WO2022133621A1 - Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides, las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto; kit; reactivos para conformar dicho kit; uso de los reactivos y uso de marcadores moleculares parte del método - Google Patents

Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides, las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto; kit; reactivos para conformar dicho kit; uso de los reactivos y uso de marcadores moleculares parte del método Download PDF

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thyroid cancer
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Hernán Eugenio GONZÁLEZ DÍAZ
María Soledad URRA GAMBOA
Sergio Sebastián VARGAS SALAS
Francisco Luciano CÓRDOVA RIQUELME
José Rodrigo Waldemar MARTÍNEZ SOLÍS
Estefanía del Carmen MUÑOZ MUÑOZ
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Pontificia Universidad Católica De Chile
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    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation

Definitions

  • the present invention is directed to an in vitro method and its kits for predicting the aggressiveness of papillary thyroid cancer and guiding the most recommendable surgical plan for the treatment of the tumor in a subject.
  • the present invention describes an in vitro method using a molecular classifier to predict the aggressiveness (metastatic potential) of papillary thyroid cancer, allowing the surgeon to recommend the best surgical option to treat the tumor in a subject.
  • FNA fine-needle aspiration biopsy
  • Cytological diagnosis of thyroid cancer by FNA allows cancer to be classified into 4 main types: papillary thyroid carcinoma (the most common malignant thyroid neoplasm), follicular thyroid carcinoma, medullary thyroid carcinoma, and anaplastic thyroid carcinoma (Quang t. et al., 2015).
  • the American Joint Committee on Cancer AJCC
  • Tumor, Node, Metastasis TPM classification system.
  • TPM Tumor, Node, Metastasis
  • This system is the most widely used for prediction of prognosis for thyroid cancer.
  • this system focuses its analysis on patient survival rather than disease recurrence, so it is not a
  • Treatment options for thyroid cancer include surgery, radioactive iodine (1311) therapy, and targeted molecular therapies with various tyrosine kinase inhibitors (TKIs).
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • the National Cancer Institute in the United States has defined treatment recommendations according to the stage of advancement (National Cancer Institute). Surgery is presented as a standard treatment option, being considered for papillary and follicular thyroid cancer if it is localized or metastatic, in recurrent papillary and follicular thyroid cancer and in anaplastic thyroid cancer (National Cancer Institute. Thyroid cancer treatment (PDQ).http://cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/thyroid/HealthProfessional.).
  • the surgical treatment option includes hemithyroidectomy and total thyroidectomy (removal of all visible thyroid tissue), selecting partial or total removal according to the size of the tumor. (Quang et al., 2015). In short, there are several variables that influence the diagnostic decision and particularly in the decision of the type of surgery for tumor removal.
  • Thyroid cancer is diagnosed mainly by orthological analysis. Although this diagnostic strategy is the standard clinical protocol, it has been observed to have limitations such as the difficulty in differentiating between papillary and follicular cancer variants. In addition, this type of technique does not confer any prognostic or therapeutic predictive information. Based on this problem, diagnostic work was done with immunohistochemical markers, however, few have the capacity to determine the metastatic potential or prognosis of thyroid carcinoma (Sethi K. et al., 2010).
  • Document W02012160519 presents a methodology for the detection of the expression levels of one or more gene products, including the detection and analysis of the chemokine receptor CCR3.
  • the presence and/or level of aggressiveness of thyroid cancer is determined from a thyroid tissue sample.
  • documents WO2016201555, W02012170711, US2007099209, WO2013022995 present methods based on the detection of expression levels of one or more genes, including molecular markers such as PTEN, BRAF, CTLA4, VEGFC, among others.
  • the focus of these documents is to obtain information regarding the presence or absence of cancer and the aggressiveness of the cancer.
  • document US10260103B2 presents diagnostic tests, in vitro methods and Kits that allow the identification of thyroid cancer in a biological sample, by means of fine needle aspiration sampling and the analysis of the expression levels of groups of genes that comprise the selected group of genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1, CLDN-1, CAR, XB-130, HO-1 and CCR7.
  • ThyroSeq® is a test for the preoperative evaluation of thyroid nodules with indeterminate cytology, which offers an evaluation of the probability of cancer in a given nodule.
  • ThyroSeq v3 Test indicates that it provides information about the prognosis that helps to determine what type of surgery to perform, until now there is no study that shows that Thyroseq v3 predicts an aggressive condition or that its use induces behavior change clinically relevant.
  • ThyroSeq v2 and ThyroSeq v3 which incorporate an increasingly complete panel of genes to analyze (Thyroseq®, Thyroid Genomic Classifier).
  • Thyroseq® Thyroid Genomic Classifier
  • This technology is based on next-generation sequencing of DNA and RNA, a highly complex and expensive technique, which is not available in all the countries of the world in a massive way and even less for its use in clinical diagnosis.
  • Afirma® genomic classification test Another diagnostic test based on the genetic analysis of thyroid cancer is the Afirma® genomic classification test. This test preoperatively evaluates the probability or suspicion of cancer in thyroid nodules with indeterminate cytology.
  • the company that develops this technology has incorporated the use of Afirma ® Xpression Atlas (XA), a test that suggests surgeons adapt the surgery strategy or treatment options for patients whose thyroid nodules are cancerous or cancer suspects, from the same FNA samples used in the Afirma® test.
  • XA Afirma® Xpression Atlas
  • Afirma® is based on complete RNA transcriptome sequencing and Afirma® XA, on the detection of genomic alterations (DNA variants and RNA fusions), using the sequencing platform of new generation, complex and high-cost technology that does not allow the use of these molecular tests globally.
  • the present invention provides an in vitro method and kits to predict the aggressiveness (metastatic potential) of papillary thyroid cancer and more accurately indicating the type of surgery that should be performed to perform a surgical treatment with greater chances of definitive cure.
  • the present invention is based on the quantification of the expression of at least one or more genes in a FNA sample from a patient with papillary thyroid cancer, which, combined in a specific way by a classifier developed by neural networks, allow to predict with high accuracy the metastatic potential of the tumor.
  • the present invention is based on the quantification of the expression levels of at least one or more genes, corresponding to BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, miR-16, miR-146b, miR-155, miR-181d, RNU6B and RET.
  • the gene combinations included in this invention provide significantly improved diagnostic and classification results compared to existing and available methods.
  • the algorithmic analysis of the expression of at least one or more of the genetic markers obtained from FNA samples included in the present invention delivers unexpectedly high results that are much higher than the predictive capacity of the genes individually or by the mere additive combination of the markers or other previously described markers.
  • the measurement of one or more, two or more, three or more, or the set of genes of the present invention, with subsequent analysis by a stage classifier algorithm is capable of predicting with high diagnostic efficacy that patients with papillary thyroid cancer have an aggressive molecular profile (high metastatic potential).
  • the present invention only uses 11 markers, allowing it to be packaged in a kit (“/n vitro diagnostic” or IVD) that can be distributed anywhere. pathology laboratories globally, expanding the availability of the diagnostic test and reducing the costs of prognostic evaluation in patients with papillary thyroid cancer.
  • the development of the method proposed in the present invention includes the analysis of gene expression data of one or more genes through 3 steps: 1) a data preprocessing stage, 2) a data processing stage and 3) a classification stage.
  • the multilayer perceptron (MLP) artificial neural network was used as a strategy to build a model or classification algorithm.
  • MLP multilayer perceptron
  • training and cross-validation tests were performed for perceptrons with different combinations of hyperparameters of the model or algorithm.
  • the hyperparameters considered were epoch, learning rates, dropouts, rho and epsilon.
  • 50% of them were used for the training phase and 50% for the cross-validation phase.
  • the best network with accuracy > 0.80 was chosen for the training and cross-validation cohorts.
  • the third stage corresponds to the classification in which the scores obtained from the MLP classification algorithm or model are integrated to evaluate the diagnostic efficacy of the Thyroid Metastatic Classifier (CMT).
  • CMT Thyroid Metastatic Classifier
  • ROC receiver operating characteristic
  • the performance in predicting lymph node metastasis was determined. According to the results, the CMT predicts with high efficacy the cases with high metastatic potential in FNA samples from patients with papillary thyroid cancer.
  • the cut-off point to classify samples as metastatic (M-PTC) or non-metastatic (NM-PTC) was 0.20.
  • a prediction method based on a Thyroid Metastatic Classifier with the best diagnostic performance for lymph node metastases is provided.
  • the diagnostic efficacy of the classifier reached an AUC of 0.82 [CI 0.73 - 0.92], a sensitivity of 79% [CI 61-92] and a specificity of 76% [CI 61- 88], the PPV and NPV were 70% [CI 56 - 80%] and 85% [CI 73 - 92%], respectively.
  • TPC reproduced its efficacy, showing an AUC of 0.84 [CI 0.76 - 0.95], a sensitivity of 72% [CI 70 - 96%] and a specificity of 87% [ CI 61-88%].
  • the PPV and NPV were 79% [CI 59-90%] and 82% [CI 69-90%], respectively.
  • the positive and negative predictive values of the CMT were estimated according to Bayes' Theorem.
  • the classifier is expected to achieve a positive predictive value of 60-79% and a negative predictive value of 94-82% over a range of lymph node metastasis prevalence of 25-40%.
  • the in vitro method proposed in the present invention allows the cancerous thyroid tissue sample to be identified as metastatic or non-metastatic with a sensitivity greater than or equal to 69% or greater than or equal to 90%; a specificity greater than or equal to 78% or greater than or equal to 93%; a positive predictive value greater than or equal to 52% or greater than or equal to 76%; a negative predictive value greater than or equal to 55% or greater than or equal to 93%; a positive odds ratio greater than or equal to 2 or greater than or equal to 12; a positive post-test probability greater than or equal to 58% or greater than or equal to 90%; a negative odds ratio greater than or equal to 0.19 or greater than or equal to 0.58; and a negative post-test probability greater than or equal to 9% or greater than or equal to 32%.
  • approximately is meant an amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length that varies up to 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 , 4, 3, 2 or 1% to a reference quantity. In any embodiment discussed in the context of a numerical value used in conjunction with the term “approximately”, it is contemplated that this term may be omitted.
  • a “reduced”, “decreased”, “minor” amount corresponds to a “statistically significant” amount of decrease in values, quantities, measurements in results.
  • the term “increased” or “improved” corresponds to a “statistically significant” amount of increase in values, quantities, measurements in results. Both the “statistically significant” increase and decrease are compared with the control values of each trial. The decrease or increase of the values obtained in the results with respect to the control can range from approximately 0.1 to 1,000, for example, a sample can increase its expression levels with respect to the control 50 times.
  • derived from refers to the fact that a sample itself is isolated or derived from a particular source. The same goes for the term “derived from”, which can refer to the source the sample came from.
  • an embodiment indicates particular characteristics or structure described in relation to the embodiment that includes at least one embodiment present in the invention, which do not necessarily correspond to the same embodiment. On the other hand, particular structures or features may combine one or more embodiments.
  • quantification indicates an embodiment of the present invention, which refers to counting in numbers or expressing magnitude through numbers or percentages. When referring to “quantification of expression levels” it refers to the quantification of gene expression products that can be indicated as quantity or percentage of proteins or mRNA.
  • Coding sequence is meant any nucleotide or polynucleotide sequence that contributes to the peptide or polypeptide product of a gene.
  • non-coding sequence indicates nucleotide or polynucleotide sequences that do not contribute to the polypeptide product of a gene.
  • Gene means a unit of heredity that occupies a specific place on a chromosome and consists of transcriptional and/or translational regulatory sequences and/or a coding region and/or non-translated sequences such as introns.
  • Gene product the term “gene product” is understood as the product that results from the expression of a gene, which can be a protein or RNA.
  • Gene expression refers to the cellular process that allows the information encoded by nucleic acids to be transformed into proteins. When the term “overexpression” or “gene overexpression” is indicated, it refers to the obtaining of a high number of proteins, after the transformation process from nucleic acids.
  • mRNA or mRNA transcripts This document includes, but is not limited to pre-mRNA transcripts, mature mRNAs, and translation and transcription of these sequences.
  • An mRNA refers to a nucleic acid for the synthesis of which DNA has been used as a template.
  • cDNA the definition of cDNA is included, which describes that a cDNA corresponds to a reverse form of DNA which comes from mRNA.
  • Sample mRNAs include, but are not limited to mRNA transcripts from gene(s), cDNA reverse transcription from mRNA, cRNA transcript from cDNA, amplified DNA from genes, RNA transcribed from amplified DNA, and the like.
  • Amplification When referring to the term “amplification”, “sequence amplification”, it refers to increasing or increasing the quantity or increasing the number of copies of a gene product or gene sequences.
  • the term “amplification” is used in molecular assays such as Polymerase Chain Reaction or PCR. When reference is made to PCR assays, it refers to that assay of a molecular nature which allows obtaining a greater number of copies of a gene product. When reference is made in the present invention to real-time PCR or qPCR or quantitative PCR, it refers to the molecular procedure that allows the amplified gene product to be amplified and quantified.
  • the real-time PCR technique or qPCR or quantitative PCR uses specific primers or primers, and specific reagents for said reaction, which is thermostable, however, unlike conventional PCR, this method also uses a fluorophore which is identified by a fluorescence sensor that allows the quantification of the amplified gene product.
  • "reagents” are used, which comprise chemical substances that allow interaction with different components in a reaction or allow the generation of new substances.
  • polynucleotides or “nucleic acid” which refer to the polymeric form of nucleotides of at least 10 bases in length, ribonucleotides or deoxyribonucleotides or a modified form thereof. Included in this term are the single-stranded and double-stranded structures of DNA and RNA.
  • polynucleotide sequences may include genomic sequences, extragenomic sequences, plasmid-encoded sequences, engineered expression gene segments, peptides, or engineered sequences tailored for peptide expression. These genomic segments can be modified by the hand of man.
  • polynucleotides of this invention can be combined with other DNA sequences, such as promoters, signals polyadenylation, cutting sites for restriction enzymes, among others. Therefore, it is possible to use a fragment of nucleotide sequences of almost any length, preferably limited by the maximum length that allows for ease of preparation and use in recombinant DNA protocols.
  • Polynucleotide Variant refers to polynucleotides that show substantial sequence identity to the reference polynucleotide sequence. This term contemplates polynucleotides that are distinguished from one another by the addition, deletion, or substitution of at least one nucleotide.
  • Sequence Identity This term is used herein to refer to the degree to which sequences are identical on a nucleotide-for-nucleotide or amino-acid-for-amino-acid basis as compared to another sequence.
  • Polypeptide and protein refer to a polymer of amino acid residues and their natural and analogous synthetic variants. These terms apply to polymers of synthetic or non-synthetic amino acids.
  • Probe refers to a small DNA or RNA fragment, which is used in molecular biology techniques to identify the presence of DNA or RNA. Probes are characterized by having the ability to bind or hybridize with DNA or RNA sequences or sectors of sequences. Furthermore, these probes may or may not contain "fluorophores” that emit light when this probe binds to a DNA or RNA sequence. The term “fluorophore” refers to molecules or components of these that are fluorescent because they contain a functional group that absorbs a specific wavelength that it then emits as light.
  • Subject or Individual A "subject” or “individual” is referred to herein as any animal that exhibits a symptom, or could exhibit a symptom, which may be treated or diagnosed in accordance with the invention. Topics for profiling the gene products of the invention for diagnostic and other purposes are included. Suitable subjects or individuals (patients) include laboratory animals, farm animals, domestic animals. Mammals such as primates and humans are included.
  • Treatment includes any desirable effect on the symptoms or pathology of a disease or condition, for example, thyroid cancer. This term does not necessarily indicate the eradication or cure of the disease or the associated symptoms thereof.
  • the treatments can be applied to the subjects that need it.
  • Diagnosis when referring to the term "diagnosis” it includes any type of recognition, analysis and evaluation that is carried out to determine a given situation and what its characteristics are. In medical terms, the diagnosis allows to identify the appearance of diseases in an individual through the observation of symptoms and the application of tests and analyzes that allow the determination of the disease.
  • Prediction refers to the study of possible future scenarios through different analysis techniques.
  • a "prediction” made by means of a diagnostic method makes it possible to determine whether or not the disease that is diagnosed in the individual may worsen in the future and thus evaluate the treatment conditions for said individual.
  • Forecast when referring to the term “forecast” it refers to the estimation of processes or situations where uncertainty is generated.
  • prognosis refers to the ability to report the progress of a disease in the near future, anticipating its possible evolution, recovery and effectiveness of the treatments applied in required cases.
  • Wild type refers to a microorganism, gene, or gene product that has the characteristics of that microorganism, gene, or gene product that is isolated from a natural source.
  • Differential expression is understood in the present invention by "differential expression", when a biological sample is indicative of cancer by presenting differences in the expression of one or more, two or more, or three or more of the gene products or in combination of these, in said biological sample compared to the expression in a normal (non-cancerous) control sample.
  • Differential expression includes a statistically significant difference in one or more expression levels of a gene product compared to expression levels of the same gene product that has been determined as a control.
  • the statistically significant difference may be an increase or decrease in expression levels, as measured by RNA levels, protein levels, protein function, or any other relevant measure of gene expression noted herein.
  • the term “statistically significant” is used when the result obtained is unlikely to occur by chance.
  • the "statistical significance” can be defined as the probability of making a favorable or unfavorable decision according to the hypothesis that is had, this decision is determined using the value of "p", if "p" is less than the level of significance, the hypothesis is rejected. The smaller the p-value, the more significant the results will be.
  • the Bayes factors are also presented, which are used for the determination of statistical significance, thus, an analysis can be reflected in which the probability of making the decision to reject the null hypothesis when the null hypothesis is really true is not greater than the stated probability. With this type of analysis, decisions can be made for sets of probabilities with greater accuracy.
  • the present invention is based on the initial identification of new molecular markers of papillary thyroid cancer, thereby allowing the classification of the degree of aggressiveness of the tumor. For this reason, the present invention presents diagnostic assays with which biological samples obtained from a subject with papillary thyroid cancer can be analyzed and the degree of aggressiveness of the tumor determined. In addition, the present invention makes it possible to determine the type of surgery to which the subject may be subjected in the event of suffering from more aggressive papillary thyroid cancer, increasing the chances of its success.
  • the methods of the present invention also include the step of performing orthological or histological analysis on a biological sample, eg, a thyroid tissue sample obtained from the subject, eg, for the purpose of defining a preliminary diagnosis.
  • Orthological or histological analysis can be performed prior to, concurrent with, or subsequent to performing gene product expression-based analysis, as described herein.
  • samples with a preliminary diagnosis of papillary thyroid cancer are analyzed by the methods of the present invention.
  • the method further comprises identifying the subject at risk for aggressive thyroid cancer by orthological or histochemical analysis of biological samples obtained from the subject, for example, by needle biopsy or fine needle aspiration techniques.
  • the abnormal and uncontrolled growth of cells in the thyroid can form nodules that can be benign or malignant.
  • Benign or noncancerous tumors include nodular hyperplasia (NHP), lymphocytic thyroiditis (LCT), and Hürthle cell adenoma (HA), follicular adenoma (FA).
  • malignant tumors include papillary, follicular, medullary and anaplastic tumors, which in turn present subtypes of tumors such as follicular variant of papillary carcinoma (FVPTC), medullary thyroid carcinoma (MTC), papillary thyroid carcinoma (PTC) , Hürthle cell carcinoma (HC), anaplastic thyroid carcinoma (ATC) and follicular carcinoma (FC).
  • FVPTC papillary carcinoma
  • MTC medullary thyroid carcinoma
  • PTC papillary thyroid carcinoma
  • HC Hürthle cell carcinoma
  • ATC anaplastic thyroid carcinoma
  • FC follicular carcinoma
  • metastatic potential refers to the ability or possibility that a cancer cell moves from an initial site (in this case the thyroid gland) to other sites in the body, being able to develop in other organs.
  • a method for diagnosing, identifying, or classifying a cancer, particularly thyroid cancer, in a subject comprises the steps of analyzing tissue samples to determine the expression levels of one or more gene products and from that sample to identify if it corresponds to a cancerous sample with lymph node metastasis.
  • the present invention provides a method that comprises determining the expression of one, two or more, three or more gene products obtained from the biological sample of thyroid tissue.
  • the method comprises performing a total or partial removal surgery of the thyroid on the subject, depending on the degree of aggressiveness of the tumor that is determined in the biological sample with papillary thyroid cancer.
  • the gene product to be analyzed corresponds to RNA and the assay for its analysis comprises PCR, RT-PCR or qPCR, or any other assay that allows determining the amount of RNA or the levels of expression, including the assays described herein.
  • the gene product to be analyzed is a polypeptide, and the analysis assay corresponds to immunohistochemistry or any other assay that allows the determination of the quantities of polypeptides or the levels of expression, where those presented in this document are included.
  • the biological sample was obtained from a subject suffering from papillary thyroid cancer.
  • Gene products for which gene expression is determined include those described herein and may comprise one or more of these gene products, which may also be referred to as "set gene products.” This set of gene products can be used to determine the presence or absence of lymph node metastasis in papillary thyroid cancer.
  • the set of gene products can be referred to as "biomarkers”.
  • the present invention provides a method for detecting or diagnosing the presence or absence of lymph node metastases in papillary thyroid cancer. in a subject comprising determining the expression levels of two or more, or three or more gene products that are expressed by the genes listed in Table 2, and identifying the thyroid tissue sample as cancerous with metastases or cancerous without metastases by correlating the expression levels determined by the biological sample of the subject with the presence or absence of lymph node metastases.
  • the present invention includes a method for treating a subject in need thereof, comprising: determining whether the subject has a cancer, particularly papillary thyroid cancer, by any of the diagnostic methods of the present invention; and performing a surgery that contemplates the complete surgical removal of the subject's tumor with cervical lymph node dissection or only a complete removal of the tumor or a portion thereof, in the event that the subject is determined to have a cancer, particularly papillary cancer of thyroid.
  • the method for treating a subject in need thereof comprises: (i) determining whether the subject suffering from papillary thyroid cancer has lymph node metastasis by means of a method comprising performing an assay to determine an expression level for one or more gene products of a biological sample of thyroid tissue and identify whether or not this thyroid tissue sample has lymph node metastases or if it is suspected that gene expression levels in these tissues are indicative of tumor aggressiveness, (ii) perform partial or total removal surgery of cancerous tissue in the subject's thyroid and/or removal of cervical lymph nodes, if tests of the subject (i) indicate that the subject probably has papillary thyroid cancer with lymph node metastases.
  • the present invention includes a method for determining whether a subject has cancer with any degree of tumor aggressiveness, for example, a papillary thyroid cancer with lymph node metastasis, where an initial test performed on a biological sample obtained from the subject, by example, by FNA of thyroid tissue, showed a cancerous result, the method comprises performing, requesting, or obtaining the results of a diagnostic test described herein performed on a biological sample, e.g., a thyroid sample, obtained from the subject .
  • a biological sample e.g., a thyroid sample
  • the diagnostic assay includes performing an assay to determine an expression level for one or more gene products from a biological sample, eg, a thyroid tissue sample; and identifying the biological sample as cancerous without lymph node metastases in which the expression level(s) of the gene product indicates a lack of lymph node metastases in the biological sample or identifying the biological sample as malignant or aggressive cancer in which the level(s) of Expression of the gene product is indicative of lymph node metastasis in the biological sample.
  • a biological sample eg, a thyroid tissue sample
  • the method comprises determining a level of expression of two or more, or three or more, gene products in the thyroid tissue sample, where the two or more, or three or more, gene products are expressed by one or more genes listed in Table 1 and where at least one of the gene products is expressed by the BRAF gene, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, mR-16, mR-146b, miR-155, mR-181d, RNU6B, RET.
  • the correlation is carried out by comparing the expression levels of the gene products of the thyroid tissue sample and the reference expression levels for each gene product in question.
  • Biological samples of thyroid tissue are identified as cancerous with lymph node metastases if there is a significant difference in the expression level of gene products between the thyroid tissue sample and normal control or reference expression levels.
  • the thyroid tissue sample is identified as cancerous with lymph node metastases, if there is a significant difference in the expression level of two or more, three or more, or four or more gene products between the thyroid tissue sample and a thyroid tissue sample. normal control or reference expression levels.
  • the thyroid tissue sample is identified as cancerous without lymph node metastases, if there is no significant difference (i.e., there is substantial similarity) in the level of gene product expression between the thyroid tissue sample and normal levels of thyroid cancer. control or reference expression.
  • the thyroid tissue sample is identified as cancerous without lymph node metastases, if there is no significant difference in the expression level of two or more, three or more, or four or more gene products between the thyroid tissue sample and the thyroid tissue sample. a normal control or expression of reference levels.
  • the tissue sample is identified as cancerous with lymph node metastasis, if the expression level of one or more of the genes (NM_005429.5, MIMAT0000069, MIMAT0002809, MIMAT0000646 , MIMAT0002821 and NR_002752.2) is decreased, or if the expression level of one or more of the genes (NM_005214.5) is increased in the thyroid tissue sample, compared to normal expression levels (expression levels used as reference), the decrease or increase in gene expression levels is seen by the increase or decrease in the expression of at least 3 genes.
  • the genes NM_005429.5, MIMAT0000069, MIMAT0002809, MIMAT0000646 , MIMAT0002821 and NR_002752.2
  • each gene corresponds to: BRAF (Gen 1), CD80 (Gen 2), CTLA4 (Gen 3), PTEN (Gen 4), VEGFC (Gen 5), m ⁇ R-16 (Gen 6), m ⁇ R-146b (Gen 7), miR-155 (Gen 8), m ⁇ R-181d (Gen 9), RNU6B (Gen 10), RET (Gen 11).
  • a thyroid tissue sample is identified as cancerous with lymph node metastases, if the expression level of one or more, two or more, three or more, or four or more Gene products of any of the gene subsets described herein are altered as described above.
  • the set of genes includes one or more genes corresponding to BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m ⁇ R-16, m ⁇ R-146b, miR-155, m ⁇ R-181d, RNU6B, RET .
  • the correlation is performed by comparing the gene expression levels of the gene products of the biological sample obtained from the subject with the reference levels using an algorithm.
  • These reference levels may include expression levels of each individual gene product from a variety of biological samples cancerous with lymph node metastases and cancers without lymph node metastases.
  • the comparison of expression levels allows a correlation between the gene expression levels of different samples to be determined.
  • the biological samples used to generate this correlation include a variety of thyroid tissue samples, including cancerous tissue samples without indicators of tumor aggressiveness and cancerous tissue samples with indicators of tumor aggressiveness, the latter being considered cancer with lymph node metastasis where the expression levels of the genes mentioned above present a significant difference in the expression levels of the gene product with respect to the expression levels of normal cancer tissue, if this difference does not exist or is not a substantial difference, consider the sample to be normal.
  • the method enables the cancerous thyroid tissue sample to be identified as metastatic or non-metastatic with a sensitivity greater than or equal to 69% or greater than or equal to 90%; a specificity greater than or equal to 78% or greater than or equal to 93%; a positive predictive value greater than or equal to 52% or greater than or equal to 76%; a negative predictive value greater than or equal to 55% or greater than or equal to 93%; a positive odds ratio greater than or equal to 2 or greater than or equal to 12; a positive post-test probability greater than or equal to 58% or greater than or equal to 90%, a negative likelihood ratio greater than or equal to 0.19 or greater than or equal to 0.58; and a negative post-test probability greater than or equal to 9% or greater than or equal to 32%.
  • any of the methods or kits presented in this invention the expression levels of two or more gene products, one or more, two more, or three or more gene products are determined, where the genes are BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m ⁇ R-16, m ⁇ R-146b, miR-155, m ⁇ R-181d, RNU6B, RET.
  • any of the above gene products, two or more, three or more gene products include one or more gene products from BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, miR-16, m ⁇ R-146b, miR-155, m ⁇ R-181d, RNU6B.
  • the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products corresponds to BRAF.
  • the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products is CD80.
  • the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products is CTLA4.
  • the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products corresponds to PTEN. In particular embodiments, the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products includes the VEGFC gene assay. In particular embodiments, the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products corresponds to mIR-16.
  • the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products corresponds to miR-155. In particular embodiments, the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products is m ⁇ R-181 d. In particular embodiments, the gene products include one or more, or three or more of the genes mentioned in Table 2, where at least one of the gene products is RNU6B.
  • kits for the characterization of thyroid cancer.
  • characterization of thyroid cancer in a subject refers to the identification of one or more properties that may be found in a cancer sample obtained from a subject suspected of having this disease.
  • a type of thyroid cancer may contain specific characteristics and include determining the subject's prognosis and survival.
  • Types of thyroid cancer can be identified by molecular markers, which include the gene products indicated in this invention.
  • biology methods, software and systems can be used for the diagnosis of cancer, particularly thyroid cancer.
  • various computer program and software products may be used for various purposes such as data management, primer design, probe design, among others.
  • One of skill in the art will appreciate that the general methods described herein can be readily adapted to determine the type of thyroid cancer, for example, by comparing expression levels of gene products with those determined for various types of thyroid cancer. Based on the determination of the type of thyroid cancer, prognosis, survival and/or the probability of metastasis can be determined and estimated, for example, based on historical data or results.
  • the methods indicated in the present invention include analyzes to determine the molecular profiles of the biological samples by means of techniques that allow the determination of the expression levels of the gene products of the genes or sets of genes identified to carry out the present invention.
  • Gene products include, but are not limited to mRNAs and proteins expressed by said genes.
  • Gene products (also known as “gene expression products") are analyzed by determining or measuring the expression levels of these (genes presented in Table 2, their variants or homologues in other species, or additional gene products), according to with the methods presented in this invention.
  • the methods used in the present invention are presented for determining the expression levels of one, two, three, four, five or more genes corresponding to those presented in Table 2 of a tissue sample, particularly of thyroid tissue.
  • the levels of gene expression determined in the analysis of one or more genes or in combination of these are determined by analyzing the expression of genes BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m ⁇ R-16, m ⁇ R-146b, miR-155, m ⁇ R-181d, RNU6B, RET.
  • the level of expression of the gene products can be determined by any of the available techniques depending on the gene product to be evaluated.
  • the gene products can be evaluated by means of reagents that allow determining the expression of mRNA, the expression or activation of proteins, or the subsequent biological functions of the proteins that are encoded by the genes described in Table 2. Considering the aforementioned, this document includes reagents for the detection of said genes or gene products thereof.
  • gene products can be determined using antibodies such as, immunohistochemistry using specific antibodies, a polypeptide array or an antibody array, immunoblotting, Western Blot, ELISA assay, flow cytometry, immunofluorescence.
  • MS mass spectrometry
  • techniques can be used to quantify the presence or levels of gene products, these techniques correspond to flow cytometry, immunofluorescence, in situ hybridization, fluorescent in situ hybridization (FISH).
  • the methods of the invention may include the isolation of one or more gene products from the biological sample, these gene products may comprise polypeptides, peptides, DNA, RNA.
  • these gene products may comprise polypeptides, peptides, DNA, RNA.
  • the isolation of gene products such as RNA can be isolated by known nucleic acid extraction techniques. RNA expression levels are determined by known techniques, which include PCR, RT-PCR and qPCR.
  • amplification techniques may be employed for the gene products.
  • the term “amplification” or “nucleic acid amplification” is defined as the production of multiple copies of at least a portion of a target nucleotide sequence, under “amplification conditions” that allow amplification of the target nucleotide sequence, the result of this amplification of nucleotide sequence is called an "amplicon” and each amplicon serves for the detection of that sequence and the determination of its expression level.
  • amplicon each amplicon serves for the detection of that sequence and the determination of its expression level.
  • the described method comprises obtaining a biological sample from a subject, where said biological sample can be any material containing tissues, cells, nucleic acids, genes, gene fragments, expression products, gene products (for example , mRNA or proteins) or fragments of gene products from a subject to be analyzed.
  • a sample may include, but is not limited to, tissue, cells, or cell-derived biological material from an individual.
  • the sample can be a heterogeneous or homogeneous population of cells or tissues.
  • the biological sample is a tissue sample, eg, a sample obtained from the thyroid or a thyroid nodule of a subject.
  • a biological sample comprises gene products such as nucleic acids, including mRNA and/or protein.
  • the subject is an animal (eg, a mammal), including, but not limited to humans, non-human primates, rodents, dogs, cats, pigs, fish, and the like.
  • the method is used in biological samples from humans.
  • the subject is at risk of having or is suspected of having having a thyroid tumor, where being at risk or suspected of is related to the subject having one or more symptoms suggestive of thyroid cancer (eg, a noticeable lump or mass) or being screened for cancer ( eg, during a routine physical exam).
  • the subject may also be a subject suspected of having thyroid carcinoma who may have one or more risk factors.
  • a subject suspected of having thyroid cancer encompasses subjects who have received an initial diagnosis but the stage of cancer of said subject's tumor has not been determined or is not known.
  • the term also includes people who have ever had cancer (for example, an individual in remission). Also included are subjects whose biological samples may have been previously analyzed, but the results were inconclusive or indeterminate.
  • the term "subject at risk for thyroid cancer” refers to a subject with one or more risk factors for developing thyroid cancer, in particular aggressive or metastatic thyroid cancer.
  • Risk factors include, but are not limited to, gender, age, genetic predisposition, environmental exposure, previous incidents of cancer, pre-existing non-cancerous conditions, and lifestyle.
  • a biological sample may be obtained using any method known in the art that can provide a suitable sample for the analytical methods described herein.
  • Methods of obtaining a biological sample from a subject include, but are not limited to, biopsy methods including fine needle aspiration (FNA), needle aspiration, core needle biopsy, vacuum assisted biopsy, incisional biopsy, excisional biopsy, or needle biopsy.
  • the methods and kits of the present invention use biological samples obtained by PAAF.
  • Methods for obtaining adequate thyroid samples are known in the art and are described in more detail in the ATA International Clinical Guidelines for the Management of Thyroid Nodules (Haugen et al, 2016). Generic methods for obtaining biological samples are also known in the art.
  • the sample is a fine needle aspirate of a suspected thyroid gland, thyroid nodule, or thyroid tumor.
  • the fine-needle aspiration sampling procedure may be guided by the use of an ultrasound, x-ray, or other imaging device.
  • multiple biological samples such as multiple thyroid samples, may be obtained for diagnosis by the methods of the present invention, eg, at the same time or at different times.
  • a sample, or samples obtained at the same or different times are stored and/or analyzed by different methods.
  • a sample can be obtained and analyzed by orthological analysis.
  • an additional sample may be obtained from a subject at the same time or later, for example, based on the results of an orthological analysis.
  • the additional sample can be used in a method of the present invention, for example, when orthological analysis was indeterminate with respect to the presence or absence of cancer.
  • a single sample may be obtained and a portion of the sample analyzed by orthological analysis, while another portion of the sample is analyzed by the methods of the present invention.
  • a physician may obtain a biological sample from a subject, at locations such as a hospital, physician's office, testing facility, or laboratory.
  • a biological sample may be obtained using a kit, which may contain means for obtaining a sample as described herein, means for storing the sample, and instructions for use of the kit.
  • the kit is provided by a molecular profiling service, which may also perform a diagnostic assay on the biological sample.
  • a biological sample is stored for a time such as seconds, minutes, hours, days, weeks, months, years, or more after the sample is obtained and before the sample is analyzed by one or more methods of analysis. the invention.
  • the sample obtained from a subject is subdivided before the subsequent storage or analysis step, so that different portions of the sample are subjected to different subsequent methods or processes, including storage, cytological analysis, suitability testing, nucleic acid extraction, protein extraction, molecular profiling, or combinations thereof.
  • a portion of the sample is stored while another portion of the sample is further handled.
  • Such manipulations may include, but are not limited to: molecular profiling; orthological staining; nucleic acid (eg mRNA) extraction, detection or quantification; extraction detection, protein quantification; fixation (eg, formalin-fixed paraffin-embedded samples); and/or exams.
  • the sample can be fixed before or during storage by any method known in the art, such as the use of glutaraldehyde, formaldehyde, or methanol.
  • the sample is collected, stored, and subdivided after the storage step for further analysis, so that different parts of the sample are subjected to different subsequent methods or processes, including storage, cytological analysis, fitness, nucleic acid extraction, polypeptide extraction, molecular profiling, determination of expression of one or more gene products, or a combination thereof.
  • samples are obtained and analyzed by, for example, cytological analysis, and the resulting sample material is further analyzed by one or more methods. of the present invention comprising determining the expression levels of gene products described herein, for example, by molecular profiling.
  • the samples may be stored between the orthological analysis steps and the steps to determine gene product expression levels, for example, by molecular profiling.
  • samples may be stored frozen, eg, at about any of the following temperatures between about 8°C and about 0°C in a suitable preservation medium during and after sample collection.
  • the evaluation of the biological sample can be carried out during or after obtaining it, including after the storage process.
  • the evaluation of the sample will include the determination of its suitability for use in the methods and compositions described in this invention, thereby indicating whether or not the sample is suitable for subsequent analysis.
  • An inadequate sample will be considered if the characteristics of this sample include insufficient cells, insufficient genetic material, insufficient proteins, DNA or RNA, cells inappropriate for the indicated test or material inappropriate for the indicated test, age of the sample, way in which it was obtained the sample or how the sample was stored or transported.
  • Sample suitability can be determined using known methods such as cell staining, measurement of cell number or tissue amount, determination of total proteins and/or nucleic acids, microscopic examinations, temperature and pH evaluations.
  • sample adequacy is determined from the results of performing a gene product level assay experiment.
  • methods for determining that adequate numbers of a specific cell type are present include PCR, quantitative PCR, RT-PCR, immunohistochemistry, cytological, microscopy, and visual analysis.
  • Samples can be analyzed for nucleic acid content after extraction from the biological sample using a variety of methods known in the art, such as, for example, ultraviolet absorbance, including but not limited to absorbance at 260 nanometers ( nm) using a spectrophotometer, among others.
  • the protein content of the biological sample is determined using a variety of methods known in the art, including but not limited to ultraviolet absorbance at 280 nm, cell or protein staining, in some cases the protein is extracted of the biological sample before its measurement.
  • the samples can be analyzed by protein techniques.
  • the samples are processed by any known method.
  • the products Gene genes are selected from nucleic acids, such as DNA and RNA, including mRNA and proteins.
  • Biological samples can be analyzed using cell staining techniques and microscopic observation.
  • Cell staining may include EA stains, hematoxylin stain, cytostain, Papanicolaou stain, eosin stain, Nissl stain, toluidine blue, silver stain, azocarmic stain, neutral red, or Janus green staining techniques.
  • Nucleic acid content can be determined by staining using ethidium bromide, hematoxylin, Nissl stain, or other stains known in the art.
  • the cells can be placed on a slide using standard methods known in cytological examinations, in addition, liquid cytology (LBC) methods can be used, where the biological samples of the subject are transferred to a container or vial that contains the liquid ortho solution, which can be any of those known in the art.
  • LBC liquid cytology
  • the sample with the orthological solution can be stored and/or processed for the production of a layer of cells on a glass slide, which in turn can be stained and subsequently observed under a microscope.
  • the samples can be analyzed by immunohistochemical assays and thereby observe the presence, location and distribution of molecules such as proteins, peptides, nucleic acids or other molecules that can be recognized by specific antibodies, where depending on the antigen to be identified they may or may not use secondary antibodies for identification.
  • cytological examination it is possible to determine if a biological sample is negative or free of cancer; suspicious, ambiguous or suggestive for the presence of cancer; diagnostic (showing the presence of cancer); nondiagnostic or indeterminate (which provides inadequate information about the presence or absence of cancer).
  • diagnostic shows the presence of cancer
  • nondiagnostic or indeterminate which provides inadequate information about the presence or absence of cancer.
  • the results of these diagnoses will determine whether they will be benign or malignant, being in some cases diagnoses indicative of the presence of a type of cancer, particularly a type of thyroid cancer.
  • the present invention provides diagnostic kits or tests for diagnosing or predicting cancer, such as thyroid cancer, in subjects.
  • the diagnostic tests described in this document may be in vitro diagnostic tests. Diagnostic tests include but are not limited to in vitro diagnostic tests FDA-approved or authorized, tests developed in a centralized laboratory, direct-to-consumer tests, which can be used to analyze a biological sample and detect or indicate the presence or absence of metastatic cancer, such as thyroid cancer with lymph node metastasis.
  • a diagnostic test or kit may be used in a laboratory or other healthcare professional setting.
  • a consumer may use an at-home diagnostic test or kit.
  • Diagnostic tests or kits comprise one or more reagents for the detection of gene products described herein and may comprise other reagents, instruments and systems intended for in vitro diagnostic use for the diagnosis of thyroid cancer, for the purpose of cure, mitigate, treat or prevent the disease or its sequelae.
  • the diagnostic kits or tests described herein may be intended for use in the collection, preparation, and examination of specimens taken from the human body.
  • the term "laboratory test” refers to one or more medical or laboratory procedures that involve testing a biological sample obtained from a subject.
  • the diagnostic kits and tests of the present invention comprise one or more of the reagents for the detection of one or more gene products described herein, such as those expressed by the genes listed in Table 2.
  • reagents for detection may comprise any reagent known to the skilled person for detecting gene products, including but not limited to antibodies and oligonucleotides.
  • the diagnostic kit or assay may further comprise written instructions on how to perform the assay described herein to determine gene product expression levels using the kit.
  • a diagnostic kit or assay of the present invention comprises two or more, three or more, or four or more reagents, eg, probes for the detection of a gene product described herein.
  • the gene products are proteins or nucleic acids, eg, mRNA.
  • the reagents are antibodies or oligonucleotides, including any of those described herein.
  • each reagent is a set of oligonucleotides, eg, where each set consists of two nucleotides that together are capable of amplifying a target polynucleotide gene product by PCR.
  • a diagnostic kit or assay comprises two or more, three or more, or four or more reagents for detecting a gene product, wherein the diagnostic kit or assay comprises two or more, three or more, or four or more sets. of primers, each set with the ability to amplify at least a portion of a target gene product.
  • said diagnostic kit or assay further comprises two or more, three or more, or four or more more separately labeled probes, each probe specifically binds to one of the target gene products or a complement thereof. Accordingly, in certain embodiments, each set of primers is used to amplify a target gene product and then each probe is used to detect amplification products and measure the expression levels of each gene product.
  • each reagent detects a different gene product.
  • certain embodiments may include two or more reagents that amplify the same gene product.
  • a diagnostic kit or assay may comprise two reagents, one a set of amplification primers and the other a probe, that each specifically bind to and/or detect the same gene product.
  • a diagnostic kit or assay may comprise multiple combinations of two or more reagents that each specifically bind to or detect the same gene product, for example, where each combination specifically binds to or detects a different gene product, thereby allowing amplification and detection of multiple gene products, eg, at the same time.
  • the gene products detected by the diagnostic kit or assay reagents are expressed by one or more genes listed in Table 2, where at least one of the gene products is expressed by the PTEN, BRAF, CD80, CTLA4 genes , VEGFC, m ⁇ R-16, m ⁇ R-146b, miR-155, m ⁇ R-181d, RNU6B and RET.
  • the diagnostic kit or assay comprises each reagent in a separate container.
  • each reagent is provided in the same container.
  • the reagents are each bound to discrete regions of a solid substrate.
  • the reagents are oligonucleotides covalently attached to a solid substrate, wherein the array is optionally a microarray.
  • the reagents are sets of oligonucleotides, eg, primers, and the sets of oligonucleotides comprise DNA.
  • the diagnostic kits or assays of the present invention may further comprise one or more solutions suitable for binding said reagents to said gene products, and/or one or more solutions or reagents used in performing a method of the present invention to determine a level expression of gene products.
  • a diagnostic kit or assay comprises a set of PCR primers, it may also comprise one or more additional reagents to perform a PCR assay, such as, for example, a thermostable polymerase, a mixture of deoxynucleotides and /or a detectably labeled probe.
  • the detectably labeled probe comprises a fluorophore and a quenching moiety, and the probe can emit a detectable signal when the probe is cleaved, but not when the probe is intact.
  • the diagnostic kits or assays of the present invention may further comprise one or more reagents for processing and/or storing a biological sample, for example, wherein processing the thyroid tissue sample comprises extracting gene products from the biological sample.
  • the diagnostic kits or assays of the present invention may further comprise one or more control gene products, such as, for example, positive controls containing a sample of the gene product and/or a negative control not containing it, to confirm that the methods performed were successful in specifically identifying and/or measuring the expression and/or presence of gene products.
  • control gene products such as, for example, positive controls containing a sample of the gene product and/or a negative control not containing it, to confirm that the methods performed were successful in specifically identifying and/or measuring the expression and/or presence of gene products.
  • a diagnostic kit or assay comprises data or information, for example, corresponding to gene expression levels of gene products in positive and/or negative control samples or predetermined gene expression cut-off values indicative of the presence or absence of lymph node metastasis in cases of thyroid cancer.
  • one or more gene product detection reagents, solution, additional reagents, and control gene products are in separate containers.
  • FIG. 1 Flowchart of the study cohort. The figure shows the scheme designed for the analysis of the cohort of tissue biopsy samples and FNA of thyroid nodules. Samples of each subtype were randomly assigned to either the training or validation cohort.
  • FIG. 1 Differential expression between FNA samples with metastatic and non-metastatic papillary thyroid cancer. Gene expression was determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) on 62 metastatic and 97 non-metastatic FNAs. To calculate gene expression for each sample, the informative gene was normalized by 2 reference genes. The bars represent the gene expression of the metastatic samples compared to the average of the gene expression of those without metastases (*p ⁇ 0.05).
  • FIG. 1 Thyroid Metastatic Classifier Model.
  • the diagram of the gene prediction model is presented in the figure. Gene analysis was performed in three consecutive steps. The analysis steps are presented as a) raw data processing using the Principal Component Analysis (PCA) method that simplifies the complexity of the data while maintaining trends and patterns, b) data processing using the Multilayer Perceptron Neural Network (MLP) as a strategy for building the classification model, and c) the classification of the data according to the scores obtained by MLP were integrated for the evaluation of the performance of the predictive model.
  • PCA principal component analysis.
  • Figure 4 Principal component analysis of the independent variables included in the Thyroid Metastatic Classifier model, (a) Proportion of variance explained (PVE) and (b) Cumulative proportion of variance explained for each of the principal components.
  • the first 11 principal components obtained are capable of explaining more than 90% of the total variance of the analyzed data.
  • FIG. 5 ROC curve and area under the curve (AUC) for classification of lymph node metastasis in FNA by the 5 genes with the highest individual AUC values (AUC>0.60) evaluated by linear discriminant analysis.
  • the gene expression of the markers was determined with the qPCR-SYBRGreen technique.
  • the classifier reached an AUC of 0.69 in the training stage and 0.62 in the validation stage.
  • Figure 6 Representation of the association between the expression of the 5 genes with the highest individual AUC values (AUC >0.60). Dispersion graphs showing the correlation between the expression values of the genes that independently presented higher AUC. Data analyzed using Spearman's correlation coefficient test.
  • FIG. 7 ROC curve and area under the curve (AUC) for the Thyroid Metastatic Classifier by qPCR-SYBRGreen technique in FNA.
  • the figure shows a graph showing the area under the curve of the 11 genes used in the predictive model of thyroid classification using MLP.
  • the classifier reached an AUC of 0.82 in the training stage and 0.84 in the validation stage.
  • the Thyroid Metastatic Classifier effectively identifies metastases by qPCR-SYBRGreen technique in FNA. Scatter plot showing the classification score obtained by the algorithm for each PAAF in the training and validation set, respectively. The classification cut-off point between metastasis and non-metastasis was 0.20. The dots show the classification of the cases that do not present metastasis (NM-PTC) and the squares, those that are metastatic (M-PTC).
  • the classifier is expected to reach a PPV of 64-79% and a NPV of 94-82% with a prevalence of lymph node metastases between 25-40%.
  • FIG. 10 ROC curve and area under the curve (AUC) for the Thyroid Metastatic Classifier (11 genes) by qPCR-TaqMan technique in PAAF.
  • the figure shows a graph showing the area under the curve of the 11 genes used in the predictive model of thyroid classification using MLP.
  • the classifier reached an AUC of 0.92 in the training stage and 0.87 in the validation stage.
  • the Thyroid Metastatic Classifier effectively identifies metastases by qPCR-TaqMan technique in FNA.
  • a scatter plot is presented showing the classification score obtained by the algorithm for each FNA.
  • the classification cut-off point for the data obtained using the qPCR-TaqMan method between metastasis and non-metastasis was 0.47.
  • the dots show the classification of cases that do not present metastasis (NM-PTC) and in squares, those that are metastatic (M-PTC).
  • Bayes Theorem analysis shows adequate theoretical performance for the Thyroid Metastatic Classifier in the validation stage.
  • the classifier is expected to reach a PPV of 60-79% and a NPV of 90-79% with a prevalence of lymph node metastases between 25-40%.
  • Example 1 Definition of biomarkers for genetic classifier of samples of thyroid nodules in tissue biopsies.
  • tissue biopsies fresh tissue thyroid biopsies
  • tissue biopsies were prospectively collected between the years 2014 and 2017 at the Hospital Cl ⁇ nic de la Pontificia Catholic University of Chile, Santiago, Chile. Tissue biopsies were collected in the operating room from patients undergoing lobectomy or total thyroidectomy and immediately placed in RNALater (Ambion).
  • Fine-needle aspiration (FNAB) samples were prospectively collected under ultrasound guidance between 2016 and 2018 at six academic centers, stabilized using RNAprotect Cell Reagent (Qiagen), and stored at -80°C until extraction. of RNA.
  • the patients signed an informed consent previously approved by the Ethics Committee of each institution.
  • Surgical histopathology report was used as the gold standard to compare cytology for both tissue biopsies and FNA in Bethesda categories V and VI.
  • a flow chart of the study design is presented in Figure 1, where samples of each subtype were randomly assigned to either the training cohort or the validation cohort. The minimum sample size for each set was calculated based on the World Health Organization recommendations for clinical studies with a power of 80% and a precision of 95% for the test.
  • an operator blinded to molecular diagnosis compared the classifier score with the respective surgical pathology report for each patient.
  • FNA fine needle aspiration puncture.
  • PTC papillary thyroid carcinoma
  • vile usual variant
  • vF follicular variant
  • RNA from tissue biopsies and FNA was extracted with the RNeasy Plus-Mini kit (Qiagen). Total RNA concentration was determined using the Qubit® RNA HS assay kit and the Qubit® 2.0 fluorometer (Invitrogen). Reverse transcription (RT) reactions to assess mRNA expression were performed in a final volume of 20 pL using 150 ng total RNA from tissue biopsies or 50 ng PAAF with the Improm IITM Reverse Transcription System (Promega). , following the manufacturer's instructions.
  • RT reactions to evaluate miRNA were performed according to the miQPCR method published in Benes et al., 2015. Briefly, a denaturation mixture was prepared containing 10 ng total RNA, 0.4 pM miLINKER adapter, and 30% of PEG 8000 (New England Biolabs), and incubated for 3 minutes at 75°C. Next, the miLINKER adapter was ligated to the template miRNAs for 30 minutes at 25°C in the presence of 1X T4 buffer (New England Biolabs), 5 pM MgCl2, 0.1 pL 40 U/pL RNase inhibitor (Promega) and 200 units of T4 RNA Ligase 2, K227Q truncated (New England Biolabs).
  • the cDNA synthesis was performed in three steps: first, the mixture was incubated with 0.25 mM dNTPs and 0.125 pM mQ-RT universal primer for 2 min at 85°C; then 1X RT buffer (Invitrogen), 5 mM DTT (Invitrogen) and water were added to make up to 19.7 pL volume to the mixture and incubated for 3 minutes at 45°C. Finally, 0.3 pL of Superscript II (200 U/pL; Invitrogen) was added to the mixture, incubated for 30 minutes at 45°C, 3 minutes at 85°C and kept at 10°C.
  • Genes include BRAF (gene 1), CD80 (gene 2), CTLA4 (gene 3), PTEN (gene 4), VEGFC (gene 5), m ⁇ R-16 (gene 6), m ⁇ R-146b ( gene 7), miR-155 (gene 8), m ⁇ R-181d (gene 9), RNU6B (gene 10), RET (gene 11). These genes are described in table 2, where the sequence identifier for the present invention is also indicated.
  • qPCR reactions were performed in a final volume of 20 pL of reaction mix containing 2 pL of cDNA, 10 pL of 2X Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (Agilent Technologies), 250 nM of each primer, and nuclease-free water.
  • the conditions for the amplification reaction were: 10 min at 95°C, followed by 40 cycles of 20s at 95°C, 20s at 60°C and 20s at 72°C. Melting curve analysis was performed by increasing the temperature 1°C/s in the range from 72°C to 95°C.
  • qPCR reactions were performed in 20 pL volumes with 0.1 ng of synthesized cDNA (100 pg/reaction) in the presence of a 0.25 pM miQPCR-specific universal reverse primer, 1X Brilliant. II SYBR Green Mastermix (Agilent Technologies) and nuclease-free water until completing 20 pL of reaction.
  • the qPCR reaction was performed in the Rotor-Gene thermocycler (Qiagen) with the following reaction conditions: 95°C for 10 minutes, 50 cycles of 95°C for 10s, 60°C for 35s, and a final step for the melting curve from 60°C to 95°C, increasing one degree per second (table 3).
  • Table 2 Description of the 11 Thyroid Metastatic Classifier genes selected by qPCR-SYBRGreen technique.
  • the primers used for the analysis of tissue biopsies and FNA were designed in different exons using the P ⁇ mer-BLAST software (www. neb ⁇ . ni m. ni h. gov/too Is/pr i mer-blast /) .
  • biomarker gene expression was assessed by qPCR in a multiplex configuration using TaqMan probe assays, including one target gene and two reference genes. Reactions were standardized following the manufacturer's recommendations.
  • qPCR reactions to assess mRNA were performed by adding 5 pl of dilution of 1:12.5 RT reaction in a final volume of 20 pl containing 10 pl of TaqManTM 2X multiplex master mix with Mustang Purple (Applied Biosystems), TaqManTM sequence-specific assays (Applied Biosystems), and nuclease-free water.
  • RT reactions to assess miRNA were performed using the Advanced TaqManTM miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) and miRNA expression was quantified by adding 5 pL of 1:20 RT reaction dilution in a final volume of 20 pL containing contained 10 pL TaqManTM Multiplex 2X Master Mix with Mustang Purple (Applied Biosystems), Advanced TaqManTM sequence-specific miRNA assays (Applied Biosystems), and nuclease-free water.
  • the conditions for amplification were: 20 seconds at 95°C, followed by 40 cycles of 3 seconds at 95°C and 30 seconds at 60°C.
  • a graph ( Figure 2) is provided showing the differential expression between metastatic (62) and non-metastatic (97) fine-needle aspiration biopsy (FNAB) samples of 10 genes as determined by quantitative real-time PCR and analyzed by Pfaffl's relative quantization model. To calculate gene expression for each sample, the target was normalized to 2 reference genes. Zero value corresponds to gene expression from non-metastatic thyroid tumors and bars correspond to gene expression variation in metastatic cancer samples (relative fold change).
  • the gene expression results of the 11 genes analyzed by Pfaffl's indicate that 6 genes (VEGFC, m ⁇ R-16, miR-146, miR-155, m ⁇ R-181d, RNLI6B) were significantly overexpressed (p ⁇ 0. 05), while 1 gene (CTLA4) significantly decreased its expression compared to non-metastatic PTC (p ⁇ 0.05) (figure 2).
  • Example 2 Design and development of a thyroid metastasis classifier model for diagnostic/prognostic assay
  • MLP Multilayer Perceptron Neural Network
  • FIG. 3 The construction of the final prediction model was carried out following the training method and cross-validation of the perceivers with different combinations of hyperparameters.
  • SYBRGreen's gene expression quantification technique we used 50% for the training stage and 50% for cross-validation using SYBRGreen's gene expression quantification technique.
  • TaqMan gene expression quantification technique we used 70% of the data for the training stage and 30% for the cross-validation stage. The best network with accuracy > 0.80 was chosen for the training and cross-validation cohort.
  • the receptor operating characteristic (ROC) curve was developed with the output scores obtained from the analysis performed with the MLP algorithm, using the ROCR R package, http://rocr.bioinf.mpi-sb.mpg.de/. This method was used both for the data obtained by the SYBRGreen detection technique (qPCR-SYBRGreen) and for those obtained by the TaqMan technique (qPCR-TaqMan).
  • the potential classification power of the gene expression of the individual markers in FNA samples with metastatic and non-metastatic thyroid cancer was compared by constructing ROC curves.
  • ROC curves were constructed from CT values.
  • Table 4 presents the area under the curve (AUC) for each gene as a result of individual diagnostic performance. The diagnostic performance of each gene is shown in this table and it is observed that none of the genes evaluated individually reached the minimum performance required to classify metastatic thyroid cancer from non-metastatic cases. However, VEGFC showed the largest relative change of gene expression and the best diagnostic performance (AUC > 0.70).
  • Table 5 the data representing the diagnostic efficiency that were determined from the classification results obtained by ALD of the expression of the 5 genes with the highest individual AUC are presented.
  • the diagnostic efficacy of the classifier reached an AUC of 0.69 (Cl 0.56 - 0.84), a sensitivity of 65% (Cl 43 - 84), and a specificity of 69% (Cl 52 - 84).
  • the PPV and NPV were 58% (Cl 41 - 74%) and 76% (Cl 60 - 87%), respectively.
  • AUC Area under the curve
  • FNA fine needle aspiration puncture
  • CI confidence interval
  • Figure 7 shows the AUC where the classifier developed in qPCR-SYBRGreen used 11 genes that were integrated by the neural network.
  • the classifier in the training cohort reaches an AUC of 0.82
  • the validation cohort it reaches an AUC of 0.84.
  • Table 7 shows the data obtained from the samples that were evaluated using the qPCR-SYBRGreen method.
  • the diagnostic efficacy of the classifier reached an AUC of 0.82 (Cl 0.73 - 0.92), a sensitivity of 79% (Cl 61 - 92), and a specificity of 76% (Cl 61 - 88).
  • the PPV and NPV were 70% (Cl 56 - 80%) and 85% (Cl 73 - 92%), respectively.
  • the classifier reproduced its performance, showing an AUC of 0.84 (Cl 0.76 - 0.95), a sensitivity of 72% (Cl 70 - 96%), and a specificity of 87%. (Cl 61-88%).
  • the PPV and NPV were 79% (Cl 59-90%) and 82% (Cl 69-90%), respectively.
  • Table 7 Statistical efficacy of the Thyroid Metastatic Classifier developed with the qPCR-SYBRGreen technique.
  • AUC area under the curve
  • FNA fine needle aspiration
  • CI confidence interval
  • the classifier is expected to achieve a positive predictive value of 60-79% and a negative predictive value of 94-82% over a range of lymph node metastasis prevalence of 25-40%.
  • Figure 10 shows the area under the curve where the classifier developed in qPCR-TaqMan used 11 genes that were developed by the neural network. In this figure it is possible to observe that the classifier in the training stage reaches an AUC of 0.92, while in the validation stage it reaches an AUC of 0.87.
  • Table 8 shows the data obtained from the Thyroid Metastatic Classifier in FNA samples that were evaluated using the qPCR-TaqMan method.
  • the diagnostic efficacy of the classifier reached an AUC of 0.92 (Cl 0.91 - 0.93), a sensitivity of 80% (Cl 63 - 92), and a specificity of 84% (Cl 70 - 92).
  • the PPV and NPV were 76% (Cl 58 - 88%) and 87% (Cl 75 - 86%), respectively.
  • the classifier reproduced its performance, showing an AUC of 0.87 (Cl 0.85 - 0.91), a sensitivity of 73% (Cl 69 - 90%), and a specificity of 81% ( Cl 78-93%).
  • the PPV and NPV were 71% (Cl 52-76%) and 80% (Cl 55-93%), respectively.
  • Table 8 Statistical efficacy of the Thyroid Metastatic Classifier developed with the qPCR-TaqMan technique.
  • AUC area under the curve
  • FNA fine needle aspiration
  • CI confidence interval
  • the score obtained in the training and validation stages for each of the samples was plotted.
  • the cut-off point to classify the samples as metastatic (M-PTC) or non-metastatic (NM-PTC) was 0.47. These data can be observed in figure 11 .
  • the positive and negative predictive values of the Thyroid Metastatic Classifier for the FNA samples evaluated using the qPCR-TaqMan technique were estimated according to Bayes' Theorem (figure 12). The classifier is expected to achieve a positive predictive value of 60-79% and a negative predictive value of 90-79% over a range of lymph node metastasis prevalence of 25-40%.

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Abstract

Se presenta un método y un kit in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto. Como parte del alcance se proveen reactivos para conformar el kit y el uso de estos reactivos como parte del kit. Se provee también el uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto.

Description

METODO IN VITRO PARA EL DIAGNÓSTICO Y PREDICCIÓN DE LA AGRESIVIDAD DE CANCER DE TIROIDES, LAS POSIBILIDADES Y TIPO DE CIRUGÍA DE PRECISIÓN PARA LA REMOCIÓN DEL TUMOR EN UN SUJETO; KIT; REACTIVOS PARA CONFORMAR DICHO KIT; USO DE LOS REACTIVOS Y USO DE MARCADORES MOLECULARES PARTE DEL MÉTODO
MEMORIA DESCRIPTIVA
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a un método in vitro y sus kits para predecir la agresividad del cáncer papilar de tiroides y guiar el plan quirúrgico más recomendable para el tratamiento del tumor en un sujeto. La presente invención describe un método in vitro mediante el uso de un clasificador molecular para predecir la agresividad (potencial metastásico) del cáncer papilar de tiroides, permitiendo al cirujano recomendar la mejor opción quirúrgica para tratar el tumor en un sujeto.
Descripción del estado de la técnica
La mejora en las tecnologías de ultrasonido de alta resolución y el aumento en la disponibilidad y uso de la biopsia por aspiración con aguja fina (PAAF) han facilitado el manejo y diagnóstico de los nodulos tiroideos. Como consecuencia de esto, se está realizando un mayor número de PAAF para determinar si los nodulos tiroideos son malignos o no (Sosa JA, y cois., 2013). En los Estados Unidos, se realizan aproximadamente 350,000 PAAF cada año, de los cuales el 15% se informa como cáncer (Faquín WC. y cois, 2011).
El diagnóstico citológico del cáncer de tiroides mediante la PAAF permite clasificar el cáncer en 4 tipos principales: carcinoma papilar de tiroides (neoplasia maligna de tiroides más común), carcinoma folicular de tiroides, carcinoma medular de tiroides y carcinoma anaplásico de tiroides (Quang t. y cois, 2015).
Se ha descrito que, después de un diagnóstico citológico de cáncer de tiroides, es importante realizar estad ificación preoperatoria mediante imágenes, ya que puede alterar el pronóstico y el curso del tratamiento del paciente. Para ayudar a identificar potenciales metástasis linfáticas, se recomienda una ecografía preoperatoria del cuello de estadificación para evaluar el lóbulo contralateral y los linfonodos cervicales para todos los pacientes que serán sometidos a tiroidectomía por malignidad. A pesar de esta recomendación clínica, el ultrasonido del cuello sólo identifica el 50% de los ganglios linfáticos que se encuentran durante la cirugía (Haugen y cois, 2016).
En cuanto a la estadificación del cáncer de tiroides, el Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC) ha designado la estadificación del cáncer de tiroides por el sistema de clasificación Tumor, Nodo, Metástasis (TNM). Este sistema es el más utilizado para la predicción del pronóstico para el cáncer de tiroides. Sin embargo, este sistema centra su análisis en la supervivencia del paciente más que en la recurrencia de la enfermedad por lo que no es una
1
HOJAS DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) metodología suficiente para predecir la recurrencia, en particular, en pacientes con cáncer de tiroides en etapas tempranas.
A partir de la estadificación del paciente, se define la estrategia de tratamiento del paciente. Las opciones de tratamiento para el cáncer de tiroides incluyen cirugía, terapia de yodo radioactivo (1311) y terapias moleculares dirigidas con varios inhibidores de tirosina quinasa (TKI).
El Instituto Nacional del Cáncer en Estados Unidos ha definido recomendaciones de tratamiento según la etapa de avance (National Cancer Institute). Se presenta como opción de tratamiento estándar la cirugía, considerándose para el cáncer de tiroides papilar y folicular en caso de que sea localizado o metastásico, en cáncer de tiroides papilar y folicular recurrente y en cáncer anaplásico de tiroides (National Cancer Institute. Thyroid cancer treatment (PDQ). http://cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/thyroid/HealthProfessional.). En el caso de tumores primarios, la opción de tratamiento quirúrgico incluye la hemitiroidectomía y tiroidectomía total (extirpación de todo el tejido tiroideo visible), realizando la selección de la extirpación parcial o total de acuerdo con el tamaño del tumor. (Quang y cois, 2015). En definitiva, existen diversas variables que influyen en la decisión diagnóstica y particularmente en la decisión del tipo de cirugía para la remoción del tumor.
El cáncer de tiroides se diagnostica principalmente mediante análisis ortológico. Si bien, esta estrategia diagnóstica es el protocolo clínico estándar, se ha observado que presenta limitaciones como la dificultad para diferenciar entre las vahantes de cáncer papilar y folicular. Además, este tipo de técnica no confiere ninguna información pronostica o predictiva terapéutica. A partir de esta problemática, se trabajó de forma diagnóstica con marcadores inmunohistoquímicos, sin embargo, pocos tienen la capacidad para determinar el potencial metastásico o el pronóstico del carcinoma tiroideo (Sethi K. y cois., 2010).
Se han descrito diferentes artículos científicos y documentos de patente referidos al análisis de biomarcadores para la predicción del diagnóstico clínico de pacientes con carcinoma de tiroides. Xing M. y colaboradores, por ejemplo, presentan un estudio donde se describen las nuevas técnicas para la detección de nodulos y cáncer de tiroides mediante el uso de marcadores moleculares. Se hace mención del análisis de mutaciones como RET-PTC, RAS y BRAF (V600E); galectina 3 (Xing M. y cois., 2013). Adicionalmente, el documento descrito por González y colaboradores en el año 2017, describe un prototipo de clasificación de genes, que mediante diagnostico in vitro permite la caracterización de los nodulos con citología indeterminada.
Se ha descrito también el uso de la técnica de qPCR y de microarreglos para evaluar diferentes muestras de cáncer de tiroides teniendo como enfoque marcadores asociados a la función mitocondrial y tumorigenesis tiroidea (Jacques C, 2013). Otros autores han identificado microRNAs para el pronóstico del cáncer papilar de tiroides (Qiu J. y cois, 2018). De forma particular, se presenta el estudio de la relación de los niveles de expresión de m¡R- 146a y m¡R-146b con la aparición, proliferación y pronóstico de carcinoma papilar de tiroides en donde se detectó que los niveles de expresión m¡R-146a y m¡R-146b pueden afectar la proliferación y migración celular del cáncer.
El documento W02012160519 presenta una metodología para la detección de los niveles de expresión de uno o más productos génicos, incluyendo la detección y análisis del receptor de quimiokina CCR3. En estos documentos, a partir de una muestra de tejido de tiroides se determina la presencia y/o el nivel de agresividad del cáncer de tiroides.
Por otro lado, los documentos WO2016201555, W02012170711 , US2007099209, WO2013022995, presentan métodos basados en la detección de niveles de expresión de uno o más genes, incluyendo marcadores moleculares como PTEN, BRAF, CTLA4, VEGFC, entre otros. El enfoque de estos documentos es obtener información con respecto a la presencia o ausencia de cáncer y la agresividad de este. Adicionalmente, el documento US10260103B2 presenta ensayos de diagnóstico, métodos in vitro y Kits que permiten identificar cáncer de tiroides en una muestra biológica, mediante toma de muestra por aspiración con aguja fina y el análisis de los niveles de expresión de grupos de genes que comprende el grupo seleccionado de los genes CXCR3, CCR3, CXCL10, CK19, TIMP-1 , CLDN-1 , CAR, XB-130, HO-1 y CCR7.
Otros documentos como WO2013022995, WO2012174282 y LIS2011160290, incluyen la determinación del pronóstico de un sujeto con cáncer de tiroides mediante el análisis de marcadores como m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, RNLI6B, entre otros.
En el mercado también existen kits y servicios basados en el análisis de un modelo de clasificación para la predicción diagnóstica de cáncer de tiroides. En Estados Unidos, por ejemplo, el test de clasificación genómica denominado ThyroSeq® es una prueba para la evaluación preoperatoria de los nodulos tiroideos con citología indeterminada, que ofrece una evaluación de la probabilidad de cáncer en un nodulo dado. Aunque el grupo que ofrece el Test ThyroSeq v3 indica que proporciona información acerca del pronóstico que ayuda a determinar qué tipo de cirugía realizar, hasta ahora no hay ningún estudio que demuestre que Thyroseq v3 prediga una condición de agresividad ni que su uso induzca cambio de conducta clínicamente relevante. Esta tecnología incluye diversas versiones, ThyroSeq v2 y ThyroSeq v3 los que incorporan un panel cada vez más completo de genes para analizar (Thyroseq®, Thyroid Genomic Classifier). Esta tecnología se basa en secuenciación de nueva generación de ADN y ARN, una técnica altamente compleja y costosa, que no se encuentra disponible en todos los países del mundo de forma masiva y menos para su uso en diagnóstico clínico.
Otra prueba diagnóstica basada en el análisis genético del cáncer de tiroides es el test de clasificación genómica Afirma®. Este test evalúa de manera preoperatoria la probabilidad o sospecha de cáncer en nodulos tiroideos con citología indeterminada. A esta prueba diagnóstica, la empresa que desarrolla esta tecnología (Veracyte) ha incorporado el uso de Afirma ® Xpression Atlas (XA), una prueba que sugiere a los cirujanos adaptar la estrategia de cirugía u opciones de tratamiento para pacientes cuyos nodulos tiroideos son cancerosos o sospechosos de cáncer, a partir de las mismas muestras de PAAF utilizadas en el test Afirma®. Sin embargo, Afirma® XA carece de ensayos clínicos que validen su utilidad clínica. Por otro lado, desde el punto de vista técnico, Afirma® se basa en la secuenciación de transcriptoma completo de ARN y Afirma® XA, en la detección de alteraciones genómicas (vanantes de ADN y fusiones de ARN), utilizando la plataforma de secuenciación de nueva generación, tecnología compleja y de alto costo que no permite el uso de estas pruebas moleculares a nivel global.
Existen otras pruebas desarrolladas que se basan en análisis mutacionales de biomarcadores conocidos aceptados por la American Thyroid Association (Quest Diagnostics y Asuragen). Sin embargo, falta validar dicho análisis mediante ensayos clínicos.
En general, los métodos existentes hasta ahora exigen el análisis de una gran cantidad de biomarcadores, los test y servicios de predicción requieren de análisis que deben realizarse en laboratorios clínicos de servicio centralizado y requieren el envío de una muestra para su análisis. Por tanto, aún no se ha descrito y validado un método diagnóstico que permita identificar con alta exactitud qué pacientes tienen una potencialidad biológica de mayor agresividad y requieren de una intensificación de plan de tratamiento previo a la cirugía.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un método in vitro y kits para predecir la agresividad (potencial metastásico) del cáncer papilar de tiroides e indicando en forma más exacta el tipo de cirugía que se debe realizar para ejecutar un tratamiento quirúrgico con mayores probabilidades de curación definitiva.
La presente invención se basa en la cuantificación de la expresión de al menos uno o más genes en una muestra de PAAF de un paciente con cáncer papilar de tiroides, los cuales combinados en forma específica por un clasificador desarrollado por redes neuronales permiten predecir con alta exactitud el potencial metastásico del tumor. La presente invención se basa en la cuantificación de los niveles de expresión de al menos uno o más genes, correspondientes a BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, miR-16, miR-146b, miR-155, miR- 181d, RNU6B y RET.
Las combinaciones de genes incluidas en esta invención proporcionan resultados de diagnóstico y clasificación significativamente mejorados en comparación con los métodos existentes y disponibles. El análisis por el algoritmo de la expresión de al menos uno o más de los marcadores genéticos obtenidos desde muestras de PAAF incluidos en la presente invención, entrega resultados inesperadamente altos y muy superiores a la capacidad predictiva de los genes en forma individual o por la mera combinación aditiva de los marcadores u otros marcadores descritos previamente. En otras palabras, la medición de uno o más, dos o más, tres o más, o el conjunto de genes de la presente invención, con el subsecuente análisis por un algoritmo clasificador por etapas, es capaz de predecir con alta eficacia diagnóstica que pacientes con cáncer papilar de tiroides presentan un perfil molecular agresivo (alto potencial metastásico).
A diferencia de los paneles genéticos disponibles (ThyroSeq V3 y Afirma® GSC), que utilizan cientos de marcadores, la presente invención sólo utiliza 11 marcadores, permitiendo empaquetarlo en un kit (“/n vitro diagnostic” o IVD) que puede ser distribuido en laboratorios de patología a nivel global, ampliando la disponibilidad de la prueba diagnóstica y reduciendo los costos de evaluación pronostica en pacientes con cáncer papilar de tiroides.
El desarrollo del método propuesto en la presente invención incluye el análisis de los datos de expresión génica de uno o más genes a través de 3 pasos: 1) una etapa de preprocesamiento de datos, 2) una etapa de procesamiento de datos y 3) una etapa de clasificación.
En la etapa de pre procesamiento de datos se utilizan varias técnicas para limpiar y transformar los datos brutos a un formato útil o adecuado para que luego sean utilizados en la etapa de procesamiento de forma eficiente. Los datos brutos de expresión génica se prepararon por medio de varias técnicas para limpiar o transformarlos en un formato útil para la etapa de procesamiento. En esta primera etapa se incluyó la generación de razones o relaciones, expansión de características y reducción de dimensiones. Este último se realizó con el análisis de componentes principales (PCA) que simplifica la complejidad de los datos con múltiples dimensiones, al tiempo que conserva las tendencias y los patrones. Este análisis permite la reducción de las dimensiones, es decir, reducir el número de variables aleatorias tratadas.
Para la segunda etapa de análisis de datos definida como etapa de procesamiento de datos se utilizó la red neuronal artificial de perceptron multicapa (MLP) como estrategia para construir un modelo o algoritmo de clasificación. Para definir este modelo, se realizaron ensayos de entrenamiento y validación cruzada para perceptrones con diferentes combinaciones de hi perpará metros del modelo o algoritmo. Los hiperparámetros considerados fueron época, tasas de aprendizaje, abandonos, rho y épsilon. De todos los datos aleatorizados, se utilizó un 50% de ellos para la fase de entrenamiento y 50% para la etapa de validación cruzada. Se eligió la mejor red con exactitud > 0,80 para las cohortes de entrenamiento y validación cruzada.
La tercera etapa corresponde a la clasificación en la cual las puntuaciones obtenidas a partir del algoritmo o modelo MLP de clasificación se integran para evaluar la eficacia diagnóstica del Clasificador Metastásico Tiroideo (CMT). De acuerdo con el análisis de componentes principales de las variables independientes incluidas en el modelo Clasificador de predicción, se definió el uso de los primeros 11 componentes principales que explican el 99,3% de la varianza entre las variables. Este análisis permite entonces establecer los componentes que resultan suficientes para explicar el comportamiento de los datos incluidos en el modelo CMT. Se elaboró una curva de características operativas del receptor (ROC) para definir el potencial diagnóstico de la firma genética, que refleja la fuerza en la predicción del potencial metastásico. A partir de esto se definió el área bajo la curva (AUC). La firma genética del clasificador se construyó luego de diferentes iteraciones de predicción, hasta la obtención del AUC más sensible.
Con la definición del AUC, en donde el clasificador utilizó 11 genes que fueron integrados por la red neuronal, se determinó el rendimiento para predecir metástasis en ganglios linfáticos. De acuerdo con los resultados, el CMT predice con alta eficacia los casos con alto potencial metastásico en muestras de PAAF de pacientes con cáncer papilar de tiroides. El punto de corte para clasificar muestras como metastásicos (M-PTC) o no metastásicos (NM-PTC) fue de 0,20.
Entonces, se provee un método de predicción basado en un Clasificador Metastásico Tiroideo con el mejor rendimiento diagnóstico para metástasis linfonodal. En la cohorte de entrenamiento, la eficacia diagnóstica del clasificador alcanzó un AUC de 0,82 [IC 0,73 - 0,92], una sensibilidad del 79% [IC 61-92] y una especificidad del 76% [IC 61-88], El VPP y el VPN fueron 70% [IC 56 - 80%] y 85% [IC 73 - 92%], respectivamente. En la cohorte de validación estadística, el TPC reprodujo su eficacia, mostrando un AUC de 0,84 [IC 0,76 - 0,95], una sensibilidad del 72% [IC 70 - 96%] y una especificidad del 87% [IC 61-88%]. El VPP y el VPN fueron 79% [IC 59-90%] y 82% [IC 69-90%], respectivamente.
Los valores predictivos positivos y negativos del CMT fueron estimados según el Teorema de Bayes. Se espera que el clasificador alcance un valor predictivo positivo de 60-79% y un valor predictivo negativo de 94-82% en un rango de prevalencia de metástasis en los ganglios linfáticos de 25-40%. El método in vitro propuesto en la presente invención permite identificar la muestra de tejido tiroideo canceroso como metastásico o no metastásico con una sensibilidad mayor o igual al 69% o mayor o igual al 90%; una especificidad mayor o igual al 78% o mayor o igual al 93%; un valor predictivo positivo mayor o igual al 52% o mayor o igual al 76%; un valor predictivo negativo mayor o igual al 55% o mayor o igual al 93%; una razón de probabilidad positiva mayor o igual a 2 o mayor o igual a 12; una probabilidad post-prueba positiva mayor o igual al 58% o mayor o igual al 90%; una razón de probabilidad negativa mayor o igual a 0,19 o mayor o igual a 0,58; y una probabilidad post-prueba negativa mayor o igual a 9% o mayor o igual 32%.
En la siguiente descripción se presentan detalles específicos que permiten la comprensión de las diversas realizaciones de la invención.
Definiciones
Los términos presentados en este documento tienen el mismo significado que se utiliza de forma habitual en el estado de la técnica, a menos que se indique lo contrario. Los términos utilizados en este documento se presentan a continuación:
Se entiende por “aproximadamente” una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % a una cantidad de referencia. En cualquier realización discutida en el contexto de un valor numérico usado junto con el término “aproximadamente”, se contempla que este término puede ser omitido.
En la presente invención, se presenta en la memoria descriptiva y en el pliego de reivindicaciones el término “comprender” y las variaciones del mismo (“comprende y “que comprende”) deben ser interpretadas en sentido abierto e inclusivo, es decir como “incluyendo, pero no limitando a”.
Cuando se utiliza el término “consistente en”, se indica que los elementos enumerados en la frase son obligatorios y no pueden estar presentes en otros elementos. Además, el término “que consiste esencialmente en” es utilizado para cualquier elemento enumerado después de la frase y limitado a otros elementos que no interfieren con la actividad o acción específica de la divulgación de los elementos enumerados o que no presenten contribución.
Una cantidad “reducida, “disminuida”, “menor”, corresponde a una cantidad “estadísticamente significativa” de disminución en valores, cantidades, mediciones en resultados. El término “aumentado” o “mejorado”, corresponde a una cantidad “estadísticamente significativa” de aumento en valores, cantidades, mediciones en resultados. Tanto el aumento como la disminución “estadísticamente significativos” se comparan con los valores control del cada ensayo. La disminución o aumento de los valores obtenidos en los resultados con respecto al control puede ir aproximadamente desde 0,1 a 1.000, por ejemplo, una muestra puede aumentar sus niveles de expresión con respecto al control 50 veces.
El término “obtenido de” hace referencia a que una muestra como tal se aísla o deriva de una fuente en particular. Lo mismo ocurre con el término “derivado de”, el cual puede hacer referencia a la fuente de donde proviene la muestra.
El término específico “una realización” indica características o estructura particular descrita en relación con la realización que incluye al menos una realización presente en la invención, las cuales no necesariamente corresponden necesariamente a una misma realización. Por otro lado, las estructuras o características particulares pueden combinar una o más realizaciones. El termino especifico “cuantificación” indica una realización de la presente invención, la cual hace referencia al conteo en números o a la expresión de magnitud a través de números o porcentajes. Cuando se hace referencia a “cuantificación de niveles de expresión” se refiere a la cuantificación de los productos de expresión de genes que puede ser indicado como cantidad o porcentaje de proteínas o ARNm.
A menos que se indique lo contrario a las definiciones presentadas en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados presentan el mismo significado que los entendidos en la técnica. Para la presente invención, los siguientes términos científicos serán definidos a continuación:
Secuencia codificante: se entiende cualquier secuencia nucleotídica o polinucleotídica que contribuya al producto péptido o polipéptido de un gen. A su vez, el término “secuencia no codificante” indica secuencias nucleotídicas o polinucleotí dicas que no contribuyen al producto polipéptido de un gen.
Gen: se entiende por “gen” a una unidad de herencia que ocupa un lugar específico en un cromosoma y consiste en secuencias reguladoras transcripcionales y/o traduccionales y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas como intrones.
Producto génico: se entiende el término “producto génico” como aquel producto que resulta de la expresión de un gen, el cual puede ser una proteína o ARN.
Expresión génica: el término “expresión génica”, “expresión de genes” hace referencia al proceso celular que permite transformar la información codificada por los ácidos nucleicos a proteínas. Cuando se indica el término “sobreexpresión” o “sobreexpresión de genes” se refiere a la obtención de un número elevado de proteínas, luego del proceso de trasformación a partir de los ácidos nucleicos.
Aislado: se entiende como material que se encuentra libre de componentes los que normalmente acompañan a este material en su estado nativo. ARNm o transcripciones de ARNm: en este documento se incluyen, pero no se limitan a transcripciones de pre-ARNm, ARNm maduros y traducción y transcripción de estas secuencias. Un ARNm se refiere a un ácido nucleico para cuya síntesis se ha utilizado ADN como plantilla.
ADNc: se incluye la definición de ADNc, la cual describe que un ADNc corresponde a una forma inversa de ADN la cual proviene a partir de ARN m. Un ADNc, ARN, ARN amplificado, ADN amplificado, etc. para efectos de esta solicitud provienen de la transcripción de ARNm y la detección de productos derivados de esta transcripción. Las muestras de ARNm incluyen, pero no se limitan a transcripciones de ARNm del o de los genes, transcripción inversa de ADNc desde el ARNm, transcripción de ARNc a partir de ADNc, ADN amplificado desde los genes, ARN transcrito desde ADN amplificado y similares.
Amplificación: cuando se hace referencia al término “amplificación”, “amplificación de secuencias”, se refiere a incrementar o aumentar la cantidad o aumentar el número de copias de un producto génico o de secuencias génicas. El término “amplificación” se utiliza en ensayos moleculares como la Reacción de polimerasa en cadena o PCR. Cuando se hace referencia a ensayos de PCR, se refiere a aquel ensayo de carácter molecular el cual permite la obtención de un mayor número de copias de un producto génico. Cuando en la presente invención se hace referencia a PCR en tiempo real o qPCR o PCR cuantitativa se refiere al procedimiento molecular que permite amplificar y cuantificar el producto génico que se amplificó. La técnica de PCR en tiempo real o qPCR o PCR cuantitativa emplea cebadores o partidores específicos, y reactivos específicos para dicha reacción, la cual es termoestable, sin embargo, a diferencia de la PCR convencional, este método usa además un fluoróforo el cual es identificado por un sensor de fluorescencia que permite la cuantificación del producto génico amplificado. Por otro lado, en estas técnicas mencionadas en esta invención, se utilizan “reactivos”, los cuales comprenden sustancias químicas que permiten la interacción con diferentes componentes en una reacción o permiten la generación de nuevas sustancias. Se hace referencia al término “polinucleótidos” o “ácido nucleico” los cuales se refieren a la forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de estos. Se incluyen en este término las estructuras monocatenarias y bicatenarias de ADN y ARN. En esta invención, las secuencias de polinucleótidos pueden incluir secuencias genómicas, extragenómicas, secuencias codificadas por plásmidos, segmentos de genes diseñados para la expresión, péptidos o secuencias diseñadas adaptadas a la expresión de péptidos. Dichos segmentos genómicos pueden ser modificados por la mano del hombre. Los polinucleótidos de esta invención pueden combinarse con otras secuencias del ADN, como, por ejemplo, promotores, señales de poliadenilación, sitios de corte para enzimas de restricción, entre otros. Por lo tanto, es posible utilizar un fragmento de secuencias nucleotídicas de casi cualquier longitud, de preferencia limitada por la longitud máxima que permite la facilidad de preparación y uso en los protocolos de ADN recombinante.
Vanante de polinucleótidos: este término hace referencia a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con la secuencia de polinucleótidos de referencia. Este término contempla polinucleótidos que se distinguen de otro por adición, eliminación o sustitución de al menos un nucleótido.
Identidad de secuencia: se utiliza este término en el presente documento para referir al grado en que las secuencias son idénticas en secuencias nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido sobre la comparación con otra secuencia.
Polipéptido y proteína: hacen referencia a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes sintéticos análogos y naturales de los mismos. Estos términos se aplican a los polímeros de aminoácidos sintéticos o no sintéticos.
Sonda: hace referencia a un fragmento de ADN o de ARN de pequeño tamaño, el cual es usado en técnicas de biología molecular para la identificación de la presencia de ADN o de ARN. Las sondas se caracterizan por tener la capacidad de unirse o h¡ bridarse con secuencias o sectores de secuencias de ADN o ARN. Además, estas sondas pueden o no contener “fluoróforos” que emiten una luz cuando esta sonda se une a una secuencia de ADN o ARN. El término “fluoróforo” hace referencia a moléculas o componentes de estas que son fluorescentes ya que contienen un grupo funcional que absorbe una longitud de onda específica que luego emite en forma de luz.
Sujeto o individuo: en este documento se hace referencia a un “sujeto” o “individuo” como cualquier animal que presenta un síntoma, o podría presentar un síntoma el cual puede ser tratado o diagnosticado de acuerdo con la invención. Se incluyen temas para obtener el perfil de los productos génicos de la invención para diagnóstico y otros fines. Los sujetos o individuos (pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio, animales de granja, animales domésticos. Se incluyen mamíferos como primates y humanos.
Tratamiento: este término incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección, por ejemplo, cáncer de tiroides. Este término no indica necesariamente la erradicación o cura de la enfermedad o los síntomas asociados de la misma. Los tratamientos pueden ser aplicados a los sujetos que lo necesiten.
Diagnóstico: cuando se hace referencia al término “diagnóstico” se incluye cualquier tipo de reconocimiento, análisis y evaluación que se realiza para determinar una situación dada y cuáles son sus características. En términos médicos el diagnóstico permite identificar la aparición de enfermedades en un individuo mediante la observación de síntomas y la aplicación de pruebas y análisis que permiten la determinación de la enfermedad.
Predicción: el término “predicción” hace referencia al estudio de posibles escenarios futuros mediante diferentes técnicas de análisis. En el caso de la presente invención, una “predicción” realizada mediante un método de diagnóstico permite determinar si a futuro la enfermedad que se diagnostica en el individuo puede o no empeorar y con ello evaluar las condiciones de tratamiento para este.
Pronóstico: cuando se hace referencia al término “pronóstico” se hace alusión a la estimación de procesos o situación en donde se genera incertidumbre. Con respecto a la presente invención el término “pronóstico” se refiere a la capacidad informar los avances de una enfermedad en un futuro cercano, anticipando su posible evolución, recuperación y efectividad de los tratamientos aplicados en casos requeridos.
Tipo salvaje: hace referencia a un microorganismo, gen, o producto génico que tiene las características de ese microorganismo, gen o producto génico que se aísla a partir de una fuente natural.
Expresión diferencial: se entiende en la presente invención por “expresión diferencial”, cuando una muestra biológica es indicativa de cáncer al presentar diferencias en la expresión de uno o más, dos o más, o tres o más de los productos génicos o en combinación de estos, en dicha muestra biológica en comparación con la expresión en una muestra de control normal (no cancerosa). La expresión diferencial incluye una diferencia estadísticamente significativa en uno o más niveles de expresión de un producto génico en comparación con los niveles de expresión del mismo producto génico que ha sido determinado como control. La diferencia estadísticamente significativa puede ser un aumento o disminución en los niveles de expresión, medidos por los niveles de ARN, los niveles de proteína, la función de la proteína o cualquier otra medida relevante de expresión génica indicada en este documento. El término “estadísticamente significativo” se usa cuando el resultado obtenido es poco probable que ocurra por casualidad. Este resultado presentará un nivel de significancia que será relacionado con un concepto de prueba de hipótesis estadística frecuente. La “significancia estadística” puede ser definida como la probabilidad de tomar una decisión favorable o desfavorable según la hipótesis que se tenga, esta decisión se determina utilizando el valor de “p”, si “p” es menor que el nivel de significancia, la hipótesis se rechaza. Entre más pequeño sea el valor de “p”, más significativo serán los resultados. En este documento, también se presentan los factores de Bayes, los cuales son utilizados para la determinación de la significancia estadística, así, se puede reflejar un análisis en que la probabilidad de tomar la decisión de rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es realmente verdadera no es mayor que la probabilidad establecida. Con este tipo de análisis se pueden tomar decisiones para conjuntos de probabilidades con mayor exactitud.
Ensayos diagnósticos.
La presente invención está basada en la identificación inicial de nuevos marcadores moleculares de cáncer papilar de tiroides, con ello se permite la clasificación del grado de agresividad del tumor. Por ello, en la presente invención se presentan ensayos de diagnóstico con los que se pueden analizar muestras biológicas obtenidas de un sujeto con cáncer papilar de tiroides y determinar el grado de agresividad del tumor. Además, la presente invención permite determinar el tipo de cirugía a la cual puede ser sometido el sujeto en caso de padecer cáncer papilar de tiroides más agresivo, aumentando las probabilidades de éxito de ésta.
En diversas realizaciones, los métodos de la presente invención también incluyen la etapa de realizar un análisis ortológico o histológico en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de tejido tiroideo obtenida del sujeto, por ejemplo, con el objetivo de definir un diagnóstico preliminar. El análisis ortológico o histológico puede realizarse antes, concurrente o posterior a la realización del análisis basado en la expresión de productos génicos, como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, las muestras con un diagnóstico preliminar de cáncer papilar de tiroides se analizan por los métodos de la presente invención. En realizaciones particulares, el método comprende además identificar al sujeto con riesgo de padecer cáncer de tiroides agresivo mediante un análisis ortológico o histoquímico de muestras biológicas obtenidas del sujeto, por ejemplo, mediante técnicas de biopsia con aguja o aspirado con aguja fina.
En realizaciones particulares, el crecimiento anormal y descontrolado de células en la tiroides puede formar nodulos que pueden ser benignas o malignas. Los tumores benignos o no cancerosos incluyen a hiperplasia nodular (NHP), tiroiditis linfocítica (LCT) y adenoma de células Hürthle (HA), adenoma folicular (FA). Mientras que los tumores malignos incluyen los tumores papilar, folicular, medular y anaplásico, los que a su vez presentan subtipos de tumores como vahante folicular del carcinoma papilar (FVPTC), carcinoma medular de tiroides (MTC), carcinoma papilar de tiroides (PTC), carcinoma de células de Hürthle (HC), carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma folicular (FC). Estos tipos de cáncer, presentan potencial metastásico, por ejemplo, un cáncer de tiroides medular o folicular agresivo o un cáncer de tiroides medular o folicular con potencial metastásico. El “potencial metastásico” hace referencia a la capacidad o posibilidad de que una célula cancerosa se mueva desde un sitio inicial (en este caso la glándula tiroides) a otros sitios del cuerpo, pudiendo desarrollarse en otros órganos. En otras realizaciones particulares de la presente invención, se proporciona un método para el diagnóstico, identificación o clasificación de un cáncer, particularmente el cáncer de tiroides en un sujeto. El método propuesto comprende los pasos de analizar muestras de tejido para la determinación de los niveles de expresión de uno o más productos génicos y a partir de esa muestra identificar si esta corresponde a una muestra cancerosa con metástasis linfonodal. La identificación de la expresión de los productos génicos indicará que las muestras biológicas no presentan metástasis cuando estos niveles de expresión de uno o más productos génicos indican baja expresión de estos productos asociados a factores de agresividad tumoral. En cambio, una muestra biológica con alto grado de malignidad será identificada como tal, cuando la expresión de uno o más productos génicos sea indicativa de metástasis linfonodal. En realizaciones particulares, en la presente invención se proporciona un método que comprende la determinación de expresión de uno, de dos o más, de tres o más, productos génicos obtenidos de la muestra biológica de tejido tiroideo. Los productos génicos que se expresan se observan en la tabla 2 y en donde, al menos, uno de los productos génicos se expresa por el gen BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, m¡R-181d, RNU6B, RET. En ciertas realizaciones de esta invención, el método comprende la realización de una cirugía de remoción total o parcial de la tiroides sobre el sujeto, según el grado de agresividad del tumor que se determine en la muestra biológica con cáncer papilar de tiroides. En realizaciones particulares de la presente invención, el producto génico a analizar corresponde a ARN y el ensayo para el análisis de este comprende PCR, RT-PCR o qPCR, o cualquier otro ensayo que permita determinar la cantidad de ARN o los niveles de expresión, incluyendo los ensayos descritos en este documento. En realizaciones particulares, el producto génico a analizar es un polipéptido, y el ensayo de análisis corresponde a inmunohistoquímica o cualquier otro ensayo que permita la determinación de las cantidades de polipéptidos o los niveles de expresión, donde se incluyen los presentados en este documento.
En otras realizaciones particulares, la muestra biológica se obtuvo de un sujeto que padece cáncer papilar de tiroides. Los productos génicos para los que se determina la expresión génica incluyen los descritos en este documento y pueden comprender uno o más de estos productos génicos, los cuales también pueden ser denominados como “conjunto de productos génicos”. Este conjunto de productos génicos puede ser utilizado para la determinación de la presencia o ausencia de metástasis linfonodal en cáncer papilar de tiroides. El conjunto de productos génicos puede ser denominado como “biomarcadores”.
En realizaciones particulares, la presente invención proporciona un método para la detección o diagnóstico de la presencia o ausencia de metástasis linfonodal en cáncer papilar de tiroides en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de dos o más, o tres o más productos génicos que se expresan por los genes indicados en la tabla 2, e identificar la muestra de tejido tiroideo como cancerosa con metástasis o cancerosa sin metástasis correlacionando los niveles de expresión determinados por la muestra biológica del sujeto con la presencia o ausencia de metástasis linfonodal.
En otras realizaciones relacionadas la presente invención incluye un método para el tratamiento de un sujeto que lo necesita, que comprende: determinar si el sujeto tiene un cáncer, particularmente, cáncer papilar de tiroides, por cualquiera de los métodos de diagnóstico de la presente invención; y realizar una cirugía que contemple la extirpación quirúrgica completa del tumor del sujeto con disección cervical de los ganglios linfáticos o sólo una remoción completa del tumor o una porción del mismo, en el caso que se determine que el sujeto tiene un cáncer, particularmente cáncer papilar de tiroides.
El método para el tratamiento de un sujeto que lo necesita comprende: (i)determinar si el sujeto que padece cáncer papilar de tiroides presenta metástasis linfonodal mediante un método que comprende realizar un ensayo para determinar un nivel de expresión para uno o más productos génicos de un muestra biológica de tejido tiroideo e identificar si esta muestra de tejido tiroideo presenta metástasis linfonodal o no o se sospecha que los niveles de expresión génica en estos tejidos son indicativos de un agresividad tumoral, (¡i) realizar una cirugía de extirpación parcial o total del tejido canceroso en la tiroides del sujeto y/o remoción cervical de los ganglios linfáticos, si los análisis del sujeto (i) indican que probablemente el sujeto padece de cáncer papilar de tiroides con metástasis linfonodal.
En ciertas realizaciones, la presente invención incluye un método para determinar si un sujeto presenta cáncer con algún grado de agresividad tumoral, por ejemplo, un cáncer papilar de tiroides con metástasis linfonodal, donde una prueba inicial realizada en una muestra biológica obtenida del sujeto, por ejemplo, mediante PAAF de tejido tiroideo, presentaba un resultado canceroso, el método comprende realizar, solicitar u obtener los resultados de un ensayo de diagnóstico descrito en el presente documento realizado en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de tiroides, obtenida del sujeto. En realizaciones particulares, el ensayo de diagnóstico incluye realizar un ensayo para determinar un nivel de expresión para uno o más productos génicos de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de tejido tiroideo; e identificar la muestra biológica como cancerosa sin metástasis linfonodal en la que el nivel o niveles de expresión del producto génico indica una falta de metástasis linfonodal en la muestra biológica o identificar la muestra biológica como maligno o cáncer agresivo en el que el nivel o niveles de expresión del producto génico es indicativo de metástasis linfonodal en la muestra biológica. En realizaciones particulares, el método comprende determinar un nivel de expresión de dos o más, o tres o más, productos génicos en la muestra de tejido tiroideo, en donde los dos o más, o tres o más, productos génicos se expresan por uno o más genes enumerados en la Tabla 1 y en donde al menos uno de los productos génicos se expresa por el gen BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B, RET.
En realizaciones particulares de la presente invención, en cualquiera de sus métodos, la correlación se realiza mediante la comparación de los niveles de expresión de los productos génicos de la muestra de tejido tiroideo y los niveles de expresión de referencia para cada producto génico en cuestión. Se identifican las muestras biológicas de tejido tiroideo como cancerosas con metástasis linfonodal, si se presenta una diferencia significativa en el nivel de expresión de los productos génicos entre la muestra de tejido tiroideo y los niveles normales de control o expresión de referencia. En ciertas realizaciones, la muestra de tejido tiroideo se identifica como cancerosa con metástasis linfonodal, si hay una diferencia significativa en el nivel de expresión de dos o más, tres o más, o cuatro o más productos génicos entre la muestra de tejido tiroideo y un control normal o expresión de referencia niveles. Asimismo, la muestra de tejido tiroideo se identifica como cancerosa sin metástasis linfonodal, si no hay una diferencia significativa (es decir, existe una similitud sustancial) en el nivel de expresión de los productos génicos entre la muestra de tejido tiroideo y los niveles normales de control o expresión de referencia. En ciertas realizaciones, la muestra de tejido tiroideo se identifica como cancerosa sin metástasis linfonodal, si no hay una diferencia significativa en el nivel de expresión de dos o más, tres o más, o cuatro o más productos génicos entre la muestra de tejido tiroideo y un control normal o expresión de niveles de referencia.
En realizaciones de la presente invención de cualquiera de los métodos descritos en este documento, la muestra de tejido es identificada como cancerosa con metástasis linfonodal, si el nivel de expresión de uno o más de los genes (NM_005429.5, MIMAT0000069, MIMAT0002809, MIMAT0000646, MIMAT0002821 y NR_002752.2) disminuye, o si el nivel de expresión de uno o más de los genes (NM_005214.5) aumenta en la muestra de tejido de tiroides, en comparación con los niveles de expresión normales (niveles de expresión utilizados como referencia), la disminución o aumento de los niveles de expresión génica se ve por el aumento o disminución de la expresión de al menos 3 genes. La identidad de cada gen corresponde a: BRAF (Gen 1), CD80 (Gen 2), CTLA4 (Gen 3), PTEN (Gen 4), VEGFC (Gen 5), m¡R-16 (Gen 6), m¡R-146b (Gen 7), miR-155 (Gen 8), m¡R-181d (Gen 9), RNU6B (Gen 10), RET (Gen 11). En otras realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, una muestra de tejido tiroideo se identifica como cancerosa con metástasis linfonodal, si el nivel de expresión de uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más productos génicos de cualquiera de los subconjuntos de genes descritos en este documento se altera como se describió anteriormente. En realizaciones particulares, el conjunto de genes incluye uno o más genes correspondientes a BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B, RET.
En realizaciones particulares, la correlación se realiza mediante la comparación de los niveles de expresión génica de los productos génicos de la muestra biológica obtenida del sujeto con los niveles de referencia utilizando un algoritmo. Estos niveles de referencia pueden incluir niveles de expresión de cada producto génico por individual a partir de una diversidad de muestras biológicas cancerosas con metástasis linfonodal y cancerosas sin metástasis linfonodal.
En ciertas realizaciones, la comparación de los niveles de expresión permite determinar una correlación entre los niveles de expresión génica de las diferentes muestras. Las muestras biológicas utilizadas para la generación de esta correlación comprenden una diversidad de muestras de tejido de tiroides, dentro de las cuales se encuentran muestras de tejido canceroso sin indicadores de agresividad tumoral y muestras de tejido canceroso con indicadores de agresividad tumoral, esta última es considerada cancerosa con metástasis linfonodal donde los niveles de expresión de los genes mencionados anteriormente presentan una diferencia significativa en los niveles de expresión del producto génico con respecto a los niveles de expresión del tejido canceroso normal, si esta diferencia no existiese o no fuese una diferencia sustancial se considera que la muestra es normal.
En realizaciones de la presente invención, el método permite identificar la muestra de tejido tiroideo canceroso como metastásico o no metastásico con una sensibilidad mayor o igual al 69% o mayor o igual al 90%; una especificidad mayor o igual al 78% o mayor o igual al 93%; un valor predictivo positivo mayor o igual al 52% o mayor o igual al 76%; un valor predictivo negativo mayor o igual al 55% o mayor o igual al 93%; una razón de probabilidad positiva mayor o igual a 2 o mayor o igual a 12; una probabilidad post-prueba positiva mayor o igual al 58% o mayor o igual al 90%, una razón de probabilidad negativa mayor o igual a 0,19 o mayor o igual a 0,58; y una probabilidad post-prueba negativa mayor o igual a 9% o mayor o igual 32%.
En realizaciones particulares de la invención, cualquiera de los métodos o kits presentados en esta invención, se determina los niveles de expresión de dos o más productos génicos, uno o más, dos más, o de tres o más productos génicos, donde los genes son BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B, RET.
En realizaciones particulares, cualquiera de los productos génicos anteriores, dos o más, tres o más productos génicos incluyen uno o más productos génicos de BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, miR-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos corresponde a BRAF. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos es CD80. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos es CTLA4. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos corresponde a PTEN. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos incluye el análisis del gen VEGFC. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos corresponde a m¡R-16.
En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos corresponde a miR-155. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos es m¡R-181 d. En realizaciones particulares, los productos génicos incluyen uno o más, o tres o más de los genes mencionados en la tabla 2, donde al menos uno de los productos génicos es RNU6B.
También se incluye en la presente invención métodos y equipos útiles (kits) para la caracterización del cáncer de tiroides. El término “caracterización del cáncer de tiroides” en un sujeto hace referencia a la identificación de una o más propiedades que pueden encontrarse en una muestra de cáncer obtenida de un sujeto sospechoso de esta enfermedad. Por ejemplo, un tipo de cáncer de tiroides puede contener características específicas e incluir la determinación del pronóstico y la supervivencia del sujeto. Los tipos de cáncer de tiroides pueden ser identificados mediante marcadores moleculares, donde se incluyen, los productos génicos que se indican en esta invención.
En ciertas realizaciones de la presente invención, para el diagnóstico de cáncer, particularmente de cáncer de tiroides se pueden emplear métodos, softwares y sistemas de biología. En ciertas realizaciones pueden emplearse diversos productos de programas de computadores y software para diversos propósitos como la administración de datos, diseño de partidores, diseño de sondas, entre otros. Un experto en la materia apreciará que los métodos generales aquí descritos pueden adaptarse fácilmente para determinar el tipo de cáncer de tiroides, por ejemplo, comparando los niveles de expresión de los productos génicos con los determinados para diversos tipos de cáncer de tiroides. Sobre la base de la determinación del tipo de cáncer de tiroides, se puede determinar e estimar el pronóstico, la supervivencia y/o la probabilidad de metástasis, por ejemplo, sobre la base de datos o resultados históricos.
Genes y productos génicos
Los métodos indicados en la presente invención incluyen análisis para determinar los perfiles moleculares de las muestras biológicas mediante técnicas que permitan determinar los niveles de expresión de los productos génicos de los genes o conjuntos de genes identificados para llevar a cabo la presente invención. Dentro de los productos génicos se incluyen, pero no se limitan a ARNm y proteínas expresadas por dichos genes. Los productos génicos (también denominados como “productos de expresión génica”), se analizan determinando o midiendo los niveles de expresión de estos (genes presentados en la tabla 2, sus vanantes u homólogos en otras especies, o productos génicos adicionales), de acuerdo con los métodos presentados en esta invención.
En realizaciones particulares, se presentan los métodos utilizados en la presente invención, para la determinación de los niveles de expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes correspondientes a los presentados en la tabla 2 de una muestra de tejido, particularmente de tejido de tiroides. En particular, los niveles de expresión génica determinados en el análisis de uno o más genes o en conjunto de estos, se determinan mediante el análisis de la expresión de los genes BRAF, CD80, CTLA4, PTEN, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B, RET.
El nivel de expresión de los productos génicos puede ser determinado por cualquiera de las técnicas disponibles dependiendo del producto génico que se desee evaluar. Los productos génicos pueden ser evaluados mediante reactivos que permitan determinar la expresión de ARNm, la expresión o activación de proteínas, o las funciones biológicas posteriores de las proteínas que son codificadas por los genes descritos en la tabla 2. Considerando lo mencionado anteriormente, este documento incluye los reactivos para la detección de dichos genes o productos génicos de los mismos.
En ciertas realizaciones de esta invención, los productos génicos pueden determinarse mediante el uso de anticuerpos tales como, inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos, una matriz de polipéptidos o una matriz de anticuerpos, inmunotransferencia, Western Blot, ensayo de ELISA, citometría de flujo, inmunofluorescencia. En ciertas realizaciones se puede emplear espectrometría de masas (MS) u otros medios basados en la determinación del peso molecular. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar técnicas para cuantificar la presencia o los niveles de productos génicos, estas técnicas corresponden a citometría de flujo, inmunofluorescencia, hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ (FISH).
En ciertas realizaciones de la invención, los métodos de la invención pueden incluir el aislamiento de uno o más productos génicos a partir de la muestra biológica, estos productos génicos pueden comprender poli péptidos, péptidos, ADN, ARN. En ciertas realizaciones, el aislamiento de productos génicos como ARN pueden ser aislados mediante técnicas de extracción ya conocidas de ácidos nucleicos. Los niveles de expresión de ARN son determinados mediante técnicas ya conocidas, los cuales incluyen PCR, RT-PCR y qPCR.
En ciertas realizaciones se pueden emplear técnicas de amplificación para los productos génicos. Se define el término “amplificación” o “amplificación de ácidos nucleicos” como la producción de múltiples copias de al menos una porción de una secuencia nucleotídica diana, en “condiciones de amplificación” que permiten la amplificación de la secuencia nucleotídica diana, el resultado de esta amplificación de secuencia nucleotídica se denomina “amplicón” y cada amplicón sirve para la detección de esa secuencia y la determinación de su nivel de expresión. Las técnicas a utilizar para este procedimiento se encuentran descritas en la técnica y corresponden a las técnicas de PCR, qPCR y RT-PCR.
Muestras biológicas
En la presente invención, el método descrito comprende obtener una muestra biológica de un sujeto, donde dicha muestra biológica puede ser cualquier material que contenga tejidos, células, ácidos nucleicos, genes, fragmentos de genes, productos de expresión, productos de genes (por ejemplo, ARNm o proteínas) o fragmentos de productos de genes de un sujeto a analizar. Una muestra puede incluir, entre otros, tejido, células o material biológico de células o derivado de células de un individuo. La muestra puede ser una población heterogénea u homogénea de células o tejidos. En ciertas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra obtenida de la tiroides o un nodulo tiroideo de un sujeto. En realizaciones particulares de la presente invención, una muestra biológica comprende productos génicos como ácidos nucleicos, donde se incluyen ARNm y/o proteínas.
En la presente invención, el sujeto corresponde a un animal (por ejemplo, un mamífero), que incluye, pero no se limita a humanos, primates no humanos, roedores, perros, gatos, cerdos, peces y similares. En realizaciones particulares, el método se utiliza en muestras biológicas de humanos. En realizaciones particulares, el sujeto está en riesgo de tener o se sospecha que tiene un tumor de tiroides, donde tener riesgo o sospecha de se relaciona con que el sujeto presenta uno o más síntomas indicativos de cáncer de tiroides (p. Ej. , Un bulto o masa notable) o está siendo examinado para detectar un cáncer (p. Ej., durante un examen físico de rutina). El sujeto también puede ser un sujeto sospechoso de tener carcinoma de tiroides que puede tener uno o más factores de riesgo. Un sujeto sospechoso de tener cáncer de tiroides abarca sujetos que han recibido un diagnóstico inicial pero no se ha determinado o no se conoce la etapa del cáncer en que se encuentra el tumor de dicho sujeto. El término incluye además a personas que alguna vez tuvieron cáncer (por ejemplo, un individuo en remisión). Se incluyen también, sujetos cuyas muestras biológicas pueden haber sido analizadas previamente, pero los resultados no fueron concluyentes o indeterminados.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto en riesgo de cáncer de tiroides" se refiere a un sujeto con uno o más factores de riesgo para desarrollar cáncer de tiroides, en particular cáncer de tiroides agresivo o metastásico. Los factores de riesgo incluyen, entre otros, género, edad, predisposición genética, exposición ambiental, incidentes previos de cáncer, enfermedades preexistentes no cancerosas y estilo de vida.
Es posible obtener una muestra biológica usando cualquier método conocido en la técnica que pueda proporcionar una muestra adecuada para los métodos analíticos descritos en el presente documento. Los métodos para obtener una muestra biológica de un sujeto incluyen, entre otros, métodos de biopsia que incluyen aspiración con aguja fina (PAAF), aspiración con aguja, biopsia con aguja gruesa, biopsia asistida por vacío, biopsia por incisión, biopsia por escisión o biopsia por punción. En realizaciones particulares, los métodos y kits de la presente invención utilizan muestras biológicas obtenidas por PAAF. Los métodos para obtener muestras adecuadas de tiroides se conocen en la técnica y se describen con más detalle en las Guías clínicas internacionales ATA para el manejo de nodulos tiroides (Haugen y cois, 2016). Los métodos genéricos para obtener muestras biológicas también se conocen en la técnica. En una realización, la muestra es un aspirado con aguja fina de una glándula tiroides, un nodulo tiroideo o un tumor tiroideo sospechoso. En algunos casos, el procedimiento de muestreo por aspiración con aguja fina puede guiarse mediante el uso de un ultrasonido, rayos X u otro dispositivo de imagen.
En algunos casos, se pueden obtener múltiples muestras biológicas, tales como múltiples muestras de tiroides, para el diagnóstico mediante los métodos de la presente invención, por ejemplo, en el mismo momento o en momentos diferentes. En algunos casos, una muestra, o muestras obtenidas en el mismo momento o en momentos diferentes, se almacenan y/o analizan por diferentes métodos. Por ejemplo, se puede obtener una muestra y analizarla mediante análisis ortológico. En algunos casos, se puede obtener una muestra adicional de un sujeto al mismo tiempo o más tarde, por ejemplo, en base a los resultados de un análisis ortológico. La muestra adicional puede usarse en un método de la presente invención, por ejemplo, cuando el análisis ortológico fue indeterminado con respecto a la presencia o ausencia de cáncer. En otras realizaciones de los métodos de la presente invención, se puede obtener una sola muestra y una parte de la muestra analizada por análisis ortológico, mientras que otra parte de la muestra se analiza por los métodos de la presente invención.
En ciertas realizaciones, un médico puede obtener una muestra biológica de un sujeto, en lugares como un hospital, consultorio médico, centro de pruebas o laboratorio. En ciertas realizaciones, se puede obtener una muestra biológica usando un kit, que puede contener un medio para obtener una muestra cómo se describe en este documento, un medio para almacenar la muestra e instrucciones para el uso del kit. En algunos casos, el kit es proporcionado por un servicio de perfil molecular, que también puede realizar un ensayo de diagnóstico en la muestra biológica.
En realizaciones particulares, una muestra biológica se almacena durante un tiempo tal como segundos, minutos, horas, días, semanas, meses, años o más después de que se obtiene la muestra y antes de que la muestra sea analizada por uno o más métodos de la invención. En algunos casos, la muestra obtenida de un sujeto se subdivide antes de la etapa de almacenamiento o análisis posterior, de modo que diferentes porciones de la muestra están sujetas a diferentes métodos o procesos posteriores, incluyendo el almacenamiento, análisis citológico, pruebas de adecuación, extracción de ácidos nucleicos, extracción de proteínas, perfiles moleculares o combinaciones de los mismos. En algunos casos, una porción de la muestra se almacena mientras que otra porción de dicha muestra se manipula adicionalmente. Dichas manipulaciones pueden incluir, pero no se limitan a: perfiles moleculares; tinción ortológica; extracción, detección o cuantificación de ácido nucleico (p. ej. ARNm); extracción detección, cuantificación de proteínas; fijación (por ejemplo, muestras embebidas en parafina fijadas con formalina); y/o exámenes. La muestra se puede fijar antes o durante el almacenamiento mediante cualquier método conocido en la técnica, como el uso de glutaraldehído, formaldehído o metanol. En otros casos, la muestra se obtiene, se almacena y se subdivide después del paso de almacenamiento para un análisis posterior, de modo que diferentes partes de la muestra están sujetas a diferentes métodos o procesos posteriores, que incluyen almacenamiento, análisis citológico, pruebas de adecuación, extracción de ácido nucleico, extracción de polipéptidos, perfiles moleculares, determinación de la expresión de uno o más productos génicos, o una combinación de los mismos. En algunos casos, las muestras se obtienen y analizan mediante, por ejemplo, análisis citológico, y el material de muestra resultante se analiza adicionalmente mediante uno o más métodos de la presente invención que comprenden determinar los niveles de expresión de productos genéticos descritos en el presente documento, por ejemplo, mediante perfiles moleculares. En tales casos, las muestras pueden almacenarse entre los pasos del análisis ortológico y los pasos para determinar los niveles de expresión del producto génico, por ejemplo, mediante perfiles moleculares. En ciertas realizaciones, las muestras pueden almacenarse congeladas, por ejemplo, a aproximadamente cualquiera de las siguientes temperaturas entre aproximadamente 8°C y aproximadamente 0°C en un medio de conservación adecuado durante y después de la obtención de la muestra.
La evaluación de la muestra biológica puede ser realizada durante o después de la obtención de esta incluyendo luego del proceso de almacenamiento. La evaluación de la muestra comprenderá la determinación de la aptitud de esta para su uso en los métodos y composiciones descritas en esta invención, con ello se indicará si la muestra es adecuada o no para el análisis posterior. Se considerará una muestra inadecuada si las características de esta muestra incluyen células insuficientes, material genético insuficiente, proteínas, ADN o ARN insuficientes, células inapropiadas para la prueba indicada o material inapropiado para la prueba indicada, edad de la muestra, forma en que se obtuvo la muestra o forma en que se almacenó o transportó la muestra. La aptitud de la muestra puede ser determinada usando métodos conocidos como tinción celular, medición del número de células o cantidad de tejido, determinación de proteínas totales y/o ácidos nucleicos, exámenes microscópicos, evaluaciones de temperatura y pH. En una realización, la adecuación de la muestra se determina a partir de los resultados de realizar un experimento de análisis de nivel de producto génico. Los ejemplos de métodos para determinar que está presente un número adecuado de un tipo específico de célula incluyen PCR, PCR cuantitativa, RT-PCR, inmunohistoquímica, análisis citológico, microscopía y visual.
Las muestras pueden analizarse determinando el contenido de ácido nucleico después de la extracción de la muestra biológica usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, absorbancia ultravioleta, que incluyen, pero no se limitan a absorbancia a 260 nanómetros (nm) usando un espectrofotómetro, entre otros. En algunas realizaciones, el contenido proteico de la muestra biológica se determina utilizando vanados métodos conocidos en la técnica, en donde se incluyen, pero no se limitan a absorbancia ultravioleta a 280 nm, tinción celular o de proteínas, en algunos casos la proteína se extrae de la muestra biológica antes de la medición de esta. En otras realizaciones, las muestras pueden ser analizadas por técnicas de proteínica. En realizaciones particulares, las muestras se procesan por cualquier método ya conocido. En realizaciones particulares, los productos génicos se seleccionan de ácidos nucleicos, como ADN y ARN, donde se incluye el ARNm y proteínas.
Análisis citológico
Las muestras biológicas pueden ser analizadas mediante técnicas de tinción celular y observación microscópica. La tinción celular puede comprender las técnicas de tinciones de EA, tinción de hematoxilina, citostain, tinción de Papanicolaou, tinción de eosina, tinción de Nissl, azul de toluidi na, tinción de plata, mancha de azocármica, rojo neutro o verde janus. El contenido de ácido nucleico puede ser determinado mediante tinción utilizando bromuro de etidio, hematoxilina, tinción de Nissl u otras tinciones conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, las células pueden ser colocadas sobre un portaobjetos utilizando métodos estándar conocidos en los exámenes cito lógicos, además, pueden utilizarse métodos de citología líquida (LBC), en donde, las muestras biológicas del sujeto son transferidas a un recipiente o vial que contiene la solución ortológica líquida, que puede ser cualquiera de las que son conocidas en la técnica. La muestra con la solución ortológica puede ser almacenada y/o procesada para la producción de una capa de células en un portaobjetos de vidrio, la que a su vez puede ser teñida y posteriormente observada al microscopio.
En algunas realizaciones, las muestras pueden ser analizadas mediante ensayos de inmunohistoquímica y con ello observar la presencia, ubicación y distribución de moléculas como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos u otras moléculas que puedan ser reconocidas por anticuerpos específicos, en donde dependiendo del antígeno a identificar pueden o no utilizar anticuerpos secundarios para la identificación.
Con el examen citológico se puede determinar si una muestra biológica es negativa o libre de cáncer; sospechosa, ambigua o sugerente para la presencia de cáncer; diagnóstica (que muestre la presencia de cáncer); no diagnóstica o indeterminada (la cual proporciona información inadecuada sobre la presencia o ausencia de cáncer). Los resultados de estos diagnósticos determinaran si las muestran serán benignas o malignas, siendo en algunos casos diagnósticos indicativos de la presencia de un tipo de cáncer, particularmente un tipo de cáncer de tiroides.
KITS
En realizaciones particulares, la presente invención provee kits o pruebas de diagnóstico para diagnosticar o predecir cáncer, como por ejemplo, el cáncer de tiroides en los sujetos. Las pruebas de diagnóstico descritas en este documento pueden ser pruebas de diagnóstico in vitro. Las pruebas de diagnóstico incluyen, entre otras, pruebas de diagnóstico in vitro aprobadas o autorizada por la FDA, pruebas desarrolladas en un laboratorio centralizado, pruebas directas al consumidor, que pueden utilizarse para analizar una muestra biológica y detectar o indicar la presencia o ausencia de cáncer metastásico, como un cáncer de tiroides con metástasis linfonodal. En una realización, se puede usar una prueba o kit de diagnóstico en un laboratorio u otro entorno profesional de la salud. En otra realización, un consumidor puede usar una prueba o kit de diagnóstico en la casa.
Las pruebas de diagnóstico o kits comprenden uno o más reactivos para la detección de productos génicos descritos en este documento y pueden comprender otros reactivos, instrumentos y sistemas destinados para el uso diagnóstico in vitro del diagnóstico de cáncer de tiroides, con el fin de curar, mitigar, tratar o prevenir la enfermedad o sus secuelas. En una realización, los kits o pruebas de diagnóstico descritos en este documento pueden ser destinados para el uso en la colección, preparación y examinación de especímenes tomados desde el cuerpo humano. Como se usa en este documento, el término "prueba de laboratorio" se refiere a uno o más procedimientos médicos o de laboratorio que implican analizar una muestra biológica obtenida de un sujeto.
Los kits y pruebas de diagnóstico de la presente invención comprenden uno o más de los reactivos para la detección de uno o más productos génicos descritos en este documento, como aquellos expresados por los genes enlistados en la tabla 2. A este respecto, los reactivos para la detección pueden comprender cualquier reactivo conocido por la persona experta para detectar productos génicos, que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos y oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, el kit o ensayo de diagnóstico puede comprender además instrucciones escritas sobre cómo realizar el ensayo descrito en el presente documento para determinar los niveles de expresión del producto génico usando el kit.
En ciertas realizaciones, un kit o ensayo de diagnóstico de la presente invención comprende dos o más, tres o más, o cuatro o más reactivos, por ejemplo, sondas para la detección de un producto génico descrito en este documento. En realizaciones particulares, los productos génicos son proteínas o ácidos nucleicos, por ejemplo, ARNm. En ciertas realizaciones, los reactivos son anticuerpos u oligonucleótidos, incluyendo cualquiera de aquellos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, cada reactivo es un conjunto de oligonucleótidos, por ejemplo, donde cada conjunto consiste en dos nucleótidos que juntos son capaces de amplificar un producto génico polinucleótido objetivo por PCR. En ciertas realizaciones, un kit o ensayo diagnóstico comprende dos o más, tres o más, o cuatro o más reactivos para detectar un producto génico, en donde el kit o ensayo diagnóstico comprende dos o más, tres o más, o cuatro o más conjuntos de cebadores, cada conjunto con la capacidad de amplificar al menos una porción de un producto génico objetivo. En ciertas realizaciones, el dicho kit o ensayo diagnóstico además comprende dos o más, tres o más, o cuatro o más sondas marcadas más separadamente, cada sonda se une específicamente a uno de los productos génicos objetivo o un complemento de los mismos. En consecuencia, en ciertas realizaciones, cada conjunto de cebadores se usa para amplificar un producto génico objetivo y entonces cada sonda se usa para detectar la amplificación de los productos y medir los niveles de expresión de cada producto génico. En realizaciones particulares, cada reactivo, por ejemplo, cada conjunto de cebadores detecta un producto génico diferente. Sin embargo, se entiende que ciertas realizaciones pueden incluir dos o más reactivos que amplifiquen el mismo producto génico. Por ejemplo, un kit o ensayo de diagnóstico puede comprender dos reactivos, uno es un conjunto de cebadores de amplificación y el otro es una sonda, que cada uno se une y/o detecta específicamente el mismo producto génico. Además, un kit o ensayo diagnóstico puede comprender múltiples combinaciones de dos o más reactivos que cada uno se une o detecta específicamente el mismo producto génico, por ejemplo, en el que cada combinación se une o detecta específicamente un producto génico diferente, permitiendo así la amplificación y detección de múltiples productos génicos, por ejemplo, al mismo tiempo.
En realizaciones particulares, los productos génicos detectados por los reactivos del kit o ensayo diagnóstico son expresados por uno o más genes enlistados en la tabla 2, en donde al menos uno de los productos génicos es expresado por los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B y RET.
En ciertas realizaciones, el kit o ensayo diagnóstico comprende cada reactivo en un recipiente separado. En otras realizaciones, cada reactivo se proporciona en el mismo contenedor. En realizaciones particulares, los reactivos están unidos cada uno a regiones discretas de un sustrato sólido. Por consiguiente, en una realización, los reactivos son oligonucleótidos unidos covalente mente a un sustrato sólido, en el que la matriz es opcionalmente una micromatriz. En ciertas realizaciones, los reactivos son conjuntos de oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores, y los conjuntos de oligonucleótidos comprenden ADN.
Los kits o ensayos diagnósticos de la presente invención pueden comprender además una o más soluciones adecuadas para unir dichos reactivos a dichos productos génicos, y/o una o más soluciones o reactivos utilizados en la realización de un método de la presente invención para determinar un nivel de expresión de los productos genéticos. Por ejemplo, en realizaciones particulares, un kit o ensayo de diagnóstico comprende un conjunto de cebadores de PCR, puede comprender además uno o más reactivos adicionales para realizar un ensayo de PCR, como, por ejemplo, una polimerasa termoestable, una mezcla de desoxinucleótidos y/o una sonda marcada detectable mente. En una realización particular, la sonda marcada de forma detectable comprende un fluoróforo y un resto de enfriamiento, y la sonda puede emitir una señal detectable cuando la sonda se escinde, pero no cuando la sonda está intacta.
Los kits o ensayos de diagnóstico de la presente invención pueden comprender además uno o más reactivos para procesar y/o almacenar una muestra biológica, por ejemplo, en donde el procesamiento de la muestra de tejido tiroideo comprende extraer los productos génicos de la muestra biológica.
Los kits o ensayos de diagnóstico de la presente invención pueden comprender además uno o más productos de genes de control, tales como, por ejemplo, controles positivos que contienen una muestra del producto de genes y/o un control negativo que no lo contiene, para confirmar que los métodos realizados tuvieron éxito en identificar y/o medir específicamente la expresión y/o presencia de productos génicos.
En ciertas realizaciones, un kit o ensayo de diagnóstico comprende datos o información, por ejemplo, correspondiente a los niveles de expresión génica de los productos génicos en muestras de control positivas y/o negativas o valores de corte predeterminados de expresión génica indicativos de la presencia o ausencia de metástasis linfonodal en casos de cáncer de tiroides.
En realizaciones particulares, uno o más reactivos para la detección de productos génicos, la solución, los reactivos adicionales y los productos génicos de control están en recipientes separados.
Descripción de las figuras.
Figura 1 Diagrama de flujo de la cohorte del estudio. En la figura se presenta el esquema diseñado para el análisis de la cohorte de las muestras de biopsias de tejido y PAAF de nodulos tiroideos. Las muestras de cada subtipo se asignaron al azar para la cohorte de entrenamiento o de validación.
Figura 2. Expresión diferencial entre muestras PAAF con cáncer papilar de tiroides metastásica y sin metástasis. La expresión génica se determinó por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en 62 PAAF con metástasis y 97 no metastásica. Para calcular la expresión génica de cada muestra, el gen informativo fue normalizado por 2 genes de referencia. Las barras representan la expresión génica de las muestras metastásica respecto al promedio de la expresión génica de las que no presentan metástasis (*p < 0,05).
Figura 3. Modelo del Clasificador Metastásico Tiroideo. En la figura se presenta el diagrama del modelo de predicción de genes. El análisis de los genes se realizó en tres pasos consecutivos. Los pasos de análisis se presentan como a) procesamiento de datos crudos utilizando el método de análisis de componentes principales (PCA) que simplifica la complejidad de los datos manteniendo las tendencias y las pautas, b) procesamiento de datos utilizando la Red neuronal de perceptron multicapas (MLP) como estrategia para la construcción del modelo de clasificación, y c)la clasificación de los datos según puntuación obtenidas por MLP se integraron para la evaluación del rendimiento del modelo predictivo. PCA: principal component analysis.
Figura 4. Análisis de componentes principales de las variables independientes incluidas en el modelo Clasificador Metastásico Tiroideo, (a) Proporción de la varianza explicada (PVE) y (b) proporción de la varianza explicada acumulada para cada uno de los componentes principales. Los primeros 11 componentes principales obtenidos son capaces de explicar más del 90% de la varianza total de los datos analizados.
Figura 5. Curva ROC y área bajo de la curva (AUC) de clasificación de metástasis linfonodal en PAAF por los 5 genes con valores de AUC individual más altos (AUC>0,60) evaluados mediante análisis lineal discriminante. La expresión génica de los marcadores se determinó con la técnica qPCR-SYBRGreen. El clasificador alcanzó una AUC de 0,69 en la etapa de entrenamiento y 0,62 en la etapa de validación.
Figura 6. Representación de la asociación entre la expresión de los 5 genes con valores de AUC individual más altos (AUC >0,60). Gráficos de dispersión que muestran la correlación entre los valores de expresión de los genes que presentaron mayor AUC de manera independiente. Datos analizados mediante la prueba de coeficiente de correlación de Spearman.
Figura 7. Curva ROC y área bajo de la curva (AUC) para el Clasificador Metastásico Tiroideo por técnica qPCR-SYBRGreen en PAAF. En la figura se presenta un gráfico en donde se muestra el área bajo la curva de los 11 genes utilizados en el modelo predictivo de clasificación de tiroides usando MLP. El clasificador alcanzó una AUC de 0,82 en la etapa de entrenamiento y 0,84 en la etapa de validación.
Figura 8. El Clasificador Metastásico Tiroideo efectivamente identifica metástasis por técnica qPCR-SYBRGreen en PAAF. Gráfico de dispersión que muestra el puntaje de clasificación obtenido mediante el algoritmo para cada PAAF en el set de entrenamiento y de validación, respectivamente. El punto de corte de clasificación entre metástasis y no metástasis fue de 0,20. Los puntos muestran la clasificación de los casos que no presentan metástasis (NM-PTC) y los cuadrados, aquellos que son metastásico (M-PTC).
Figura 9. Análisis mediante Teorema de Bayes muestra un desempeño teórico adecuado para el Clasificador Metastásico Tiroideo en la etapa de validación. Por
TI teorema de Bayes, se espera que el clasificador alcance un VPP de 64-79% y un VPN de 94- 82% con una prevalencia de metástasis linfonodal entre el 25-40%.
Figura 10. Curva ROC y área bajo de la curva (AUC) para el Clasificador Metastásico Tiroideo (11 genes) por técnica qPCR-TaqMan en PAAF. En la figura se presenta un gráfico en donde se muestra el área bajo la curva de los 11 genes utilizados en el modelo predictivo de clasificación de tiroides usando MLP. El clasificador alcanzó una AUC de 0,92 en la etapa de entrenamiento y 0,87 en la etapa de validación.
Figura 11. El Clasificador Metastásico Tiroideo efectivamente identifica metástasis por técnica qPCR-TaqMan en PAAF. Se presenta un gráfico de dispersión que muestra el puntaje de clasificación obtenido mediante el algoritmo para cada PAAF. El punto de corte de clasificación para los datos obtenidos utilizando el método qPCR-TaqMan entre metástasis y no metástasis fue de 0,47. Los puntos muestran la clasificación de los casos que no presentan metástasis (NM-PTC) y en cuadrados, aquellos que son metastásico (M-PTC).
Figura 12. Análisis mediante Teorema de Bayes muestra un desempeño teórico adecuado para el Clasificador Metastásico Tiroideo en la etapa de validación. Por teorema de Bayes, se espera que el clasificador alcance un VPP de 60-79% y un VPN de 90- 79% con una prevalencia de metástasis linfonodal entre el 25-40%.
Ejemplos de aplicación
Ejemplo 1 : Definición de biomarcadores para clasificador genético de muestras de nodulos tiroideos en biopsias de tejido.
- Recolección de muestras de biopsias de tiroides de tejido fresco v cohorte de pacientes Para el análisis se recolectaron biopsias de tiroides de tejido fresco (en adelante denominadas "biopsias de tejido") prospectivamente entre los años 2014 y 2017 en el hospital clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. Se recogieron biopsias de tejido en el quirófano de pacientes sometidos a lobectomía o tiroidectomía total y se dispusieron inmediatamente en RNALater (Ambion).
Las muestras obtenidas por medio de aspiración con aguja fina (PAAF) se recolectaron prospectivamente mediante guía de ultrasonido entre 2016 y 2018 en seis centros académicos, se estabilizaron utilizando reactivo de células RNAprotect (Qiagen) y se almacenaron a -80°C hasta la extracción de ARN. Los pacientes firmaron un consentimiento informado previamente aprobado por el Comité de Ética de cada institución. El informe histopato lógico quirúrgico se utilizó como el estándar de oro para comparar las citologías tanto para las biopsias de tejido como para las PAAF en las categorías Bethesda V y VI. En la figura 1 se presenta un esquema de flujo del diseño del estudio, donde las muestras de cada subtipo se asignaron al azar a la cohorte de entrenamiento o a la cohorte de validación. El tamaño mínimo de muestra para cada conjunto se calculó en base a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para estudios clínicos con una potencia del 80% y una precisión del 95% para la prueba. Además, un operador ciego al diagnóstico molecular comparó la puntuación del clasificador con el informe patológico quirúrgico respectivo para cada paciente.
Tras un seguimiento de al menos 4 años de una cohorte metacénthca de 3650 muestras de PAAF, se obtuvo el informe histopatológico quirúrgico (estándar de oro) en 292/612 casos de cáncer (Bethesda V/VI). A continuación, las muestras se estratificaron según el informe de citología y la característica de agresividad a estudiar como variable dependiente (metastásico/no metastásico) y se asignaron al azar. La caracterización clínico-histopatológica de las muestras PAAF se presenta en la tabla 1. Tabla 1. Caracterización clínico-histológica de las muestras PAAF.
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PAAF: Punción aspirativa por aguja fina. CPT: carcinoma papilar de tiroides, vil: vanante usual, vF: vanante folicular, vHC vanante Hürtle Cell, vTCV: variante Tall Cell - Extracción de ARN v síntesis de ADNc
El ARN total de biopsias de tejidos y PAAF se extrajo con el kit RNeasy Plus-Mini (Qiagen). La concentración total de ARN se determinó usando el kit de ensayo Qubit® RNA HS y el fluorómetro Qubit® 2.0 (Invitrogen). Las reacciones de transcripción inversa (RT) para evaluar la expresión de ARNm se realizaron en un volumen final de 20 pL utilizando 150 ng de ARN total de biopsias de tejido o 50 ng de PAAF con el sistema de transcripción inversa Improm II ™ (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las reacciones de RT para evaluar miARN se realizaron de acuerdo con el método miQPCR publicado en Benes y cois., 2015. Brevemente, se preparó una mezcla de desnaturalización que contenía 10 ng de ARN total, 0,4 pM de adaptador miLINKER y 30% de PEG 8000 (New England Biolabs), y se incubó durante 3 minutos a 75°C. A continuación, el adaptador miLINKER se ligó a los miARN molde durante 30 minutos a 25°C en presencia de tampón T4 1X (New England Biolabs), MgCI2 5 pM, inhibidor de RNasa 0,1 pL 40 U/pL (Promega) y 200 unidades de T4 RNA Ligase 2, K227Q truncado (New England Biolabs).
La síntesis de ADNc se realizó en tres pasos: primero, la mezcla se incubó con 0,25 mM de dNTP y 0,125 pM de cebador universal mQ-RT durante 2 minutos a 85°C; luego se añadieron 1X de tampón RT (Invitrogen), 5 mM de DTT (Invitrogen) y agua hasta completar un volumen de 19,7 pL a la mezcla y se incubaron durante 3 minutos a 45°C. Finalmente, se añadieron 0,3 pL de Superscript II (200 U/pL; Invitrogen) a la mezcla, se incubaron durante 30 minutos a 45°C, 3 minutos a 85°C y se mantuvieron a 10°C.
- Selección de biomarcadores
Para la preselección de los biomarcadores a evaluar, se identificaron genes informados que muestran expresión diferencial y/o importancia biológica en la agresividad/inflamación/transición epitelio-mesénquima de la carcinogénesis tiroidea mediante una búsqueda en PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Se incluyen los genes BRAF (gen 1), CD80 (gen 2), CTLA4 (gen 3), PTEN (gen 4), VEGFC (gen 5), m¡R-16 (gen 6), m¡R-146b (gen 7), miR-155 (gen 8), m¡R-181 d (gen 9), RNU6B (gen 10), RET (gen 11). Estos genes son descritos en la tabla 2, en donde además se indica el identificador de secuencias para la presente invención.
- qPCR
Para evaluar la expresión de ARNm en muestras de biopsias de tejido, las reacciones de qPCR se realizaron en un volumen final de 20 pL de mezcla de reacción que contenía 2 pL de ADNc, 10 pL de Mezcla maestra 2X Brilliant II SYBR Green qPCR (Agilent Technologies), 250 nM de cada cebador y agua libre de nucleasas.
Las condiciones para la reacción de amplificación fueron: 10 min a 95°C, seguido de 40 ciclos de 20s a 95°C, 20s a 60°C y 20s a 72°C. El análisis de la curva de fusión se realizó aumentando la temperatura 1°C/s en el intervalo desde 72°C a 95°C.
Para evaluar la expresión de miARN, las reacciones de qPCR se realizaron en volúmenes de 20 pL con 0, 1 ng de ADNc sintetizado (100 pg/reacción) en presencia de un cebador universal inverso y específico de miQPCR 0,25 pM, 1X Brilliant II SYBR Green Mastermix (Agilent Technologies) y agua libre de nucleasas hasta completar 20 pL de reacción. La reacción de qPCR se realizó en el termociclador Rotor-Gene (Qiagen) con las siguientes condiciones de reacción: 95°C durante 10 minutos, 50 ciclos de 95°C durante 10s, 60°C durante 35s, y un paso final para la curva de fusión de 60°C a 95 °C, aumentando un grado por segundo (tabla 3).
Tabla 2: Descripción de los 11 genes del Clasificador Metastásico Tiroideo seleccionados mediante técnica qPCR-SYBRGreen.
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Para evitar la amplificación genómica, los cebadores utilizados para el análisis de biopsias de tejido y PAAF se diseñaron en diferentes exones utilizando el software Pñmer-BLAST (www. nebí . ni m. ni h. gov/too Is/pr i mer-blast/) .
En muestras de PAAF, se evaluó la expresión génica de los biomarcadores mediante qPCR en configuración multiplex utilizando ensayos de sondas TaqMan, que incluyen un gen objetivo y dos genes de referencia. Las reacciones se estandarizaron siguiendo las recomendaciones del fabricante
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/taqman_optimization_man.pdf). Las reacciones de qPCR para evaluar el ARNm se realizaron agregando 5 pl de dilución de reacción 1 :12,5 RT en un volumen final de 20 pl que contenía 10 pl de mezcla maestra multiplex TaqMan ™ 2X con Mustang Purple (Applied Biosystems), TaqMan ™ específico de secuencia ensayos (Applied Biosystems) y agua libre de nucleasas. Las reacciones de RT para evaluar miARN se realizaron usando el kit de síntesis de ADNc miRNA Advanced TaqMan ™ (Applied Biosystems) y la expresión de miARN se cuantificó agregando 5 pL de dilución de reacción RT 1 :20 en un volumen final de 20 pL que contenía 10 pL de TaqMan ™ Multiplex 2X Master Mix con Mustang Purple (Applied Biosystems), ensayos de miARN Advanced TaqMan ™ de secuencia específica (Applied Biosystems) y agua libre de nucleasas. Las condiciones para la amplificación fueron: 20 segundos a 95°C, seguidos de 40 ciclos de 3 segundos a 95°C y 30 segundos a 60°C.
Todas las reacciones de qPCR se realizaron en el termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen). No se consideraron las reacciones con un umbral de ciclo > 35 y/o curvas de fusión deficientes.
Tabla 3. Secuencias de cebadores para pruebas en SYBRGreen y ensayos de sondas TaqMan™ para los genes objetivo.
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*pb: Pares de bases En la tabla 3 se presentan las secuencias de cebadores para uso en SYBRGreen e identificación de los ensayos de sondas para uso en TaqMan de los 11 genes seleccionados. S: partidor sentido; A: partidor antisentido.
Se proporciona un gráfico (figura 2) que muestra la expresión diferencial entre muestras de biopsia por aspiración con aguja fina (PAAF) metastásica (62) y no metastásica (97) de 10 genes según lo determinado por PCR en tiempo real cuantitativo y analizado por el modelo de cuantificación relativa de Pfaffl. Para calcular la expresión génica de cada muestra, el objetivo se normalizó con 2 genes de referencia. El valor cero corresponde a la expresión génica de tumores tiroideos sin metástasis y las barras corresponden a la variación de la expresión génica en muestras de cáncer metastásicas (veces relativas de cambio). Los resultados de la expresión génica de los 11 genes analizados mediante Pfaffl’s indican que 6 genes (VEGFC, m¡R-16, miR-146, miR-155, m¡R-181d, RNLI6B) fueron significativamente sobreexpresados (p<0,05), mientras que 1 gen (CTLA4) disminuyó su expresión significativamente en comparación con el CPT no metastásico (p<0,05) (figura 2).
Ejemplo 2: Diseño y desarrollo de un Modelo clasificador de metástasis tiroideo para ensayo diagnóstico/pronóstico
Con el objetivo de identificar un panel de genes expresados diferencialmente, se desarrolló un modelo de aprendizaje automático de acuerdo con el algoritmo de análisis de redes neuronales (NN) (paquete Keras, una biblioteca estadística y una biblioteca de redes neuronales de código abierto; https: //cran.r-project.org/web/packages/keras/index.html), utilizando el software R v3.3.1. (Figura 3)
La predicción se realizó a partir de 81 muestras PAAF para la etapa de entrenamiento y 78 muestras PAAF para la etapa de validación. Previamente, para optimizar el rendimiento del clasificador, las variables de entrada o predictoras (expresión génica) se evaluaron mediante un análisis de componentes principales (PCA; paquete kernlab; https://cran.r- project.org/web/packages/kernlab/index.html). Esta técnica permite reducir toda la dimensionalidad de los datos, encontrar las causas de la variabilidad y definir patrones predominantes en un conjunto de datos. Particularmente, en la figura 4, se presenta un gráfico que muestra los primeros 11 componentes principales que explican el 99,3% de la varianza entre las variables.
Luego se realizó un segundo procesamiento de datos en el cual se utilizó un algoritmo denominado Red neuronal de perceptron multicapa (MLP, por sus siglas en inglés “Multilayer perceptron Neural Network”) y con ello se construyó el modelo predictivo (figura 3). La construcción del modelo de predicción final se realizó siguiendo el método de entrenamiento y validación cruzada de los perceptores con combinaciones diferentes de hiperparámetros. Los hiperparámetros considerados fueron época, tasas de aprendizaje, abandonos, rho y épsilon. De todos los datos aleatorios, utilizamos el 50% para la etapa de entrenamiento y el 50% para la validación cruzada al utilizar la técnica de cuantificación de expresión génica de SYBRGreen. Al utilizar la técnica de cuantificación de expresión génica TaqMan, utilizamos en 70% de los datos para la etapa de entrenamiento y el 30% para la etapa de validación cruzada. Se eligió la mejor red con una exactitud > 0,80 para la cohorte de entrenamiento y de validación cruzada.
Para validar la eficacia diagnóstica de la firma genética en la clasificación de los casos con cáncer de tiroides metastásico y no metastásico, se elaboró la curva de características operativas de receptor (ROC) con los puntajes de salida obtenidos del análisis realizado con el algoritmo MLP, utilizando el paquete ROCR R, http://rocr.bioinf.mpi-sb.mpg.de/. Este método se utilizó tanto para los datos obtenidos mediante la técnica de detección SYBRGreen (qPCR-SYBRGreen) como para los obtenidos por la técnica TaqMan (qPCR-TaqMan).
Finalmente, para obtener el método de predicción, los puntajes de los datos de salida obtenidos del análisis con el algoritmo MLP se clasificaron para la evaluación de la eficacia diagnóstica del Clasificador Metastásico Tiroideo (CMT).
En primera instancia, se comparó el potencial poder de clasificación de la expresión génica de los marcadores en forma individual en muestras de PAAF con cáncer de tiroides metastásico y no metastásico, mediante la elaboración de curvas ROC. Para cada gen individual, las curvas ROC se elaboraron a partir de los valores de CT. En la tabla 4, se presenta el área bajo la curva (AUC, del inglés area under curve) para cada gen como resultado de la eficacia diagnóstica individual. El rendimiento diagnóstico de cada gen se muestra en esta tabla y se observa que ninguno de los genes evaluados de manera individual alcanzó el rendimiento mínimo requerido para clasificar el cáncer de tiroides metastásico de los casos no metastásicos. Sin embargo, VEGFC mostró el mayor cambio relativo de la expresión génica y el mejor rendimiento diagnóstico (AUC> 0,70).
Tabla 4. Rendimiento diagnóstico individual de los 11 genes seleccionados mediante la técnica qPCR-SYBRGreen.
Figure imgf000037_0001
*AUC: área bajo la curva.
Para comprobar que el potencial diagnóstico no es por mera combinación aditiva de factores de expresión de los marcadores o por una relación lineal entre las variables de entrada o predictoras, se evaluó la eficacia diagnóstica de la expresión de los 5 genes que presentaron valores de AUC individual mayor a 0,60, mediante el análisis lineal discriminante (ALD). La figura 5 muestra que las AUC obtenidas para la cohorte de entrenamiento es de 0,69 y para la de validación, de 0,62.
En la tabla 5, se presentan los datos que representan la eficacia diagnóstica que se determinaron a partir de los resultados de clasificación obtenidos mediante ALD de la expresión de los 5 genes con mayor AUC individual. En la cohorte de entrenamiento, la eficacia diagnóstica del clasificador alcanzó un AUC de 0,69 (Cl 0,56 - 0,84), una sensibilidad del 65% (Cl 43 - 84), y una especificidad del 69% (Cl 52 - 84). El VPP y el VPN fueron del 58% (Cl 41 - 74%) y del 76% (Cl 60 - 87%), respectivamente. En la cohorte de validación estadística, se obtuvo un AUC de 0,63 (Cl 0,48 - 0,77), una sensibilidad del 50% (Cl 70 - 96%), y una especificidad del 62% (Cl 45 - 77%). El VPP y el VPN fueron 47% (Cl 30 - 65%) y 65% (Cl 49 - 79%), respectivamente.
Tabla 5. Eficacia estadística de clasificación de los 5 genes con valores de AUC individual más altos (AUC >0,60) evaluados mediante análisis lineal discriminante.
Figure imgf000038_0001
AUC: Área bajo la curva; PAAF: punción aspirativa por aguja fina; IC: ntervalo de confianza En conjunto, estos datos muestran una mala capacidad diagnóstica y predicción para metástasis linfonodal en muestras de PAAF de pacientes con cáncer papilar de tiroides al combinar y adicionar factores de expresión génica de manera lineal. Esto se explica debido a que los métodos de análisis de regresión lineal, como ALD, son sensibles a los fenómenos de colinealidad que se pueden dar entre las variables de entrada o predictoras, es decir, que una variable predictora puede ser predicha en gran medida a partir de otra variable predictora.
Este fenómeno se puede observar en los datos entregados por la tabla 6 y figura 6, donde la expresión génica de los marcadores CTLA4, VEGFC, m¡R-146b, m¡R-188d y RNU6B (variables predictoras de metástasis linfonodal) presentan una correlación lineal significativa entre ellos. Tabla 6. Asociación entre la expresión de los 5 genes con valores de AUC individual más altos (AUC >0,60). Análisis de correlación entre los valores de expresión de los genes que presentaron mayor AUC de manera independiente. Datos analizados mediante la prueba de coeficiente de correlación de Spearman.
Figure imgf000039_0001
En la figura 7, se presenta el AUC en donde el clasificador desarrollado en qPCR-SYBRGreen utilizó 11 genes que fueron integrados por la red neuronal. En esta figura es posible observar que el clasificador en la cohorte de entrenamiento alcanza un AUC de 0,82, mientras que en la cohorte de validación alcanza un AUC de 0,84. En la tabla 7, se presentan los datos obtenidos de las muestras que fueron evaluadas mediante el método de qPCR-SYBRGreen. En la cohorte de entrenamiento, la eficacia diagnóstica del clasificador alcanzó un AUC de 0,82 (Cl 0,73 - 0,92), una sensibilidad del 79% (Cl 61 - 92), y una especificidad del 76% (Cl 61 - 88). El VPP y el VPN fueron del 70% (Cl 56 - 80%) y del 85% (Cl 73 - 92%), respectivamente. En la cohorte de validación estadística, el clasificador reprodujo su rendimiento, mostrando un AUC de 0,84 (Cl 0,76 - 0,95), una sensibilidad del 72% (Cl 70 - 96%), y una especificidad del 87% (Cl 61-88%). El VPP y el VPN fueron 79% (Cl 59-90%) y 82% (Cl 69-90%), respectivamente. Tabla 7. Eficacia estadística del Clasificador Metastásico Tiroideo desarrollado con la técnica qPCR-SYBRGreen.
Figure imgf000040_0001
AUC: Área bajo la curva, PAAF: punción aspirativa por aguja fina, IC: intervalo de confianza. Para observar la eficacia diagnóstica del clasificador de predicción de cáncer papilar de tiroides en muestras PAAF desarrollado en qPCR-SYBRGreen, se gráfico el puntaje obtenido en la etapa de entrenamiento y en la etapa de validación para cada una de las muestras. El punto de corte para clasificar las muestras como metastásicas (M-PTC) o no metastásicas (NM-PTC) fue de 0,20. Estos datos pueden ser observados en la figura 8. Los valores predictivos positivos y negativos del Clasificador de predicción de cáncer papilar de tiroides para las muestras evaluadas mediante la técnica qPCR-SYBRGreen fueron estimados según el Teorema de Bayes (figura 9). Se espera que el clasificador alcance un valor predictivo positivo de 60-79% y un valor predictivo negativo de 94-82% en un rango de prevalencia de metástasis en los ganglios linfáticos de 25-40%. En la figura 10, se presenta el área bajo la curva en donde el clasificador desarrollado en qPCR-TaqMan utilizó 11 genes que fueron desarrollados por la red neuronal. En esta figura es posible observar que el clasificador en la etapa de entrenamiento alcanza un AUC de 0,92, mientras que en la etapa de validación alcanza un AUC de 0,87. En la tabla 8, se presentan los datos obtenidos del Clasificador Metastásico Tiroideo en muestras PAAF que fueron evaluadas mediante el método de qPCR-TaqMan. En la cohorte de entrenamiento, la eficacia diagnóstica del clasificador alcanzó un AUC de 0,92 (Cl 0,91 - 0,93), una sensibilidad del 80% (Cl 63 - 92), y una especificidad del 84% (Cl 70- 92). El VPP y el VPN fueron 76% (Cl 58 - 88%) y 87% (Cl 75 - 86%), respectivamente. En el conjunto de validación, el clasificador reprodujo su rendimiento, mostrando un AUC de 0,87 (Cl 0,85 - 0,91), una sensibilidad del 73% (Cl 69 - 90%), y una especificidad del 81% (Cl 78-93%). El VPP y el VPN fueron del 71% (Cl 52-76%) y del 80% (Cl 55-93%), respectivamente. Tabla 8. Eficacia estadística del Clasificador Metastásico Tiroideo desarrollado con la técnica qPCR-TaqMan.
Figure imgf000041_0001
AUC: Área bajo la curva, PAAF: punción aspirativa por aguja fina, IC: intervalo de confianza.
Para observar la eficacia diagnóstica del clasificador de predicción de cáncer papilar de tiroides en muestras PAAF desarrollado en qPCR-TaqMan, se gráfico el puntaje obtenido en la etapa de entrenamiento y de validación para cada una de las muestras. El punto de corte para clasificar las muestras como metastásicas (M-PTC) o no metastásicas (NM-PTC) fue de 0,47. Estos datos pueden ser observados en la figura 11 . Los valores predictivos positivos y negativos del Clasificador Metastásico Tiroideo para las muestras PAAF evaluadas mediante la técnica qPCR-TaqMan fueron estimados según el Teorema de Bayes (figura 12). Se espera que el clasificador alcance un valor predictivo positivo de 60-79% y un valor predictivo negativo de 90-79% en un rango de prevalencia de metástasis en los ganglios linfáticos de 25-40%.
Los resultados de los criterios que determinan la eficacia diagnóstica obtenida mediante las técnicas qPCR-SYBRGreen y qPCR-TaqMan, son comparables e incluso muestran mayor poder de clasificación al utilizar la técnica qPCR-TaqMan. Estos resultados indican que el clasificador de predicción para cáncer papilar de tiroides desarrollado en formato qPCR- TaqMan en configuración multiplex es robusto y predice con altos estándares de eficacia diagnóstica la metástasis linfonodal en muestras de PAAF de forma prequirúrgica.
Análisis estadístico
Para las biopsias de tejido y PAAF, la expresión génica se analizó por el método de Pfaffl. La sensibilidad, especificidad y área bajo la curva (AUC) se estimaron mediante curvas características operativas del receptor (ROC). Los valores predictivos positivos y negativos fueron estimados por el Teorema de Bayes. Los análisis de asociación entre las variables de entrada o predictoras se realizaron con la prueba de coeficiente de correlación de Spearman. Las pruebas de comparación múltiple se realizaron utilizando la prueba de rango de Tukey. La expresión diferencial significativa fue estimada por la prueba de los rangos por signo de Wilcoxon. Se consideró que los valores p de dos colas de menos de 0,05 indican significación estadística. Los datos recopilados se organizaron en Microsoft Office Excel 365, los gráficos se elaboraron con el software estadístico GraphPad v7.0 (GraphPad Software, Inc.) y todo el análisis estadístico se realizó con el software SPSS v23.0 (IBM).
Bibliografía
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Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto CARACTERIZADO porque dicho método comprende:
(a) obtener una muestra de tejido tiroideo del sujeto;
(b) determinar el nivel de expresión de productos génicos en una muestra de tejido tiroideo obtenida del sujeto, donde al menos uno o más de los productos génicos son expresados por al menos uno o más de los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNU6B y RET; c) identificar la muestra de tejido de tiroides como cancerosa metastásica y cancerosa no metastásica, correlacionando los niveles de expresión de los genes determinados en (b) con la presencia o ausencia de metástasis linfonodal en la muestra de tejido previamente diagnosticado con cáncer de tiroides, en donde la correlación se realiza usando los datos de la expresión de los genes indicados en (b) a partir de una pluralidad de muestras de tejido canceroso metastásico y tejido canceroso no metastásico; d) identificar la muestra de tejido tiroideo canceroso como metastásico o no metastásico con: Una sensibilidad mayor o igual al 69% o mayor o igual al 90%;
Una especificidad mayor o igual al 78% o mayor o igual al 93%;
Un valor predictivo positivo mayor o igual al 52% o mayor o igual al 76%;
Un valor predictivo negativo mayor o igual al 55% o mayor o igual al 93%;
Una razón de probabilidad positiva mayor o igual a 2 o mayor o igual a 12;
Una probabilidad post-prueba positiva mayor o igual al 58% o mayor o igual al 90%
Una razón de probabilidad negativa mayor o igual a 0,19 o mayor o igual a 0,58; y Una probabilidad post-prueba negativa mayor o igual a 9% o mayor o igual 32%; y e) extirpar quirúrgicamente el tumor completo del sujeto con disección cervical de los ganglios linfáticos o sólo una remoción completa del tumor o una porción del mismo si este tejido tiroideo canceroso es identificado como metastásico.
2. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque la correlación descrita en c) comprende la comparación de los niveles de expresión de los genes indicados en b) con una (i) pluralidad de muestras de tejido de tiroides canceroso no metastásico y (¡i) una pluralidad de muestras de tejido canceroso metastásico.
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3. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 CARACTERIZADO porque la muestra de tejido de tiroides canceroso se identifica como metastásico si existen niveles de expresión diferentes en los productos génicos de la muestra de tejido tiroideo canceroso y los datos de expresión génica de (i) o si no existen diferencias significativas en los niveles de expresión de los productos génicos entre la muestra de tejido de tiroides canceroso y los datos de expresión génica de (¡i).
4. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 3 CARACTERIZADO porque la muestra de tejido tiroideo canceroso se identifica como metastásico con:
Una sensibilidad mayor o igual al 69% o mayor o igual al 90%;
Una especificidad mayor o igual al 78% o mayor o igual al 93%;
Un valor predictivo positivo mayor o igual al 52% o mayor o igual al 76%;
Un valor predictivo negativo mayor o igual al 55% o mayor o igual al 93%;
Una razón de probabilidad positiva mayor o igual a 2 o mayor o igual a 12;
Una probabilidad post-prueba positiva mayor o igual al 58% o mayor o igual al 90% Una razón de probabilidad negativa mayor o igual a 0,19 o mayor o igual a 0,58; y Una probabilidad post-prueba negativa mayor o igual a 9% o mayor o igual al 32%.
5. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto CARACTERIZADO porque dicho método comprende:
(a) obtener una muestra de tejido tiroideo del sujeto,
(b) determinar el nivel de expresión de productos génicos en una muestra de tejido tiroideo canceroso obtenida del sujeto, donde al menos uno o más de los productos génicos son expresados por uno o más de los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R- 146b, miR-155, m¡R-181 d, RNU6B y RET, c) identificar metástasis linfonodal en el sujeto previamente diagnosticado con cáncer papilar de tiroides, utilizando un algoritmo de clasificación entrenado para clasificar muestras de tejido tiroideo canceroso basado en la integración de los datos de expresión de dichos productos génicos en dos grupos identificados como:
(i) los datos de expresión génica de cada muestra de tejido tiroideo canceroso son preprocesados, en donde se generan razones entre los niveles de expresión génica de los productos génicos en el paso (b) y los niveles de expresión génica de productos génicos de
45 referencia, se genera la expansión de cada una de las variables y se reducen las dimensiones de dichas variables; y d) en donde,
(i) los datos preprocesados para cada muestra de tejido tiroideo canceroso mencionados en el paso (c)(¡) son integrados en un algoritmo clasificador para clasificar la muestra como metastásica o no metastásica; en donde el algoritmo se entrenó con los niveles de expresión preprocesados de dichos productos génicos en una pluralidad de muestras conocidas con y sin metástasis linfonodal; en donde el método comprende además la extirpación quirúrgica completa del tumor del sujeto con disección cervical de los ganglios linfáticos o sólo una remoción completa del tumor o una porción del mismo.
6. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 5 CARACTERIZADO porque el puntaje de salida de clasificación que otorga el algoritmo a las muestras de tejido a analizar en los pasos (c)(¡) y (d)(¡) se clasifican de acuerdo con el valor de corte de clasificación, mayor o igual a 0,47, para informar la probabilidad de metástasis o no metástasis en tejido de tiroides canceroso de un sujeto.
7. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidad y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 CARACTERIZADO porque el algoritmo clasificador comprende un análisis de red neuronal con perceptron multicapa.
8. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 CARACTERIZADO porque las muestras de tejido tiroideo son obtenidas por aspiración por aguja, aspiración por aguja fina, biopsia con aguja gruesa, biopsia asistida por vacío, biopsia de núcleo grande, biopsia por incisión, biopsia por escisión o biopsia por punción con sacabocado.
9. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a ARN.
10. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a ARN, donde ARN es mARN, rARN, tARN o miARN.
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11. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 10 CARACTERIZADO porque comprende la determinación de los niveles de expresión de ARN mediante técnicas de microarreglos, análisis serial de la expresión génica (SAGE), técnicas de transferencia, PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, PCR semicuantitativa, técnicas de codificación de barras moleculares, análisis de transcripción con ayuda de captura de afinidad (TRAC), arreglos de PCR, PCR cuantitativa en configuración múltiple o ensayo cuantitativo de protección de nucleasas (qNPA).
12. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a proteínas.
13. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque comprende la determinación de la expresión de proteínas de los productos génicos mediante técnicas de ELISA, espectrofotometría de masas, técnicas de transferencia, técnicas de proteómica o inmunohistoquímica.
14. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 CARACTERIZADO porque comprende realizar adicionalmente un análisis ortológico en una muestra de tejido tiroideo extraída de un sujeto en el paso (a) para obtener un diagnóstico preliminar.
15. Método in vitro para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14 CARACTERIZADO porque las muestras con diagnostico preliminar canceroso se analizan adicionalmente mediante los pasos (b) y (c).
16. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto CARACTERIZADO porque comprende uno o más reactivos para la detección de uno o más productos génicos, donde los productos génicos son expresados por uno o más genes correspondientes a PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R- 181d, RNU6B y RET.
17. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 16 CARACTERIZADO por que los reactivos corresponden a anticuerpos, donde cada anticuerpo se une específicamente a un producto génico de poli péptidos o proteínas.
18. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 16 y 17 CARACTERIZADO porque los reactivos corresponden a oligonucleótidos o un conjunto de oligonucleótidos los cuales se unen específicamente a un producto génico de ácido nucleico.
19. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 18 CARACTERIZADO porque el kit comprende reactivos para realizar ensayo de PCR.
20. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 18 y 19 CARACTERIZADO porque los reactivos comprenden agentes adicionales que se seleccionan del grupo de una polimerasa termoestable, una mezcla de desoxinucleotidos y una sonda marcada detecta ble mente.
21. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 18 a 20 CARACTERIZADO porque la sonda marcada detectable mente comprende un fluoróforo.
22. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 16 a 21 CARACTERIZADO porque los reactivos están unidos cada uno a un sustrato, particularmente unidos de manera covalente.
23. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 16 a 22 CARACTERIZADO porque los reactivos están unidos a diferentes regiones de una matriz sólida, particularmente una micromatriz.
24. Kit para para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 16 a 23 CARACTERIZADO porque determina los niveles de expresión de uno o más productos génicos expresados por los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181 d, RNU6B y RET.
25. Kit para para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 24 CARACTERIZADO porque la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes permite identificar la presencia o ausencia de cáncer en la muestra de tejido de tiroides.
26. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 24 y 25 CARACTERIZADO porque los niveles de expresión de uno o más genes identificados en una muestra de tejido de tiroides se asocian comparando el nivel de expresión con un control normal de cada producto génico.
27. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 24 a 26 CARACTERIZADO porque la muestra de tejido tiroideo se identifica como canceroso si se presenta una diferencia en los niveles de expresión de uno o más genes con respecto a los niveles de expresión de uno o más genes de las muestras utilizadas como control.
28. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 24 a 27 CARACTERIZADO porque la identificación de tejido canceroso comprende comparar niveles de expresión de uno o más productos génicos en dos conjuntos de muestras biológicas: i) múltiples muestras de tejido tiroideo normal y;
¡i) múltiples muestras de tejido canceroso donde si existen diferencias entre los niveles de expresión de uno o más productos génicos descritos en (i) y (¡i) la muestra se considera cancerosa.
29. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 28 CARACTERIZADO porque el producto génico corresponde a ADN, ARN o proteínas.
30. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 29 CARACTERIZADO porque el producto génico de ARN corresponde a ARNm.
31. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo a la reivindicación 30 CARACTERIZADO porque la cuantificación de los niveles de expresión de ARNm de uno o más de los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-
49 146b, miR-155, m¡R-181d, RNLI6B y RET se realiza mediante técnicas de microarreglos, análisis serial de la expresión génica (SAGE), técnicas de transferencia, PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, PCR se mi cuantitativa, técnicas de codificación de barras moleculares, análisis de transcripción con ayuda de captura de afinidad (TRAC), arreglos de PCR, PCR cuantitativa en configuración múltiple o ensayo cuantitativo de protección de nucleasas (qNPA).
32. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 28 CARACTERIZADO porque el producto génico corresponde a poli péptidos o proteínas.
33. Kit para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto de acuerdo a la reivindicación 32 CARACTERIZADO porque la cuantificación de los niveles de expresión de las proteínas de al menos uno o más genes de los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181d, RNLI6B y RET se realiza mediante técnicas de ELISA, espectrofotometría de masas, técnicas de transferencia, técnicas de proteómica o inmunohistoquímica.
34. Reactivos para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto CARACTERIZADO porque detectan los niveles de expresión de uno o más productos génicos correspondientes a los genes PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR- 155, m¡R-181d, RNLI6B y RET en una muestra de tejido tiroideo.
35. Reactivos para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 34 CARACTERIZADO porque permiten la identificación de los niveles de expresión de uno o más genes en una muestra de tejido tiroideo, en donde los reactivos comprenden: i) anticuerpos de unión específica a uno o más productos génicos; o
¡i) oligonucleótidos o conjunto de oligonucleótidos que se unen específicamente a ácidos nucleicos de uno o más productos génicos.
36. Reactivos para el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 34 y 35 CARACTERIZADO porque comprenden: i) uno o más reactivos para procesar una muestra de tejido tiroideo; o ¡i) uno o más productos génicos de control.
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37. Uso de los reactivos según las reivindicaciones 34 a 36 CARACTERIZADO porque sirven en el diagnóstico y predicción de la agresividad de cáncer de tiroides y las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto.
38. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto CARACTERIZADO porque comprende a) amplificar y detectar usando un procedimiento de biología molecular tal como PCR y ELISA, utilizando uno o más de los marcadores PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R- 146b, miR-155, m¡R-181 d, RNU6B y RET; b) cuantificar la sobreexpresión o baja expresión de uno o más de los marcadores PTEN, BRAF, CD80, CTLA4, VEGFC, m¡R-16, m¡R-146b, miR-155, m¡R-181 d, RNU6B y RET; y c) correlacionar la cuantificación de la sobreexpresión o baja expresión obtenida con la predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto,
(i) en donde se identifica la muestra de tejido tiroideo canceroso como metastásico o no metastásico con:
Una sensibilidad mayor o igual al 69% o mayor o igual al 90%;
Una especificidad mayor o igual al 78% o mayor o igual al 93%;
Un valor predictivo positivo mayor o igual al 52% o mayor o igual al 76%;
Un valor predictivo negativo mayor o igual al 55% o mayor o igual al 93%;
Una razón de probabilidad positiva mayor o igual a 2 o mayor o igual a 12;
Una probabilidad post-prueba positiva mayor o igual al 58% o mayor o igual al 90%
Una razón de probabilidad negativa mayor o igual a 0,19 o mayor o igual a 0,58; y Una probabilidad post-prueba negativa mayor o igual a 9% o mayor o igual al 32%.
(¡i) en donde, los resultados del método comprenden además la extirpación quirúrgica completa del tumor del sujeto con disección cervical de los ganglios linfáticos o sólo una remoción completa del tumor o una porción del mismo.
39. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 38 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a ácidos nucleicos.
40. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 39 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a ARN, donde ARN es mARN, rARN, tARN o miARN.
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41. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según las reivindicaciones 39 a 40 CARACTERIZADO porque comprende la determinación de los niveles de expresión de ARN mediante técnicas de microarreglos, análisis serial de la expresión génica (SAGE), técnicas de transferencia, PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, PCR semicuantitativa, técnicas de codificación de barras moleculares, análisis de transcripción con ayuda de captura de afinidad (TRAC), arreglos de PCR, PCR cuantitativa en configuración múltiple o ensayo cuantitativo de protección de nucleasas (qNPA).
42. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 38 CARACTERIZADO porque los productos génicos en análisis corresponden a proteínas.
43. Uso de los marcadores de predicción de la agresividad del cáncer de tiroides y de las posibilidades y tipo de cirugía de precisión para la remoción del tumor en un sujeto según la reivindicación 42 CARACTERIZADO porque comprende la determinación de la expresión de proteínas de los productos génicos mediante técnicas de ELISA, espectrofotometría de masas, técnicas de transferencia, técnicas de proteómica o inmunohistoquímica.
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