JP5557139B2 - 食道癌の検出又は予後の予測のための方法及び食道癌抑制剤 - Google Patents
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Description
PCDH17遺伝子の変化は、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、又は発現低下であることが好ましい。
好ましくは、PCDH17遺伝子の不活性化が、CpGアイランドのメチル化による当該遺伝子の不活性化であることを確認する。
好ましくは、PCDH17遺伝子の変化を、DNAチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアル・タイム定量RT−PCR法、FISH法、CGH法、アレイCGH法、COBRA法、及びバイサルファイト・シーケンシング法からなる群から選択される少なくとも一つの手法により解析する。
好ましくは、PCDH17遺伝子から翻訳されるタンパク質を免疫染色法により検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する。
好ましくは、前記検体が、食道組織である。
好ましくは、検出又は予後を予測する食道癌が、食道扁平上皮癌である。
好ましくは、検体としてpN0(リンパ節転移を認めない)食道癌の検体を使用して、食道癌の検出の予後を予測する。
好ましくは、前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
好ましくは、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている。
(1)食道癌の検出又は予後の予測のための方法
本発明による食道癌の検出又は予後の予測のための方法は、検体において、PCDH17(Protocadherin 17; PCDH17)遺伝子の変化を解析する工程を含むことを特徴とする。ここで、PCDH17遺伝子の変化としては、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、発現低下などが挙げられ、これらを検出することにより食道癌の検出又は予後の予測が可能となる。特に本発明では、pN0(リンパ節転移を認めない)食道癌の検体において、PCDH17遺伝子の変化を解析することによって、予後を予測することができる。
本発明において、PCDH17遺伝子のホモ接合性欠失の検出する手法としては、CGH(Comparative Genomic Hybridization)法、アレイCGH(array−based comparative genomic hybridization)法、FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)法、ゲノムPCR法(genomic PCR)、サザン・ブロット法等を挙げることができる。
FISH法に関しては、PCDH17遺伝子を有するBAC(Bacterial Artificial Chromosome)DNA、YAC(Yeast Artificial Chromosome)DNA、PAC(P1−drived Artificial Chromosome)DNA(以下、BAC DNA等ともいう)を標識し、FISHをおこなうと、PCDH17遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。
CpGリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている(Bird AP., et al.,Cell,99,451−454,1999).癌細胞では、CpGアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域の高度メチル化(Hypermethylation)は、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している(Ehrlich M.,et al,Oncogene,21,6694−6702,2002)。後述するように、実際、PCDH17遺伝子のエキソンに存在するCpGアイランドはプロモーター活性を有している。また、このCpGアイランドのメチル化の度合いは、食道扁平上皮癌でのPCDH17遺伝子発現の抑制と強く相関することがある。
本発明において、PCDH17遺伝子の発現低下を検出する方法としては、PCDH17からのメッセンジャーRNA(mRNA)を検出する手法、又は、PCDH17遺伝子から翻訳されたタンパク質を検出する手法が挙げられる。具体的には、食道癌が疑われる検体と正常食道組織とについて、PCDH17mRNAの発現量ないしPCDH17タンパク質の発現量を適宜の手法により比較することでPCDH17遺伝子の発現低下を評価することが可能である。
本発明の一態様によれば、本発明の食道癌抑制剤は有効成分としてPCDH17遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の食道癌抑制剤は有効成分としてPCDH17タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
<細胞培養、薬剤処理及び臨床組織サンプル>
全部で43のESCC細胞株を用いたが、そのうち31の細胞株は外科的に切除した腫瘍から確立したKYSEシリーズ(Shimada Y, Imamura M, Wagata T, Yamaguchi N, Tobe T. (1992). Characterization of 21 newly established esophageal cancer cell lines. Cancer 69: 277-284)に属し、12の細胞株は東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターから提供されたTE−シリーズ株である。全てのESCC細胞は、既報の方法により維持した(上述の非特許文献8参照)。PCDH17の回復を分析するために、細胞を、5日間、5μmol/Lの5−アザ−デオキシシチジン(5−aza−dCyd)、及び/又は最後の12時間100ng/mLのトリコスタチンA(TSA)、それぞれの存在下又は非存在下で処理した。
Agilent Human Genome CGH Microarray Kit 244K(Agilent Technologies社製)を用いて、当該細胞株におけるコピー数変化のゲノム・ワイドな分析を行った。ラベリング及びハイブリダイゼーションは、上記キットの製造業者によって提供されるプロトコルに従って行った。アレイは、アジレント・スキャナー(Agilent scanner)を用いてスキャンし、データ抽出、フィルタリング及び標準化は、Feature Extraction software(Agilent Technologies社製)を用いて行った。CGHAnalytics program vesion 3.4.40(Agilent Technologies社製)を用いて、他の分析プログラムにおいて使用するためのアレイCGHデータを書き出した。
<ホモ接合性欠失及び変異を検出するためのゲノムPCR>
ホモ接合性欠失は、ゲノムPCR(genomic polymerase chain reaction)で確認した。PCDH17のコード領域における変異は、エクソン部分の増幅及びダイレクト・シーケンシングにより分析した。サンプルにおいて検出した全ての塩基の変化は、各産物を両方向から配列決定して確認した。プライマーは、各エクソン周辺のゲノム配列に設計した(表1参照)。
mRNAの発現レベルは、TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems社製)を用い、定量リアル・タイム蛍光検出法(ABI PRISM 7500 sequence detection System;Applied Biosystems社製)により、当該製造業者のマニュアルに従って測定した。遺伝子発現値は、PCDH17遺伝子(Hs00205457_m1;Applied Biosystems社)、及び試料から分離したRNAの量に対する標準化因子を提供する内部基準遺伝子(β−アクチンのHs99999903_m1、ACTB;Applied Biosystems社)の比で表され、続いて、コントロールにおける値で標準化される(相対発現レベル)。正常ヒト食道に由来する全RNAは、Ambion(Austin, TX, USA)から購入した。各アッセイは、各サンプルにつき二組で行った。
ゲノムDNAを、亜硫酸水素ナトリウム(Sodium bisulfite)で処理し、任意の領域を増幅するために設計したプライマーセット(表2参照)を用いたPCRに供試した。COBRA法のため、PCR産物をBstUI又はTaqIで制限酵素処理を行い、電気泳動を行った(Xiong Z, Laird PW. (1997). COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 25: 2532-2534.)。ゲルをエチジウム・ブロマイドで染色しいた後、MultiGauge 2.0(Fuji Film社製)を用いた密度測定により、メチル化されたアレルの強度(パーセンテージとして)を測定した。メチル化密度カットオフポイントである20%を有意義と考慮した(Sonoda I, Imoto I, Inoue J, Shibata T, Shimada Y, Chin K, et al. (2004). Frequent silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) expression by genetic and epigenetic mechanisms in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 64: 3741-3747.)。BGS分析のため、PCR産物はサブクローニングし、塩基配列を決定した。
PCDH17のCpG−rich領域周辺の任意のゲノムDNA断片をPCRにより得て、ベクターpGL3−Basic(Promega社製)に挿入した。各コンストラクト(construct)又は空のpGL3−Basicベクター等量を、FuGENE6(Roche Diagnostics社製)を用いて、内部コントロールベクター(pRL−hTK、Promega社製)と共に、細胞に導入した。トランスフェクションの36時間後に、Dual−Luciferase Reporter Assay System(Promega社製)を用いて、ホタルルシフェラーゼ及びレニラ(Renilla)ルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。相対的なルシフェラーゼ活性を計算し、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
Anti−PCDH17ウサギ・ポリクローナル抗体を、ヒトPCDH17由来のペプチド(DHPNRDLGRESVDAE; Operon Biotechnology社製)に対して産生し、アフィニティ・カラムを通して精製した。Anti−Myc−Tag抗体は、Cell signaling Technology社から入手し、anti−FLAG−Tag 抗体及びanti−β−actin抗体は、Sigma社から入手し、anti−p21抗体、anti−p27抗体及びanti−CCND1抗体は、それぞれ、BD Biosciences社、Santa Cruz Biotechnology社及びCell Signalling Technology社から入手した。内在性のPCDH17の発現をノックアウトするために、PCDH17をターゲットとするsiRNAのそれぞれ(Stealth RNAiTM siRNA #HSS17838383、 #HSS17838384、及び #HSS17838385; Invitrogen社)又はネガティブ・コントロール(Negative universal control Med;Invitrogen社)を、Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社製)を用い、当該製造業者の指示に従って、ESCC細胞にトランスフェクションした(10 nmol/L)。細胞溶解物を既報の通りウェスタン・ブロッティングにより分析した(Kozaki K, Imoto I, Mogi S, Omura K, Inazawa J. (2008). Exploration of tumor-suppressive microRNAs silenced by DNA hypermethylation in oral cancer. Cancer Res 68: 2094-2105.)。
シラン・コートガラススライド上に据え付け、かつ0.3%の過酸化水素を含有するメタノールに浸潤したホルマリン固定パラフィン封入組織切片(厚さ3μm)に対して、間接免疫組織化学法を行った。クエン酸緩衝液(pH9.0、ニチレイ社製)において、マイクロ波前処理により、抗原を回収した。2%の通常ブタ血清でブロッキングした後、室温下、一晩の間、anti−Anti−PCDH17抗体(1:3000)でインキュベートし、アビジン−ビオチン複合体(ABC)キット(R.T.U.Vectastain Elite ABC Reagent;Vector Laboratories社製)、ジアミノベンジジン四塩酸塩及び過酸化水素を用いて、抗原抗体反応を可視化した。スライドは、メイヤーズ・ヘマトキシリンで対比染色した。
C末端にmycペプチドを付加したPCDH17を発現するプラスミド(pCMV−3Tag4A−PCDH17)、及び、内部リボソームエントリー部位(internal ribosomal entry site; IRES)によりGFPを融合させ、かつC末端にFLAGペプチドを付加したPCDH17を発現するプラスミド(pIRES−hGFPII−PCDH17)を、3×Myc及び3×FLAGエピトープとイン・フレームであるPCDH17の全コード配列のRT−PCR産物を真核細胞発現ベクターpCMV−3Tag4A(Stratagene社製)及びpIRES−HGFPII(Stratagene社製)のそれぞれにクローニングすることによって取得した。各コンストラクト又は空のベクター(pCMV−3Tag4A−mock)を導入した細胞を滅菌カバーガラスに播種した。エピトープを付加したタンパク質を発現する細胞は、メタノールで15分間、−20℃で固定し、35分間1%ウシ血清アルブミンでブロッキングし、マウス・モノクローナルanti−MYC又はanti−FLAG抗体(1:100)、及び/又は、ウサギ・ポリクローナルanti-PCDH17抗体(1:100)に保蔵した。洗浄した細胞は、anti-マウス又はanti-ウサギ抗体をコンジュゲートしたAlexafluor 488又は594(Invitrogen社製)を1:100で希釈したものとインキュベートし、4’,6−diamidino−2−phenylindole dihydrochloride(DAPI、0.15μg/mL)で対比染色した。
コロニー・フォーメーションアッセイ(非特許文献8を参照)のために、pCMV−3TAG4A−PCDH17又は空のベクター(pCMV−3Tag4A−mock)コントロールを、リポフェクタミン2000(Invitrogen社製)を用いて細胞に導入した。導入後48時間後に、PCDH17タンパク質の発現をウェスタン・ブロッティング及び免疫蛍光細胞化学法(IFC)により確認した。コロニー・フォーメーションアッセイのため、G418の適切な濃度下で6ウェル・プレートにおいて10日間インキュベーションした後、細胞を70%エタノールで固定し、クリスタル・バイオレットで染色した。
安定に形質転換したESCC細胞は、コンフルエントになるまで、6ウェル・プレートで培養した。細胞層を、滅菌20μlチップを用いて注意深く傷つけ、新しい培地で二回洗浄し、24時間培養した。0、6、12及び24時間の時点で、CCDカメラに接続した位相差顕微鏡により、傷つけた単層の画像を得た。写真をTIFFイメージに変換した後、傷つけた領域をCT−ASソフトウェア(Nikon社製)を用いて、ピクセル数を数えて測定した。実験は3組で行った。
トランスウェル移動/浸潤アッセイを、24ウェルに改良したボイデン・チャンバー(Boyden chamber)(transwell−chamber culture system、Becton Dickinson社製)において行った(Shinoda Y, Kozaki K, Imoto I, Obara W, Tsuda H, Mizutani Y, et al. (2007). Association of KLK5 overexpression with invasiveness of urinary bladder carcinoma cells. Cancer Sci 98: 1078-1086.)。8μmの孔を有する直径6.4mmのフィルターの上面をマトリゲル(Matrigel;BD transduction社製)でコーティングしたもの(浸潤アッセイ)と、コーティングしていないもの(移動アッセイ)を準備した。安定形質転換体(2×104細胞/ウェル)を上方のチャンバーに移した。48時間インキュベートした後、フィルターの上面における移動していない細胞(non−migrated cell)又は浸潤した細胞(invasive cell)を滅菌綿棒で取り除いた。フィルターの下面における移動していない細胞(non−migrated cell)又は浸潤した細胞(invasive cell)は固定し、Diff−Quik stain(Sysmex社製)で染色し、染色した細胞核を直接、3組で数えた。浸潤インデックスを計算することにより、浸潤可能性を算定した。浸潤インデックスとは、コントロール対象物における試験細胞の非被覆フィルターを通した移動(migration)に対する、Matrigel被覆フィルターを通したパーセンテージ浸潤の比である。
サブグループの間における違いは、スチューデントのt検定(Student's t−test)で試験した。臨床腫瘍組織におけるPCDH17の発現と、対応する患者に関係する臨床病理学的因子との相関は、Χ2又はフィッシャーの直接確率検定(Fisher's exact test)を用いて、統計的有意差を分析した。生存分析のために、一変量の予測因子に基づくグループに対してはKaplan−Meier生存曲線を構築し、グループ間の差異についてlog−rank検定により検定した。差異は、two−sided検定を用いて評価し、P<0.05レベルで優位であると判断した。
(1)オリゴヌクレオチド・アレイCGH
オリゴヌクレオチド・アレイCGHにより、ESCC細胞株におけるPCDH17のホモ接合性欠失を同定した。高密度オリゴヌクレオチドアレイ(Agilent Human Genome CGH Microarray Kit 244K)を用いて、43のESCC細胞株において、様々な注目すべきコピー数の獲得(高レベル増幅、log 2 ratio>2.0)及びコピー数の欠失(ホモ接合性欠失、log 2<2.0)が検出された。予想した通り、いくつかの小さなホモ接合性の欠失した領域が検出されたが、これら領域は、通常のBACアレイCGH(Pimkhaokham A, Shimada Y, Fukuda Y, Kurihara N, Imoto I, Yang ZQ, et al. (2000). Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res 91: 1126-1133.;非特許文献8)では同定されていないものであった。これらの新規に同定された領域のうち、13q21.2におけるホモ接合性の欠失が、KYSE890及びKYSE1170細胞株において検出された(図1A参照)。この13q21.2におけるホモ接合性の欠失はPCDH17遺伝子内にあり、以前報告された二つのTSG、 すなわち、PCDH8(Yu JS, Koujak S, Nagase S, Li CM, Su T, Wang X, et al. (2008). PCDH8, the human homolog of PAPC, is a candidate tumor suppressor of breast cancer. Oncogene 27: 4657-4665.)、及びPCDH20(Imoto I, Izumi H, Yokoi S, Hosoda H, Shibata T, Hosoda F, et al. (2006). Frequent silencing of the candidate tumor suppressor PCDH20 by epigenetic mechanism in non-small-cell lung cancers. Cancer Res 66: 4617-4626.)の近傍に位置する。これらの細胞株におけるPCDH17のホモ接合性欠失を確認し、この部分がほかのESCC株においてホモ接合的に欠失しているか否か決定するため、当該遺伝子のエクソン1〜4に設計したプライマーを用いてゲノムPCRを行った。その結果、KYSE890及びKYSE1170細胞のみにおいて、エクソン1及び3の間においてPCDH17の一部のホモ接合性欠失が検出された(図1B参照)。従来、PCDH17の欠失はESCCを含む癌において全く報告されていないので、当該遺伝子は、食道の癌形成に関係するTSGの候補であるかどうかを調べた。
次に、全てのESCC細胞株及び正常な食道について、リアル・タイム定量逆転写PCR(real−time quantitative reverse transcription−polymerase chain reaction ;RT−PCR)により、PCDH17のmRNAの発現について調べた。正常な食道と比較して、KYSE890及びKYSE1170細胞は、13q21.2にホモ接合性欠失を有しない他のESCC細胞株(41の内の39、95.1%)の大多数と同様に、PCDH17mRNAの発現を欠いていた(図1C参照)。二つのESCC細胞株(KYSE110及びKYSE140)及び正常食道では、PCDH17mRNAが発現しており、エピジェネティックな事象を含む、ゲノム上の欠失以外のメカニズムから生じる、腫瘍における発現の喪失が示唆された。41株のうち11株は、アレイCGH分析においてPCDH17周辺にホモ接合性欠失のパターンを示し、そのうち10株は、当該遺伝子を発現していなかった(図1C参照)。初めに、当該遺伝子のホモ接合性欠失を有しない41のESCC細胞株の一群と50のESCC臨床腫瘍組織について、PCDH17のタンパク質コード配列内の塩基置換をスクリーニングした(表3参照)。コドン56におけるGlyからArgの変異、及び、コドン776におけるGluからLysの変異のそれぞれに繋がる、一つのヘテロ接合性の塩基置換及び一つのホモ接合性の塩基置換が、KYSE70及びKYSE110/KYSE200細胞のそれぞれにおいて同定された。ESCC臨床腫瘍組織において検出された、二つのサイレントなヘテロ接合性の塩基置換は、対をなす非癌部の食道組織においても観察された(表3参照)。これらの結果から、これらの変異は一塩基変異多型(SNPs)であることが示唆された。アミノ酸の変異を伴う観察された変異は、SNPデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ 及び http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)では報告されていないが、タンパク質コード配列内の塩基置換は、PCDH17の発現抑制に重要な役割を果たしてはいないようである。
PCDH17の発現抑制においてCpGアイランド周辺のメチル化の潜在的な役割を示すため、当該遺伝子の発現が在るもの及び無いもののESCC細胞株についてバイサルファイト−リストリクション結合分析(COBRA法)及びバイサルファイト・ゲノム・シーケンシング(BGS法)を行うことにより、ESCC細胞株におけるPCDH17CpGアイランド周辺のメチル化状態をスクリーニングした(図2A参照)。COBRA法を用いた予備的なスクリーニングにより、PCDH17の発現状態に関わらず、ESCC細胞株において大抵のCpgアイランドは高度にメチル化されていることが証明されたので(図2B及び図5参照)、更なる分析からこれら領域は除外して、転写開始サイト(transcription start site;TSS)周辺の領域に注目した(図2Aにおける領域1〜3)。PCDH17発現ESCC細胞株はほとんど脱メチル化されているか、あるいは部分的にメチル化されているのに対し、非発現細胞株ではPCDH17−TSS周辺のCpGサイトは、広範囲にメチル化されている傾向にあった(図2B及び図2C参照)。PCDH17−TSS周辺のCpgリッチ領域の一部は、メチル化のターゲットとなるようであり、当該遺伝子の転写レベルの発現抑制に密接に関係しているようであった。よって、この領域を含み、またその領域内にある二つの断片(978bp及び171bp;図2Aにおける各fragment1及び2)をルシフェラーゼ・レポーターに接続し、ESCC細胞において当該領域のプロモーター活性を調べた。PCDH17mRNAの発現状態に関わらず、転写活性における顕著な増加は、fragment 1を含むコンストラクトの特徴であった(図2D参照)。これにより、プロモーター活性を示す特定のCpGサイト周辺の領域が、PCDH17を発現抑制するためのDNAメチル化の潜在的なターゲットであることが示された。
ESCC臨床腫瘍組織において、PCDH17の異常なメチル化がどの程度、当該遺伝子の発現抑制に関与しているかを決定するために、領域1及び2(図2A及び図3A参照)についてCOBRA法を行うことにより、対応する非癌部の食道組織と共に、13の臨床ESCC検体の凍結切片について、当該遺伝子のメチル化状態を調べた。PCDH17の異常なメチル化は、13のESCC臨床腫瘍組織のうち9検体(69.2%)において、主に領域2において検出され、対応する非癌部の食道組織については、9検体のうち2検体(22.2%)においても検出された。これにより、PCDH17プロモーター領域の異常なメチル化は食道の癌形成の初期に生じることが示唆された。対応する非癌部組織と共に、代表となるESCC臨床腫瘍組織からの個々のアレルについて領域1及び2のBGS法を行った結果(図3B参照)、COBRA法においてメチル化が陽性であったESCC腫瘍では異常なメチル化が確認されたが、メチル化が陰性であった非癌部の食道組織では異常なメチル化は確認されなかった。これらの知見は、PCDH17プロモーターのメチル化は、in vitroにおける細胞系統の継代中に生じた単なる修飾(artifact)ではなく、ESCCの発症機序において癌に関係する真の事象であることが示された。
ESCC臨床腫瘍組織におけるPCDH17発現の低下を検証し、その臨床病理学的な意義を決定するために、145の臨床腫瘍組織検体についてPCDH17タンパク質の免疫組織化学分析を行った。表4は、PCDH17タンパク質の発現状態と臨床病理学的特徴との間の関係を要約したものである。145のESCC検体のうち、18検体(12.4%)はPCDH17に対して免疫反応を示し(表4及び図6において陽性)、127検体(87.6%)は免疫反応を示さなかった(表4及び図3Dにおいて陰性)。十分に/適度に分化した腫瘍(病理組織的分類、P=0.032、フィッシャーの直接確率検定)よりも、男性のケース(P=0.015、Χ2検定)及び不十分に分化した腫瘍において、より高頻度にPCDH17の発現が陰性であった。また、pN0腫瘍よりもpH1腫瘍の方がよりPCDH17の発現が陰性である傾向にあった(P=0.086、Χ2検定)。しかし、各腫瘍におけるPCDH17タンパク質発現は他の特徴に関係していなかった。Log rank検定を用いた全体の生存の単変量解析では、PCDH17の発現状態と患者の全体的な生存との間に有意義な関係を証明することはできなかった(図7参照)。しかし、本研究中、pN0 ESCC腫瘍をもったPCDH17陽性患者(n=10)では死亡したものはおらず、それに対し、陰性グループにおける44人の患者中9人(20.5%)が死亡した(図3E参照)。pN0 ESCC腫瘍を伴ったケースでは、PCDH17が陽性及び陰性のグループの間では、臨床病理学的な差異は観察されなかった(表5参照)。これにより、陰性のPCDH17の免疫反応性は、この不利なグループにおいて治療手段の選択を予測するために有用であることが示された。
ESCC細胞株及び臨床腫瘍検体におけるプロモーターのメチル化を介したPCDH17の高頻度な発現消失から、PCDH17は有効なTSGであることが示唆された。PCDH17発現の回復が、当該遺伝子の発現を欠いたESCC細胞の増殖を抑制するかどうか調べるため、PCDH17の全コード配列を有する発現コンストラクトを用いたコロニー・フォーメーションアッセイを行った(図4A参照)。トランスフェクション及び続く薬剤耐性コロニーの選抜の後10日目、空のベクターを導入した対照物のものと比較すると、PCDH17を導入したKYSE170及びKYSE200細胞によって産生された大きなコロニーの数は減少した。予想通り、免疫蛍光染色によれば、異所的に発現したPCDH17タンパク質は主に細胞膜に位置していた(図8参照)。細胞増殖アッセイを、安定形質転換したKYSE170及びKYSE200細胞に対して行った(図4B参照)。FLAGペプチドを付加したPCDH17を安定に発現する細胞(図参照)はわずかに増殖したが、空のベクターを導入した細胞よりも圧倒的に増殖が遅かった(P<0.05、スチューデントのt検定)。ESCC細胞におけるPCDH17が誘発する増殖阻害のメカニズムをさらに調べるため、安定にPCDH17を形質転換したKYSE17及びKYSE200細胞において、細胞周期及び細胞周期に関連する遺伝子の発現に対するPCDH17の異所性発現の影響について調べた(図4C参照)。蛍光標識細胞分取(fluorescence−activated cell sorting; FACS)分析において、空ベクター(mock)の形質転換対照物と比較して、PCDH17形質転換細胞では、G0〜G1期において細胞の蓄積が、S及びG2〜M期の細胞においては減少が観察されたが、一方、サブG1期の細胞において増加は観察されなかった。これにより、PCDH17は、アポトーシスを誘発することなく、G1−SチェックポイントにおけるESCC細胞の停止(G0-G1停止)に貢献していることが示された。コントロール対象物と比較して、PCDH17形質転換KYSE170及びKYSE200細胞では、p21及びp27タンパク質発現における上昇傾向が、また、CCND1タンパク質発現における下降傾向が観察された。
Claims (15)
- 検体において、PCDH17遺伝子の変化を解析する工程を含む、食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子の変化が、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、又は発現低下である、請求項1に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子の不活性化が、CpGアイランドのメチル化による当該遺伝子の不活性化であることを確認する、請求項2に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子の変化を、DNAチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアル・タイム定量RT−PCR法、FISH法、CGH法、アレイCGH法、COBRA法、及びバイサルファイト・シーケンシング法からなる群から選択される少なくとも一つの手法により解析する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子から転写されるmRNA又は翻訳されるタンパク質を検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する、請求項2に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子から翻訳されるタンパク質を免疫染色法により検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する、請求項5に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- 前記検体が、食道組織である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- 検出又は予後を予測する食道癌が、食道扁平上皮癌である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- 検体としてpN0(リンパ節転移を認めない)食道癌の検体を使用して、食道癌の検出の予後を予測する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
- PCDH17遺伝子又はその相同遺伝子を含有する食道癌抑制剤であって、前記相同遺伝子が、配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子である、食道癌抑制剤。
- 前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項10に記載の食道癌抑制剤。
- 前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項11に記載の食道癌抑制剤。
- 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項12に記載の食道癌抑制剤。
- 前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項10に記載の食道癌抑制剤。
- PCDH17タンパク質又はその相同タンパク質を含有する食道癌抑制剤であって、前記相同タンパク質が、配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、食道癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、食道癌抑制剤。
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