a 60%, maior do que ou igual a 70%, maior do que ou igual a 80%, maior do que ou igual a 90%, ou maior do que ou igual a 95%.

[071] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa, com uma razão de probabilidade negativa de menos do que ou igual a 0,20, menos do que ou igual a 0,18, menos do que ou igual a 0,16, menos do que ou igual a 0,14, menos do que ou igual a 0,12, menos do que ou igual a 0,10, menos do que ou igual a 0,08, ou menos do que ou igual a 0,06.

[072] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como benigna ou cancerosa com uma probabilidade de pós-teste negativo de menos do que ou igual a 10,0%, menos do que ou igual a 9,0% ou menos de igual a 8,0%, menos do que ou igual a 7,0%, menos do que ou igual a 6,0%, menos do que ou igual a 5,0%, menos do que ou igual a 4,0% ou menos do que ou igual a 3,0%.

[073] Em formas de realização particulares de métodos e kits da presente invenção, uma amostra de tecido ou nódulo da tiroide é diagnosticada como cancerosa ou benigna com uma sensibilidade maior do que ou igual a 92% ou maior do que ou igual a 97% e uma especificidade maior do que ou igual a 60% ou maior do que ou igual a 90%. Em formas de realização particulares, a ASC é superior a 0,97, com ambos valores de sensibilidade e especificidade maiores ou iguais a 92% e 60%, respectivamente. Em formas de realização particulares, a ASC é superior a 0,97, com ambos valores de sensibilidade e especificidade maiores ou iguais a 92% e 90%, respectivamente. Em formas de realização particulares, a ASC é superior a 0,97, com ambos valores de sensibilidade e especificidade maiores ou iguais a 97% e 90%, respectivamente.

[074] Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico, identificação ou classificação de um câncer, por exemplo, um câncer de tiroide, que compreende os passos de: obtenção de um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna em que o (s) nível (s) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica. Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico, identificação, classificação ou diagnóstico de câncer, por exemplo, câncer de tiroide, que compreende os passos de: obtenção de um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica; e identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer na amostra biológica. Por exemplo, isto pode ser feito por meio da correlação dos níveis de expressão dos produtos de genes na amostra biológica com os níveis dos mesmos produtos de expressão de genes em uma amostra de controle ou um valor de referência, a fim de identificar (ou descartar) a presença de câncer de tireoide na amostra biológica.

[075] Em formas de realização particulares, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico, identificação, ou a classificação de um câncer, por exemplo, um câncer de tiroide, em um indivíduo, que compreende os passos de: realizar um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna, onde o (s) nível (is) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica ou a identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita onde o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer no amostra biológica. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em certas formas de realização, o método compreende ainda a realização da cirurgia, por exemplo, uma tireoidectomia, no indivíduo, se a amostra biológica for determinada ser cancerosa ou maligna. Em formas de realização particulares, o produto e gene é um RNA, e o ensaio compreende PCR, RT- PCR ou PCR quantitativo, ou qualquer outro ensaio para medir quantidades de RNA ou níveis de expressão, incluindo qualquer um desses ensaios aqui descritos. Em formas de realização particulares, o produto de gene é um polipeptídeo, e o ensaio compreende um ensaio de imuno- histoquímica, ou qualquer outro ensaio para medir quantidades de polipeptídeos ou níveis de expressão, incluindo qualquer um dos aqui descritos.

[076] Em formas de realização particulares, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico, identificação ou classificação de um câncer, por exemplo, um câncer de tiroide, em um indivíduo, que compreende os passos de: obtenção de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide a partir de um indivíduo; realização de um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes na amostra biológica; e identificação da amostra biológica como benigna em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica ou a identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita onde o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer na amostra biológica. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em certas formas de realização, o método compreende ainda a realização da cirurgia, por exemplo, uma tireoidectomia, no indivíduo, se a amostra biológica for determinada ser cancerosa ou maligna. Em formas de realização particulares, o produto de gene é um RNA, e o ensaio compreende PCR, RT- PCR ou PCR quantitativo, ou qualquer outro ensaio para medir quantidades de RNA ou níveis de expressão, incluindo qualquer um desses ensaios aqui descritos. Em formas de realização particulares, o produto de gene é um polipeptídeo, e o ensaio compreende um ensaio de imuno- histoquímica, ou qualquer outro ensaio para medir quantidades de polipeptídeos ou níveis de expressão, incluindo qualquer um dos aqui descritos.

[077] Como descrito ainda aqui, em formas de realização particulares, a amostra biológica foi obtida a partir de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo suspeito de ter ou em risco de ter um câncer. Os produtos do gene para o qual a expressão é determinada incluem aqueles aqui descritos, e pode compreender dois ou mais produtos de genes, que podem também ser referidos como um "conjunto de produtos de gene". Os produtos de genes aqui descritos, que podem ser utilizados para determinar a presença ou ausência de câncer, por exemplo, câncer de tiroide, também podem ser referidos como "marcadores".

[078] Em formas de realização particulares, a presente invenção proporciona um método de detecção ou diagnóstico da presença ou ausência de câncer de tiroide em um indivíduo, que compreende determinar um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes em uma amostra de tecido da tiroide obtidos a partir do indivíduo, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7; e identificação da amostra de tecido da tiroide como benigna ou cancerosa, correlacionando os níveis de expressão determinados para a amostra biológica do indivíduo com a presença ou ausência de câncer de tiroide.

[079] A presente invenção inclui um método de tratamento de um indivíduo com essa necessidade, que compreende a execução de uma cirurgia, por exemplo, remoção cirúrgica da tiroide do indivíduo ou uma sua porção (por exemplo, uma tireoidectomia), no indivíduo, se o indivíduo foi determinado ter câncer de tiroide, em que a determinação foi feita por qualquer um dos métodos de diagnóstico da presente invenção. Em formas de realização particulares, um método de tratamento de um indivíduo com essa necessidade compreende a realização de uma cirurgia, por exemplo, uma tireoidectomia, no indivíduo, se o indivíduo foi determinado ter um câncer de tiroide através de um método compreendendo os passos de: realizar um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna, em que a expressão do produto de gene nível (s) indica a ausência de câncer na amostra biológica, ou a identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer na amostra biológica. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em formas de realização particulares, o método compreende ainda a identificação do indivíduo como estando em risco de ter câncer de tiroide pela realização de uma análise citológica ou histoquímica de uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo, por exemplo, por uma agulha de biopsia ou punção aspirativa por agulha fina.

[080] Em formas de realização relacionadas, a presente invenção inclui um método de tratamento de um indivíduo com essa necessidade, compreendendo: determinar se o indivíduo tem um câncer, por exemplo, câncer de tiroide, por qualquer um dos métodos de diagnóstico da presente invenção; e realizar uma cirurgia, por exemplo, a remoção cirúrgica do tumor do indivíduo ou uma sua porção (por exemplo, uma tireoidectomia), se o indivíduo é determinado ter um câncer, por exemplo, câncer de tiroide. Em formas de realização particulares, o método de tratamento de um indivíduo em necessidade do mesmo compreende: (i) determinar se o indivíduo tem um câncer de tiroide através de um método compreendendo os passos de: realizar um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de um amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica, ou a identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer no amostra biológica; e (ii) realização de uma cirurgia, por exemplo, uma tireoidectomia, no indivíduo, se os resultados do passo (i) indicam que o indivíduo tem ou provavelmente tem um câncer, por exemplo, câncer de tireoide. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em formas de realização particulares, o método compreende ainda a identificação do indivíduo como estando em risco de ter câncer de tiroide pela realização de uma análise citológica ou histoquímica de uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo, por exemplo, por uma agulha de biopsia ou punção aspirativa por agulha fina.

[081] Em certas formas de realização, a presente invenção inclui um método de tratamento de um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo: (i) requisição ou obtenção dos resultados de um ensaio de diagnóstico aqui descrito, que foi realizado em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra da tiroide, obtida a partir do indivíduo; e (ii) realização de uma cirurgia, por exemplo, a remoção cirúrgica do tumor do indivíduo ou uma sua porção (por exemplo, uma tireoidectomia), se os resultados do ensaio de diagnóstico indicam que o indivíduo tem um câncer, por exemplo, câncer de tiroide. Em formas de realização particulares, o ensaio de diagnóstico compreende: realizar um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica, ou a identificação da amostra biológica como maligna ou suspeita, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer no amostra biológica. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em formas de realização particulares, o método compreende ainda a identificação do indivíduo como estando em risco de ter câncer de tiroide, solicitando, ou obtendo os resultados de uma análise citológica ou histoquímica de uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo, por exemplo, por uma agulha de biopsia ou punção aspirativa por agulha fina.

[082] Em certas formas de realização, a presente invenção inclui um método para determinar se um indivíduo tem um câncer, por exemplo, um câncer de tiroide, onde um teste inicial, realizado sobre uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo, por exemplo, uma PAAF do tecido da tiroide, foi indeterminado, o método compreendendo a realização de, solicitação, ou obtenção dos resultados de um ensaio de diagnóstico aqui descrito realizado em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra da tiroide, obtida a partir do indivíduo. Em formas de realização particulares, o ensaio de diagnóstico compreende: realizar um ensaio para determinar um nível de expressão de um ou mais produtos de genes de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide; e identificação da amostra biológica como benigna, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene indica uma falta de câncer na amostra biológica, ou a identificação da amostra biológica como maligna ou cancerígena, em que o (s) nível (is) de expressão do produto de gene é indicativo de um câncer no amostra biológica. Em formas de realização particulares, o método compreende a determinação de um nível de expressão de dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes na amostra de tecido da tiroide, em que os dois ou mais, ou três ou mais, produtos de genes são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1 e em que, pelo menos, um dos produtos de gene é expresso por um gene CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7.

[083] Em formas de realização particulares de qualquer um dos métodos da invenção, a correlação é realizada por comparação do (s) nível (is) de expressão dos produtos de genes na amostra do indivíduo a um nível de expressão de controle ou de referência para cada produto de gene examinados. A amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa, se existe uma diferença significativa no nível de expressão dos produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de controle ou de referência normais. Em certas formas de realização, a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa, se existe uma diferença significativa no nível de expressão de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e um nível de expressão de controle ou de referência normal. Da mesma forma, a amostra de tecido da tiroide é identificada como benigna, se não há nenhuma diferença significativa (isto é, não existe semelhança significativa) no nível de expressão dos produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de controle ou de referência normais. Em certas formas de realização, a amostra de tecido da tiroide é identificada como benigna, se não há nenhuma diferença significativa no nível de expressão de dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e um controle normal ou níveis de expressão de referência.

[084] Em certas formas de realização de qualquer um dos métodos aqui descritos, a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa, se o nível de expressão de qualquer um ou mais dos genes 1, 8, 9, 13, 14, 15 e/ou 18 é reduzido; e/ou o nível de expressão de qualquer um ou mais dos genes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 16 e/ou 17 é aumentado na amostra de tecido da tireoide em comparação com o nível de expressão de controle normal, em que o número total de genes com expressão aumentada ou reduzida é de, pelo menos, três. A identidade de cada gene é a seguinte: CXCR3 (Gene 1), CXCR3A (Gene 2), CXCR3B (Gene 3), CXCR4 (Gene 4), CCR3 (Gene 5), CXCL9 (Gene 6), CXCL10 (Gene 7), CXCL11 (Gene 8), SPAG-9 (Gene 9), CK-19 (Gene 10), TIMP-1 (Gene 11), CLDN-1 (Gene 12), CAR (Gene 13), Nectin-1 (Gene 14), XB-130 (Gene 15), HO-1 (Gene 16), CCR7 (Gene 17) e CXCL4 (Gene 18). Em outras formas de realização de qualquer um dos métodos aqui descritos, uma amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa, se o nível de expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais produtos de gene de qualquer um dos subgrupos de genes aqui descritos é alterado, como descrito acima. Em formas de realização particulares, o conjunto de genes inclui um ou mais de CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7.

[085] Em formas de realização particulares, a correlação é realizada por comparação dos níveis de expressão dos produtos de genes na amostra obtida a partir do indivíduo para níveis de referência, utilizando um algoritmo. Os níveis de referência podem incluir os níveis de expressão para cada produto de gene previamente determinado a partir de uma pluralidade de amostras biológicas cancerosas e/ou não-cancerosas.

[086] Em certas formas de realização, a correlação compreende a comparação do nível de expressão de determinados níveis de expressão de genes com os produtos de gene para os seguintes dois conjuntos de amostras biológicas: uma pluralidade de amostras de tecidos normais da tiroide; e uma pluralidade de amostras de tecido canceroso da tiroide, em que a amostra de tecido da tiroide é identificada como cancerosa, se existe uma diferença significativa no nível de expressão dos produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de gene para a pluralidade de amostras de tecidos normais da tiroide, ou se não há substancialmente qualquer diferença no nível de expressão do gene dos produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão do gene para a pluralidade de amostras de tecido canceroso da tiroide.

[087] Em formas de realização particulares de qualquer um dos métodos e kits da presente invenção, os dois ou mais, ou três ou mais produtos de genes para os quais os níveis de expressão são determinados compreendem ou consistem de: dois ou mais, ou três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7; os produtos dos genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; os produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; os produtos dos genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou os produtos do gene dos genes CXCL10 , TIMP-1, CLDN-1, e CCR7.

[088] Em formas de realização particulares de qualquer um dos conjuntos de produtos de genes acima referidos, os dois ou mais, ou três ou mais produtos de gene incluem um ou mais de CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em formas de realização particulares, os produtos de gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene CXCR3. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene CCR3. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene CXCL10. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene CAR. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene XB130. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene HO-1. Em formas de realização particulares, os produtos do gene incluem um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos genes listados na Tabela 1, e, pelo menos, um dos produtos de genes é expresso por um gene CCR7.

[089] Em várias formas de realização, os métodos da presente invenção também incluem o passo de realizar uma análise histológica ou citológica em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide, obtida a partir do indivíduo, por exemplo, para se obter um diagnóstico preliminar. A análise citológica ou histológica pode ser realizada antes de, concorrentemente com, ou subsequente à realização de análises com base na expressão de produtos de genes, tal como aqui descrito. Em certas formas de realização, as amostras com um diagnóstico preliminar de intermediário ou indeterminado são ainda analisadas pelos métodos da presente invenção.

[090] Em formas de realização particulares de métodos da presente invenção, os métodos compreendem ainda a obtenção de uma amostra biológica a partir do indivíduo.

[091] Em certas formas de realização dos métodos da presente invenção, os métodos compreendem ainda o tratamento do indivíduo para o câncer de tiroide, se o paciente é diagnosticado como tendo câncer de tiroide. Em certas formas de realização, o tratamento compreende a remoção cirúrgica de tiroide do indivíduo ou uma porção da mesma.

[092] A presente invenção também inclui métodos e kits úteis para a caracterização de câncer de tiroide. Tal como aqui utilizado, o termo "caracterização de câncer de tiroide" em um indivíduo refere-se à identificação de uma ou mais propriedades de uma amostra de câncer em um indivíduo, por exemplo, um tipo específico de câncer de tireoide, e também pode incluir a determinação do prognóstico ou sobrevivência do indivíduo. Os cânceres podem ser caracterizados pela identificação da expressão de um ou mais marcadores, incluindo mas não se limitando a, os produtos de genes aqui divulgados. O versado na técnica irá apreciar que os métodos gerais aqui descritos podem ser facilmente adaptados para determinar o tipo de câncer de tiroide, por exemplo, através da comparação dos níveis de expressão dos produtos de genes àqueles determinados para vários tipos de câncer de tiroide. Com base na determinação do tipo de câncer de tireoide, o prognóstico, a sobrevivência e/ou a probabilidade de metástases podem ser determinados ou estimados, por exemplo, com base em dados históricos ou resultados.

Amostras Biológicas

[093] Em certas formas de realização, os métodos da presente invenção utilizam uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, e certos métodos incluem a obtenção de uma amostra biológica a partir de um indivíduo. A amostra biológica pode ser qualquer material que contenha tecidos, células, ácidos nucleicos, genes, fragmentos de genes, produtos de expressão, produtos de genes (por exemplo, RNAm ou proteínas), ou fragmentos do produto de gene de um indivíduo a ser testado. Os métodos para a determinação da adequação e/ou adequabilidade da amostra são fornecidos. Uma amostra pode incluir, mas não está limitada a, tecido, células ou material biológico de células ou derivados de células de um indivíduo. A amostra pode ser uma população homogênea ou heterogênea de células ou tecidos. Em certas formas de realização, a amostra biológica é uma amostra de tecido, por exemplo, uma amostra obtida a partir da tiroide ou um nódulo da tiroide de um indivíduo. Um nódulo de tireoide é um tumor na glândula tireoide. Em formas de realização particulares, uma amostra biológica compreende os produtos e genes, por exemplo, ácidos nucleicos, tais como RNAm e/ou proteínas.

[094] Em várias formas de realização, o indivíduo é um animal (por exemplo um mamífero), incluindo mas não se limitando a seres humanos, primatas não humanos, roedores, cães, gatos, suínos, peixes e outros semelhantes. Em formas de realização particulares, os presentes métodos e composições aplicam-se as amostras biológicas de seres humanos. Em algumas formas de realização, o ser humano é uma criança, um adolescente ou um adulto. Em formas de realização particulares, o indivíduo foi determinado estar em risco de ter ou é suspeito de ter um tumor da tiroide.

[095] O termo "indivíduo suspeito de ter" o câncer de tireoide refere-se a um indivíduo que apresenta um ou mais sintomas indicativos de um câncer de tireoide (por exemplo, um nódulo ou massa visível) ou está sendo examinado para um câncer (por exemplo, durante um exame de rotina). Por exemplo, um indivíduo pode ter sido determinado ter uma tireoide aumentada e/ou um ou mais nódulos da tireoide. Um indivíduo suspeito de ter carcinoma da tiroide pode também ter um ou mais fatores de risco. Um indivíduo com suspeita de câncer de tireoide abrange indivíduos que tenham recebido um diagnóstico inicial, mas para quem o estágio do câncer não é conhecido. O termo inclui ainda as pessoas que tiveram uma vez câncer (por exemplo, um indivíduo em remissão). Além disso, certos indivíduos podem ter sido previamente testados para tumor da tireoide, mas os resultados foram inconclusivos ou indeterminados.

[096] Tal como aqui utilizado, o termo "indivíduo em risco de câncer de tiroide" refere-se a um indivíduo com um ou mais fatores de risco para o desenvolvimento de câncer de tiroide, em particular câncer de tiroide agressivo ou metastático, mais particularmente ATC. Os fatores de risco incluem, mas não estão limitados a, sexo, idade, predisposição genética, exposição ambiental, incidentes anteriores de câncer, doenças preexistentes não-cancerosas, e estilo de vida.

[097] A amostra biológica pode ser obtida utilizando qualquer método conhecido na técnica que pode fornecer uma amostra adequada para os métodos de análise aqui descritos. Métodos de obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo incluem, mas não se limitam a, métodos de biópsia incluindo punção aspirativa por agulha fina (PAAF), aspiração por agulha, biópsia de fragmento com agulha, biópsia assistida por vácuo, biópsia incisional, biópsia excisional ou biópsia dirigida. Em formas de realização particulares, métodos e kits da presente invenção utilizam amostras biológicas obtidas por PAAF. Métodos de obtenção de amostras adequadas de tiroide são conhecidos na técnica e encontram-se descritos nas Orientações ATA para a gestão de nódulo da tireoide (Cooper et al. Vol tiroide. 16 No. 2, 2006), aqui incorporado por referência na sua totalidade. Métodos genéricos para a obtenção de amostras biológicas também são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo Ramzy, Ibrahim Citopatologia Clínica e a Biópsia por Aspiração de 2001, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em uma forma de realização, a amostra é um aspirado de agulha fina de uma glândula tiroide, um nódulo da tiroide ou suspeita de um tumor da tiroide. Em alguns casos, o processo de amostragem de punção aspirativa por agulha fina pode ser guiado pela utilização de um ultrassom, raios-X, ou outro dispositivo de geração de imagem.

[098] Em alguns casos, várias amostras biológicas, tais como múltiplas amostras da tiroide, podem ser obtidas para diagnóstico pelos métodos da presente invenção, por exemplo, nos mesmos ou diferentes momentos. Em alguns casos, uma amostra, ou amostras obtidas nos mesmos ou em tempos diferentes, são armazenadas e/ou analisadas por meio de métodos diferentes. Por exemplo, uma amostra pode ser obtida e analisada por análise citológica (coloração de rotina). Em alguns casos, uma amostra adicional pode ser obtida a partir de um indivíduo, ao mesmo tempo ou mais tarde, por exemplo, com base nos resultados de uma análise citológica. A outra amostra pode ser utilizada em um método da presente invenção, por exemplo, quando a análise citológica não foi possível determinar em relação à presença ou ausência de câncer. Em outras formas de realização dos métodos da presente invenção, uma única amostra pode ser obtida e uma porção da amostra analisada por análise citológica, enquanto que uma outra porção da amostra é analisada por métodos da presente invenção.

[099] Em certas formas de realização, uma amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo por um profissional médico, por exemplo, em um hospital, consultório médico, centro de testes ou laboratório. Em certas formas de realização, uma amostra biológica pode ser obtida utilizando um kit, que pode conter um meio para a obtenção de uma amostra tal como aqui descrito, um meio para armazenar a amostra e instruções para utilização do kit. Em alguns casos, o kit é fornecido por um serviço de perfil molecular, que também pode realizar um ensaio de diagnóstico com a amostra biológica.

[0100]Em formas de realização particulares, uma amostra biológica é armazenada durante um tempo tal como segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses, anos ou mais, após a amostra ser obtida e antes da amostra ser analisada por um ou mais dos métodos da invenção. Em alguns casos, a amostra obtida de um indivíduo é subdividida antes do passo de armazenamento ou uma análise mais aprofundada de tal modo que diferentes partes da amostra são sujeitas a diferentes métodos ou processos a jusante, incluindo mas não se limitando a armazenagem, análise citológica, testes de adequação, extração de ácido nucleico, extração de proteínas, perfis moleculares ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, uma porção da amostra é armazenada, enquanto uma outra porção da referida amostra é ainda manipulada. Estas manipulações podem incluir, mas não estão limitados a: perfil molecular; coloração citológica; extração, detecção ou quantificação de ácido nucleico (por exemplo, RNAm); extração, detecção ou quantificação de proteína; fixação (por exemplo, amostras embebidas parafina fixada em formalina); e/ou exame. A amostra pode ser fixada antes de ou durante o armazenamento por qualquer método conhecido na técnica, tal como a utilização de glutaraldeído, formaldeído ou metanol. Em outros casos, a amostra é obtida e armazenada e subdividida após o passo de armazenamento para posterior análise, tal que porções diferentes da amostra são sujeitas a diferentes métodos ou processos a jusante, incluindo mas não se limitando a armazenagem, análise citológica, testes de adequação, extração de ácido nucleico, extração de polipeptídeo, perfil molecular, determinação da expressão de um ou mais produtos de genes ou uma sua combinação. Em alguns casos, as amostras são obtidas e analisadas através de, por exemplo, análise citológica e o material de amostra resultante é ainda analisado por um ou mais métodos da presente invenção, que compreende a determinação de níveis de produtos de genes aqui descritos, por exemplo, por expressão de perfil molecular. Em tais casos, as amostras podem ser guardadas entre os passos de análise citológica e os passos de determinar os níveis de expressão do produto do gene, por exemplo, por perfis moleculares. Em certas formas de realização, as amostras podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, a cerca de qualquer de 0°C, 1°C, - 2°C, -3°C, -4°C, - 5°C, -6°C, -7°C, -8°C, -9°C, -10°C, - 30°C, -35°C, -40°C, -45°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, - 100°C, -120°C, -140°C, -180°C, -190°C ou cerca de -200°C) ou a temperaturas reduzidas (por exemplo, entre cerca de 20°C e cerca de 0°C) em um meio, excipiente ou uma solução apropriada, tal como, por exemplo, uma preparação comercial adequada para o armazenamento de células para análise citológica subsequente, tais como, mas não limitado a, Cytyc ThinPrep, SurePatch ou Monoprep.

[0101] Durante ou após a obtenção da amostra, incluindo antes ou depois de um passo de armazenar a amostra, a amostra biológica pode ser avaliada quanto à sua aptidão para utilização nos métodos e composições da presente invenção. A amostra pode ser determinada a ser adequada ou inadequada para posterior análise devido a muitos fatores, incluindo, mas não limitados a: células insuficientes, material genético insuficiente, proteínas, DNA, ou RNA insuficientes, células inadequadas para o teste indicado, ou material inapropriado para o teste indicado, idade da amostra, maneira pela qual se obteve a amostra, ou modo em que a amostra foi armazenada ou transportada. A adequação pode ser determinada utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como um procedimento de coloração celular, medição do número de células ou quantidade de tecido, medição do total de proteína, medição do ácido nucleico, exame visual, exame microscópico, ou determinação de temperatura ou do pH. Em uma forma de realização, a adequação da amostra é determinada a partir dos resultados da realização de um experimento de análise de nível de produto de gene.

[0102]Exemplos de métodos para a determinação em que um número adequado de um tipo específico de célula está presente incluem PCR, PCR quantitativa, RT-PCR, análise imuno-histoquímica, análise citológica, microscópica e/ou análise visual.

[0103]As amostras podem ser analisadas por determinação do teor de ácido nucleico após extração da amostra biológica utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, absorvância no ultravioleta, incluindo mas não se limitando a absorvância a 260 nanômetros, utilizando um espectrofotômetro. Em certas formas de realização, a quantidade de RNA ou rendimento de uma determinada amostra é medido utilizando um espectrofotômetro NanoDrop em um intervalo de nano- a micro- gramas. Em algumas formas de realização, a qualidade do RNA é medida utilizando um instrumento Agilent Bioanalyzer 2100, e é caracterizada por um número de integridade do RNA calculado (RIN, 1-10). O número de integridade do RNA (RIN) é um algoritmo para atribuir valores de integridade para medições de RNA. O algoritmo de RIN é aplicado às medições de RNA eletroforéticas e com base em uma combinação de diferentes características que contribuem informações sobre a integridade do RNA para fornecer uma medida universal mais robusta. O algoritmo atribui uma pontuação de 1 a 10 RIN, onde o nível de 10 RNA é a mais alta qualidade. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de analisar a expressão do gene a partir de uma amostra com um valor de RIN de RNA igual ou menor do que 6,0, igual ou menor do que 5, ou igual ou menor do que 4. Em algumas formas de realização, uma amostra contendo RNA com um número de RIN de cerca de qualquer de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 ou 6,0 é analisada utilizando os presentes métodos e algoritmos da presente invenção.

[0104]Em algumas formas de realização, o teor de proteína na amostra biológica é medido utilizando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não se limitando a: absorvância de ultravioleta a 280 nanômetros, coloração celular, ou coloração de proteína com, por exemplo, azul de Coomassie ou ácido bicinconínico. Em alguns casos, a proteína é extraída a partir da amostra biológica antes da medição da amostra.

[0105]Em formas de realização particulares, as amostras são processadas através de qualquer método conhecido e disponível na técnica, por exemplo, para isolar os produtos dos genes a partir da amostra biológica. Em certas formas de realização, os produtos do gene são selecionados a partir de ácidos nucleicos (por exemplo, RNA, incluindo RNAm e proteínas).

Análise citológica

[0106]A análise citológica de amostras biológicas pode ser realizada, por exemplo, por coloração celular combinada com o exame microscópico das células na amostra biológica. A coloração celular, ou exame citológico, pode ser realizada por uma série de métodos e reagentes adequados conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a: coloração EA, coloração de hematoxilina, citostain, coloração de Papanicolau, eosina, coloração de Nissl, azul de toluidina, coloração de prata, coloração de azocarmine, vermelho neutro, ou verde jânus. Em alguns casos, as células são fixadas e/ou permeabilizadas, por exemplo, utilizando-se metanol, etanol, glutaraldeído ou formaldeído, antes ou durante o processo de coloração, enquanto que em outros, elas não são. O teor de ácido nucleico pode ou não pode ser realizado, por exemplo, utilizando um procedimento de coloração, por exemplo, com brometo de etídio, hematoxilina, coloração de Nissl ou qualquer coloração de ácido nucleico conhecida na técnica.

[0107]Em algumas formas de realização, as células podem ser espalhadas em uma lâmina através de métodos padrão bem conhecidos na técnica para exame citológico. Em outros casos, podem ser utilizados métodos de citologia em meio líquido (LBC). Em métodos LBC, as amostras biológicas são transferidas a partir do indivíduo para um recipiente ou frasco contendo uma solução de preparação de citologia em meio líquido tal como, por exemplo Cytyc ThinPrep, SurePatch, ou Monoprep ou qualquer outra solução de preparação de citologia em meio líquido conhecida na técnica. Além disso, a amostra pode ser lavada a partir do dispositivo de recolha com uma solução de preparação de citologia em meio líquido para dentro do recipiente ou frasco para assegurar uma transferência substancial quantitativa da amostra. A solução que contém a amostra biológica em solução de preparação de citologia em meio líquido pode então ser armazenada e/ou processada por uma máquina ou por uma pessoa versada na técnica para produzir uma camada de células em uma lâmina de vidro. A amostra pode ser adicionalmente corada e examinada ao microscópio da mesma forma como uma preparação citológica convencional.

[0108]Em algumas formas de realização, as amostras podem ser analisadas por coloração imuno-histoquímica. A coloração imuno-histoquímica fornece para a análise de presença, localização e distribuição de moléculas ou antígenos específicos através da utilização de anticorpos em uma amostra biológica (por exemplo, células ou tecidos). Os antígenos podem ser pequenas moléculas, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou qualquer outra molécula capaz de ser reconhecida especificamente por um anticorpo. As amostras podem ser analisadas por métodos de imuno- histoquímica com ou sem fixação prévia e/ou passo de permeabilização. Em alguns casos, o antígeno de interesse pode ser detectado por contato da amostra com um anticorpo específico para o antígeno e, em seguida, a ligação não específica pode ser removida por uma ou mais lavagens. Os anticorpos ligados especificamente podem então ser detectados por um reagente de detecção de anticorpos, tal como, por exemplo, um anticorpo secundário marcado, ou um avidina/estreptavidina marcado. Em alguns casos, o anticorpo específico para o antígeno pode ser marcado diretamente, em vez disso. Marcadores adequados para imuno- histoquímica incluem, mas não estão limitados a fluoróforos tais como fluoresceína e rodamina, enzimas tais como fosfatase alcalina e peroxidase de rábano, e radionuclídeos tais como 32P e 125I. Exemplos de marcadores de produto de gene que podem ser detectados por coloração imuno- histoquímica incluem mas não estão limitados ao Her2/Neu, Ras, Rho, EGFR, VEGFR, UbcHIO, RET/PTC1, citoqueratina 20, calcitonina, Gal-3, peroxidase da tiroide e tireoglobulina.

[0109]Os resultados do exame citológico de rotina podem indicar uma amostra biológica como negativa (livre do câncer), ambígua ou suspeita (sugestivo da presença de um câncer), diagnóstico (diagnóstico positivo para o câncer), ou não-diagnóstico ou indeterminado (fornecimento de informações inadequadas a respeito da presença ou ausência de câncer). Os resultados de diagnóstico podem ser classificados como benignos ou malignos. Em alguns casos, os resultados de diagnóstico podem ser indicativos de um tipo particular de câncer ou uma condição, tal como qualquer uma das doenças ou condições aqui descritas.

Genes e Produtos de Genes

[0110]Em várias formas de realização, os métodos da presente invenção incluem perfis moleculares de uma amostra biológica, por exemplo, por meio da determinação dos níveis de expressão de produtos de genes expressos por qualquer um dos genes ou conjuntos de genes aqui identificados. Os produtos gênicos incluem, mas não estão limitados a, RNAm e proteína expressa a partir do gene. Os produtos gênicos (também referidos como "produtos de expressão de genes") para os quais os níveis de expressão são determinados, medidos ou analisados de acordo com os métodos da presente invenção, compreendem ou consistem em produtos de genes expressos por um ou mais, dois ou mais, de três ou mais, ou quatro ou mais genes apresentados na Tabela 1, bem como variantes ou homólogos destes (ou seja, os genes correspondentes de outras espécies). Os produtos do gene para o qual a expressão é determinada pode ser exclusivamente produtos de genes expressos por genes da Tabela 1 (ou variantes destes) ou homólogos, ou podem incluir um ou mais produtos de genes, incluindo qualquer previamente ligado ao câncer de tiroide e os descritos, por exemplo, nos pedidos de patente PCT WO2011/032296, WO2011/143361, ou WO2010/056374. A Tabela 1 fornece os nomes e números de acesso das sequências ilustrativas, para os genes humanos. Os correspondentes genes de outras espécies estão prontamente disponíveis. TABELA 1. GENES

[0111]Em formas de realização particulares, os métodos da presente invenção compreendem a determinação de um nível de expressão de produtos do gene de dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais dos genes mostrados na Tabela 1 em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide. Em certas formas de realização, o método compreende a determinação de um nível de expressão de produtos do gene de, pelo menos um, pelo menos dois, ou pelo menos três genes selecionados de entre os genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 e CCR7. Em uma forma de realização, os níveis de expressão foram determinados para produtos de genes que compreendem ou que consistem em produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7. Em outras formas de realização, os níveis de expressão foram determinados para produtos de genes que compreendem ou que consistem em: produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou produtos de genes da CXCL10, genes TIMP-1, CLDN-1, e CCR7. Os conjuntos particulares de produtos de gene para o qual a expressão é determinada pode ser referido como um "conjunto" de produtos de genes, e os genes particulares para as quais é determinada a expressão pode ser referido como um "conjunto de genes". Em certas formas de realização, o nível de um mesmo tipo de produto do gene, por exemplo, RNAm ou proteína de expressão, é determinado para cada conjunto de gene utilizado de acordo com um método da presente invenção. Assim, em formas de realização particulares, o nível de um só tipo de produto de gene, por exemplo expressão de RNAm ou proteína, é determinado na prática de um método da presente invenção, em uma amostra de tecido particular. No entanto, está contemplado que os métodos da presente invenção podem ser praticados em que os níveis de expressão de dois ou mais tipos diferentes de produtos de genes, por exemplo tanto de RNAm quanto de proteína, são determinados para cada gene de um conjunto de genes a ser utilizado.

Medição dos níveis de Produtos de Gene

[0112]O nível de expressão de produtos de genes pode ser determinado por quaisquer meios adequados disponíveis na técnica, e dependerá principalmente do tipo de produto de gene a ser medido. Por exemplo, os reagentes para a detecção de produtos de genes pode medir a expressão de RNA, a expressão da proteína, a atividade da proteína ou funções biológicas a jusante da proteína codificada pelos genes aqui descritos. Assim, a presente invenção inclui os reagentes para a detecção de tais genes ou produtos de genes das mesmas, incluindo ácidos nucleicos, sondas de DNA, ou anticorpos que se ligam às proteínas codificadas, e semelhantes.

[0113]Os níveis de expressão da proteína podem ser determinados, por exemplo, por imuno-histoquímica utilizando anticorpos que se ligam especificamente a produtos de genes de proteína. Em certas formas de realização, os níveis de expressão de proteína são determinados utilizando uma matriz de polipeptídeo ou uma matriz de anticorpo. Certas formas de realização podem empregar metodologias e detectores padrão, tal como transferência Western e imunoprecipitação, ensaios ligados a enzima (ELISA), citometria de fluxo, e ensaios de imunofluorescência (IFA), que utilizam um dispositivo de geração de imagem. Estes métodos bem conhecidos utilizam tipicamente um ou mais anticorpos monoclonais ou policlonais ou seus fragmentos, que se ligam especificamente a um produto de gene de polipeptídeo alvo selecionado da invenção, ou uma região única desse polipeptídeo, e geralmente não se liga significativamente a outras polipeptídeos. Um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, é dito "se ligar especificamente", "se ligar imunologicamente" e/ou é "imunologicamente reativo" a um polipeptídeo da invenção que reage a um nível detectável (dentro, por exemplo, de um ensaio de ELISA) com o polipeptídeo, e que não reage de forma detectável, de uma maneira estatisticamente significativa, com polipeptídeos não relacionados sob condições semelhantes.

[0114] Certas formas de realização podem empregar "arranjos", tais como "micro arranjos". Em certas formas de realização, um "micro arranjo" pode também referir-se a um "micro arranjo de peptídeo" ou "micro arranjo de proteína" tendo uma coleta ligada ao substrato ou uma pluralidade de polipeptídeos, a ligação à cada um da pluralidade de polipeptídeos ligados sendo separadamente detectável. Alternativamente, o micro arranjo de peptídeo pode ter uma pluralidade de ligantes, incluindo, mas não limitados a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, ligantes de exibição em fagos, ligantes de levedura 2, híbridos e aptâmeros, que podem especificamente detectar a ligação dos produtos de gene de polipeptídeo aqui descritos. O arranjo pode ser baseado na detecção de auto-anticorpos de polipeptídeos, tal como descrito, por exemplo, em Robinson et al., Nature Medicine 8(3):295-301 (2002). Exemplos de arranjos de peptídeos podem ser encontrados em WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210 e WO 97/42507 e Pat. dos EUA Nos 6.268.210, 5.766.960, e 5.143.854, cada um dos quais são incorporados por referência.

[0115] Certas formas de realização podem empregar espectrometria de massa (EM) ou outros métodos baseados no peso molecular para detectar, diagnosticamente, produtos de genes de polipeptídeo. Em refere-se geralmente a uma técnica analítica para determinar a composição elementar de uma amostra ou molécula. Em também pode ser utilizada para determinar as estruturas químicas das moléculas, tais como peptídeos e outros compostos químicos. Um instrumento de EM ilustrativo tem três módulos: uma fonte de íons, a qual converte as moléculas de amostra de fase gasosa em íons (ou, no caso de ionização por eletropulverização, move os íons que existem em solução na fase gasosa); um analisador de massa, que classifica os íons por suas massas através da aplicação de campos eletromagnéticos; e um detector, que mede o valor de uma quantidade de indicador e, assim, fornece dados para calcular a abundância de cada íon presente. A técnica de EM tem utilizações tanto qualitativas como quantitativas, incluindo quantificar a quantidade de um produto de gene de polipeptídeo em uma amostra. Incluem-se cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG/EM ou CG-EM), cromatografia líquida- espectrometria de massa (CL/EM ou CL-EM) e espectrometria de mobilidade iônica/espectrometria de massa (EMI/EM ou IMMS). Por conseguinte, as técnicas de EM podem ser utilizadas de acordo com qualquer dos métodos aqui proporcionados para medir os níveis de produto de gene de polipeptídeo em uma amostra, e, opcionalmente, para comparar estes níveis com uma amostra de controle ou um valor predeterminado.

[0116] Certas formas de realização podem utilizar dispositivos/técnicas de ordenação celular ou de visualização celular ou de imagem para detectar ou quantificar a presença ou níveis de produtos de genes em uma amostra. Exemplos incluem a citometria de fluxo ou FACS, análise de imunofluorescência (IFA), e técnicas de hibridização in situ, tais como hibridização in situ fluorescente (FISH).

[0117]Em certas formas de realização, os métodos da invenção incluem um passo de detecção de um produto de gene de polipeptídeo ou determinação ou medição de uma quantidade de um produto de gene de polipeptídeo que compreende o contato da amostra biológica com uma ou mais sondas (por exemplo, polipeptídeos ou anticorpos) que se ligam aos produto de gene de polipeptídeo sob condições e por um tempo suficiente para que tal ligação ocorra, e, em seguida, a detecção de uma quantidade do produto de gene de polipeptídeo que está ligado à (s) sonda (s), por exemplo, uma quantidade do complexo de sonda e o produto de gene de polipeptídeo. A detecção pode ser realizada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica e podem empregar o uso de marcadores detectáveis, por exemplo, unidades de imunofluorescência. Em certas formas de realização, a sonda é marcada de forma detectável. Em certas formas de realização, o produto de gene de polipeptídeo ligado é detectado em solução ou em um suporte sólido.

[0118]Os métodos da invenção podem incluir um passo de isolamento de um ou mais produtos de genes a partir de uma amostra biológica, por exemplo, antes ou durante a determinação da quantidade de produtos de genes particulares na amostra. Em certas formas de realização, os produtos de genes a serem detectados são polipeptídeos, e polipeptídeos são purificados ou parcialmente purificados a partir da amostra biológica. Em certas formas de realização, os produtos dos genes a serem detectados são RNAm, e polinucleotídeos ou RNAm são purificados ou parcialmente purificados a partir da amostra biológica. Métodos de purificação ou purificação parcial de polipeptídeos ou polinucleotídeos de uma amostra biológica são conhecidos na técnica.

[0119]Os níveis de expressão de ácido nucleico podem ser determinados utilizando uma variedade de ensaios diferentes, incluindo mas não se limitando a ensaios de amplificação e ensaios de hibridização. Os ensaios de amplificação úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo ensaios de PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) e PCR em tempo real, e os métodos de amplificação isotérmica. Os ensaios de hibridização incluem, mas não estão limitadas a, Northern blot, reação em cadeia da polimerase quantitativa ou qualitativa (PCR), PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa ou qualitativa, micro arranjo, dot ou slot blots, e a hibridização in situ bem como a hibridização in situ fluorescente (FISH).

[0120] Certas formas de realização podem empregar métodos de hibridização para a medição da expressão de um produto de gene de polinucleotídeo, tal como RNAm. Os métodos para realização de ensaios de hibridização de polinucleotídeo foram bem desenvolvidos na técnica. Procedimentos e condições de ensaio de hibridização variarão dependendo da aplicação e serão selecionados de acordo com os métodos gerais de ligação conhecidos, incluindo os referidos em: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonagem molecular: Um Manual de Laboratório) (2a Ed Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989); Berger e Kimmel, Methods in Enzymology (Métodos em Enzimologia) Vol. 152, Guide to Molecular CLoning techniques (Guia de técnicas de clonagem molecular) (Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia, 1987); Young e Davis, PNAS. 80:1194 (1983). Métodos e aparelhos para a realização de reações de hibridização repetidas e controladas foram descritas nas Patentes dos EUA Nos 5.871.928, 5.874.219, 6.045.996 e 6.386.749, 6.391.623 cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

[0121] Certas formas de realização podem empregar técnicas de codificação de barra moleculares, tais como a comercialmente disponível a partir de NanoString Technologies Inc. (Seattle, WA, EUA) sob o nome de marca nCounter Gene Expression Assay. Esta tecnologia permite que os níveis de expressão alvo sejam diretamente testados a partir de amostras como complexos tal como lisados de tecido, sem a necessidade de amplificação de transcrição. Neste método, uma sonda de captura biotinilada e uma sonda repórter de código de barras (codificados por cores) são especificamente hibridizados diretamente a um gene alvo de interesse. A seguir à remoção do excesso de sonda não ligada, os complexos sonda/alvo são imobilizados e alinhados em cartuchos nCounter, e, em seguida, as imagens digitais são adquiridas e quantificadas, cada contagem de código de barras representa uma cópia de transcrição do gene alvo correspondente. Mais importante, o uso deste método de barra de codificação permite a detecção múltipla de mais de 500 genes em uma única reação de amostra com elevada reprodutibilidade.

[0122] Certas formas de realização podem medir a expressão de RNA utilizando o método de análise de transcrição e de captura por afinidade (TRAC), em que a detecção multiplexada de espécies de RNA expressas pode ser realizada diretamente em lisados celulares ou em amostras de RNA total purificadas, sem a necessidade de qualquer transcrição reversa ou de amplificação. Neste novo procedimento, sondas específicas para gene de oligo-dT biotinilada e marcadas com fluoróforo dual, cada uma das sondas com tamanhos muito diferentes, são hibridizadas com os RNAm em uma determinada amostra. O material hibridizado é ligado a esferas de estreptavidina magnéticas, lavado, liberado, e, em seguida, resolvido por meio de eletroforese capilar. Assim, identificação e quantificação alvo é conseguida simultaneamente por análise dos perfis de tamanho de sonda/alvo e de fluorescência.

[0123] Certas formas de realização podem empregar ensaios quantitativos de proteção de nuclease (qNPA) ou micro arranjos de qNPA, tais como os comercialmente disponíveis a partir de High Throughput Genomics Molecular Diagnostics Inc (Tucson, AZ, EUA), em que a hibridização de sondas específicas de genes para RNA expressos protege complexos transcritos/sonda da digestão pela ribonuclease S1 específica de cadeia simples. Após o tratamento de S1 e dissociação do complexo sonda/alvo mediado por uma base, as sondas restantes existem em uma estequiometria 1:1 para as suas sequências alvo correspondentes, e, assim, a quantificação através de sondas de captura na superfície do micro arranjo permite inferir os correspondentes níveis de expressão de sequências alvo.

[0124] Certas formas de realização podem utilizar métodos de amplificação de ácidos nucleicos para a detecção de produtos de genes. O termo "amplificação" ou "amplificação de ácido nucleico" refere-se à produção de múltiplas cópias de, pelo menos, uma porção de uma sequência de ácido nucleico alvo. As múltiplas cópias podem ser referidas como amplificações ou produtos de amplificação. "Amplificação seletiva" ou "amplificação específica", tal como aqui utilizado, refere-se à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo de acordo com a presente invenção, em que a amplificação detectável da sequência alvo é substancialmente limitada à amplificação da sequência alvo contribuída por uma amostra de ácido nucleico de interesse que está sendo testada e não é contribuída pela sequência de ácido nucleico alvo contribuída de alguma outra fonte de amostra, por exemplo, a contaminação presente em reagentes utilizados durante as reações de amplificação ou no ambiente em que as reações de amplificação são realizadas.

[0125]O termo "condições de amplificação" refere-se a condições que permitem à amplificação de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Os oligonucleotídeos utilizados nas reações de amplificação da presente invenção hibridizam com os seus alvos pretendidos, sob condições de amplificação. Condições aceitáveis para realizar as amplificações de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser facilmente determinadas por alguém com conhecimentos correntes na técnica, dependendo do método particular de amplificação empregue.

[0126]Muitos métodos conhecidos de amplificação de ácido nucleico necessitam de termociclização para desnaturar alternadamente ácidos nucleicos de cadeia dupla e hibridizar iniciadores; no entanto, outros métodos conhecidos de amplificação de ácidos nucleicos são isotérmicos. A reação em cadeia da polimerase (Patente dos EUA Nos 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188), normalmente referida como PCR, utiliza múltiplos ciclos de desnaturação, emparelhamento de pares de iniciadores a cadeias opostas e extensão do iniciador para aumentar exponencialmente o número de cópias da sequência alvo. Em uma variação chamada de RT-PCR, transcriptase reversa (RT) é utilizada para fazer um DNA complementar (DNAc) a partir de RNAm, e o DNAc é então amplificado por PCR para produzir cópias múltiplas de DNA.

[0127] Como observado acima, o termo "PCR" refere-se a múltiplos ciclos de amplificação que amplificam seletivamente uma espécie de ácido nucleico alvo. Estão incluídos PCR quantitativa (qPCR), PCR em tempo real, PCR de transcrição reversa (RT-PCR) e PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) está bem descrita na técnica. O termo "qPCR" refere-se a uma reação em cadeia de polimerase quantitativa, e o termo "qRT-PCR" refere-se a uma reação em cadeia de transcrição inversa de polimerase quantitativa. qPCR e qRT-PCR podem ser utilizadas para amplificar e quantificar simultaneamente uma molécula de DNAc alvo. Ela permite tanto a detecção e quantificação de uma sequência específica de um conjunto de DNAc. Os produtos de amplificação podem então ser visualizados por uma variedade de meios, por exemplo, diretamente em um gel através de coloração, o produto pode ser detectado por hibridização com uma sonda detectável, e/ou por sequenciamento utilizando a próxima geração.

[0128] "PCR em tempo real" pode utilizar corante de ligação a DNA para se ligar a DNA de cadeia dupla (ds) na mistura de reação de PCR, causando a fluorescência do corante. Um aumento em produto de DNA durante a PCR, então, leva a um aumento na intensidade de fluorescência e é medido em cada ciclo, permitindo assim que as concentrações de DNA sejam quantificadas. Os corantes de dsDNA, tais como SYBR verde, irão ligar-se a todos os produtos de PCR de DNAds. Certas formas de realização podem utilizar sondas Taqman, que são marcadas na extremidade 5' com um fluoróforo e a extremidade 3' com um supressor e são concebidos para hibridizar entre os locais de ligação de iniciadores diretos e reversos de um fragmento amplificado desejado. Contanto que o inibidor seja mantido em estreita proximidade com o fluoróforo, nenhuma fluorescência é emitida. Durante um ciclo de PCR, no entanto, enquanto a polimerase estende os inciadores, o fluoróforo e supressor de uma sonda ligada são clivados por meio de atividade de exonuclease 5'-3' de polimerase e a fluorescência é emitida. Assim, a quantidade de transcrição presente na amostra é diretamente proporcional à quantidade de fluorescência detectada, e aumentos no número de ciclos de PCR seguintes à transcrição levam a um aumento correspondente da fluorescência emitida. A fluorescência é detectada e medida no termociclador de PCR em tempo real, e o seu aumento geométrico correspondente ao aumento exponencial do produto é utilizado para determinar o ciclo limite ("Ct") em cada reação.

[0129]O termo "pontuação de Ct" refere-se ao número de ciclo limite, que é o ciclo no qual a amplificação por PCR ultrapassou um determinado limiar. Se há uma quantidade mais elevada de RNAm para um gene particular em uma amostra, ela irá atravessar o limiar mais cedo do que um gene expresso mais baixo, uma vez que há mais RNA de partida para amplificar. Portanto, uma baixa pontuação de Ct indica a alta expressão de gene em uma amostra e um alto valor de Ct é indicativo de baixa expressão do gene. Um valor atípico de Ct é um valor que é maior do que dois desvios-padrão do valor médio de Ct para um determinado gene.

[0130]Em certas formas de realização, os referidos métodos de amplificação podem utilizar a multiplexação baseada em PCR, aqui definido como o processo de detecção de duas ou mais sequências alvo em uma única reação. Outras formas de realização dos referidos métodos de amplificação podem empregar micro fluidos para controlar o processo de ciclagem térmica, ou controlar com precisão a quantidade e temporização dos reagentes adicionados, ou em outras formas de realização, para permitir a adaptação dos referidos métodos de amplificação para kits portáteis adequados para a aplicação clínica dos referidos métodos em vez de diagnósticos personalizados.

[0131] Certas formas de realização podem utilizar métodos de detecção baseados em amplificação em um formato de matriz, por exemplo, tais como os oferecidos comercialmente pela Qiagen (Hilden, Alemanha) sob o nome de marca de RT2 Profiler PCR Array, ou pela Lonza (Basileia, Suíça) sob o nome de marca StellARray, ou pela Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA) sob a marca OpenArray. Nestas abordagens, reações de qPCR independentes podem ser executadas simultaneamente em placas de 96 poços de alta densidade, placas de 384 poços, discos de 100 poços, ou lascas de 48 poços, permitindo a quantificação de conjuntos de genes padrão ou personalizados com todos os benefícios de qPCR e a vantagem adicional de alto rendimento.

[0132] Certas formas de realização podem empregar a reação de cadeia de ligase (Weiss, Science 254:1292, 1991), normalmente referida como LCR, que utiliza dois conjuntos de oligonucleotídeos de DNA complementares que hibridizam com regiões adjacentes do ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos de DNA são ligados covalentemente por uma DNA ligase em ciclos repetidos de desnaturação térmica, hibridização e ligação para produzir um produto de oligonucleotídeo ligado de cadeia dupla detectável.

[0133]Outro método é a amplificação por deslocamento de cadeia (Walker, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:392-396; Patente dos EUA Nos 5.270.184 e 5.455.166), normalmente referido como SDA, que usa ciclos de emparelhamento dos pares de sequências de iniciadores para cadeias opostas de uma sequência alvo, a extensão do iniciador na presença de um dNTPαS para produzir um produto de extensão de iniciador hemifosforotioado duplex, corte mediado por endonuclease de um local de reconhecimento de endonuclease de restrição hemimodificada, e polimerase mediada por extensão do iniciador a partir da extremidade 3' do corte para deslocar uma cadeia existente e produzir uma fita para a próxima rodada de emparelhamento, corte e deslocamento de cadeia do iniciador, resultando na amplificação geométrica do produto. SDA termofílico (TSDA) utiliza endonucleases e polimerases termifílicas a temperaturas mais elevadas em, essencialmente, o mesmo método (Pat. Europeia No 0 684 315).

[0134]Outros métodos de amplificação incluem, por exemplo: a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (Patente dos EUA No 5.130.238), vulgarmente referida como NASBA; uma que utiliza uma RNA replicase para amplificar a própria molécula de sonda (Lizardi, P. et al., 1988, Biotechnol 6: 1197-1202), vulgarmente referida como Qβ-replicase; um método de amplificação baseado na transcrição (Kwoh, D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:1173-1177); replicação de sequência auto-sustentada (Guatelli, J. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87: 1874-1878); e, a amplificação mediada por transcrição (Pat. dos EUA Nos 5.480.784 e 5.399.491), normalmente referida como TMA. Para uma discussão mais aprofundada dos métodos de amplificação conhecidos ver Persing, David H., 1993, " In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques (Técnicas de Amplificação in vitro de Ácido Nucleico" em Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Microbiologia de Diagnóstico Médico: Princípios e Aplicações) (Persing et al., Eds), páginas 51-87 (Sociedade Americana para Microbiology, Washington, DC).

[0135] Sistemas de amplificação baseados em transcrição ilustrativos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem a amplificação mediada por transcrição (TMA), que emprega uma RNA polimerase para produzir múltiplos transcritos de RNA de uma região alvo (Pat. Nos 5.480.784 e 5.399.491). TMA utiliza um "iniciador promotor" que hibridiza com um ácido nucleico alvo na presença de uma transcriptase reversa e uma polimerase de RNA para formar um promotor de cadeia dupla a partir do qual a polimerase de RNA produz transcritos de RNA. Estes transcritos pode tornar-se modelos para outras rodadas de TMA na presença de um segundo iniciador capaz de hibridizar com os transcritos de RNA. Ao contrário do PCR, LCR ou outros métodos que requerem desnaturação pelo calor, TMA é um método isotérmico que utiliza uma atividade de RNAase H para digerir a cadeia de RNA de um híbrido de RNA:DNA, tornando desse modo a cadeia de DNA disponível para hibridização com um iniciador ou iniciador promotor. Geralmente, a atividade de RNAase H associada à transcriptase reversa fornecida para amplificação é utilizada.

[0136]Em certas formas de realização, podem ser utilizadas outras técnicas para determinar a expressão de um produto de gene de polinucleotídeo, incluindo a análise de micro arranjo (Han, M., et al., Nat Biotechnol, 19:631635, 2001; Bao, P., et al., Anal Chem, 74: 1792-1797, 2002; Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 93:10.614-19, 1996; e Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94: 215055, 1997) e SAGE (análise em série da expressão do gene). Como MPSS, SAGE é digital e pode gerar um grande número de sequências de assinatura, (ver, por exemplo, Velculescu, VE, et al., Trends Genet, 16:423-425, 2000; Tuteja R. e Tuteja N. Bioessays 2004 agosto; 26(8):916-22), apesar de ordens de grandeza menores do que estão disponíveis a partir de técnicas tais como MPSS.

[0137]Em certas formas de realização, o termo "micro arranjo" inclui um "micro arranjo de ácido nucleico" tendo uma pluralidade de ácidos nucleicos ligados ao substrato, hibridização de cada um da pluralidade de ácidos nucleicos ligados separadamente sendo detectável. O substrato pode ser sólido ou poroso, planar ou não planar, unitário ou distribuído. Micro arranjos de ácidos nucleicos incluem todos os dispositivos nomeados em Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Micro arranjos de DNA: Uma Abordagem Prática) (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21 (1) (Suppl): 1-60 (1999); Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology (Biochip de Micro arranjo: Ferramentas e Tecnologia), Eaton Publishing Company/Divisão de Livros de Biotécnicas (2000). Micro arranjos de ácidos nucleicos podem incluir uma pluralidade de substratos ligados a ácidos nucleicos em que a pluralidade de ácidos nucleicos é disposta sobre uma pluralidade de grânulos, em vez de sobre um substrato planar unitário, tal como descrito, por exemplo, em Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97(4): 1665-1670 (2000). Exemplos de micro arranjos de ácidos nucleicos podem ser encontrados nas Pat. Nos 6.391.623, 6.383.754, 6.383.749, 6.380.377, 6.379.897, 6.376.191, 6.372.431, 6.351.712, 6.344.316, 6.316.193,

[0138]Exemplos adicionais incluem matrizes de ácidos nucleicos que estão comercialmente disponíveis a partir de Affymetrix (Santa Clara, Calif.), sob o nome de marca GeneChip™ ou Ilumina (San Diego, CA). Outros exemplos de métodos de fabricação e utilização de matrizes são fornecidos, por exemplo, Pat. dos EUA Nos 7.028.629; 7.011.949; 7.011.945; 6.936.419; 6.927.032; 6.924.103; 6.921.642; e 6.818.394.

[0139]A presente invenção, tal como relacionada com matrizes e micro arranjos também contempla muitas utilizações para os polímeros ligados a substratos sólidos. A monitorização exemplar da expressão do gene e métodos de perfil e métodos úteis para a monitorização e perfis da expressão do gene são descritas nas Pat. Nos 5.800.992, 6.013.449, 6.020.135, 6.033.860, 6.040.138, 6.177.248 e 6.309.822. Genotipagem e utilizações, por conseguinte, são mostrados em Ser. dos EUA Nos 10/442.021, 10/013.598 (pedido dos Estados Unidos No. 2003/0036069), e Pat. dos EUA Nos 5.925.525, 6.268.141, 5.856.092, 6.267.152, 6.300.063, 6.525.185, 6.632.611, 5.858.659, 6.284.460, 6.361.947, 6.368.799, 6.673.579 e 6.333, 179. Outros métodos de amplificação de ácido nucleico, rotulagem e análise que podem ser utilizados em combinação com os métodos divulgados aqui são incorporados nas Pat. Nos 5.871.928, 5.902.723, 6.045.996, 5.541.061, e 6.197.506.

[0140] Certas formas de realização podem empregar sequenciamento de RNA, tais como, como um Whole Transcriptome Shotgun Sequencing (WTSS), vulgarmente referido como RNA-Seq, para a análise de expressão de RNA, em que um mapa de transcriptoma de perfis de expressão com uma única resolução nt pode ser montado através da utilização de tecnologias de sequenciamento de profundidade. Em uma forma de realização, as amostras de RNA, por exemplo RNAm, são convertidas em DNAc fragmentados e então ligadas a adaptadores de sequenciamento. Alta taxa de transferência de sequenciamento permite a geração de milhões de leituras de sequências curtas que podem ser montadas de novo, ou alinhadas contra uma sequência de genoma ou de referência conhecida. A razão entre a leitura de sequência individual para o número total de leituras gravadas pode então ser utilizada para gerar um perfil de expressão.

[0141]Em certas formas de realização, os métodos da invenção incluem um passo de detecção de um produto de gene de polinucleotídeo (por exemplo, RNAm) ou a determinação ou medição de uma quantidade de um produto de gene de polinucleotídeo que compreende o contato da amostra biológica com uma ou mais sondas (por exemplo, iniciadores ou polinucleotídeos) que se ligam ao produto de gene de polinucleotídeos sob condições e durante um tempo suficiente para que tal ligação ocorra, e, em seguida, a detecção de uma quantidade do produto de gene de polinucleotídeo que está ligada à sonda (s), por exemplo, uma quantidade do complexo de sonda e produto de gene de polinucleotídeo. A detecção pode ser realizada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica e pode empregar o uso de marcadores detectáveis, por exemplo, unidades de imunofluorescência. Em certas formas de realização, a sonda é marcada de forma detectável. Em certas formas de realização, o produto de gene de polinucleotídeo ligado é detectado em solução ou em um suporte sólido.

Reagentes para a detecção de Produtos de Gene

[0142] Como será evidente para as pessoas versadas na técnica, certas formas de realização podem empregar reagentes para a detecção de produtos de genes, tais como, por exemplo, anticorpos e oligonucleotídeos, incluindo os iniciadores ou sondas, como aqui descrito. Em formas de realização particulares, um reagente para a detecção de um produto de gene se liga especificamente ou especificamente hibridiza com o produto de gene alvo e não a produtos de genes estranhos, por exemplo, produtos de genes expressos a partir de um gene diferente, não relacionado. Métodos de produção de reagentes, tais como anticorpos e oligonucleotídeos, que se ligam especificamente ou hibridizam especificamente a um polipeptídeo alvo ou sequência de ácido nucleico, são conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados por qualquer um de uma variedade de técnicas conhecidas aos versados na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticorpos: Um Manual de Laboratório), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Os anticorpos monoclonais específicos para um polipeptídeo de interesse podem ser preparados, por exemplo, utilizando a técnica de Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, e melhorias dos mesmos.

[0143]No que diz respeito aos ácidos nucleicos de cadeia simples, particularmente oligonucleotídeos, o termo "hibridizar especificamente" refere-se à associação entre duas moléculas de nucleotídeos de cadeia simples de sequência complementar suficiente para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas, geralmente utilizados na técnica (por vezes denominado "substancialmente complementar"). Em particular, em uma forma de realização, o termo refere-se a hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contida dentro de uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples, para a exclusão substancial da hibridização do oligonucleotídeo com ácidos nucleicos de cadeia simples de sequência não complementar. Por exemplo, a hibridização específica pode referir-se a uma sequência que hibridiza com um produto de gene sob condições adequadas que permitam a hibridização específica de moléculas de ácidos nucleicos de cadeia simples de complementaridade variada são bem conhecidos na técnica.

[0144]Em uma forma de realização, o nível de expressão de um produto de gene em uma amostra biológica é determinado através da medição das velocidades relativas de transcrição de RNA, tais como por produção de DNAc correspondente e, em seguida, analisando o DNA resultante utilizando sondas, tais como, por exemplo, aqueles desenvolvidos a partir das sequências de genes identificadas na Tabela 1. Deste modo, os níveis de DNAc produzidos pela utilização de transcriptase reversa com o RNA de uma amostra biológica produz uma quantidade correspondente de DNAc, que pode então ser amplificada utilizando a reação em cadeia da polimerase, ou alguns outros meios, para determinar os níveis relativos de DNAc resultante e, assim, os níveis relativos de expressão de gene.

[0145]Os reagentes ilustrativos para a detecção de produtos de genes de ácidos nucleicos incluem os ácidos nucleicos, e em particular incluem oligonucleotídeos. Um ácido nucleico pode ser DNA ou RNA, e pode ser de cadeia simples ou dupla. Em uma forma de realização, os oligonucleotídeos são sondas de DNA ou iniciadores para amplificar ácidos nucleicos produzidos a partir de genes alvo. Em uma forma de realização, os oligonucleotídeos da presente invenção são capazes de especificamente hibridizar (por exemplo, sob condições de hibridização rigorosas ou moderadas), a um produto de gene aqui descrito. Os oligonucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou sintética, mas são tipicamente preparados por meios sintéticos. Os oligonucleotídeos, tal como aqui descrito, podem incluir segmentos de DNA, ou os seus complementos. O tamanho exato do oligonucleotídeo irá depender de vários fatores e da aplicação particular e da utilização do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos, que incluem iniciadores e sondas, podem ser de qualquer comprimento a partir de 3 nucleotídeos até todo o comprimento de um produto de gene alvo (tais como os expressos a partir do gene fornecido na Tabela 1), e inclui explicitamente cada número possível de ácidos nucleicos contíguos a partir de 3 até do comprimento total de um produto de gene alvo. Assim, os oligonucleotídeos pode ser entre 5 e 100 bases contíguas, e muitas vezes variam de 5, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos a 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nucleotídeos. Oligonucleotídeos entre 5-10, 5-20, 10-20, 12-30, 15-30, 10-50, 20-50 ou 20-100 bases em comprimento são comuns.

[0146]Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser RNA, DNA, ou derivados de qualquer um. O tamanho mínimo de tais oligonucleotídeos é o tamanho necessário para a formação de um híbrido estável entre um oligonucleotídeo e uma sequência complementar de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, os produtos de genes expressos ou cDNAs ou cópias resultantes dos mesmos resultantes de amplificação). A presente invenção inclui oligonucleotídeos que podem ser utilizados como, por exemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucleico (por exemplo, sondas de DNA) ou iniciadores para amplificar moléculas de ácidos nucleicos.

[0147]Em uma forma de realização, um oligonucleotídeo podem ser uma sonda que se refere, por exemplo, um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, RNA ou DNA, quer ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzido sinteticamente, que seja capaz de hibridização com ou hibridizar especificamente a um ácido nucleico com sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. O comprimento exato da sonda vai depender de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte da sonda e a utilização do método. Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora possa conter menos nucleotídeos. Em certas formas de realização, uma sonda pode estar entre 5 e 100 bases contíguas, e é geralmente de cerca de 5, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento, ou pode ser de cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nucleotídeos de comprimento. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares a diferentes cadeias de uma sequência de ácido nucleico alvo particular. Isto significa que as sondas devem ser suficientemente complementares de modo a serem capazes de hibridizar especificamente ou emparelhamento com as suas respectivas cadeias alvo sob um conjunto de condições pré- determinadas. Por conseguinte, a sequência da sonda não necessita refletir a sequência complementar exata do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeos não complementares pode estar ligado à extremidade 5' ou 3' da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não- complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas na sonda, desde que a sequência da sonda tenha complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo especificamente.

[0148]Em uma forma de realização, um oligonucleotídeo pode ser um iniciador, que refere-se a um oligonucleotídeo, quer RNA ou DNA, quer de cadeia simples ou de cadeia dupla, quer derivado a partir de um sistema biológico, gerado por digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente, que, quando colocado no ambiente adequado, é capaz de atuar funcionalmente como um iniciador de síntese de ácido nucleico dependente do molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucleico apropriado, precursores de trifosfato de nucleosídeo adequados de ácidos nucleicos, uma enzima polimerase, cofatores e condições adequadas, tais como temperatura e pH adequados, o iniciador pode ser estendido no seu terminal 3' através da adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou atividade semelhante para se obter um produto de extensão do iniciador. O iniciador pode variar em comprimento, dependendo das condições particulares e do requisito de aplicação. Por exemplo, em certas aplicações, um iniciador de oligonucleotídeo é de cerca de 15-25 ou mais nucleotídeos de comprimento, mas pode, em certas formas de realização ser de entre 5 e 100 bases contíguas, e muitas vezes ser de cerca de 5, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento, ou, em certas formas de realização, pode ser cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 nucleotídeos de comprimento. O iniciador deve ser de complementaridade suficiente para o modelo desejado para iniciar a síntese do produto de extensão desejado, isto é, para ser capaz de emparelhar com a cadeia molde desejada de um modo suficiente para fornecer a porção hidroxila 3' do iniciador em apropriada justaposição para utilização na iniciação de síntese por uma polimerase ou uma enzima semelhante. Não é necessário que a sequência do iniciador represente um complemento exato do modelo desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada à extremidade 5' de um iniciador complementar, de outro modo. Alternativamente, bases não complementares podem ser intercaladas dentro da sequência de iniciador de oligonucleotídeo, desde que a sequência de iniciador tenha complementaridade suficiente com a sequência da cadeia molde desejada para proporcionar funcionalmente um complexo molde-iniciador para a síntese do produto de extensão.

[0149]Em certas formas de realização, um reagente para a determinação da expressão de um produto genético compreende um conjunto de dois, três ou mais oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo do conjunto hibridiza com um produto de gene aqui descrito ou uma cadeia complementar do produto do gene. Assim, por exemplo, cada um dos oligonucleotídeos pode hibridizar com um produto de gene de RNAm e/ou a uma ou mais cadeias de um DNAc produzido a partir do RNAm. Em uma forma de realização, um conjunto de oligonucleotídeos compreende sondas de DNA. Em certas formas de realização, um conjunto de oligonucleotídeos compreende, pelo menos, dois iniciadores de amplificação ou iniciadores de PCR, que juntos são capazes de amplificar, pelo menos, uma porção de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, um produto de gene RNAm ou DNAc resultante. Em uma outra forma de realização, os conjuntos de oligonucleotídeos ou as sondas de DNA podem ser proporcionados em uma matriz, tais como matrizes de fase sólida, micro arranjos cromossômico/de DNA, ou matrizes de micro grânulos. A tecnologia de matrizes é bem conhecida na técnica e aqui descrita.

[0150]Os oligonucleotídeos de uma sequência e estrutura química definidos pode ser produzida por técnicas conhecidas aos versados na técnica, tais como por síntese química ou bioquímica, e por expressão in vitro ou in vivo de moléculas de ácido nucleico recombinantes, por exemplo, vetores bacterianos ou virais. Em certas formas de realização, um oligonucleotídeo não consiste exclusivamente do DNA cromossômico do tipo selvagem ou os produtos de transcrição in vivo dos mesmos.

[0151]Em certas formas de realização, a presente invenção proporciona polinucleotídeo isolado, por exemplo, iniciadores ou sondas, que compreendem vários comprimentos de extensões contíguas de sequência idêntica ou complementar a um gene ou produto de gene de polinucleotídeo, por exemplo, RNAm, aqui descrito.

[0152]Oligonucleotídeos, sondas ou iniciadores podem ser modificados de qualquer maneira, contanto que uma dada alteração seja compatível com a função desejada de um dado oligonucleotídeo. Um vulgar versado na técnica pode facilmente determinar se uma dada modificação é apropriada ou desejada para um determinado oligonucleotídeo da presente invenção.

[0153]Embora a concepção e a sequência de oligonucleotídeos dependa da sua função, tal como aqui descrito, diversas variáveis são geralmente levadas em conta. Entre as mais importantes estão: comprimento, temperatura de fusão (Tm), especificidade, complementaridade com outros oligonucleotídeos no sistema, teor de G/C, extensões de polipirimidina (T, C) ou de polipurina (A, G), e a sequência 3' terminal. O controle destas e outras variáveis é um padrão e aspecto normal bem conhecido de concepção de oligonucleotídeos, e vários programas de computador estão disponíveis para o rastreio de grandes números de potenciais oligonucleotídeos para aquelas ótimas.

[0154] Como será reconhecido pelo versado na técnica, os polinucleotídeos podem ser de cadeia simples (codificante ou anti-sense) ou de cadeia dupla e podem ser DNA (genômico, DNAc ou sintético) ou moléculas de RNA. As sequências de codificação adicional ou não codificadoras, podem, mas não necessitam, estar presente dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não necessita, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

[0155]A presente invenção inclui a utilização de oligonucleotídeos que se ligam especificamente a um produto de gene alvo sob condições adequadas para realizar qualquer um dos ensaios aqui descritos, incluindo mas não se limitando a PCR, RT-PCR e PCT em tempo real. As condições adequadas são conhecidas na técnica e incluem aquelas utilizadas em reações convencionais realizadas acordo com as instruções fornecidas pelos distribuidores de máquinas e reagentes de PCR. Em certas formas de realização, a presente invenção contempla polinucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos, que hibridizam com sequências de nucleotídeos de referência (por exemplo, produtos de genes alvo), ou para os seus complementares, sob condições de rigor descritas abaixo. Tal como aqui utilizado, o termo "hibridiza sob condições de baixo rigor, médio rigor, elevado rigor, ou em condições de elevado rigor" descreve condições para hibridização e lavagem. Orientações para a realização de reações de hibridização podem ser encontrados em Ausubel et al., (1998, supra), Seções 6.3.1-6.3.6. Métodos aquosos e não aquosos são descritos na referência e ambos podem ser utilizados.

[0156]A referência aqui feita a condições de baixo rigor inclui e engloba a partir de, pelo menos, cerca de 1% v/v a pelo menos cerca de 15% v/v de formamida, e de, pelo menos, cerca de 1 M a pelo menos cerca de 2 M de sal para a hibridização a 42°C, e pelo menos cerca de 1 M a pelo menos cerca de 2 M de sal para a lavagem a 42°C. As condições de baixa restringência também podem incluir 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA), EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7% para hibridização a 65°C, e (i) 2 x SSC, SDS a 0,1%; ou (ii) 0,5% de BSA, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS a 5% para a lavagem à temperatura ambiente. Uma forma de realização de condições de baixo rigor inclui a hibridização em 6 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por duas lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a, pelo menos, 50°C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55°C durante condições de baixo rigor).

[0157]As condições de restringência média incluem e abrangem a partir de, pelo menos, cerca de 16% v/v a pelo menos cerca de 30% v/v de formamida, e de, pelo menos, cerca de 0,5 M a pelo menos cerca de 0,9 M de sal para a hibridização a 42°C, e pelo menos cerca de 0,1 M a pelo menos cerca de 0,2 M de sal para a lavagem a 55°C. As condições de restringência média também podem incluir 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA), EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7% para a hibridização em 65°C, e (i) 2 x SSC, SDS a 0,1%; ou (ii) 0,5% de BSA, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS a 5% para a lavagem a 60-65°C. Uma forma de realização de condições de rigor médio incluem hibridização em 6 x SSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 60°C. Condições de elevado rigor incluem e abrangem a partir de, pelo menos, cerca de 31% v/v a pelo menos cerca de 50% v/v de formamida, e de cerca de 0,01 M a cerca de 0,15 M de sal para a hibridização a 42°C, e cerca de 0,01 M a cerca de 0,02 M de sal para a lavagem a 55°C.

[0158]As condições de elevado rigor podem também incluir BSA a 1%, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7% para a hibridização a 65°C, e (i) 0,2 x SSC, SDS a 0,1%; ou (ii) 0,5% de BSA, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS a 1% para a lavagem a uma temperatura em excesso de 65°C. Uma forma de realização de condições de alto rigor inclui hibridização em 6 x SSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% SDS a 65°C. Uma forma de realização de condições de muito elevado rigor inclui hibridizar em fosfato de sódio 0,5 M, SDS a 7% a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, 1% SDS a 65°C.

[0159]Outras condições de restringência são bem conhecidos na técnica e um versado na técnica reconhecerá que vários fatores podem ser manipulados para otimizar a especificidade da hibridização. Optimização do rigor das lavagens finais podem servir para assegurar um elevado grau de hibridização. Para exemplos detalhados, ver Ausubel et al., supra, nas páginas 2.10.1 a 2.10.16 e Sambrook et al. (1989, supra) nas seções de 1,101-1,104.

[0160]Enquanto lavagens rigorosas são tipicamente realizadas a temperaturas desde cerca de 42°C a 68°C, um perito na técnica irá apreciar que outras temperaturas podem ser adequadas para as condições rigorosas. A taxa máxima de hibridização tipicamente ocorre a cerca de 20°C a 25°C abaixo do Tm para a formação de um híbrido de DNA-DNA. É bem conhecido na técnica que a Tm é a temperatura de fusão ou a temperatura a que duas sequências de polinucleotídeos complementares dissociam. Métodos para estimar a Tm são bem conhecidos na técnica (ver Ausubel et al., Supra na página 2.10.8).

[0161]Em geral, a Tm de um duplex perfeitamente emparelhado de DNA pode ser prevista como uma aproximação pela fórmula: Tm = 81,5 + 16,6 (log10 M) + 0,41 (% G + C) - 0,63 (% de formamida) - (600/comprimento) em que: M é a concentração de Na+, de preferência no intervalo de 0,01 molar até 0,4 molar; % G + C é a soma das bases de guanosina e citosina como uma percentagem do número total de bases, dentro do intervalo entre 30% e 75% de G + C; % de formamida é a percentagem da concentração de formamida em volume; comprimento é o número de pares de bases do duplex de DNA. A Tm de um DNA duplex diminui em cerca de 1°C com cada aumento de 1% no número de pares de bases desemparelhados aleatoriamente. A lavagem é geralmente realizada a Tm - 15°C, para elevado tigor, ou Tm - 30°C para rigor moderado.

[0162]Oligonucleotídeos, iniciadores e sondas da presente invenção podem compreender ou consistir de regiões que são variantes de polinucleotídeos de uma porção de um gene ou sequência de RNAm alvo, ou um seu complemento. Em formas de realização particulares, um oligonucleotídeo podem compreender ou consistir de uma sequência possuindo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com uma região de um gene alvo ou uma sequência de RNAm, ou um seu complemento.

[0163]Os oligonucleotídeos para uso como iniciadores ou sondas podem ser selecionados utilizando programa de computador conhecido na técnica. Por exemplo, o programa de computador OLIGO 4.06 é útil para a seleção de pares de iniciadores de PCR de mais de 100 nucleotídeos cada, e para a análise de oligonucleotídeos e polinucleotídeos maiores de até 5000 nucleotídeos de uma sequência polinucleotídica de entrada de até 32 quilobases. Programas de seleção de iniciador similares incorporaram recursos adicionais para as capacidades expandidas. Por exemplo, o programa de seleção de iniciadores PrimOU (disponível ao público a partir do Centro do Genoma da Universidade do Texas Sudoeste Medical Center, Dallas Tex.) é capaz de escolher os iniciadores específicos de sequências a partir de sequências de megabase e é, assim, útil para a concepção de iniciadores em um escopo genômico amplo. O programa de seleção de iniciador Primer 3 (disponível ao público a partir do Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge Mass.) permite que o usuário insira uma "biblioteca de iniciadores errôneos (mispriming)", em que as sequências a serem evitadas como locais de ligação de iniciadores são especificadas pelo usuário. Primer 3 é útil, em particular, para a seleção de oligonucleotídeos para micro arranjos. (O código fonte para os dois últimos programas de seleção de iniciador pode também ser obtido a partir de suas respectivas fontes e modificados para atender às necessidades específicas do usuário). O programa PrimeGen (disponível ao público a partir do Centro de Recursos de Projeto de Mapeamento do Genoma Humano de UK, Cambridge UK) projeta iniciadores com base em vários alinhamentos de sequências, permitindo, assim, a seleção de iniciadores que hibridizam com qualquer das regiões mais conservadas ou menos conservadas de sequências de ácido nucleico alinhados. Por isso, este programa é útil para a identificação de ambos os oligonucleotídeos únicos e conservados e fragmentos de polinucleotídeos. Os métodos de seleção de oligonucleotídeos não se limitam aos aqui descritos.

[0164]Em certas formas de realização, os oligonucleotídeos podem ser preparados por síntese em fase sólida por passos, empregando métodos descritos nas referências citadas acima e abaixo no que diz respeito à síntese de oligonucleotídeos tendo uma mistura ou ligações de espinha dorsal catiônicas e não carregadas. Em alguns casos, pode ser desejável adicionar porções químicas adicionais ao oligonucleotídeo, por exemplo, para melhorar a farmacocinética ou para facilitar a captura ou detecção do composto. Uma tal porção pode ser ligada de forma covalente, tipicamente a um terminal do oligômero, de acordo com métodos de síntese convencionais. Por exemplo, a adição de uma porção de polietilenoglicol ou outro polímero hidrofílico, por exemplo, um que tenha 10-100 subunidades monoméricas, pode ser útil para aumentar a solubilidade. Um ou mais grupos carregados, por exemplo, grupos aniônicos carregados tal como um ácido orgânico, podem aumentar a absorção celular.

[0165]Uma variedade de moléculas detectáveis pode ser utilizada para tornar um oligonucleotídeo ou proteínas detectáveis (isto é, marcados de forma detectável), tais como radioisótopos, fluorocromos, corantes, enzimas, nanopartículas, marcadores quimioluminescentes, biotina ou outros monômeros conhecidos na técnica que podem ser detectados diretamente (por exemplo, por emissão de luz) ou indiretamente (por exemplo, por ligação de um anticorpo marcado fluorescentemente).

[0166]Os radioisótopos proporcionam exemplos de moléculas detectáveis que podem ser utilizadas em certos aspectos da presente invenção. Vários radioisótopos podem ser utilizados como moléculas detectáveis para a marcação de nucleotídeos ou proteínas, incluindo, por exemplo, 32P, 33P, 35S, 3H e 125I. Estes radioisótopos têm semividas, tipos de deterioração e níveis de energia diferentes, que podem ser adaptados para corresponder às necessidades de um protocolo particular. Por exemplo, 3H é um emissor de baixa energia que resulta em baixos níveis de fundo, no entanto, este baixo consumo de energia também resulta em longos períodos de tempo para autorradiografia. Ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e aminoácidos marcados radioativamente estão disponíveis comercialmente. Os nucleotídeos estão disponíveis que são marcados radioativamente, no primeiro, ou α, grupo fosfato, ou o terceiro, ou y, grupo fosfato. Por exemplo, tanto [α-32P] dATP e [Y-32P] dATP estão disponíveis comercialmente. Além disso, diferentes atividades específicas de nucleotídeos marcados radioativamente também estão disponíveis comercialmente e podem ser adaptados para diferentes protocolos.

[0167]Outros exemplos de moléculas detectáveis que podem ser utilizadas para detectar um oligonucleotídeo incluem fluoróforos. Vários fluoróforos podem ser utilizados para a marcação de nucleotídeos, incluindo, por exemplo, fluoresceína, tetrametilrodamina, Vermelho do Texas e um número de outros (por exemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes - 9a Ed, 2002, Moles Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, The Handbook: Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (O manual: Um Guia para Sondas fluorescentes e tecnologias de Rotulagem) - 10a Ed, de 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0168] Como um exemplo, os oligonucleotídeos podem ser marcados de forma fluorescente durante a síntese química, uma vez que a incorporação de aminas ou tióis durante a síntese de nucleotídeos permite a adição de fluoróforos. Nucleotídeos marcados por fluorescência estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, trifosfatos de uridina e desoxiuridina estão disponíveis, que são conjugados com dez fluoróforos diferentes que cobrem o espectro. Corantes fluorescentes que podem ser ligados diretamente aos nucleotídeos também podem ser utilizados como moléculas detectáveis. Por exemplo, FAM, JOE, TAMRA, e ROX são corantes fluorescentes reativos de amina que foram ligados a nucleotídeos e são utilizados no sequenciamento de DNA automatizado. Estes nucleotídeos marcados com fluorescência, por exemplo, ROX-ddATP, ROX-ddCTP, ddGTP e ROX-ROX-ddUTP, estão disponíveis comercialmente.

[0169]Moléculas detectáveis fluorescentes e não radioativas estão ainda disponíveis. Como observado acima, a biotina pode ser ligada diretamente aos nucleotídeos e detectada por afinidade de ligação específica e elevada a avidina ou a estreptavidina, que foi quimicamente acoplada a uma enzima que catalisa uma reação colorimétrica (tais como fosfatase, luciferase ou peroxidase). Nucleotídeos marcados com digoxigenina também podem, da mesma forma, ser utilizados para a detecção não isotópica de ácidos nucleicos. Nucleotídeos biotinilados e marcados com digoxigenina estão disponíveis comercialmente.

[0170] Partículas muito pequenas, denominadas nanopartículas, também podem ser utilizadas para marcar as sondas de oligonucleotídeos. Estas partículas variam de 11000 nm em tamanho e incluem diversas estruturas químicas, tais como partículas de ouro e de prata e pontos quânticos. Quando irradiadas com luz incidente angular branca, nanopartículas de prata ou ouro variando de 40-120 nm vão espalhar luz monocromática com alta intensidade. O comprimento de onda da luz dispersa é dependente do tamanho da partícula. Quatro a cinco diferentes partículas em estreita proximidade terão, cada uma, luz monocromática de dispersão, que quando sobrepostas vai dar uma cor específica, única. As partículas estão sendo fabricados por empresas como Genicon Sciences (Carlsbad, CA). As partículas derivadas de prata ou ouro podem ser ligadas a uma ampla variedade de moléculas incluindo, proteínas, anticorpos, moléculas pequenas, ligantes de receptores e ácidos nucleicos. Por exemplo, a superfície da partícula pode ser quimicamente derivatizada para permitir a ligação a um nucleotídeo.

[0171]Outros tipos de nanopartículas que podem ser utilizadas para a detecção de uma molécula detectável incluem pontos quânticos. Pontos quânticos são cristais fluorescentes de 1-5 nm de diâmetro que são excitáveis pela luz sobre uma grande variedade de comprimentos de onda. Após a excitação por uma luz tendo um comprimento de onda apropriado, estes cristais emitem luz, como a luz monocromática, com um comprimento de onda dependente da sua composição e tamanho do produto químico. Os pontos quânticos tais como CdSe, ZnSe, InP, ou InAs possuem propriedades óticas únicas; estes e outros pontos quânticos estão disponíveis a partir de um número de fontes comerciais (por exemplo, NN-Labs, Fayetteville, AR; Ocean Nanotech, Fayetteville, AR; Nanoco Technologies, Manchester, Reino Unido; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

[0172]Em certas formas de realização, os iniciadores de oligonucleotídeos ou sondas podem ser marcados com um ou mais corantes de emissão de luz ou de outro modo detectáveis. A luz emitida pelos corantes pode ser de luz visível ou luz invisível, tal como luz ultravioleta ou infravermelha. Em formas de realização exemplares, o corante pode ser uma transferência de energia de ressonância de fluorescência do corante (FRET); um corante de xanteno, tal como fluoresceína e rodamina; um corante que tem um grupo amino na posição alfa ou beta (tal como um corante de naftilamina, 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, sulfonato de 1-anilino-8-naftalendeno e sulfonato de 2-p- touidinil-6-naftaleno); um corante que tem 3-fenil-7- isocianatocumarina; uma acridina, como 9- isotiocianatoacridina e laranja de acridina; um pireno, um bensoxadiazol e um estilbeno; um corante que tenha 3-(s- carboxipentil)-3-etil-5,5'-dimetiloxacarbocianina (CYA); 6- carboxifluoresceína (FAM); 5 & 6-carboxirrodamina-110 (R110); 6-carboxirrodamina-6G (R6G); N,N,N',N'-tetrametil- 6-carboxirrodamina (TAMRA); 6-carboxi-X-rodamina (ROX); 6- carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE); Alexa Fluor™; Cy2; Vermelho do Texas e vermelho de Rodamina; 6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína (TET); 6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína (HEX); 5- carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína (ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; e Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680 ou Alexa Fluor 750.

[0173] Certas formas de realização, por conseguinte, incluem métodos para a detecção de um produto de gene de polinucleotídeo alvo em uma amostra, compreendendo a) hibridização da amostra com uma sonda compreendendo uma sequência complementar ao produto de gene de polinucleotídeo alvo na amostra, e qual sonda hibridiza especificamente com o referido polinucleotídeo alvo produto do gene, sob condições em que um complexo de hibridização é formado entre a referida sonda e o referido produto de gene polinucleotídico alvo ou seus fragmentos, e b) detectar a presença ou ausência do referido complexo de hibridização, e, se presente, a quantidade dos mesmos. Também estão incluídos métodos para a detecção de um produto de gene de polinucleotídeo alvo em uma amostra, compreendendo: a) amplificar o produto de gene polinucleotídico alvo ou um seu fragmento, e b) detectar a presença ou ausência do referido produto de gene polinucleotídico alvo amplificado ou um seu fragmento, e, se presente, a sua quantidade. Em formas de realização particulares, a sonda é marcada de forma detectável.

Análise dos Níveis de Expressão do Produto de Gene

[0174] De acordo com certas formas de realização, métodos e kits da presente invenção podem ser utilizados para determinar se um indivíduo tem câncer de tiroide ou se um tumor da tiroide ou nódulo é benigno, com base nos níveis de expressão de produtos de genes expressos por dois ou mais genes mostrados na Tabela 1, incluindo mas não se limitando a qualquer combinação específica de produtos de genes aqui descritos. Geralmente, uma determinação de câncer de tiroide é feita quando o padrão de expressão é determinado correlacionar mais estreitamente para o padrão de expressão observado em amostras biológicas obtidas a partir de tecido da tiroide canceroso, do que o padrão de expressão observado em amostras biológicas obtidas a partir de tecido da tiroide normal ou não-canceroso. Do mesmo modo, uma determinação de que a amostra de tecido da tiroide se benigna é geralmente feita quando o padrão de expressão é determinado correlacionar mais estreitamente com o padrão de expressão observado em amostras biológicas obtidas a partir de tecido da tiroide normal ou não- canceroso, do que o padrão de expressão observado em amostras biológicas obtidas a partir de tecido da tireoide canceroso.

[0175]Em certos casos, a presença de câncer de tiroide é diagnosticada através da comparação dos níveis de expressão de um ou mais produtos de genes aqui descritos com um controle adequado. Um "controle adequado" ou "controle apropriado" inclui um valor de referência, por exemplo, o nível de expressão, aspecto, característica ou propriedade, determinados por uma célula ou outra amostra biológica de um tecido ou organismo, por exemplo, um controle ou células, tecido ou organismo normais, que exibem, por exemplo, traços normais, tais como a ausência da condição, por exemplo, câncer de tiroide. Em certas formas de realização, um "controle adequado" ou "controle apropriado" é um valor, nível, aspecto, característica ou propriedade predefinidos.

[0176]Em certas formas de realização, a expressão de um ou mais produtos de genes em uma amostra biológica é comparada a um nível de expressão de produto de gene, o que pode, em certas formas de realização, ser um valor predeterminado ou predefinido de referência. Os níveis de expressão de referência podem ser determinados com base no nível de expressão de um produto genético em uma ou mais amostras de controle adequadas, que podem ser tanto amostras de tecidos normais quanto amostras de tecidos tumorais, por exemplo, um tumor da tiroide. Por exemplo, em certas formas de realização, um nível de expressão de referência associado com o tecido normal é determinado com base no nível de expressão de um produto genético em 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, ou mais amostras biológicas obtidas de tecido normal, não-canceroso, tal como, por exemplo, tecido normal da tiroide. Em outras formas de realização, um nível de expressão de referência associado com tecido de câncer, por exemplo, câncer de tiroide, é determinado com base no nível de expressão de um produto genético em 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, ou mais amostras biológicas obtidas a partir de tecido de câncer, como, por exemplo, tecido de câncer de tireoide. Em certas formas de realização, os níveis de expressão de referência em um ou em ambos os tecidos normal e de câncer são determinados por um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais produtos de genes expressos por um gene na Tabela 1, ou, pelo menos um, pelo menos dois, ou pelo menos três genes selecionados a partir dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 e CCR7. Em formas de realização relacionadas, os níveis de expressão de referência em um ou em ambos os tecidos normal e de câncer são determinados por qualquer um dos conjuntos de produtos de genes aqui descritos, por exemplo, conjuntos de genes compreendendo ou consistindo em: produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; produtos de genes dos genes, CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CLDN-1, e CCR7.

[0177]Em formas de realização particulares, a expressão diferencial de um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos produtos de genes em uma amostra biológica, em comparação com a expressão em uma da amostra de controle normal (não cancerosa) ou de referência é indicativa de câncer. Em contraste, a expressão substancialmente semelhantes a um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais dos produtos de genes em uma amostra biológica, em comparação com a expressão em uma amostra de controle normal (não canceroso) ou de referência é indicativo de tecido benigno, enquanto que a expressão substancialmente semelhante a um, dois ou mais dos produtos de genes em uma amostra biológica, em comparação com a expressão em uma amostra de controle do câncer ou referência de controle do câncer é indicativa de câncer.

[0178]A expressão diferencial inclui uma diferença estatisticamente significativa em um ou mais níveis de um produto de expressão do gene, em comparação com os níveis de expressão do mesmo produto de gene em um controle apropriado. A diferença estatisticamente significativa pode referir-se um aumento ou uma diminuição nos níveis de expressão, como medido pelos níveis de RNA, níveis de proteína, função da proteína, ou qualquer outra medida relevante da expressão de genes, tais como aquelas aqui descritas. Um resultado é normalmente referido como estatisticamente significativo se for improvável que tenha ocorrido por acaso. O nível de significância de um teste ou resultado refere-se, tradicionalmente, a um conceito de teste de hipótese de estatística frequentista. Em casos simples, a significância estatística pode ser definida como a probabilidade de tomar a decisão de rejeitar a hipótese nula quando a hipótese nula é realmente verdade (a decisão conhecida como um erro tipo I, ou "determinação de falsos positivos"). Esta decisão é muitas vezes feita utilizando o valor-p: se o valor de p for menor que o nível de significância, então a hipótese nula é rejeitada. Quanto menor for o valor de p, mais significativo o resultado. Fatores de Bayes também podem ser utilizados para determinar a significância estatística (ver, por exemplo, Goodman, S., Ann Intern Med 130: 1005-1013, 1999). Em certos casos, o nível de significância de um teste ou resultado pode refletir uma análise em que a probabilidade de tomar a decisão de rejeitar a hipótese nula, quando a hipótese nula é realmente verdade, não é maior do que a probabilidade estabelecida. Este tipo de análise permite para aquelas aplicações em que a probabilidade de tomar a decisão de rejeitar pode ser muito menor do que o nível de significância, para alguns conjuntos de pressupostos englobados dentro da hipótese nula.

[0179]Em certas formas de realização exemplares, a expressão diferencial estatisticamente significativo pode incluir situações em que o nível de um determinado produto de gene de expressão é, pelo menos, cerca de 1,2X, 1,3X, 1,4X, 1,5X, 1,6X, 1,7X, 1,8x, 1,9x, 2,0X, 2,2x, 2,4X, 2,6X, 2,8X, 3,0X, 4,0X, 5,0X, 6,0x, 7,0x, 8,0x, 9,0x, 10,0x, 15,0X, 20,0X, 50,0X, 100,0 X, ou diferença maior na expressão (ou seja, a expressão diferencial que pode ser expressão maior ou menor) em uma amostra biológica, em comparação com um controle apropriado, incluindo todos os pontos inteiros e decimais no meio (por exemplo, 1,24X, 1,25X, 2,1X, 2,5X, 60,0X, 75,0X, etc.). Em certas formas de realização, a expressão diferencial estatisticamente significativo pode incluir situações em que o nível de um determinado produto de gene de expressão é de, pelo menos, cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 por cento (%) ou diferença maior na expressão (ou seja, a expressão diferencial que pode ser maior ou menor) em uma amostra biológica, em comparação com um controle apropriado, incluindo todos os pontos inteiros e decimais no meio.

[0180] Como um exemplo adicional, a expressão diferencial também pode ser determinada através da realização de testes-Z, isto é, calcular uma contagem absoluta de Z, tal como é conhecido na técnica. O teste Z é normalmente utilizado para identificar diferenças significativas entre a média da amostra e a média de uma população. Por exemplo, em comparação com uma tabela normal padrão (por exemplo, um tecido de controle), com um intervalo de confiança de 95% (isto é, ao nível de significância de 5%), uma pontuação Z com um valor absoluto maior que 1,96 indica a não aleatoriedade. Para um intervalo de confiança de 99%, se o Z absoluto é maior do que 2,58, isso significa que p <0,01, e a diferença é ainda mais significativa - a hipótese nula pode ser rejeitada com uma maior confiança. Nestas formas de realização e afins, uma pontuação Z absoluta de 1,96, 2, 2,58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais, incluindo todos os pontos decimais no meio (por exemplo, 10,1, 10,6, 11,2, etc.), pode fornecer uma forte medida de significância estatística. Em certas formas de realização, uma pontuação Z absoluta de acima de 6 pode fornecer, excepcionalmente, elevada significância estatística.

[0181] Similarmente substancial refere-se geralmente a falta de uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão entre a amostra biológica e o controle de referência. Exemplos de níveis de expressão substancialmente semelhantes podem incluir situações em que o nível de um determinado produto de gene de expressão fornece menos do que cerca de 0,05X, 0,1X, 0,2X, 0,3X, 0,4X, 0,5X, 0,6x, 0,7X, 0,8x, 0,9X, 1,0X, 1,1X, 1,2X, 1.3X, ou 1,4X diferença em expressão (ou seja, a expressão diferencial que pode ser expressão maior ou menor) em uma amostra biológica, em comparação com uma amostra de referência, incluindo todos os pontos decimais no meio (por exemplo, 0,15X, 0,25x, 0,35X, etc.). Em certas formas de realização, a expressão diferencial pode incluir situações em que o nível de um determinado produto de gene de expressão fornece menos do que cerca de 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 por cento (%) de diferença na expressão (ou seja, a expressão diferencial que pode ser maior ou menor) em uma amostra biológica, em comparação com uma amostra de referência, incluindo todos os pontos decimais no meio.

[0182]A expressão diferencial pode referir-se a um aumento ou uma diminuição na expressão de um determinado produto do gene, em comparação com uma amostra ou valor de controle. Em formas de realização particulares de métodos aqui descritos, um aumento na expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais produtos de genes dos genes CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CCR7 e HO-1 e/ou uma diminuição na expressão de um ou mais, dois ou mais, três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CAR e XB130, ou as alterações correspondentes, em qualquer dos vários subconjuntos de produtos de genes aqui descritos, em um amostra biológica, em comparação com a expressão nível em uma amostra de controle normal ou valor é indicativo da presença de um tumor ou câncer. O aumento ou diminuição pode corresponder a qualquer uma das diferenças na expressão do referido acima, tais como, por exemplo, um aumento de cerca de 10, 20, 50, 100, 200, 500, ou 1.000% ou uma diminuição de cerca de 10, 20, 50, ou 90%.

[0183] Como notado acima, em formas de realização particulares, a determinação se uma amostra biológica compreende tecido de câncer ou não envolve correlacionar a expressão dos níveis de um ou mais produtos de genes com a presença ou ausência de câncer. Isto pode ser conseguido através da comparação dos níveis de expressão dos produtos de genes na amostra biológica para os níveis de expressão em uma ou mais amostras de controle, tais como as amostras obtidas a partir de indivíduos que se sabe terem câncer ou se sabem não terem câncer. Em certas formas de realização, a correlação ou comparação pode ser realizada utilizando os dados de expressão de genes obtidos a partir de amostras de controle, em tempo anterior, tais como valores de referência pré-definidos ou predeterminados.

[0184] Tal como aqui descrito, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para determinar qualitativa ou quantitativamente os níveis de expressão de um ou mais produtos de genes, utilizando qualquer um de uma série de métodos conhecidos na técnica. Em alguns casos, o grau de hibridização de uma sonda detectável é diretamente relacionado à quantidade de produto de gene em uma amostra biológica. Os programas de computador podem ser utilizados para extrair, normalizar, resumir e analisar sinais de sondas. Em algumas formas de realização, a intensidade do sinal de uma dada sonda determinada para uma amostra biológica pode ser comparada com um conjunto de referências para determinar se a expressão diferencial está ocorrendo na amostra. Por exemplo, no contexto de um micro arranjo, um aumento ou diminuição da intensidade em relação a uma posição sobre uma matriz que corresponde a um produto de gene expresso é indicativo de um aumento ou diminuição, respectivamente, de expressão do gene correspondente na amostra biológica.

[0185]Análise da expressão gênica e correlação com câncer ou fenótipos benignos pode ser realizada utilizando os classificadores ou algoritmos, por exemplo, algoritmos projetados para normalizar e ou melhorar a confiabilidade dos dados. Os algoritmos que podem ser utilizados incluem qualquer um dos aqui descritos, por exemplo, os classificadores ou algoritmos descritos nos Exemplos 2 e 3. Em certas formas de realização, o produto de gene é RNAm, que pode ser medido utilizando PCR em tempo real, por exemplo, tal como descrito no Exemplo 1. Em certas formas de realização, o potencial de classificação de vários genes pode ser determinado utilizando os valores de CT de cada gene para produzir curvas COR com base na expressão dos genes em diferentes amostras de tecido obtidas a partir de nódulos da tiroide malignos e benignos, como ilustrado no Exemplo 1. A sensibilidade e a especificidade, de cada um dos genes, podem também ser determinadas.

[0186]Em formas de realização particulares, o algoritmo é um teste de classificação de multi-gene. Um tal classificador pode ser desenvolvido utilizando uma abordagem em duas fases, em que os primeiros passos identificam e classificam um grupo de amostras biológicas com valores atípicos de CT, e o segundo passo gera um algoritmo para classificar as amostras biológicas restantes não classificadas após a primeira etapa, por exemplo, tal como descrito no Exemplo 2. Os dados consolidados a partir de ambos os passos podem ser integrados e representados graficamente em uma curva COR.

[0187]Em certas formas de realização, o primeiro passo inclui duas fases. A primeira fase identifica as amostras biológicas com valores de CT atípicos para um determinado conjunto de genes. Os critérios para definir um CT atípica podem ser definidos como o valor CT médio +/- dois desvios padrão, o que representa, por conseguinte, apenas 5% dos valores de CT para qualquer dado gene. Para cada gene, a probabilidade de erro (PE) de um CT atípico, pertencente ao grupo do câncer, enquanto realmente pertencentes ao grupo benigno podem ser calculados. Tendo em conta que quanto menor for o PE reflete uma maior capacidade de classificação, um marcador pode ser calculado para cada um dos genes com base no EP. Na segunda fase, uma pontuação composta obtida a partir dos genes com melhores pontuações pode ser utilizada para classificar a amostra como câncer ou benigna.

[0188]Em certas formas de realização da segunda etapa, as amostras não classificados no primeiro passo podem ser utilizadas como o conjunto de treino remanescente para gerar um algoritmo a jusante para completar a classificação de todos os dados, como esquematizado na Figura 3. Por exemplo, isto pode ser realizado utilizando dois métodos, análise discriminante linear (LDA) e análise discriminante não lineares (NLDA). Para a análise LDA, pode ser utilizada uma abordagem LDA por passos, uma vez que pode ser desconhecido se as variáveis e amostras satisfazem as condições necessárias para uma LDA. A abordagem passo a passo pode ser escolhida, pois pode identificar, simultaneamente, a combinação de variáveis que dão a maior certeza de classificação e satisfazem às condições para uma LDA. Para NLDA, um método baseado em algoritmos genéticos para evoluir um conjunto de funções matemáticas, resultando tanto em combinações lineares quanto não-lineares de duas ou mais características podem ser utilizados (Melo et al., Protein Science, 2007). Este método gera transformações não lineares de combinações de até quatro genes para produzir pontuações de compósitos individuais.

[0189] Para integrar ambos os passos, um valor numérico pode ser atribuído aos dados obtidos no primeiro passo, a fim de lhes dar uma identidade de saída semelhante aos valores obtidos no segundo passo ou fase, como esquematizado na Figura 3.

[0190]Em certas formas de realização, um classificador ou algoritmo (ou os genes que são baseados) é selecionado para maximizar a relação sensibilidade/especificidade, atingindo ambos valores preditivo positivo (PPV) e valor preditivo negativo (NPV) maior do que 90%, e/ou alcançar ASC> 90.

[0191]Em formas de realização particulares, a correlação e/ou determinação se uma amostra biológica obtida de um indivíduo é cancerosa ou benigna é determinada utilizando um classificador ou algoritmo, por exemplo, um classificador de duas etapas, com base na expressão de um ou mais, dois ou, ou três ou mais produtos de genes aqui descritos, incluindo os produtos de genes expressos por qualquer um dos seguintes conjuntos de produtos de genes: dois ou mais, ou três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7; os produtos dos genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; os produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; os produtos de genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou os produtos de gene dos genes CXCL10 CCR7, TIMP-1, e CLDN-1.

[0192]Em certas formas de realização, os métodos da presente invenção podem ser realizados utilizando um "algoritmo de aprendizagem de máquina", que se refere a um método de previsão com base computacional, também conhecido por pessoas versadas na técnica como um "classificador", que pode ser empregue para a caracterização de um perfil de expressão de gene. Os sinais correspondentes a determinados níveis de expressão, os quais são obtidos por, por exemplo, ensaios de hibridização baseados em micro arranjos, são tipicamente submetidos ao algoritmo de modo a classificar o perfil de expressão. Aprendizagem supervisionada geralmente envolve o "treinamento" de um classificador para reconhecer as distinções entre as classes, por exemplo, o câncer versus tecido da tireoide benigno, e, em seguida, "testar" a precisão do classificador em um conjunto de teste independente. Para novas, amostras desconhecidas, o classificador pode ser utilizado para determinar a classe em que pertencem as amostras. Em formas de realização particulares, a correlação é realizada utilizando um algoritmo, incluindo baseados em níveis de expressão de qualquer um dos conjuntos de produtos de genes aqui descritos.

[0193]Exemplos de tipos de algoritmos adequados para a categorização de amostras incluem, mas não estão limitados a algoritmos vizinhos k-próximos, algoritmos de vetor de suporte, algoritmos Bayesiano ingênuo, algoritmos de rede neural, algoritmos modelo de Markov ocultos, algoritmos genéticos, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização da presente invenção, uma análise discriminante linear diagonal, algoritmo vizinho k-próximo, algoritmo de máquina de vetor de suporte (SVM), máquinas de vetores de suporte linear, algoritmo de floresta aleatório, ou um método baseado em modelagem probabilística ou uma combinação dos mesmos é fornecida para classificação de dados de micro arranjos. Em algumas formas de realização, marcadores identificados que distinguem amostras (por exemplo, benigna versus maligna, normais versus maligna) ou distinguem subtipos (por exemplo PTC contra FVPTC) são selecionados com base na significância estatística da diferença nos níveis de expressão entre as classes de interesse. Em alguns casos, a significância estatística é ajustada por aplicação de uma Benjamini Hochberg ou de outra correção de taxa de detecção falsa (FDR).

[0194]Em certas formas de realização, os algoritmos da presente invenção podem incluir uma ou mais características analíticas adicionais de computações. Por exemplo, os métodos de análise dos níveis de expressão de produto de gene podem incluir o uso de um algoritmo de seleção característico, que pode ser fornecido pelo uso do pacote de programas de computador LIMMA (Smyth, GK (2005) Limma: linear models for microarray data (Limma: Modelos lineares para dados de micro arranjo). Em: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R (Bioinformática e Soluções de Biologia Computacional utilizando R) e Bioconductor, R. Cavalheiro, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry, W. Huber (eds.), Springer, New York, páginas 397420). Métodos de análise dos níveis de expressão de produto de gene podem incluir o uso de um algoritmo pré- classificador. Por exemplo, um algoritmo pode utilizar uma impressão digital molecular específica de células para pré- classificar as amostras de acordo com a sua composição e, em seguida, aplicar um fator de correção/normalização. Esta informação/dados podem então ser alimentados para um algoritmo de classificação final que incorpora essa informação para auxiliar no diagnóstico final.

[0195]Aspectos selecionados podem ser classificados utilizando um algoritmo classificador. Algoritmos ilustrativos incluem, mas não estão limitados aos métodos que reduzem o número de variáveis, tais como algoritmos de análise de componentes principais, métodos dos mínimos quadrados parciais e algoritmos de análise de componente independentes. Algoritmos ilustrativos ainda incluem, mas não se limitam a, métodos que lidam com grandes números de variáveis diretamente tais como os métodos estatísticos e métodos baseados em técnicas de aprendizagem de máquina. Métodos estatísticos podem incluir regressão logística penalizada, análise de previsão de micro arranjos (PAM), métodos baseados em centroides encolhidos, análise de máquina de vetor de suporte, e análise discriminante linear regularizada. Técnicas de aprendizado de máquina incluem procedimentos de ensacamento, procedimentos de impulsão, algoritmos florestais aleatórios, e suas combinações. Cancer Inform. 2008; 6: 77-97 proporciona uma visão geral das técnicas de classificação fornecidas acima, para a análise dos dados de intensidade de micro arranjo.

[0196]Em alguns casos, um algoritmo de acordo com a presente invenção pode ser completado com uma abordagem meta-análise, tal como o descrito por Fishel e Kaufman et al., Bioinformática 2007 23 (13): 1599-606. Em alguns casos, o algoritmo classificador pode ser suplementado com uma abordagem de meta-análise, tal como uma análise de repetibilidade. Em alguns casos, a análise de repetibilidade seleciona marcadores que aparecem em, pelo menos, um conjunto de marcadores do produto de expressão preditivo.

[0197]Em certas formas de realização, os níveis de expressão do produto do gene, por exemplo, os valores de intensidade resultantes para cada produto de gene, medidos em uma amostra podem ser analisados utilizando técnicas de seleção de característica, tais como, mas não limitado a, técnicas de filtragem que avaliam a relevância de características vendo as propriedades intrínsecas dos dados, métodos de invólucro que incorporam a hipótese de modelo dentro de uma busca de subconjunto de aspectos, e técnicas incorporadas na qual a busca de um melhor conjunto de aspectos é construída em um algoritmo classificador.

[0198]Exemplos de técnicas de filtro úteis nos métodos da presente invenção incluem: (1) métodos paramétricos tais como a utilização de testes t de duas amostras, análise ANOVA, os formas de realização Bayesian, e modelos de distribuição de Gama; (2) métodos do modelo livre, tais como o uso de Wilcox em testes de soma de classes, entre- dentro da soma de classe de testes quadrados, métodos de grau de produtos, métodos de permutação aleatória ou TnoM, que envolve a criação de um ponto limite para as diferenças de razão de mudança na expressão entre dois conjuntos de dados e, em seguida, a detecção do ponto limiar em cada gene que minimiza o número de classificações equívocas; e (3) métodos multivariados, tais como métodos bivariados, métodos de seleção de aspectos com base na correlação (CFS), métodos de redundância mínima e máxima relevância (MRMR), métodos de filtro manta Markov, e métodos de centroide encolhido não correlacionados. Métodos de invólucro úteis nos métodos da presente invenção incluem métodos sequenciais de busca, algoritmos genéticos e estimativa de algoritmos de distribuição. Métodos incorporados úteis nos métodos da presente invenção incluem algoritmos florestais aleatório, vetor de peso de algoritmos de máquina de vetor de suporte, e pesos de algoritmos de regressão logística. Bioinformática. 01 de outubro 2007; 23 (19): 2507-17 fornece uma visão geral dos méritos relativos das técnicas de filtro fornecidas anteriormente para a análise de dados de intensidade.

[0199]Em certas formas de realização, os níveis de expressão de produtos de genes em uma amostra podem ser comparados com os dados de expressão de genes de dois ou mais conjuntos diferentes de biomarcadores, os dados de expressão de gene para cada conjunto de biomarcadores compreendendo um ou mais níveis de expressão de genes de referência correlacionados com a presença de um ou mais tipos de tecidos, por exemplo, tecido de tumor da tiroide, em que os níveis de expressão são comparados com os dados de expressão de genes para os dois ou mais biomarcadores em modo sequencial. A comparação dos níveis de expressão para os dados de expressão de gene para conjuntos de biomarcadores pode compreender a aplicação de um classificador ou aplicação sequencial de diferentes classificadores, incluindo aqueles aqui descritos, para os dados de expressão de genes. Análise sequencial pode envolver a aplicação de um classificador obtido a partir da análise de expressão do gene de amostras de tecido de câncer, seguido pela aplicação de um classificador obtido a partir de análise de uma mistura de amostras biológicas diferentes, algumas das referidas amostras contendo tecidos de câncer e outras contendo tecido benigno.

[0200]Em certas formas de realização, classificadores utilizados no início da análise sequencial podem ser utilizados para qualquer regra-de-dentro ou regra-de-fora de uma amostra como benigno ou suspeito. Em algumas formas de realização, tal análise sequencial termina com a aplicação de um classificador "principal" para os dados de amostras que não foram excluídos pelos classificadores anteriores, em que o classificador principal é obtido a partir da análise de dados dos níveis de expressão de genes em vários tipos de tecidos, e em que o classificador principal é susceptível de designar a amostra como benigna ou suspeita (ou maligna).

[0201] Por exemplo, em certas formas de realização, perfil utilizando conjuntos de genes ou marcadores pode ser utilizado para caracterizar o tecido da tiroide como benigno, suspeito e/ou maligno. Conjuntos podem ser derivados a partir de análise de níveis de expressão de gene de coortes contendo subtipos benignos (não cancerosos) da tiroide incluindo adenoma folicular (FA), hiperplasia nodular (PHN), tiroidite linfocítica (LCT) e adenoma das células de Hurthle (HA); subtipos malignos, incluindo carcinoma folicular (FC), carcinoma de tireoide papilar (PTC), variante folicular do carcinoma papilífero (FVPTC), carcinoma medular da tiroide (MTC), carcinoma de células Hurthle (HC), e carcinoma de tireoide anaplásico (ATC). Esses painéis também podem ser derivados de subtipos não- tiroide, incluindo carcinoma de células renais (RCC), carcinoma da mama (BCA), melanoma (MMN), linfoma de células B (BCL) e paratireoide (PTA). Conjuntos de biomarcadores associados com tecido normal da tiroide (NML) também podem ser utilizados nos métodos e composições aqui proporcionadas. Exemplos de marcadores são apresentados na Tabela 1, e conjuntos específicos de biomarcadores são aqui descritos.

[0202] Conforme discutido acima, os métodos e kits da presente invenção podem referir-se à utilização de conjuntos específicos de genes ou produtos de genes, por exemplo, "conjuntos" de biomarcadores, para fins de identificação, classificação, diagnóstico, ou para de outro modo caracterizar uma amostra biológica. A invenção também pode utilizar grupos de conjuntos de biomarcadores, aqui descritos como "conjuntos de classificação". Muitas vezes, o padrão de níveis de expressão de gene de biomarcadores em um conjunto (também conhecido como uma assinatura) é determinado e, em seguida, utilizado para avaliar a assinatura do mesmo conjunto de biomarcadores em uma amostra biológica, tal como por uma medida de semelhança entre a assinatura da amostra e a assinatura de referência. Em algumas formas de realização, o método envolve a medição (ou obtenção) dos níveis de dois ou mais produtos de genes que estão dentro de um conjunto de biomarcadores e/ou dentro de um conjunto de classificação. Por exemplo, em algumas formas de realização, um biomarcador definido ou um conjunto de classificação pode conter, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 38, 40, 43, 45, 48, 50, 53, 58, 63, 65, 68, 100, 120, 140, 142, 145, 147, 150, 152, 157, 160, 162, 167, 175, 180, 185, 190, 195, 200, ou 300 biomarcadores. Em algumas formas de realização, um biomarcador definido ou um conjunto de classificação contém não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 38, 40, 43, 45, 48, 50, 53, 58, 63, 65, 68, 100, 120, 140, 142, 145, 147, 150, 152, 157, 160, 162, 167, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 300 ou biomarcadores. Em algumas formas de realização, um conjunto de classificação contém, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou diferentes conjuntos de biomarcadores. Em outras formas de realização, um painel de classificação não contém mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 diferentes conjuntos de biomarcadores.

[0203] Conjuntos de biomarcadores podem ser escolhidos para acomodar a separação correta de perfis de expressão benignos de não benignos ou suspeitos. A formação (treinamento) do classificador, ou seja, o algoritmo, pode ser realizada em várias amostras biológicas, tais como pelo menos 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, ou 4000 amostras biológicas (por exemplo, amostras da tireoide). A população total de amostra pode consistir em amostras obtidas a partir de PAAFS, ou a população de amostra pode ser uma mistura de amostras obtidas por PAAFS e por outros métodos, por exemplo, tecido pós-cirúrgico. Em algumas formas de realização, vários conjuntos de treino/teste são utilizados para desenvolver o algoritmo preliminar. A taxa de erro de algoritmo geral pode ser mostrada como uma função do número de genes para amostras benignas versus não benignas. Em algumas formas de realização, outra medida de desempenho pode ser utilizada, tais como uma métrica de desempenho que é uma função do número de genes tanto para ambos os subtipos ou benigna versus maligna (B contra M). Tal parâmetro de desempenho podem ser obtidos utilizando CV, ou outro método conhecido na técnica. Todos os resultados podem ser obtidos utilizando um modelo de máquina de suporte de vetor que é treinado e testado em um modo de validade cruzada nas amostras.

[0204]A avaliação estatística dos resultados do perfil molecular pode fornecer um valor quantitativo ou valores indicativos de um ou mais dos seguintes procedimentos: a probabilidade de precisão do diagnóstico; a probabilidade de câncer; ou a probabilidade de um subtipo particular de câncer. Os dados podem ser apresentados diretamente ao médico em sua forma mais útil para orientar a assistência ao paciente.

[0205]Os resultados do perfil molecular podem ser avaliados estatisticamente utilizando um número de métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a: o teste t de Student, o teste t de duas faces, a análise de soma de classes de Pearson, análise de modelo de Markov escondido, análise de q-q plots, análise de componentes principais, ANOVA única, ANOVA dual, LIMMA e similares.

[0206]Em algumas formas de realização da presente invenção, os métodos da presente invenção, sozinhos ou em combinação com análise citológica, podem proporcionar uma classificação, identificação, ou diagnóstico, por exemplo, de câncer ou benigno, que é entre cerca de 85% e cerca de 99% preciso ou cerca de 100% preciso.

[0207]Algoritmos baseados em cada um dos conjuntos de biomarcadores ou classificação descritos neste documento podem utilizar informações sobre os níveis de expressão do gene de produtos determinados durante o treinamento do algoritmo para incluir, ou excluir uma dada amostra como "benigna", "suspeita", ou como compreendendo ou não compreendendo um ou mais tipos de tecidos (por exemplo, NML, FA, NHP, LCT, HA, FC, PTC, FVPTC, MTC, HC, ATC, RCC, BCA, MMN, BCL, e PTA). Cada algoritmo de conjunto de biomarcador ou classificação pode utilizar regras de decisão simples para filtrar amostras de entrada, removendo efetivamente quaisquer amostras sinalizadas da avaliação subsequente se as regras de decisão são satisfeitas (por exemplo, uma amostra é caracterizada sobre a identidade ou o estado de um ou mais tipos de tecidos nela contida). Os conjuntos de biomarcadores e conjuntos de classificação aqui fornecidos são úteis para a classificação, caracterização, identificação e/ou diagnóstico de câncer de tireoide ou outra condição da tiroide (incluindo o diagnóstico da tireoide como normal ou benigna).

[0208]A análise dos níveis de expressão de genes pode envolver a aplicação sequencial de diferentes classificadores ou algoritmos descritos neste documento para os dados de expressão de genes. Em certas formas de realização, tal análise sequencial pode envolver a aplicação de um classificador obtido a partir da análise da expressão de gene de uma pluralidade de amostras de tecido canceroso da tiroide, seguido pela aplicação de um classificador obtido a partir da análise de uma mistura de diferentes amostras de tecido da tiroide, com algumas das amostras contendo tecidos tireoidianos cancerosos e outras contendo tecido da tireoide benigno. Em algumas formas de realização, o classificador é obtido a partir da análise de padrões de expressão de genes em tecido benigno, de tecido normal, e/ou tecido não-tiroide (por exemplo, de tecido da paratireoide). Em algumas formas de realização, o tecido doente é tecido de HA e/ou de HC.

[0209]Em algumas formas de realização, o processo de classificação começa quando cada painel de classificação recebe como entrada os níveis de expressão de biomarcadores (por exemplo, valores de intensidade de micro arranjo resumidos, qPCR ou dados de sequenciamento) de uma amostra biológica. Os biomarcadores e níveis de expressão especificados em um painel de classificação são então avaliados. Se os dados de uma dada amostra correspondem as regras especificadas dentro do painel de classificação (ou de outra forma se correlacionam com a assinatura do painel de classificação), então sua saída de dados sinaliza a amostra e impede-a de posterior avaliação e pontuação pelo classificador (a jusante) principal. Quando um painel de classificação sinaliza uma amostra, o sistema retorna automaticamente uma chamada "suspeita" para essa amostra. Quando um painel de classificação não faz sinalização de uma amostra, a avaliação continua a jusante para o próximo painel de classificação e pode ser sinalizada ou não sinalizada. Em algumas situações, os painéis de classificação são aplicados em uma ordem específica; em outros casos, a ordem das aplicações pode ser qualquer ordem.

[0210]Em certas formas de realização, o processo de classificação começa com a determinação, tal como por análise da expressão do gene, do (s) nível (is) de expressão para um ou mais produtos de genes a partir de uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido da tiroide) de um indivíduo. Separadamente, um ou mais conjuntos de amostras de referência ou de formação podem ser analisados para determinar os dados de expressão de genes para, pelo menos, dois conjuntos diferentes de biomarcadores, os dados de expressão de gene para cada conjunto de biomarcadores compreendendo um ou mais níveis de expressão de genes correlacionados com a presença de um ou mais tipos de tecidos. Os dados de expressão de gene para um primeiro conjunto de biomarcadores podem ser utilizados para formar um primeiro classificador; dados de expressão de genes para um segundo conjunto podem ser utilizados para treinar um segundo classificador; e assim por diante para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou mais conjuntos de biomarcadores e classificadores opcionalmente correspondentes. Os conjuntos de amostras de referência ou de formação utilizados na análise de cada um dos conjuntos de marcadores podem ser sobrepostos ou não sobrepostos. Em algumas formas de realização, as amostras de referência ou de formação compreendem tecido de HA e/ou de HC. No passo seguinte do processo de classificação das amostras, uma primeira comparação é feita entre o (s) nível (is) de expressão do gene da amostra e o primeiro conjunto de biomarcadores ou primeiro classificador. Se o resultado desta primeira comparação é uma correspondência, o processo de classificação termina com um resultado, como designando a amostra como suspeita, cancerosa, ou que contém um tipo de tecido particular (por exemplo, HA ou HC). Se o resultado da comparação não é uma correspondência, o (s) nível (is) de expressão de gene da amostra são comparados em uma segunda rodada de comparação para um segundo conjunto de biomarcadores ou segundo classificador. Se o resultado desta segunda comparação é uma correspondência, o processo de classificação termina com um resultado, como designando a amostra como suspeita, cancerosa, ou que contém um tipo de tecido particular (por exemplo, HA ou HC). Se o resultado da comparação não é uma correspondência, o processo continua no passo a passo de um processo semelhante de comparações até que seja encontrada uma correspondência, ou até que todos os conjuntos de biomarcadores ou classificadores incluídos no processo de classificação sejam utilizados como uma base de comparação. Se nenhuma correspondência for encontrada entre o (s) nível (is) de expressão de gene da amostra e qualquer conjunto de biomarcadores ou classificadores utilizados no processo de classificação, a amostra pode ser designada como "benigna." Em algumas formas de realização, a comparação final no processo de classificação é entre o (s) nível (is) de expressão de gene da amostra e um classificador principal, tal como aqui descrito.

[0211]Em algumas formas de realização da presente invenção, a análise dos dados ou correlação requer um computador ou outro dispositivo, máquina ou aparelho para aplicação de diversos algoritmos descritos no presente documento, devido ao grande número de pontos de dados individuais que são processados.

Kits

[0212]Em formas de realização particulares, a presente invenção fornece kits ou testes de diagnóstico para o diagnóstico ou prognóstico de cânceres, por exemplo, câncer de tiroide, em indivíduos. Os testes de diagnóstico aqui descritos podem ser testes de diagnóstico in vitro. Os testes de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a aprovados pela FDA, ou autorizado, Diagnóstico in vitro (IVD), Teste Desenvolvido em Laboratório (LDT) ou Teste Direto ao Consumidor (DTC), que podem ser utilizados para testar uma amostra biológica e detectar ou indicar a presença ou ausência de um câncer, tal como câncer de tiroide. Em uma forma de realização, um kit de teste de diagnóstico pode ser utilizado em um ambiente de laboratório ou outro profissional de saúde. Em uma outra forma de realização, um teste de diagnóstico ou kit pode ser utilizado por um consumidor em casa.

[0213] Testes de diagnóstico e kits compreendem um ou mais reagentes para a detecção de um produto gênico aqui descrito e pode incluir outros reagentes, instrumentos e sistemas destinados a serem utilizados no diagnóstico in vitro de uma Câncer, por exemplo, câncer de tiroide, a fim de curar, mitigar, tratar ou prevenir a doença ou suas sequelas. Em uma forma de realização, os kits ou testes de diagnóstico aqui descritos podem ser destinado ao uso na coleta, preparação e análise de amostras retiradas do corpo humano. Em formas de realização determinadas, kits, testes de diagnóstico e produtos podem compreender um ou mais testes laboratoriais. Tal como aqui utilizado, o termo "teste de laboratório" significa um ou mais procedimentos médicos ou de laboratório, que envolvem ensaios de uma amostra biológica obtida de um indivíduo.

[0214]Os kits de testes e de diagnóstico da presente invenção compreendem um ou mais reagentes para a detecção de um produto gênico aqui descrito, tais como os expressos por um gene listados na Tabela 1. A este respeito, os reagentes para a detecção pode compreender qualquer reagente conhecido á pessoa especialista para a detecção de produtos de genes, incluindo, mas não limitados a anticorpos e oligonucleotídeos. Em certas formas de realização, o kit de ensaio ou de diagnóstico pode ainda compreender instruções escritas sobre como realizar o teste tal como aqui descrito, para determinar os níveis de expressão do produto de gene utilizando o kit.

[0215]Em certas formas de realização, um kit ou teste de diagnóstico da presente invenção compreende dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais reagentes, por exemplo, sondas, para a detecção de um produto de gene aqui descrito. Em formas de realização particulares, os produtos do gene são proteínas ou ácidos nucleicos, por exemplo, RNAm. Em certas formas de realização, os reagentes são anticorpos ou oligonucleotídeos, incluindo qualquer um dos aqui descritos. Em certas formas de realização, cada um dos reagentes é um conjunto de oligonucleotídeos, por exemplo, em que cada conjunto compreende ou é constituído por dois oligonucleotídeos que juntos são capazes de amplificar um produto de gene de polinucleotídeo alvo, por PCR. Em certas formas de realização, os reagentes são marcados de forma detectável. Em uma forma de realização, um kit ou teste de diagnóstico compreende dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais reagentes para a detecção de um produto de gene, em que o kit ou teste de diagnóstico compreende ou dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais conjuntos de iniciadores, cada conjunto capaz de amplificar, pelo menos, uma porção de um produto de gene alvo. Em certas formas de realização, o referido kit ou teste de diagnóstico compreende ainda dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais sondas marcadas de forma detectável, cada sonda se ligando especificamente a um dos produtos do gene alvo ou um seu complemento. Assim, em certas formas de realização, cada conjunto de iniciadores é utilizado para amplificar um produto de gene alvo, e em seguida, cada sonda é utilizada para detectar os produtos de amplificação e assim medir o nível de expressão de cada produto gênico. Em formas de realização particulares, cada um dos reagentes, por exemplo, cada conjunto de iniciadores, detecta um produto de gene diferente. No entanto, entende-se que certas formas de realização podem incluir dois ou mais reagentes que amplificam o mesmo produto de gene. Por exemplo, um kit ou teste de diagnóstico pode compreender dois reagentes, sendo um deles um conjunto de iniciadores de amplificação e o outro sendo uma sonda, que cada um se liga especificamente e/ou detecta o mesmo produto de gene. Além disso, um kit ou teste de diagnóstico pode compreender várias combinações de dois ou mais reagentes que cada um se liga especificamente ou detecta o mesmo produto de gene, por exemplo, em que cada combinação se liga especificamente ou detecta um produto de gene diferente, permitindo, assim, a amplificação e detecção de vários produtos de genes, por exemplo, ao mesmo tempo.

[0216]Em formas de realização particulares, os produtos dos genes detectados pelos reagentes do kit ou teste de diagnóstico são expressos por um ou mais genes listados na Tabela 1, em que pelo menos um dos produtos de gene é expresso pelos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CAR, XB130, HO-1 ou CCR7. Em certas formas de realização, os produtos do gene compreendem ou consistem de: três ou mais produtos de genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB130, HO-1 e CCR7; os produtos dos genes dos genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7; os produtos de genes dos genes CCR3, TIMP-1, CAR e XB130; os produtos dos genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CAR e CCR7; os produtos dos genes dos genes TIMP-1, CAR e CCR7; ou os produtos de genes dos genes CXCL10, TIMP-1, CLDN-1, e CCR7.

[0217]Em certas formas de realização, o kit ou teste de diagnóstico compreende cada reagente em um recipiente separado. Em outras formas de realização, cada um dos reagentes é fornecido no mesmo recipiente. Em formas de realização particulares, os reagentes estão, cada um, ligados a um substrato, tal como, por exemplo, uma matriz. Em formas de realização particular, os reagentes estão, cada um, ligados a regiões discretas de um substrato sólido. Por conseguinte, em uma forma de realização, os reagentes são oligonucleotídeos ou conjuntos de oligonucleotídeos ligados covalentemente a um substrato sólido, em que o substrato sólido é opcionalmente uma matriz, e em que a matriz é opcionalmente um micro arranjo. Em certas formas de realização, os reagentes são conjuntos de oligonucleotídeos, por exemplo, iniciadores, e os conjuntos de oligonucleotídeos compreendem DNA.

[0218]Os kits ou testes de diagnóstico da presente invenção podem ainda compreender uma ou mais soluções adequadas para a ligação dos referidos reagentes aos referidos produtos de gene, e/ou uma ou mais soluções ou reagentes utilizados na realização de um método da presente invenção para determinar um nível de expressão dos produtos de gene. Por exemplo, em formas de realização particulares, um kit ou teste de diagnóstico que compreende conjuntos de iniciador de PCR, podem ainda compreender um ou mais reagentes adicionais para a realização de um ensaio de PCR, tais como, por exemplo, uma polimerase termoestável, uma mistura de desoxinucleotídeos e/ou uma sonda marcada de forma detectável. Em particular forma de realização, a sonda marcada de forma detectável compreende um fluoróforo e uma porção de têmpera, e a sonda pode emitir um sinal detectável quando a sonda é clivada, mas não quando a sonda está intacta.

[0219]Os kits ou testes de diagnóstico da presente invenção podem ainda compreender um ou mais reagentes para o processamento e/ou armazenamento de uma amostra biológica, por exemplo, em que o processamento da amostra de tecido da tiroide compreende a extração dos produtos de genes da amostra biológica.

[0220]Os kits ou testes de diagnóstico da presente invenção podem ainda compreender um ou mais produtos de genes de controle, tal como, por exemplo, controles positivos que contêm uma amostra do produto de gene e/ou um controle negativo que não contém, a fim de confirmar que os métodos realizados obtiveram sucesso em identificar e/ou medir especificamente a expressão e/ou a presença de produtos de genes.

[0221]Em certas formas de realização, um kit ou teste de diagnóstico compreende dados ou informações, por exemplo, correspondentes a níveis de expressão de gene dos produtos de gene em amostras de controle positivo e/ou negativo, ou níveis de corte predeterminados da expressão do gene indicativa da presença ou ausência de um câncer, como um câncer de tireoide. Em formas de realização relacionadas, o kit ou teste de diagnóstico compreende um algoritmo para uso em correlacionar os níveis de expressão do gene em uma amostra biológica com a presença ou ausência de um câncer, por exemplo, um câncer de tiroide. Em formas de realização particulares, o kit ou teste de diagnóstico compreende um meio de leitura por computador que contém os dados e/ou algoritmo, ou que contêm código para os dados ou algoritmo.

[0222]Em formas de realização particulares, um ou mais dos reagentes para detectar os produtos de genes, a solução, os reagentes adicionais, e os produtos de gene de controle estão em recipientes separados.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Seleção de Genes para Teste de Diagnóstico

[0223] Dezoito genes pré-selecionados com base em sua relação com o câncer de tireoide foram utilizados para desenvolver um teste de diagnóstico melhorado que iria precisamente classificar nódulos tireoidianos indeterminados como benignos ou câncer. Estes genes incluíram CXCR3 (Gene 1), CXCR3A (Gene 2), CXCR3B (Gene 3), CXCR4 (Gene 4), CCR3 (Gene 5), CXCL9 (Gene 6), CXCL10 (Gene 7), CXCL11 (Gene 8), SPAG-9 (Gene 9), CK-19 (Gene 10), TrMP-1 (Gene 11), CLDN-1 (Gene 12), CAR (Gene 13), Nectin-1 (Gene 14), XB-130 (Gene 15), HO-1 (Gene 16), CCR7 (Gene 17), e CXCL4 (Gene 18).

[0224] Como um conjunto de treinamento, amostras frescas de tecido da tireoide congeladas de ambos os nódulos tireoidianos benignos e malignos foram coletadas prospectivamente na sala de cirurgia (n = 156), incluindo 100 carcinomas da tiroide e 56 nódulos benignos da tireoide. Subtipos de câncer de tireoide incluíram carcinoma da tiroide papilar (PTC) tipo usual (56), variante folicular (22), esclerosante difusa (8) e carcinoma folicular (FC) (14). Nódulos benignos incluíram hiperplasia folicular (26), tiroidite (14) e adenoma folicular (16). Relatórios finais de biópsia para todos os espécimes cirúrgicos foram revisados e confirmados por dois patologistas especializados independentes. As amostras foram imediatamente colocadas em solução de preservação de RNA (RNAlater, Ambion) a 4°C, seguido por homogeneização utilizando um kit RNAeasy Plus Mini kit (Qiagen) e armazenado a -80°C. A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro Picodrop 100, a integridade de RNA foi confirmada utilizando eletroforese em agarose- formaldeído.

[0225]Expressão diferencial do gene foi analisada por PCR em tempo real para determinar o potencial de classificação de cada gene, quer individualmente quer em combinações diferentes. A síntese do DNA complementar (DNAc) foi realizada utilizando o sistema de transcrição reversa ImProm-II (Promega). O PCR foi realizado em tempo real em amostras em duplicado com o reciclador Rotor Gene Q da Qiagen, utilizando o kit II Brilhante Verde SYBR master mix (Agilent), seguindo as instruções do fabricante. As curvas padrão foram analisadas por meio de uma aplicação de programas de computador RotorGene para determinar as condições de amplificação ótimas para cada gene. Os valores de rendimento obtidos variaram de 95% a 109%. Os valores do coeficiente de regressão linear (Rsq) foram obtidos no intervalo de 0,990 a 0,999. Para comparações iniciais, a expressão do gene foi normalizada com 18s e β-actina e analisada pelo modelo proposto por quantificação relativa de Pfaffl. Os resultados são apresentados na Figura 1 como a razão de mudança relativa ao câncer em relação a nódulos benignos da tiroide.

[0226]Utilizando os valores do CT de cada gene, Curvas de Característica de Operação do Receptor (COR) foram geradas para comparar a capacidade de cada gene individual para classificar amostras de tireoide. A área sob a curva (ASC), e a sensibilidade e especificidade ótima foram determinadas e são fornecidas na Figura 2. Individualmente, os genes com melhor ASC e valores de sensibilidade/especificidade foram gene 11 (ASC: 0,87 e sensibilidade/especificidade: 96%/78%), gene 12 (ASC: 0,85 e sensibilidade/especificidade: 85%/73%) e gene 10 (ASC: 0,84 e sensibilidade/especificidade: 81%/79%). Genes 17 e 5 apresentaram ASCs de 0,74 e 0,70, respectivamente. Todos os outros genes apresentaram pobre desempenho de classificação, como se mostra na Figura 2.

EXEMPLO 2 Desenvolvimento de Testes de Diagnóstico

[0227]Um teste de classificação multi-gene (assinatura do gene), que maximiza a relação sensibilidade/especificidade atingindo ambos os valores preditivos positivos (VPP) e valor preditivo negativo (NPV) superior a 90%, foi utilizado. Critérios de seleção de conjuntos de genes ótimos para utilizar em classificadores foram: uma ASC maior do que 0,97, com ambos os valores de sensibilidade e especificidade superiores a 92% e 90%, respectivamente; o classificador de gene deve ser robusto e suportar variações de perfil de gene atípicas sem sobre ajuste. Além disso, a assinatura deve utilizar um pequeno conjunto de genes, permitindo, assim, um simples kit a ser utilizado em um ponto de ajuste de diagnóstico de cuidados tal como laboratórios de patologia. Para atender a esses critérios, algoritmos distintos foram treinados; as primeiras amostras identificadas e classificadas com valores de CT atípicos (inconsistente), e segundas amostras classificadas com valores de CT não-atípicos (Figura 3 A). Para integrar os dados de ambos os algoritmos de saída, os dados obtidos a partir do primeiro algoritmo foram transformados matematicamente para dar uma identidade de saída semelhante aos dados obtidos a partir do segundo algoritmo (Figura 3A).

[0228] Para desenvolver o classificador, os algoritmos foram utilizados sequencialmente em um processo de duas etapas. O primeiro passo do classificador incluiu duas fases; a primeira fase de amostras identificadas com valores de CT atípicos (inconsistentes) definidos como valores maiores do que dois desvios padrão do valor de CT médio para cada gene (Figura 3 A e B). Se uma amostra satisfez os critérios de um CT atípico para um gene, é seguido para a segunda fase, que calculada a probabilidade de erro (PE) de um valor de TC atípico pertencente ao grupo do câncer, ao mesmo tempo realmente pertencendo ao grupo benigno. A PE calculado para os genes selecionados foi expressa como uma pontuação individual, a qual foi utilizada para gerar uma pontuação composta que classificou a amostra como câncer ou benigna (Figura 3A e B). O primeiro passo identificou 21 de 56 amostras benignas e 36 de 100 amostras de câncer como atípicas e as classificaram com 100% de precisão.

[0229]As amostras que não satisfazem os critérios de valor de CT atípicas da primeira fase ou não foram classificadas na segunda fase seguiu o processo de classificação através da segunda etapa (Figura 3B). A segunda etapa utilizou algoritmos treinados por dois métodos, ou seja, análise discriminante linear (LDA) e análise discriminante Não-linear (NLDA) (Figura 3B). Análise LDA foi realizada utilizando o programa de computador SPSS 15.0 em uma abordagem passo a passo, uma vez que era desconhecido se as variáveis e amostras reuniam as condições necessárias para uma LDA. A abordagem gradual foi escolhida porque simultaneamente identificou a combinação de variáveis que deu a melhor classificação certamente e satisfez as condições necessárias para uma LDA. Para NLDA, um método baseado em algoritmos genéticos para evoluir um conjunto de funções matemáticas, resultando em quaisquer combinações não-lineares ou lineares de dois ou mais recursos foi utilizada (Melo et al., Protein Science, 2007). Este método gerou transformações não lineares de combinações de até quatro genes que produziram pontuações individuais compostas.

EXEMPLO 3 Seleção de Conjuntos de Genes de Diagnóstico

[0230] Classificadores de gene novos gerados a partir de ambas as estratégias de LDA e NLDA, tal como descrito no Exemplo 2, foram escolhidos com base em parâmetros da curva COR, incluindo a área sob a curva (ASC), a sensibilidade e especificidade. Os resultados de algoritmos representativos obtidos por LDA (SV) e NLDA (FM72 e FM208) são mostrados na Figura 4. Todos os classificadores mostraram excelente desempenho com ASCs maiores do que 0,98, sensibilidades que variam entre 94-97,8%, e as especificidades entre 92-99%. Mais importante ainda, o algoritmo com melhor desempenho (SV; Figura 4) mostrou um valor preditivo positivo e valor preditivo negativo de 95,8% e 96,1%, respectivamente (Figura 7).

[0231]Embora os três genes com melhor desempenho individual (CK19, TIMP-1, CLDN1) tenham sido previamente demonstrados serem fortes biomarcadores para o câncer de tireoide, a sua combinação sozinha não conta para o desempenho desses novos algoritmos. Para demonstrar isto, estes genes, quer individualmente quer combinados entre si utilizando a mesma estratégia de algoritmo em dois passos descrito no Exemplo 2 para os integrar, foram comparados com as novas combinações de genes aqui identificados, incluindo a combinação de gene SV. Surpreendentemente, a combinação dos três genes não modificou o seu desempenho em comparação com os genes individualmente, como se mostra na Figura 5. Além disso, a análise de correlação de Spearman mostrou que eles estão intimamente relacionados (p <0,001) (Figura 6), o que explica por que razão a combinação destes genes não melhorou o seu desempenho individual. Além disso, o desempenho das combinações de genes específicas aqui identificadas, incluindo a combinação do gene SV, foi estatisticamente superior a CK19, TIMP-1 e CLDN1, quer individualmente quer combinados (Figura 5). Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a superioridade das combinações de genes aqui descritos baseia-se na combinação de biomarcadores "bons" com biomarcadores "pobres" para atingir a capacidade máxima de classificação. Isto é provavelmente atribuível ao fato de que, nas combinações específicas aqui descritas, a maioria dos genes não estão relacionados uns com os outros e, por conseguinte, desempenho melhorado do classificador é conseguido pelo fato de cada gene identificar e classificar corretamente um conjunto diferente de amostras. Especificamente, CK19, TIMP-1 e CLDN1 classificou corretamente 80% das amostras de câncer, enquanto que outros genes utilizados em combinações de genes de diagnóstico da presente invenção classificaram a maioria das amostras benignas.

[0232]Um resumo comparando o desempenho de três conjuntos de genes utilizados em classificadores desenvolvidos, tal como aqui descrito (SV, FM72 e FM208), em comparação com Gene 10, Gene 11 e Gene 12, sozinho ou em combinação, é mostrado na Figura 7. SV inclui os seguintes genes: CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, HO-1 e CCR7. FM72 inclui os seguintes genes: CCR3, TIMP-1, CAR e XB130. FM208 inclui os seguintes genes: CXCL10, TIMP-1, CLDN-1 e CCR7. Uma comparação do desempenho dos vários conjuntos de genes e classificadores aqui descritos para o teste de análise de PAAF da tiroide Afirma® (Veracyte, South San Francisco, CA) é mostrado na Figura 7. EXEMPLO 4

Teste de Classificador de Gene com um Conjunto de Teste Independente

[0233]A precisão dos marcadores genéticos de diagnóstico selecionados na detecção de câncer ou tecido benigno foi determinada contra um conjunto independente de dados. Um novo conjunto de amostras, incluindo 20 amostras de tecidos de cânceres (PTC tipo usual (15), PTC variante folicular (4) e carcinoma folicular (1)) e 39 benignos (hiperplasia folicular (28), tireoidite (7) e adenoma folicular (4)) foi utilizado. Neste caso, foi incluído um número menor de amostras de câncer para representar uma prevalência semelhante de câncer na biópsia aspirativa por agulha fina em nódulos tireoidianos indeterminados.

[0234]A análise deste conjunto independente utilizando o classificador SV mostrou excelente desempenho com uma ASC de 0,95, sensibilidade de 95%, especificidade de 90%, PPV de 83% e NPV de 98% (Figura 8). Uma redução do valor preditivo positivo de 83% era esperada dado que PPV é dependente da prevalência do câncer. Do mesmo modo, o aumento do valor preditivo negativo depende da prevalência da doença benigna e, por conseguinte, aumentada até 98% neste ensaio definido em relação ao conjunto de treino (Figura 8). Estes resultados confirmam que os marcadores utilizados nos classificadores aqui descritos produzem resultados exatos que não são sobre ajustados, e fornecem novos ensaios de diagnóstico fiáveis.

EXEMPLO 5 Teste de Classificador de Gene com Segundo Conjunto de Teste Independente Obtido de Amostras de Punção Aspirativa por Agulha Fina

[0235]A precisão dos marcadores genéticos de diagnóstico selecionados na detecção de câncer ou nódulos tireoidianos benignos foi determinada contra um conjunto independente de amostras obtidas de punção aspirativa por agulha fina (PAAF). Estes correspondem à definição clínica real em que o ensaio é realizado. Uma vez que PAAF corresponde a uma amostra muito pequena, é possível que a celularidade reduzida possa diminuir o desempenho do teste. Por conseguinte, a capacidade de conjuntos de marcadores da invenção para prever a natureza de nódulos em amostras de PAAF foi testada. O novo conjunto de amostras incluiu 26 cânceres de tireoide papilares e 74 nódulos benignos da tireoide. Um número menor de amostras de câncer foi incluído para representar uma prevalência semelhante de câncer na biópsia aspirativa por agulha fina em nódulos tireoidianos indeterminados. Diagnóstico citopatológico de amostras de PAAF foi utilizado como padrão-ouro para comparar o resultado da classificação molecular do ensaio.

[0236]A análise deste conjunto independente utilizando o classificador SV mostrou excelente desempenho, com uma sensibilidade de 96%, especificidade de 89%, VPP de 75% e NPV de 98% (Figura 9). Estes resultados confirmam que os marcadores utilizados nos classificadores aqui descritos produzem resultados exatos que não são sobre ajustados, e fornecem a confirmação segura que os ensaios da invenção têm excelente performance em amostras de PAAF utilizadas rotineiramente no contexto clínico.

[0237] Todas as patentes dos EUA, publicações de pedido de patente dos EUA, pedidos de patentes dos EUA, patentes estrangeiras, aplicações de patentes estrangeiras e publicações não-patentes referidas nesta especificação são aqui incorporadas por referência, na sua totalidade, na medida em que não sejam incompatíveis com a presente descrição.

[0238] A partir do que precede será apreciado que, embora formas de realização específicas da invenção tenham sido aqui descritas para efeitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e âmbito da invenção. Por conseguinte, a invenção não está limitada exceto pelas reivindicações anexas.

Claims (5)

1. Método in vitro de diagnóstico de câncer de tireoide caracterizado por compreender: (a) determinar um nível de expressão de produtos de genes em uma amostra de tecido da tiroide obtida a partir de um indivíduo, em que os produtos de genes são ácido ribonucleico (RNA) ou proteína expressos pelos genes consistindo em: receptor de quimiocina (porção C-X-C) 3 (CXCR3), receptor de quimiocina (porção C-C) 3 (CCR3), ligante de quimiocina (porção C-X-C) 10 (CXCL10), citoqueratina 19 (CK-19), inibidor de tecido de metaloproteinase 1 (TIMP-1), claudin 1 (CLDN-1), vírus de Coxsackie e receptor de adenovírus (CAR), proteína 1 associada a filamento de actina tipo 2 (XB-130), heme oxigenasse (deciclização) 1 (HO-1) e receptor de quimiocina (porção C-C) 7 (CCR7); em que os produtos do gene de RNA de CXCR3, CCR3, CXCL10, CK-19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB-130, HO-1 e CCR7 correspondem às SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 , respectivamente, em que os produtos do gene proteico de CXCR3, CCR3, CXCL10, CK-19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB-130, HO-1 e CCR7 correspondem às SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20, respectivamente, em que o nível de expressão dos produtos de genes é determinado usando um reagente configurado para medir a expressão de RNA ou expressão de proteína; e (b) identificar a amostra de tecido da tireoide como cancerosa ou benigna, correlacionando os níveis de expressão determinados em (a) com a presença ou ausência de câncer de tiroide na amostra de tecido da tiroide usando um classificador que identifica os valores de CT atípicos de Ciclo Limiar e/ou valores de CT não atípicos, em que a amostra de tecido da tireoide é identificada como cancerosa se houver um aumento ou uma diminuição no nível de expressão de três ou mais dos produtos de genes determinados na etapa (a) entre a amostra de tecido da tireoide e os níveis de expressão de controle normais.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra de tecido da tiroide ser identificada como cancerosa se o nível de expressão de qualquer um ou mais dos genes CXCR3, CAR e/ou XB-130 estiver reduzido; e/ou o nível de expressão de qualquer um ou mais dos genes CCR3, CXCL10, CK-19, TIMP-1, CLDN-1 e/ou CCR7 estiver aumentado na amostra de tecido da tiroide, em comparação com o nível de expressão de controle normal, em que o número total de genes com a expressão aumentada ou reduzida é de, pelo menos, três.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra de tecido da tiroide ser identificada como cancerosa se houver uma diferença estatisticamente significativa no nível de expressão dos produtos de genes entre a amostra de tecido da tiroide e os níveis de expressão de controle de câncer.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o classificador ser gerado utilizando dados de expressão gênica determinados para os produtos de genes de uma pluralidade de amostras de tecido normal da tireoide e/ou amostras de tecido cancerosa da tireoide.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender ainda a etapa de realizar uma análise citológica em uma amostra de tecido da tireoide obtida do sujeito antes de (a) para obter um diagnóstico preliminar.

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