JP2010022236A - 甲状腺癌の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】甲状腺癌におけるゲノム構造の変化を指標として、甲状腺癌の悪性度を含めて検出する手段を提供すること。
【解決手段】甲状腺癌におけるゲノム構造の変化を指標として甲状腺癌の悪性度を含めた検出を可能にすることを見出した。また、本発明は、甲状腺癌において、遺伝子の発現を抑制することにより、甲状腺癌の増殖を抑制することも見出した。
【選択図】なし

Description

本発明は、検体において、特定の染色体領域に存在する遺伝子の変化を検出することを含む癌の検出方法に関する。

未分化甲状腺癌（以下ＡＴＣ）は甲状腺癌の２〜５％を占めており、極めて悪性度の高い癌のひとつである。高分化型の甲状腺癌（ＷＤＴＣ）、すなわち甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、濾胞性甲状腺癌が、良好な予後を示すのに対し、ＡＴＣは極めて予後の悪い固形癌として位置づけられており、平均生存期間は４〜１２ヶ月と言われている。ＡＴＣはいくつかの遺伝子異常がＷＤＴＣと共通していることが知られている（ＲＡＳ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子のポイントミューテーションや、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のポイントミューテーションまたは遺伝子増幅など）。一方、ＷＤＴＣにおいてＴＰ５３遺伝子の変異は稀だが、ＡＴＣにおいては、７０％以上においてＴＰ５３遺伝子が変異していることが知られている。ＡＴＣはＷＤＴＣとの組織学的な関連から、ＡＴＣはＷＤＴＣを前段階として発生しているといわれているが、新規（de novo）に発生するものもあり、悪性度に対する分子機序はほとんど解明されていないのが現状である。

最近のがん遺伝子に対する分子標的治療法の進歩により、ＡＴＣの遺伝子の変異領域を詳細に明らかにすることが、有効な治療法の開発につながると考えている。
増幅やホモ欠失といった遺伝子のコピー数変化は、癌化の原因となるがん遺伝子やがん抑制遺伝子を同定する上での有用な目印となる。

本発明者らはこれまでのハイスループットのａｒｒａｙＣＧＨ法を用い、さまざまながんの細胞株を解析することで、癌化につながる新規な遺伝子の同定を成し遂げてきた。ＡＴＣに対して、ハイスループットのアレイのひとつであるＭＣＧ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ８００（非特許文献１）を用いた解析を行い、新規なマーカー遺伝子となるＤＵＳＰ２６遺伝子を見出した。しかしながら、ＡＴＣの分子機構の解明は未だ不十分であり、更なる解析が求められていた。

Yu et al., Oncogene 26,1178-1187,2007

甲状腺の腫瘍のなかで特に予後の悪いＡＴＣの癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける甲状腺由来細胞の癌化の早期発見や、甲状腺癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、未分化甲状腺癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、甲状腺癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する４５００種類のＢＡＣ／ＰＡＣ ＤＮＡを選別する（ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ‐４５００；Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５，５５９−５６３，２００４）ことにより、甲状腺がんで変化する特徴的な１３の染色体領域（１ｑ４１、３ｑ２８，７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１）を明らかにし、とくに癌化に関連する遺伝子として、９つの遺伝子（ＩＴＣＨ遺伝子、ＡＨＣＹ遺伝子、ＤＹＮＬＲＢ１遺伝子、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ遺伝子、ＰＩＧＵ遺伝子、ＴＰ５３ＩＰＮ２遺伝子、ＮＣＯＡ６遺伝子、ＨＭＧ４Ｌ遺伝子、ＡＳＩＰ１遺伝子）を甲状腺由来の細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子として見出し、マーカーとして特に好ましい遺伝子として、ＩＴＣＨ（ｉｔｃｈｙ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ）遺伝子を含む２０ｑ１１の新しいコピー数異常の同定に成功した。またＡＴＣを含む原発性甲状腺癌のＩＴＣＨタンパク質の過剰発現を、免疫組織化学的解析により明確にした。そして、ＩＴＣＨタンパク質の増加がＡＴＣ細胞の増殖を顕著に促進すること、また、ＩＴＣＨ遺伝子の転写産物を抑制するとＡＴＣ細胞の増殖が著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。

即ち、本発明によれば、検体において、１ｑ４１、３ｑ２８、７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の変化の少なくとも１つ以上を検出することにより癌化を検出することを含む、癌の検出方法が提供される。

好ましくは、１ｑ４１、３ｑ２８、７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅、及び／又は９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の欠失の少なくとも１つ以上を検出する。

好ましくは、検体において２０ｑ１１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅を検出する。
好ましくは、前記遺伝子はＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上である。
好ましくは、増幅の指標は、正常検体と比較して１．３２倍以上である。
好ましくは、遺伝子はＩＴＣＨ遺伝子である。

好ましくは、検体は、甲状腺由来の組織である。
好ましくは、癌は、甲状腺癌である。
好ましくは、遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。

本発明によればさらに、検体において、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法が提供される。
好ましくは、蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する。
好ましくは、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。

本発明によればさらに、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。

本発明によればさらに、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。

本発明によればさらに、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。

本発明によればさらに、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。

本発明により、甲状腺由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、甲状腺癌において、遺伝子発現を不活性化する本発明の遺伝子の転写産物を導入することにより、甲状腺癌、特に未分化甲状腺癌の増殖を抑制することができる。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、１ｑ４１、３ｑ２８、７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の変化の少なくとも１つ以上を検出することを特徴とする。好ましくは、検出される遺伝子は、ＩＴＣＨ遺伝子である。

ＩＴＣＨ遺伝子（ｉｔｃｈｙ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ）はＡＩＰ４（ａｔｒｏｐｈｉｎ−１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ４）とも呼ばれており、Ｅ３Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅｓであるＮｅｄｄ４−ｌｉｋｅタンパク質ファミリーに属する。Ｎ末端側には、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−Ｃに関連するＣ２領域が、Ｃ末端部には、４つのＷＷ領域と、ＨＥＣＴ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅ６−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ） ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ領域が含まれる構造を有している。Ｉｔｃｈ遺伝子（Ｉｔｃｈｙ）のないマウスは、皮膚の定常的なそう痒、重篤な炎症、免疫不全を伴う致死的な症状を呈する。Ｎｅｄｄ４−ｌｉｋｅ Ｅ３は食道扁平上皮癌、乳がん、前立腺癌、膵臓癌の発癌に対し重要な役割を演じているといわれている。しかしながらＩＴＣＨ遺伝子と癌の関係を示す報告はほとんどなされていない。

上述したように、本検出方法は、甲状腺由来の細胞や甲状腺癌における本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異を検出することを特徴とする方法である。
本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異を検出する対象となる甲状腺由来の細胞や甲状腺癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。

この検体組織細胞は、健常人の甲状腺に由来する細胞か、甲状腺癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または甲状腺癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある甲状腺癌の組織、等が主な対象となり得る。

本検出方法により、「検査等の結果、甲状腺に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」における本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或るいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「甲状腺癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある甲状腺癌の組織」における本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された甲状腺癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或るいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。

本検出方法は、上述したように、甲状腺由来の細胞、および甲状腺癌細胞における本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異を検出することにより、当該細胞の腫瘍化の検出、分類をおこなうことが可能である。

次に、本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異の検出について説明する。
本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の増幅や欠失の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異を検出することができる。

上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。

通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。

このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。

上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。

乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。

このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。

また、この本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の変異を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。また、この本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてＰＣＲ法も用いることができる。被検検体よりゲノムＤＮＡを分離して当該遺伝子の全部、または一部を増幅することが可能なプライマーを用いて増幅後、定量をおこなうことにより検出することが可能である。

本発明において、１ｑ４１、３ｑ２８，７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することが可能である。

変異の検出において、１ｑ４１、３ｑ２８，７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、の染色体領域においては、増幅を検出することが好ましく、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１においては、欠失を検出することが好ましい。

検体において２０ｑ１１領域の遺伝子増幅を指標とすることがより好ましく、２０ｑ１１領域の遺伝子として、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、ＡＳＩＰ１の少なくとも１つ以上の変異を検出して、検体の悪性度を含めた癌化を検出することがより好ましい。

また、増幅の指標として、正常検体と比較して１．３２倍以上である、ことがこのましい。

ＩＴＣＨ遺伝子の遺伝子増幅を指標とすることが特に好ましい。
さらに検体が、甲状腺由来の組織であることが好ましく、甲状腺癌であることがより好ましい。

具体的には、１ｑ４１の染色体領域の変異を検出する方法としては、ＢＡＣ−ＤＮＡとして、ＲＰ１１−１２４Ａ１１、ＲＰ１１−５Ｆ１９、ＲＰ１１−７９Ｈ５、ＲＰ１１−４５Ｌ２１、ＲＰ１１−６６Ｍ７ 等を用いることが好ましく、３ｑ２８の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−５４Ｌ９、ＲＰ１１−４５５Ｃ２２、ＲＰ１１−８８Ｈ６等を用いることが好ましく、７ｑ３１．２の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−５１Ｍ２２等を用いることが好ましく、８ｐ１２の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−４５１Ｏ１８ 、ＲＰ１１−２５８Ｍ１５ 、ＲＰ１１−９１Ｐ１３等を用いることが好ましく、８ｑ２２．２の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−１４２Ｆ２２等を用いることが好ましく、８ｑ２４．２１の染色体領域の変異を検出する方法としては、ＲＰ１１−８９Ｋ１０、ＲＰ１１−８９Ｌ１６等を用いることが好ましく、１１ｑ１４．１の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−９１Ｍ１０等を用いることが好ましく、１７ｑ１２の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−１９Ｇ２４等を用いることが好ましく２０ｑ１１の染色体領域の変異を検出する方法としては、ＲＰ１１−３１８Ｎ１等を用いることが好ましい。

また９ｐ２１．３の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−１１３Ｄ１９ ＲＰ１１−３４４Ａ７、ＲＰ１１−４０８Ｎ１４、ＲＰ１１−４４１Ｉ５、ＲＰ１１−１１Ｊ１、ＲＰ１１−７８２Ｋ２、ＲＰ１１−３４６Ｎ２３、ＲＰ１１−３３Ｏ１５、ＲＰ１１−４８２Ｉ１０等を用いることが好ましく、１６ｑ１３．２の染色体領域の変異を検出する方法としては、ＲＰ１１−１８５Ｊ２０等を用いることが好ましく、１６ｑ２３．１の染色体領域の変異を検出する方法としてはＲＰ１１−６１Ｌ１等を用いることが好ましい。

また、もっとも好ましいマーカ遺伝子であるＩＴＣＨ遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとして、ＲＰ１１−３１８Ｎ１等を上げることができる。

本発明の複数の遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は公知の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により公知の塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、当該塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲをおこなう。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。

本発明の染色体領域および本発明の複数の遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じておこなうことができる。

（２）細胞増殖の抑制方法及び細胞増殖抑制剤。
本発明によれば、 ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖抑制剤が提供される。

ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子）の発現を抑制することができる。

本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。

ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。

ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。

本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。

ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。

上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。

本発明で用いるＲＮＡｉによりＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。

上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖抑制剤として有用である。本発明の細胞増殖抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。 薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。

さらに、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。

本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。

本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。

なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定して標的を阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。

本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

さらに本発明では、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。

機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。

上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。

機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。

機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。

また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。

本発明の細胞増殖抑制剤は、抗腫瘍剤として有用である。本明細書でいう「抗腫瘍」とは、腫瘍の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに腫瘍細胞の増殖を抑制したり、腫瘍を縮小することによって腫瘍の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。

本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、甲状腺癌である。

（３）細胞増殖の活性化方法および細胞増殖活性化剤
本発明によればさらに、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖活性化剤が提供される。

ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。

ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２^nd Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。

ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。

動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。

上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。

得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。

また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。

本発明の細胞増殖活性化剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。

有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。

本発明の細胞増殖活性化剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖活性化剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。

本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。

（４）ＩＴＣＨ遺伝子を用いた腫瘍の検出方法
本発明の細胞増殖抑制（抗腫瘍剤）の適用対象となる腫瘍を選別するための検出方法は、ＩＴＣＨ遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＩＴＣＨ遺伝子を解析する工程を含む。ここで、ＩＴＣＨ遺伝子の一部とは、ＩＴＣＨ遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。

上記の「抗腫瘍化剤の適用対象となる腫瘍を選別するための検出」とは組織等における本発明における抗腫瘍化剤が有効に作用する腫瘍の存在の有無を知ることをいう。

腫瘍を選別するための検出は、ＩＴＣＨ遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＩＴＣＨ遺伝子を解析することによりおこなう。ここで「ＩＴＣＨ遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡの当該遺伝子の増幅・欠失の検出又は遺伝子の発現量の異常を検出することをいう。

遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、その存在の有無を確認する、もしくはその増幅物をそのまま、あるいは各種プラスミドベクターに組み換えた後配列を確認することにより可能である。

一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によっておこなうことができる。

（５）ＩＴＣＨタンパク質抗体又はその断片を用いた腫瘍を選別するための検出方法
本発明の細胞増殖抑制剤（抗腫瘍剤）の適用対象となる腫瘍を選別するための検出方法は、ＩＴＣＨタンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＩＴＣＨタンパク質の量を解析する工程を含む。
本方法に用いるＩＴＣＨタンパク質に対する抗体（以下、ＩＴＣＨ抗体という）は、ＩＴＣＨタンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作製することができる。ＩＴＣＨタンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＩＴＣＨタンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＩＴＣＨタンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。

ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作製することができる。

上記のようにして調製したＩＴＣＨタンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＩＴＣＨタンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウエスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＩＴＣＨタンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる骨髄試料、組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＩＴＣＨタンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＩＴＣＨ遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の抗腫瘍化剤の適用対象となる腫瘍を選別することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。

実験材料：
用いた１４種のＡＴＣ細胞株（ＫＴＡ−１，ＫＴＡ−２，ＫＴＡ−３，ＫＴＡ−４，ＡＲＯ，ＦＲＯ，ＴＴＡ−１，ＴＴＡ−２，ＴＴＡ−３，８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＨＴＣ／Ｃ３，ＴＣＯ−１，ＫＨＭ／５Ｍ）は臨床サンプルより樹立した細胞株を使用した。これら細胞株を１０％胎児牛血清と１００Ｕ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／１００μｇ／ｍｌｓｔｒｅｐｕｔｏｍｙｃｉｎ液で培養をおこなった。原発性甲状腺癌の１１６の臨床検体は伊藤病院より入手し、各患者の同意をもってかつ同組織の倫理委員会の承認を得て使用した。

実施例１：ＡＴＣ細胞株での遺伝子領域の増幅と欠失
未分化甲状腺癌での新規な遺伝子変化を検出するために、上述の１４種類のＡＴＣ細胞株から調製したゲノムＤＮＡを用いてＭＧＣ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５，５５９−５６３，２００４））を使用したＣＧＨアレイ解析をおこなった。なお、対象として甲状腺由来の正常な細胞から抽出したゲノムを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして未分化甲状腺癌細胞株から調整したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。

以下に、具体的な解析方法を示す。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（未分化甲状腺癌細胞株）或るいは０．３ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＧＥ ヘルスケア社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ/１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションマシーン（ＧｅｎｅＴＡＣ；ハーバードバイオサイエンス社）にＣＧＨアレイをセットし、４８−７２時間イハイブリダイゼーションをおこなった。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド/２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６．０イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。

ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝０）である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで０．４以上）の時にゲノムの増幅があり、４以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで２以上）の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−０．４以下）の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−２以下）の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。その結果を表１、２に示す。

増幅は、１ｑ４１、３ｑ２８，７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１１ｑ２２．２、１７ｑ１２、２０ｑ１１に見出された。これらの変異のうち、１１ｑ２２．２以外の染色体領域の変化は、本発明において初めて明らかになった変異である。

また、ホモ欠失は１４細胞株中６細胞株（ＡＲＯ、ＫＴＡ−４、ＴＣＯ−１、ＴＴＡ−１、ＴＴＡ−２、ＴＴＡ−３）の３つの部位（９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１）に見出された。そのうち、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子を含む９ｐ２１．３領域の欠失が尤も高頻度に観察された。がん抑制遺伝子と推定されるＷＷＯＸ遺伝子を含む１６ｑ２３のホモ欠失はＫＴＡ−４細胞株でのみ検出され、ＡＲＯ細胞株は新規領域１６ｑ１３．２にホモ欠失が検出された。高レベルの増幅は１４個中、４つの細胞株（ＡＲＯ、ＫＴＡ−３，ＴＴＡ−１，８３０５Ｃ）の１０の領域で検出された。
以上の結果より、表１、２に示す染色体領域の変化を検出することで甲状腺のがん化を検出することが可能と考えられる。

さらに、これらの領域の中で２０ｑ１１．２２の高レベルな増幅は、これまで報告されたことがなく、８３０５Ｃ細胞だけでなく、ＫＴＡ−４においても中程度の増幅（Ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＝１．６：ＢＡＣＰＲ１１−３１８Ｎ１）をしているとこが判明した（図１Ａ）。遺伝子増幅が腫瘍の病理学的、臨床的意義が大きく治療法に繋がることからこの２０ｑ１１．２２領域に注力して解析をおこなった。

実施例２：８３０５Ｃ、ＫＴＡ−４細胞でのＦＩＳＨ解析による増幅領域の絞り込みと構成される遺伝子の発現解析
２０ｑ１１．２２の増幅領域の絞込みをおこなうため、ＲＰ１１−３１８Ｎ１を中心する７つのＢＡＣおよび、２０ｐ１１領域のＢＡＣをコントロールプローブとして、定法（Ｉｎｏｕｅ Ｊ， Ｏｔｓｕｋｉ Ｔ， Ｈｉｒａｓａｗａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．；１６５：７１−８１．，２００４）により、ＦＩＳＨ解析を行った。

８３０５Ｃ細胞においてＲＰ１１−３１８Ｎ１プローブでは微小染色体対（ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）を伴う多数のシグナルが見出された。（図１Ｂ）

一方ＫＴＡ−４細胞株においては、６個のＢＡＣ（ＲＰ１１−１３４Ｉ８，３１８Ｏ１６，３１８Ｎ１，１６０Ｉ２０，３５３Ｃ１８，３８２Ａ１２）がタンデムリピートパターンを伴う８つのシグナルを検出した（図１Ｂ）。両者の結果からターゲットの候補となる増幅領域はＲＰ１１−３１８Ｎ１に絞り込まれ、ヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から、約０．６Mbの範囲でありＡＳＩＰ１，ＡＨＣＹ，ＩＴＣＨ，ＤＹＮＬＲＢ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ，ＴＰ５３ＩＰＮ２，ＰＩＧＵ，ＮＣＯＡ６，ＨＭＧ４Ｌの９の遺伝子を含むことがわかった（図１Ｃ）。

以上より、ＡＳＩＰ１，ＡＨＣＹ，ＩＴＣＨ，ＤＹＮＬＲＢ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ，ＴＰ５３ＩＰＮ２，ＰＩＧＵ，ＮＣＯＡ６，ＨＭＧ４Ｌのコピー数の増加を検出することで、甲状腺由来細胞の癌化を検出できることがわかった。
さらにこれらのターゲット遺伝子の中で、より好ましいターゲットを明確にするために、遺伝子の増幅と、発現状態の関係を決定することにした。

次に、絞り込まれた領域中に存在するＡＳＩＰ１，ＡＨＣＹ，ＩＴＣＨ，ＤＹＮＬＲＢ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ，ＴＰ５３ＩＰＮ２，ＰＩＧＵ，ＮＣＯＡ６，ＨＭＧ４Ｌの９の遺伝子について簡易定量を目的としたＰＣＲ反応をおこなった。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨを用いた。対数増殖期の各細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを採取後、定法にてｃＤＮＡを作製した。各遺伝子に特異的なプライマー（プライマーの塩基配列を表３に示す）と条件を事前に設定し、ＰＣＲ反応をおこない３％アガロースゲルにて電気泳動をおこなった。

ゲルイメージを ＬＡＳ−３０００（富士写真フイルム）にて測定しＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（富士写真フイルム）にて画像解析した（図１Ｄ）。１４の細胞株について半定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した結果、８３０５Ｃ細胞とＫＴＡ−４細胞においてＩＴＣＨ遺伝子が明らかに過剰発現していることを見出した。通常、コピー数と発現量の間には正の相関関係があることが知られており、このことから、ＩＴＣＨ遺伝子がもっとも好ましいターゲット遺伝子となることが分かった。

実施例３：ＡＴＣ細胞株でのＩＴＣＨ遺伝子のタンパク発現レベルの確認
８３０５Ｃ,ＫＴＡ−４のＩＴＣＨの過剰発現を確認するため、特異抗体を用いたウエスタンブロッキング法により、タンパクの発現を確認した。
具体的には、各細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％ ＳＤＳ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ７．４）にて溶解後、ＢＣＡ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）にてタンパク濃度を測定し各３０μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。これを、ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写し、抗ＩＴＣＨ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、コントロールとして抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）にて一次検出後、パーオキシダーゼ結合二次抗体にてｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い発色、検出した（図１Ｅ）。

またＲＴ−ＰＣＲ法により、原発性未分化甲状腺癌７検体についてＩＴＣＨｍＲＮＡの発現量の解析を行い、原発性未分化甲状腺癌においてもＩＴＣＨｍＲＮＡが過剰発現していることを確認した（図１Ｆ）。

実施例４：原発性甲状腺癌におけるＩＴＣＨの過剰発現について
ＡＴＣを含む原発性甲状腺癌のＩＴＣＨの発現状態を調べるため、１０９の原発性甲状腺癌検体（ＡＴＣ ４９検体、ＰＴＣ ２５検体、ＰＭＣ ２５検体、甲状腺腫（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｇｏｉｔｅｒｓ） １０検体）について、ＩＴＣＨ蛋白質の発現レベルを免疫組織化学染色により評価することにした。

具体的な方法としては、パラフィン包埋した組織切片をホルマリン固定することでおこなった。シランコートされたガラススライド上の切片は、脱パラフィン化とエタノールによる段階的な脱水をおこなった。抗原は、９５℃で１５分間１０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ ６．０）中でマイクロウエーブ前処理により取り出した。内因性ペルオキシダーゼは５％過酸化水素を用いて阻害した。非特異的染色は２％標準ブタ血清で阻害した。そのスライドは抗ヒトＣＴＧＦヤギポリクローナル抗体（Ｌ−２０、１：１００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩インキュベートした。スライドはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ シンプルステインＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）（Ｎｉｃｈｒｅｉ社）を用いて室温で２時間反応させた。抗原―抗体反応は０．２％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと過酸化水素により可視化した。そのスライドはＭａｙｅｒ’ｓ ヘマトキシリンを用いて対比染色した。ＩＴＣＨの免疫染色パターンを図２に、まとめを表４に示す。ＡＴＣ検体，ＰＭＣ検体，ＰＴＣ検体は免疫染色陽性であった。一方、良性腫瘍に分類される甲状腺腫は、染色されないか、もしくは非常の弱い染色量であった。

実施例４：ＡＴＣ細胞中の発癌能（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）
ＡＴＣ細胞増殖に対するＩＴＣＨ過剰発現の効果を調べるため、特異的ｓｉＲＮＡによるＩＴＣＨの発現抑制後の細胞成長試験をおこなった。
ＩＴＣＨ遺伝子に対応するｓｉＲＮＡは、ＧＧＵＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧ（配列番号１９）とデザインし購入（シグマ社）した。また、コントロールのｓｉＲＮＡとしてルシフェラーゼ遺伝子に対応する ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ（配列番号２０）を購入（シグマ社）した。合成したｓｉＲＮＡ（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｓｉＲＮＡ ＭＡＸ試薬（インビトロジェン社）を用いる（製品プロトコールで処理）ことで、それぞれのＡＴＣ細胞株に遺伝子導入された。遺伝子導入後、その効率を実施例３と同様Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した。生存細胞の数はｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ）アッセイ（Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８；同仁堂）にて測定した。コントロールとして抗β−アクチン抗体を用いた。予想どおりＩＴＣＨが増幅／過剰発現している８３０５CおよびＫＴＡ−４細胞について、非特異的なｓｉＲＮＡのコントロールに比べ、２４−７２ｈ時間後にＩＴＣＨに特異的なｓｉＲＮＡにより内在性ＩＴＣＨタンパクの抑制されていることをウエスタンブロット法により確認した（図３Ａ、Ｂ）。

また増殖に対する影響は２４ウェルプレートに細胞株を播き、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、経時的に生細胞数をｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ）アッセイ（Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８；同仁堂）にて測定した（図３Ａ、Ｂ）。

８３０５Ｃ細胞については、ＩＴＣＨ−特異的ｓｉＲＮＡにより成長が明らかに抑制されていた。同様の結果がＩＴＣＨが過剰発現しているＫＴＡ−４細胞についても得られたが、成長抑制の効果は８３０５Ｃ細胞より小さく、ＩＴＣＨタンパクの発現レベルに依存しているものと考えられる。細胞の増殖に対する抑制効果は、８３０５Ｃで７７％、ＫＴＡ−４で６９％であった。

実施例５：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法を用いたＩＴＣＨ遺伝子の作用機序（mode of action）の解析
ＡＴＣ細胞の成長に対するＩＴＣＨの作用機序を明らかにするため、ＩＴＣＨ特異的ｓｉＲＮＡを導入した８３０５Ｃ細胞とコントロール細胞の細胞周期の解析をＦＡＣＳを用いて行った。

具体的には、細胞はトリプシン処理後、７０％エタノール液にオーバーナイトで固定化処理し、引き続きＲＮａｓｅＡ（４０Ｕ／ｍｌ）で３０分、さらにＰＢＳバッファーのＰＩ液（２０ｇ／ｍｌ）で３０分処理をした。細胞のＤＮＡ量はＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（共にＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析された。実験は３回行った。

解析の結果、ＩＴＣＨの発現を抑制させると、Ｇ０／Ｇ１が増加し、ＳおよびＧ２／Ｍが減少しているがわかり、このことから、Ｇ１期で細胞周期が停止していることが明らかとなった（図３Ｃ）。

実施例６：ＩＴＣＨ遺伝子による成長促進効果の確認
これまでの結果をふまえ、ＩＴＣＨ遺伝子発現を活性化することで、ＡＴＣ細胞の増殖が促進されるかどうかどうかを検討した。まず、ＩＴＣＨ遺伝子のＭｙｃタグを発現する２つのプラスミド（ワイルドタイプ：ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ＩＴＣＨ ＷＴ、ユビキチン連結酵素活性を無くしたミュータントタイプ：ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ＩＴＣＨ ＭＵＴ）を構築した。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＩＴＣＨのＷＴおよびＭＵＴの ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＭｙｃタグと翻訳フレームがあうように挿入して作製した。対照として、ＩＴＣＨ遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現プラスミドを、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ＴＴＡ−１細胞または８５０５Ｃ細胞へトランスフェクションした。４８時間後細胞を回収し、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロットによりＩＴＣＨ蛋白質の発現を確認した（図３Ｄ，Ｅ）。

また、トランスフェクションの３週間後に、ネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖した細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレッドで染色することによりカウントした。その結果、空ベクターでトランスフェクションした細胞と比べて、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ＩＴＣＨ ＷＴおよびＭＵＴでトランスフェクションした細胞は顕著にコロニー数が増加した（図３Ｄ、Ｅ）。この結果から、明らかにＩＴＣＨ遺伝子の発現を活性化することで、ＡＴＣ細胞の増殖を促進できること、および、細胞増殖は、ユビキチン連結酵素とは独立な方式で生じていることが明らかとなった。

（結論）
（１） アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、１ｑ４１、３ｑ２８，７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１１ｑ２２．２、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の遺伝子領域が、甲状腺癌の新しい癌マーカーとなることを見出した。
（２） その中で、２２ｑ１１領域、およびそこに含まれる９の遺伝子（ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、ＡＳＩＰ１）が、より好ましい癌マーカーとなることを見出した。
（３） １４種の未分化甲状腺癌由来細胞におけるＤＮＡの増幅遺伝子のスクリーニングと発現解析データを組み合わせた確認によりＩＴＣＨ遺伝子を特に好ましい、新たな癌マーカーとして同定した。
（４） ＩＴＣＨ遺伝子の発現は甲状腺癌の細胞増殖を促進していることが明らかとなった。

ＡＴＣ細胞株のＩＴＣＨ遺伝子の増幅および過剰発現を示している。（Ａ）ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００を使用したアレイＣＧＨ解析画像を示している。２つのＡＴＣ細胞株（８３０５Ｃ細胞株およびＫＴＡ−４）において、２０ｑ１１．２２での顕著なコピー数増加がきれいな緑色のシグナルとして検出された（赤矢印）。（Ｂ）８３０５ＣおよびＫＴＡ−４細胞から作られた、分裂中期染色体のＦＩＳＨ解析画像を示している。ＢＡＣクローンＲＰ１１−３１８Ｎ１（緑発光）がプローブとして使用された。コントロールプローブとして２０番染色体のＢＡＣ（ＲＰ１１−７Ｆ１０、２０ｐ１．２２；赤発光）が使用された。ＫＴＡ―４細胞がタンデムリピートパターンによる増幅（矢印部）を示したのに対し、８３０５Ｃ細胞は、微小染色体対（ｄｍｉｎ）を伴う明らかな増幅が検出された。（Ｃ）ＡＴＣ細胞株で増幅している２０ｑ１１．２２を含む領域のマップ。ＦＩＳＨ解析で使用された８つのＢＡＣが黒横棒で示されている。配列中の９つの転写物が示されている。ＳＲＯ中の全てのマーカーおよび転写物はヒトゲノムデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ａｎｄ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）に基づき配置された。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲにより決定された、ＡＴＣ細胞株の２０ｑ１１．２２に位置する遺伝子の発現。ＤＷ、蒸留水はネガコンである。アレイＣＧＨによって検出された２０ｑ１１．２２の増幅部分は矢頭で示されている。ＡＴＣ細胞株のコピー数とＩＴＣＨの発現パターンは相関していた。（Ｅ）ＡＴＣ細胞株のＩＴＣＨ蛋白質のウエスタンブロット解析。ＩＴＣＨたんぱく質の発現レベルもこの遺伝子のコピー数と相関していた。（Ｆ）７つの原発性ＡＴＣ検体と正常甲状腺組織のＩＴＣＨ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。バンドの定量化は、ＬＡＳ−３０００（富士フイルム社製）およびマルチゲージ（富士フイルム社製ソフト）により定量化した。それぞれの試料のＧＡＰＤＨで規格化されたＩＴＣＨの発現量を、正常甲状腺組織の発現量で割った数値を増加量として示した。 原発性甲状腺癌と甲状腺良性腫瘍のＩＴＣＨ免疫染色の例である。（Ａ）ＡＴＣ（強度３）（Ｂ）ＡＴＣ（強度２）（Ｃ）ＡＴＣ（強度０）（Ｄ）ＰＭＣ（強度３）（Ｅ）ＰＴＣ（強度２）（Ｆ）甲状腺腫（強度１）。免疫染色の強さから、四つの強度レベルに分類した。棒線は２０μmを示している。 （Ａ−Ｃ）ＡＴＣ細胞の成長に対するＩＴＣＨの抑制効果。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃを形質導入した細胞、もしくは溶媒のみの添加にくらべ、ＩＴＣＨに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−ＩＴＣＨ）を形質導入された８３０５Ｃ細胞（Ａ）、ＫＴＡ−４細胞（Ｂ）のウエスタンブロッティングの結果および成長曲線を示している。ｓｉＲＮＡによるノックダウンの効果は、形質導入後２４−７２時間の間で調べられた。ＷＳＴ試験法により形質導入後２４〜７２時間の生存細胞数を計測した。データは３回の計測の平均を示している。Ｐ＜０．０５を※印で示している（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ法により統計解析）。（Ｃ）８３０５Ｃ細胞にｓｉＲＮＡ−ＩＴＣＨおよびｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃをそれぞれ形質導入後、７２時間経過後、ＦＡＣＳにより測定した細胞周期ごとの細胞数分布を示している。ＩＴＣＨ特異的ｓｉＲＮＡの形質導入により、Ｇ０／Ｇ１期の細胞が蓄積することがわかる。（Ｄ，Ｅ）ＴＴＡ−１細胞（Ｄ）８５０５Ｃ細胞（Ｅ）を用いたコロニー形成法。ＩＴＣＨ遺伝子の発現は比較的少ない細胞に、ＩＴＣＨ遺伝子のＭｙｃタグを発現する２つのプラスミド（ワイルドタイプ：ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＩＴＣＨ ＷＴ、ユビキチン結合酵素活性を無くしたミュータントタイプ：ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＩＴＣＨ ＭＵＴ）ＩＴＣＨ遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）形質導入し、さらにネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で３週間、増殖した。（左）ウエスタンブロッティングで、形質導入を確認。(右)形質導入によりコロニーが形成されている。

Claims (16)

1. 検体において、１ｑ４１、３ｑ２８、７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１、９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の変化の少なくとも１つ以上を検出することにより癌化を検出することを含む、癌の検出方法。
2. １ｑ４１、３ｑ２８、７ｑ３１．２、８ｐ１２、８ｑ２２．２、８ｑ２４．２１、１１ｑ１４．１、１７ｑ１２、２０ｑ１１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅、及び／又は９ｐ２１．３、１６ｑ１３．２、１６ｑ２３．１の染色体領域に存在する遺伝子の欠失の少なくとも１つ以上を検出する、請求項１に記載の癌の検出方法。
3. 検体において２０ｑ１１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅を検出する、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
4. 前記遺伝子がＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上である、請求項３に記載の癌の検出方法。
5. 増幅の指標が、正常検体と比較して１．３２倍以上である、請求項３又は４に記載の癌の検出方法。
6. 遺伝子がＩＴＣＨ遺伝子である、請求項５に記載の癌の検出方法。
7. 検体が、甲状腺由来の組織である、請求項１から６の何れかに記載の癌の検出方法。
8. 癌が、甲状腺癌である、請求項１から７の何れかに記載の癌の検出方法。
9. 遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から８の何れかに記載の癌の検出方法。
10. 検体において、ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法。
11. 蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項１０に記載の癌の検出方法。
12. 検体の悪性度を含めた癌化を検出する、請求項１から１１の何れかに記載の癌の検出方法。
13. ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
14. ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤。
15. ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
16. ＩＴＣＨ、ＡＨＣＹ、ＤＹＮＬＲＢ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＰＩＧＵ、ＴＰ５３ＩＰＮ２、ＮＣＯＡ６、ＨＭＧ４Ｌ、又はＡＳＩＰ１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。