JP4620670B2 - 乳癌を診断する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、乳癌の検出および診断の方法、ならびに乳癌および乳癌転移を治療および予防する方法に関する。
乳癌は遺伝的に不均一な疾患であり、女性で最も一般的な悪性腫瘍である。全世界で毎年、推定で約80万件の新たな症例が報告されている(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1999)。CA Cancer J Clin 49: 33-64)。本疾患の治療のための同時併用的な選択肢のうち第一のものは乳房切除術である。原発性腫瘍の外科的除去を行っても、診断時点では検出不可能な微小転移のために局所または遠隔部位での再発が起こる可能性がある(Saphner T, Tommey DC, Gray R (1996). J Clin Oncol, 14, 2738-2746)。このような残存細胞または前癌細胞を死滅させることを狙いとして、手術後には通常、アジュバント療法として細胞毒性薬剤が投与される。
本発明は、乳癌(BRC)と相関する遺伝子発現パターンの発見に基づく。乳癌において差次的に発現される遺伝子は、本明細書において「BRC核酸」または「BRCポリヌクレオチド」と総称され、コードされる対応するポリペプチドは「BRCポリペプチド」または「BRCタンパク質」と呼ばれる。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
本発明の文脈において、BRCは、被験細胞集団(すなわち、患者由来の生物学的試料)からの一つまたは複数のBRC核酸の発現レベルを測定することによって診断される。好ましくは被験細胞集団は、上皮細胞、例えば、乳房組織から得られた細胞を含む。遺伝子発現を、血液または他の体液(尿など)から測定することもできる。他の生物学的試料をタンパク質レベルの測定のために用いることもできる。例えば、診断しようとする対象から得た血液または血清中のタンパク質レベルを、イムノアッセイまたは従来の生物学的アッセイによって測定することができる。
本発明は、対象におけるBRCの組織学的分化度を特定するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
(a)検査する対象から採取した組織試料における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを検出する段階であって、一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表10に列挙された遺伝子からなる群より選択される段階;ならびに
(b)一つまたは複数のマーカー遺伝子の検出された発現レベルを、高分化型症例および低分化型症例に付随してみられる発現レベルと比較する段階;
(c)一つまたは複数のマーカー遺伝子の検出された発現レベルが高分化型症例のものと同程度である場合に、組織試料が高分化型であると判定され、一つまたは複数のマーカー遺伝子の検出された発現レベルが低分化型症例のものと同程度である場合に、組織試料が低分化型であると判定される段階。
BRC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する作用因子は、BRCに関連して上方制御される遺伝子を発現する被験細胞集団を被験作用因子と接触させた後に、BRC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することによって同定することができる。作用因子の存在下での、BRC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが、被験作用因子の非存在下でのその発現または活性レベルと比較して低下していることにより、その作用因子がBRCに関連して上方制御される遺伝子の阻害因子であって、BRCを阻害するのに有用であることが示される。
本明細書で同定された、差次的に発現されるBRC関連遺伝子は、BRCの治療の経過をモニターすることも可能にする。この方法では、BRCに対する治療を受けようとする対象から被験細胞集団を得る。必要に応じて、治療前、治療中、および/または治療後といった種々の時点で被験細胞集団を対象から入手する。続いて、細胞集団におけるBRC関連遺伝子の一つまたは複数の発現を決定し、BRCの状態が判明している細胞を含む参照細胞集団と比較する。本発明の文脈において、参照細胞は、関心対象の治療を受けていない必要がある。
個体における遺伝的構成の差によって、個体が様々な薬剤を代謝する相対的能力に差が起こりうる。対象において代謝されて抗BRC物質として作用する物質は、対象の細胞において、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化しうる。したがって、物質が対象において適したBRC阻害物質であるか否かを決定するために、本明細書に開示される発現差のあるBRC関連遺伝子によって、選択された対象由来の被験細胞集団において、治療効果があるまたは予防効果があると推定されるBRC阻害物質が適切かどうかを調べることができる。
本明細書に開示した、差次的に発現されるBRC関連遺伝子を、BRCを治療するための候補治療剤を同定するのに用いることもできる。本発明の方法は、候補治療剤が、BRC状態に特徴的な表3〜8に列挙されたBRC関連遺伝子のうち一つまたは複数の発現プロファイルを、非BRC状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと変換させうるか否かを判定することを目的に、候補治療剤をスクリーニングすることを含む。
a)被験化合物を、表3、4、5、6、7、または8に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに接触させる段階;
b)ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;および
c)ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する段階。
a)候補化合物を、表3、4、5、6、7、または8に列挙された遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に接触させる段階;および
b)表3、5、および7に列挙された遺伝子からなる群より選択される、一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、または表4、6、および8に列挙された遺伝子からなる群より選択される、一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。
マーカー遺伝子を発現する細胞には、例えば、BRCから樹立された細胞株が含まれる;このような細胞は本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。
a)被験化合物を、表3、4、5、6、7、または8に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに接触させる段階;
b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
c)被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、表3、5、および7に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制するか、または表4、6、および8に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的活性を高める化合物を選択する段階。
a)候補化合物を、表3、4、5、6、7、または8に列挙された遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域とその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞に接触させる段階;
b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
c)該マーカー遺伝子が表3、5、および7に列挙された遺伝子からなる群より選択される、上方制御されるマーカー遺伝子である場合、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して該レポーター遺伝子の発現または活性を減少させるか、または該マーカー遺伝子が表4、6、および8に列挙された遺伝子からなる群より選択される、下方制御されるマーカー遺伝子である場合、候補化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを高める、候補化合物を選択する段階。
本発明は、乳癌の転移を治療または予防するための標的分子を提供する。本発明のBRC転移に関するスクリーニングアッセイは、上記のBRCに対する方法に従い、BRC転移との関連性のあるマーカー遺伝子を用いて行うことができる。
本発明はまた、BRCを有する対象の予後を評価する方法であって、被験細胞集団における一つまたは複数のBRC関連遺伝子の発現を、全疾患病期にわたる患者から得られた参照細胞集団における同じBRC関連遺伝子の発現と比較する段階を含む方法も提供する。被験細胞集団および参照細胞集団における一つもしくは複数のBRC関連遺伝子の遺伝子発現を比較することにより、または対象から得られた被験細胞集団の経時的な遺伝子発現のパターンを比較することにより、対象の予後を評価することができる。
本発明にはまた、BRC検出試薬、例えばBRC核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、一つもしくは複数のBRC核酸に特異的に結合するかもしくはそれを同定する核酸か、またはBRC核酸にコードされる一つもしくは複数のタンパク質に結合する抗体が含まれる。検出試薬は、キットの形で共に包装されていてもよい。例えば検出試薬、例えば核酸または抗体(固相マトリクスに結合させるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは別に包装される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、ならびに/または検出標識は、異なる容器に包装されていてもよい。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROM等)がキットに含まれていてもよい。キットのアッセイフォーマットは、当技術分野でいずれも既知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであってもよい。
本発明にはまた、一つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイも含まれる。アレイ上の核酸は、表3〜8に列挙されたBRC関連遺伝子によって示される一つまたは複数の核酸配列に特異的に対応する。表3〜8に列挙されたBRC関連遺伝子によって表される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、もしくは50個またはそれ以上の発現レベルは、アレイに結合する核酸を検出することによって同定されうる。
本発明はさらに、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子のうちの一つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を低下させるか、または表4、6、および8に列挙されたBRC関連遺伝子のうちの一つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を上昇させることにより、対象におけるBRCの症状を治療または軽減するための方法も提供する。適した治療用化合物を、BRCに罹患している対象またはBRC発症のリスク(もしくはそれに対する感受性)を有する対象に対して、予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準的な臨床的方法を用いて、または表3〜8に列挙されたBRC関連遺伝子のうちの一つまたは複数の異常な発現レベルもしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することにより、同定することができる。本発明の文脈において、適した治療薬には、例えば、細胞周期調節、細胞増殖、およびプロテインキナーゼ活性の阻害物質が含まれる。
上記のように、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸は、遺伝子の発現レベルを低下させるために用いることができる。乳癌において上方制御される、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子に対応するアンチセンス核酸は、乳癌の治療のために有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子またはそれらに対応するmRNAと結合することによって作用し、それによって遺伝子の転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/または表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、それらによってタンパク質の機能を阻害することができる。本明細書で用いる「アンチセンス核酸」という用語には、標的配列に対して完全に相補的なヌクレオチドと、アンチセンス核酸が標的配列と特異的にハイブリダイズしうるという条件付きで、一つまたは複数のヌクレオチドにミスマッチがあるヌクレオチドとの両方が含まれる。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15個の連続したヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも70%またはそれ以上、好ましくは少なくとも80%またはそれ以上、より好ましくは少なくとも90%またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも95%またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。相同性の決定には当技術分野で知られたアルゴリズムを用いうる。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque, J. M.Triques,K. and Stevenson, M (2002) 「Modulation of HIV-1 replication by RNA interference.」Nature, Vol. 418:435-438。
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UUCAAGAGA:Dykxhoorn, D. M., Novina, C. D. and Sharp, P. A. (2002) 「Killing the messenger:Short RNAs that silence gene expression.」Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457-467。
TOPK-siRNAに対して:
gaacgauauaaagccagcc-[b]-ggcuggcuuuauaucguuc(SEQ ID NO:25の標的配列に対して);
cuggaugaaucauaccaga-[b]-ucugguaugauucauccag(SEQ ID NO:28の標的配列に対して);
guguggcuugcguaaauaa-[b]-uuauuuacgcaagccacac(SEQ ID NO:31の標的配列に対して)。
1.対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。有望なsiRNA標的部位として、各AAおよび3'隣接ヌクレオチド19個の出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。
2.有望な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較して、他のコード配列と有意な相同性を有する如何なる標的配列も検討から除外する。相同性検索は、NCBIサーバー、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において認められうるBLASTを用いて行うことができる。
3.合成のために適格な標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
または、BRCにおいて過剰発現された遺伝子の一つまたは複数の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物に結合する化合物、さもなければ遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害されうる。例えば、化合物は、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明はまた、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子(すなわち、上方制御される遺伝子)からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象における乳癌を治療または予防する方法にも関する。ポリペプチドの投与は、対象において抗腫瘍免疫を誘導する。抗腫瘍免疫を誘導するために、表3、5、および7に列挙されたBRC関連遺伝子からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの免疫学的活性断片、または該ポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを、治療または予防が必要な患者に投与する。さらに、表5および7に列挙されたBRC関連遺伝子からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチドは、乳癌およびIDCの浸潤に対してそれぞれ抗腫瘍免疫を誘導しうる。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片はBRCに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体(TCR)に結合した形で投与してもよく、またはマクロファージ、樹状細胞(DC)、もしくはB-細胞のような抗原提示細胞(APC)によって提示された形で投与してもよい。DCの強い抗原提示能のため、APCの中では、DCを用いることが最も好ましい。
−腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
−腫瘍を認識する抗体の誘導、および
−抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
本発明の文脈において、適切な薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所(口腔内および舌下を含む)、膣内、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で用量単位ごとに個別に包装される。
疾病状態、例えば、BRCにおいて差次的に発現される遺伝子を同定するために、罹患組織(例えば、BRC由来の上皮細胞)および正常組織から入手した組織を評価した。アッセイは以下の通りに行った。
癌研究会附属病院乳腺外科部門(Department of Breast Surgery、Cancer Institute Hospital、東京、日本)で治療を受けた81例の患者(非浸潤性乳管癌12例および浸潤性乳管癌69例、2cm〜5cm(T2)、年齢の中央値45歳、21〜68歳の範囲)から、インフォームドコンセントを伴って原発性乳癌を入手し(表12)、このことに関しては全ての患者からインフォームドコンセントを得た。臨床情報を診療記録から入手し、かつそれぞれの腫瘍を病理学者が病理組織学的なサブタイプおよびグレードに従って診断した。腫瘍組織を用いて腫瘍の種類を評価した(世界保健機構(World Health Organization)の分類および日本癌学会の分類による)。臨床病期はJBCSのTNM分類に従って判断した。リンパ節陽性症例とリンパ節陰性症例との間に有意差は観察されなかった。血管侵入性増殖および広範囲にわたるリンパ球浸潤の存在は病理学者が判定した。エストロゲン受容体(ER)およびプロゲステロン受容体(PgR)の発現はEIAにより判定した(13fmol/mgタンパク質未満であればER陰性、BML)。閉経前乳癌患者15例または閉経後患者12例からの正常乳管細胞の混合物をそれぞれ正常対照として用いた。試料はすべて直ちに凍結し、-80℃で保存した。
腫瘍に関する臨床情報および病理学的情報は表12に詳述されている。試料はTissueTek OCT媒質(Sakura)中に包埋した後に使用時まで-80℃で保存した。凍結標本をクリオスタットで連続的に切片化して8μmの切片とし、分析する領域を規定するためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。癌細胞と非癌細胞の交差汚染を避けるために、EZ Cut LMM System(SL Microtest GmbH)を製造元のプロトコールにいくつかの修正を加えて用いることによって、これら2つの集団を調製した。貯蔵工程および組織採取の間の影響を最小化するために、癌組織を同じ手順によって慎重に取り扱った。RNAの質を調べるために、各症例の残りの組織から抽出した全RNAを変性アガロースゲル中で電気泳動し、リボソームRNAバンドの存在によってそれらの質を確認した。
レーザーで捕捉した細胞の各集団から、全RNAを350μlのRLT可溶化バッファー(QIAGEN)中に抽出した。抽出したRNAを、30単位のDNase I(QIAGEN)により室温で30分間処理した。70℃において10分間失活させた後に、製造元の推奨に従ってRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用い、RNAを精製した。DNase Iで処理したRNAすべてを、Ampliscribe T7転写キット(Epicentre Technologies)を用いた、T7に基づく増幅に供した。2回の増幅により、各試料に関して28.8〜329.4μgの増幅RNA(aRNA)が得られ、一方、15例の閉経前患者または12例の閉経後患者からの正常試料からのRNAを増幅した場合には、それぞれ合計2240.2μgおよび2023.8μgが得られた。それぞれの癌性乳管細胞および非癌性乳管細胞からのaRNAの2.5μgアリコートを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP(Amersham Biosciences)の存在下で逆転写させた。
National Center for Biotechnology Information(NCBI)のUniGeneデータベース(ビルド番号131)から選択した23,040種のcDNAを含む「ゲノムワイド」cDNAマイクロアレイシステムを確立した。cDNAマイクロアレイスライドの製作については別稿に記載されている(Ono K, Tanaka T, Tsunoda T, Kitahara O, Kihara C, Okamoto A, Ochiai K, Katagiri T and Nakamura Y.「Identification by cDNA Microarray of Genes Involved in Ovarian Carcinogenesis.」Cancer Res., 60, 5007-11, 2000)。手短に述べると、種々のヒト臓器から単離したポリ(A)+RNAを鋳型として用いる逆転写PCRによってcDNAを増幅した;アンプリコンの長さは反復配列またはポリ(A)配列を含まずに200〜1100bpの範囲とした。Lucidea Array Spotter(Amersham Biosciences)を用いて、PCR産物を7型スライドガラス(Amersham Bioscience)上に2箇所ずつスポットした;4,608種または9,216種の遺伝子を単一のスライド上に2箇所ずつスポットした。それぞれ同じ52種類のハウスキーピング遺伝子および2種類の陰性対照遺伝子もスポットした、3種類の異なるスライドのセット(合計23,040種の遺伝子)を調製した。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、すべての工程をAutomated Slide Processor(Amersham Biosciences)により行った点を除き、以前に記載されたプロトコールに従って行った(Giuliani, N. et al., V.「Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes:a potential role in multiple myeloma bone disease.」Blood, 100:4615-4621, 2002)。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度を、ArrayVisionコンピュータプログラム(Amersham Biosciences)により測定光度を算出し、バックグラウンド強度を差し引いた。52種のハウスキーピング遺伝子からの平均化シグナルを用いて、平均Cy5/Cy3比が得られるように、各標的スポットに対するCy5(腫瘍)およびCy3(対照)の蛍光強度を調整した。低いシグナル強度から得られるデータの信頼性は低いため、各スライド上のシグナル強度に対してカットオフ値を設定し、Cy3色素およびCy5色素の両方でカットオフ値よりも低いシグナル強度が得られた場合には、遺伝子をさらなる分析から除外した。各発現レベルに関するカットオフ値は、バックグラウンド変動に従って自動的に計算された。Cy5およびCy3のシグナル強度がいずれもカットオフ値より低い場合には、その試料において対応する遺伝子の発現は存在しないとして評価した。Cy5/Cy3比は相対的な発現比として算出した。他の遺伝子に関しては、各試料の生データを用いてCy5/Cy3比を算出した。
cDNAマイクロアレイを用いた29個の正常ヒト組織における遺伝子発現プロファイルによると、ペリリピン(PLIN)および脂肪酸結合タンパク質4(FABP4)は脂肪組織および乳腺組織でのみ発現された(Saito-Hisaminato, A. et al., Genome-wide profiling of gene expression in 29 normal human tissues with a cDNA microarray. DNA Res, 9: 35-45, 2002)。これらを、マイクロダイセクションされた正常乳管上皮細胞の集団に存在する脂肪細胞の割合の評価に用いた。正常全乳腺(Clontech)から単離されたポリA+RNA、およびマイクロダイセクションされた正常乳管上皮細胞のそれぞれのaRNAを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下で逆転写させた。マイクロアレイスライド上でのハイブリダイゼーションの後に、Cy5/Cy3比を算出した。それぞれの比の平均を、閉経前患者および閉経後患者における乳腺組織およびマイクロダイセクションされた正常乳管細胞を用いた結果によって決定した。
遺伝子および腫瘍の両方に対して教師なし階層クラスタリングの方法を適用した。102例の試料の分類に関して再現性のあるクラスターを得るために、実験の80%で有効データが得られていて、その発現比が1.1を上回る標準偏差で変化した710個の遺伝子を選択した。分析は、M. Eisenが作成した、ウェブ上で入手可能なソフトウエア(「Cluster」および「TreeView」)(http://genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/restech.html)を用いて行った。クラスタリングアルゴリズムを適用する前に、各スポットに関する蛍光比を対数変換し、続いて実験的偏りを除くために各試料に関してデータの中央値のセンタリングを行った上で平均連結法を用いた。
各遺伝子の相対的発現比(Cy5/Cy3強度比)を、4つのカテゴリーのいずれかに分類した:(A)上方制御される(発現比>2.0);(B)下方制御される(発現比<0.5);(C)変化なし(発現比が0.5〜2.0の間);および(D)発現されず(またはわずかな発現はあるが検出のカットオフレベル未満)。これらのカテゴリーを用いて、試料間での発現比の変化が共通している遺伝子のセットを検出した。各群において通常上方制御または下方制御される候補遺伝子を検出するために、23,040個の遺伝子の全体的な発現パターンをまずスクリーニングして、分類された群の50%超に存在し、発現比が>3.0または<1/3である遺伝子を選択した。
上方制御される5つの遺伝子を選択し、半定量的RT-PCR実験を適用することによってそれらの発現レベルを調べた。各試料からのaRNAの1μgのアリコートを、ランダムプライマー(Taniguchi, K., et al., Mutational spectrum of beta-catenin、AXIN1 and AXIN2 in hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Oncogene, 21: 4863-4871, 2002)およびSuperscript II(Life Technologies, Inc.)を用いて一本鎖cDNAへと逆転写した。各cDNA混合物を、表9に示したプライマーセットを用いるPCR増幅を次に行うために希釈した。GAPDHの発現を内部対照として用いた。PCR反応は、産物強度が直線的増幅期に確実にあるようにサイクル数に関して最適化した。
識別性のある遺伝子を、以下の2つの基準を用いて選択した:(1)シグナル強度が、症例の少なくとも70%(ER状態)または50%(組織病理学的状態およびリンパ節転移)でカットオフレベルを上回る;(2)症例の|Medr-Medn|が1を上回る(ER状態)または0.5を上回る(組織病理学的状態およびリンパ節転移)(ここでMedは、リンパ節陽性症例または陰性症例における対数変換された相対的発現比から得られた中央値である)。次に、ランダム順列検定を、一方の群(A群)ともう一方の群(B群)との間で差次的に発現される遺伝子を同定するために適用した。平均(μ)および標準(σ)偏差を、A群(r)およびB群(n)の症例における各遺伝子の対数変換された相対的発現比から算出した。各遺伝子に関する識別スコア(DS)は以下の通りに定義した:
DS=(μr-μn)/(σr+σn)
順列検定は、個々の遺伝子がA群とB群とを識別する能力を評価する目的で行い;2つのクラス間での試料のランダムな並び替えを10,000回行った。各遺伝子のDSデータセットは正規分布を示したため、ユーザー定義によるグループ分けに関してP値を算出した(Golub, T. et al., Molecular classification of cancer:class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 286: 531-537, 1999)。
予測スコアを、以前に記載された手順に従って算出した(Golub, T. et al., Molecular classification of cancer:class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 286: 531-537, 1999)。各遺伝子(gi)は、試料における発現レベル(xi)が参照試料におけるリンパ節陰性または陽性のいずれの平均発現レベルに近いかどうかに応じて、リンパ節陰性またはリンパ節陽性のいずれかに票を投じる。得票の多さ(vi)は、試料における発現レベルの、2つのクラスの平均からの偏差を反映する:
Vi= | xi-(μr+μn)/2 |
PS =(Vr-Vn)/(Vr+Vn)×100、これはリンパ節陰性またはリンパ節陽性のいずれかの方向への優位度を反映している。PS値は-100〜100の範囲にあり;PSの絶対値が高いほど、強力な予測であることを示す。
分類スコア(CS)を、各遺伝子セットにおけるリンパ節陰性(PSr)およびリンパ節陽性(PSn)の予測スコアから、以下の通りに算出した。:
CS =(μPSr-μPSn)/(σPSr+σPSn)
ヒト乳癌細胞株HBL-100、HCC1937、MCF-7、MDA-MB-435s、YMB1、SKBR3、T47D、BT-20、BT-474、BT-549、HCC1143、HCC1500、HCC1599、MDA-MB-157、MDA-MB453、OUCB-F、ZR-75-1、COS-7細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)から購入し、それぞれの寄託者の推奨に従って培養した。HBC4、HBC5およびMDA-MB-231細胞株は、財団法人癌研究会癌化学療法センター分子薬理部(Molecular Pharmacology、Cancer Chemotherapy Centre of the Japanese Foundation for Cancer Research)の矢守博士により寄贈いただいた。細胞はすべて適切な培地中で培養した。すなわち、RPMI-1640(Sigma, St. Louis, MO)をHBC4、HBC5、T47D、YMB1、OUCB-F、ZR-75-1、BT-549、HCC1143、HCC1500、HCC1599およびHCC1937に対して使用し(2mM L-グルタミンを添加);ダルベッコ変法イーグル培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)をBT474、HBL100、COS7に対して使用し;0.1mM必須アミノ酸(Roche)、1mMピルビン酸ナトリウム(Roche)、0.01mg/mlインスリン(Sigma)を加えたEMEM(Sigma)をBT-20およびMCF-7に対して使用し;McCoy(Sigma)をSKBR3に対して使用し(1.5mM L-グルタミンを添加);L-15(Roche)をMDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB453およびMDA-MB-435Sに対して使用した。それぞれの培地には、10%ウシ胎仔血清(Cansera)および1%抗生物質/抗菌性溶液(Sigma)を加えた。MDA-MB-231細胞およびMDA-MB-435S細胞は、CO2を含まない加湿空気雰囲気中で37℃に保った。他の細胞株は、5% CO2を含む加湿空気雰囲気中で37℃に保った。臨床試料(乳癌および正常乳管)は、すべての患者からインフォームドコンセントを得た上で、手術標本から入手した。
すべての乳癌細胞株から、RNeasyキット(QIAGEN)を製造元の指示に従って用いて全RNAを抽出した。DNA分解酵素I(Nippon Gene、大阪、日本)による処理の後に、mRNA精製キット(Amersham Biosciences)を製造元の指示に従って用いて、mRNAを単離した。各mRNAの1μgのアリコートを、正常成人の乳房(Biochain)、肺、心臓、肝臓、腎臓、骨髄(BD, Clontech, Palo Alto, CA)から単離したポリA(+)RNAとともに1%変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写した(乳癌ノーザンブロット)。乳癌ノーザンブロットおよびヒト多組織ノーザンブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を、RT-PCRによって調製したA7870の[α32P]-dCTP標識PCR産物とハイブリダイズさせた(下記参照)。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを用いて-80℃で14日間行った。A7870(320bp)に対する特異的プローブは、以下のプライマーセット:5'-AGACCCTAAAGATCGTCCTTCTG-3'(SEQ ID NO:13)および5'-GTGTTTTAAGTCAGCATGAGCAG-3'(SEQ ID NO:14)を用いるRT-PCRによって調製し、メガプライムDNA標識システム(Amersham bioscience)により放射性標識した。
A7870発現ベクターを構築するため、A7870 cDNAの全コード配列を、KOD-Plus DNAポリメラーゼ(Toyobo、大阪、日本)を用いるPCRによって増幅した。そのPCR産物を、pCAGGSn3FH-HA発現ベクターのEocRI部位およびXhoI部位に挿入した。この構築物(pCAGGS-A7870-HA)をDNAシークエンシングによって確認した。次に、外因性A7870の細胞内局在をまず調べるために、本発明者らは外因性発現用にCOS7細胞を1×105個/ウェルで播いた。24時間後に、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造元の指示に従って用いて、COS7細胞に対してそれぞれ1μgのpCAGGS-A7870-HAを一時的にトランスフェクトした。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドを含むPBSにより15分間固定し、0.1% Triton X-100を含むPBSを4℃で2.5分間用いて透過させた。続いて、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために、細胞を3% BSAを含むPBSにより4℃で12時間覆った。次に、A7870-HAをトランスフェクトしたCOS7細胞を、1:1000に希釈したマウス抗HA抗体(SANTA CRUZ)および1:1000に希釈した抗TOPKポリクローナル抗体(Cell Signaling)とともにインキュベートした。PBSで洗浄した後に、両方のトランスフェクト細胞を、1:5000に希釈したAlexa594結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)によって染色した。
本発明者らは、ベクターに基づくRNAiシステムを、以前の報告に従って、psiU6BX3.0 siRNA発現ベクターを用いて確立した(Shimokawa T, Furukawa Y, Sakai M, L. M.Miwa N, Lin YM, Nakamura Y (2003) Cancer Res、63, 6116-6120)。A7870に対するsiRNA発現ベクター(psiU6BX-A7870)は、psiH1BX3.0ベクターのBbsI部位への、表13中の二本鎖オリゴヌクレオチドのクローニングによって調製した。対照プラスミドであるpsiU6BX-SCおよびpsiU6BX-LUCは、SC(スクランブル対照)用の5'-TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'(SEQ ID NO:15)および5'-AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'(SEQ ID NO:16);LUC(ルシフェラーゼ対照)用の5'-TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG-3'(SEQ ID NO:17)および5'-AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTATTCCGCGTACG-3'(SEQ ID NO:18)の二本鎖オリゴヌクレオチドを、それぞれpsiU6BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。
ヒト乳癌細胞株T47DまたはBT-20を15cm皿に播き(4×106細胞/皿)、FuGENE6試薬を供給元(Roche)の推奨に従って用いて、psiU6BX-LUC(ルシフェラーゼ対照)、陰性対照としてpsiU6BX-SC(スクランブル対照)、およびpsiU6BX-A7870の各16μgでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をコロニー形成アッセイ(2×106細胞/10cm皿)、RT-PCR(2×106細胞/10cm皿)、およびMTTアッセイ(2×106細胞/ウェル)のために再び播いた。T47DまたはBT-20細胞におけるA7870導入細胞を、それぞれ0.7mg/mlまたは0.6mg/mlのネオマイシン(Geneticin、Gibco)を含む培地を用いて選択した。その後に、本発明者らは培地を3週間にわたり2日毎に交換した。siRNAの機能を評価するために、ネオマイシン選択後11日目に細胞から全RNAを抽出し、A7870およびGAPDHに対する以下の特異的なプライマーセットを用いる半定量的RT-PCRにより、siRNAのノックダウン作用を確認した;内部対照としてGAPDH用に5'-ATGGAAATCCCATCACCATCT-3'(SEQ ID NO:19)および5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQ ID NO:20)、ならびにA7870用に5'-GCCTTCATCATCCAAACATT-3'(SEQ ID NO:21)および5'-GGCAAATATGTCTGCCTTGT-3'(SEQ ID NO:22)。
乳癌の正確な遺伝子発現プロファイルに基づく分類分析:
乳癌は腫瘍塊の中に癌細胞の少数集団を含み、正常上皮乳管細胞から発生するため、周囲の非癌細胞または正常でない乳管上皮細胞の混入を避けるためにマイクロダイセクション法を行った。乳房組織中の細胞の大部分は脂肪細胞であるため、この臓器における癌特異的発現プロファイルを分析するために乳房組織全体を用いることは適切でないと考えられた。図1に示されているように、DCIS(症例10326T)、IDC(10502T)および正常乳管上皮(10341N)の各臨床標本由来の代表例をマイクロダイセクションした。これにより、以降の遺伝子発現プロファイルをより正確に得ることが可能になる。普遍的な対照としての役割を果たす、正常乳管上皮細胞のマイクロダイセクションされた集団に混入した脂肪細胞の割合を、以前に記載されたように、脂肪および乳腺組織で高発現される2つの遺伝子(すなわち、PLINおよびFABP4)のシグナル強度を測定することによって調べた(Saito-Hisaminato, A., et al., Genome-wide profiling of gene expression in 29 normal human tissues with a cDNA microarray. DNA Res, 9: 35-45, 2002)。これらの遺伝子のシグナル強度を、多数の脂肪細胞を含む全乳腺組織で調べたところ、これらの遺伝子のシグナル強度の比の平均は約99.4%であった。マイクロダイセクションされた正常乳管上皮細胞における比は約0.6%であった(「材料および方法」の混入率の項を参照されたい)。したがって、対照細胞の集団における混入脂肪細胞の平均的な割合は、マイクロダイセクション後には0.6%であると推定された。まず、遺伝子群に対して、102個の臨床試料、すなわちマイクロダイセクションされた81個の異なる乳癌臨床標本、10個体においてマイクロダイセクションされた11個の異なる組織型、2個の全乳癌組織、マイクロダイセクションされた6個の正常乳管細胞、および2個の全乳腺組織)における、それらの発現パターンの類似性に基づき、教師なし二次元階層クラスタリングアルゴリズムを適用した。再現性のあるクラスターが710個の遺伝子から得られた(「材料および方法」を参照)。102個の試料にわたるそれらの発現パターンを図2Aに示す。試料軸には、102個の試料が、それらの発現プロファイルに基づいて3つの主な群(群A、B、およびC)にクラスター化されている。次に、この分類を臨床的パラメーター、特にEIAを用いて判定したエストロゲン受容体(ER)と関連づけた。55例のER陽性腫瘍のうち、45例は腫瘍樹状図の同じ分枝(B群)にクラスター化され、このことからER状態の傾向が示唆された。さらに、独立した実験で標識およびハイブリダイゼーションを行った、異なる組織型の10例のうち7例(試料番号10864、10149、10818、10138、10005、10646および10435)は、同じ群内に非常に近接してクラスター化された。特に、これらのうち、重複した1例(10149a1および10149a1T)はまた、最も短い分枝中にクラスター化され、このことからこのマイクロアレイデータの再現性および信頼性が裏づけられた。注目されることに、C群はマイクロダイセクションされた非癌細胞、およびマイクロダイセクションされた1例の腫瘍症例を除く乳癌の全組織を含んでおり、このことはこのデータが正確な乳癌特異的発現プロファイルを示すことを示唆している。
乳癌の発生の基礎をなす機序を明らかにするために、DCISおよびIDCにおいて通常、上方制御または下方制御される遺伝子をそれぞれ調べた。77例の乳癌(DCIS 8例およびIDC 69例の閉経前患者)における遺伝子発現プロファイルにより、通常発現に変化がみられる325個の遺伝子が同定された(図4A、4B)。78個の遺伝子は通常、正常乳管細胞におけるレベルと比較して3倍を上回って上方制御されるが(図4A、図4B、表3、表5)、247個の遺伝子は乳癌細胞において発現が1/3未満に低下した(図4A、4B、表4、6)。特に、図4Bに示されているように、25個の遺伝子の発現レベルは、DCISからIDCへの移行において上昇し、49個の遺伝子のそれは低下した(表5および表6)。発現が上昇した遺伝子の中には、乳癌で過剰発現されると既に報告されているフィブロネクチン(FN1)が含まれていた(表4)(Mackay, A. et al., cDNA microarray analysis of genes associated with ERBB2 (HER2/neu) overexpression in human mammary luminal epithelial cells. Oncogene, 22: 2680-2688, 2003;Lalani, E. N. et al., Expression of the gene coding for a human mucin in mouse mammary tumor cells can affect their tumorigenicity. J Biol Chem, 266: 15420-15426, 1991.22; Martin-Lluesma, S., et al., A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science, 297: 2267-2270, 2002)。一方、発現が低下した遺伝子の中には、腫瘍抑制因子として機能することが知られているST5およびSCHIP1も含まれていた(表6)。
cDNAマイクロアレイ解析によって得られた発現データの信頼性を確認するため、情報の得られた高分化型症例において高度に上方制御されていた3個の遺伝子(アクセッション番号AI261804、AA205444、AA167194)、および有益な低分化型症例において同様に高度に上方制御されていた2個の遺伝子(AA676987およびH22566)に対して、半定量的RT-PCR実験を行った。被験症例の大部分において、RT-PCRの結果はマイクロアレイ解析の結果とよく一致した(図5、表9)。
本発明者らは、IDCにおいて上方制御される24個の遺伝子を同定した(表7)。それらのうち、本発明者らは、T-LAK細胞から生じるプロテインキナーゼ、TOPK(Genbankアクセッション番号NM_018492)と呼ばれ、mRNA転写産物が8つのエクソンからなる1899塩基長であって、染色体8p21.2上に位置する、A7870に注目した。A7870の発現は、発現データが入手可能であった乳癌症例39例中30例(77%)において上昇しており、特に浸潤性乳管癌標本を含む36症例中29例(81%)で上昇していた。この遺伝子の乳癌における発現パターンを確かめるために、本発明者らは、乳癌細胞株および(正常乳房細胞を含む)正常ヒト組織を用いた半定量的RT-PCR分析を行った。その結果、A7870は12個の臨床的乳癌標本(高分化型)中7個で、正常乳管細胞および他の正常組織と比較して発現が上昇し(図6a)、20個の乳癌細胞株のうち17個で過剰発現される(図6b)ことが見いだされた。この遺伝子の発現パターンをさらに調べるために、本発明者らは、ヒト多組織および乳癌細胞株を用いて、A7870のcDNA断片(320bp)をプローブとして用いるノーザンブロット分析を行った(図7a)。その結果、正常ヒト精巣および胸腺では2つの転写産物(約1.9kbおよび1.8kb)のみが発現されていた。乳癌ノーザンブロットを用いてこれらの転写産物の発現パターンをさらに調べたところ、本発明者らは、この両方の転写産物が正常ヒト組織と比較して、乳癌細胞株において特異的に過剰発現されることを見いだした(図7b)。
A7870の2つの転写産物のシークエンシング解析により、A7870の2つの変種は同じオープンリーディングフレーム(ORF)を含むため、本発明者らは、二重特異性のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MAPKK)ファミリーに関連するセリン/トレオニンキナーゼであるタンパク質をコードする、TOPK(Genbankアクセッション番号NM_018492)に注目した。SMARTコンピュータ予測により、TOPKはpfam、pキナーゼモチーフを32〜320残基に含むことが示され、これによりこのタンパク質は、細胞形態形成および細胞増殖において役割を果たすシグナル伝達経路に関与する可能性が示唆される。
A7870の特徴をさらに詳細に調べるために、本発明者らは、哺乳動物細胞におけるこれらの遺伝子産物の細胞内局在を調べた。まず、A7870タンパク質を発現するプラスミド(pCAGGS-A7870-HA)をCOS7細胞に一過性にトランスフェクトしたところ、抗HAタグ抗体およびTOPKポリクローナル抗体を用いた免疫細胞化学分析により、外因性A7870タンパク質が細胞質に局在し、特にトランスフェクトされた全てのCOS7細胞において核膜周囲に強いシグナルがみられることが判明した(図8a)。さらに、本発明者らは、抗TOPKポリクローナル抗体を用いる免疫細胞化学染色により、内因性タンパク質の細胞内局在を調べた。この場合も同様に、A7870タンパク質はT47D、BT-20およびHBC5細胞において細胞小器官および核周囲にあることが観察された(図8b)。
A7870の増殖促進の役割を評価するために、本発明者らは、A7870の過剰発現を示した乳癌細胞株T47DおよびBT-20において、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)法(「材料および方法」参照)によって内因性A7870の発現をノックダウンした。A7870の発現レベルを半定量的RT-PCR実験によって調べた。A7870(si1、si3およびsi4)特異的siRNAは、対照siRNA構築物(psiU6BX-LUCまたは-SC)と比較して発現を有意に抑制した。A7870特異的siRNAによる細胞増殖阻害を確認するため、本発明者らはコロニー形成アッセイおよびMTTアッセイをそれぞれ行った。その結果、A7870 siRNA構築物の導入によりこれらの乳癌細胞の増殖が抑制され、これはこの遺伝子の発現が低下した上記の結果に一致した。それぞれの結果は3回の独立した実験によって検証された。したがって、本発明者らの所見は、A7870が乳癌の細胞増殖において重要な機能を有することを示唆している。
本発明の1つの目標は、一部の患者において、異なる表現型で一貫して上方制御または下方制御される遺伝子を発見することであった。しかし、乳癌は不均一な様々な表現型を示すため、顕微鏡による組織病理学的な分化は、図2に示されたような遺伝子発現パターンによる教師なし分類を用いて、明確には識別されなかった。この観察をさらに詳細に調べるために、ランダム順列検定を行い、高分化型と低分化型症例とを識別しうる206個の遺伝子を抽出した。これらの206個の識別性のある遺伝子はすべて、31例の高分化型癌と24例の低分化型癌の間でP<0.01のレベルで有意であった(図9、表10)。これらの206個の遺伝子を用いた二次元階層クラスター分析により、IDCの異なる構成要素(高分化型、中分化型および低分化型)に関して群を分類することができた。A群クラスターには、低分化型試料で著しく発現が亢進していた遺伝子(横の列における分枝1);細胞外マトリックス構造(COL1A2、COL3A1およびP4HA2)、細胞接着(LOXL2、THBS2およびTAGLN2)が含まれ、B群クラスターには、主として高分化型および中分化型の試料において発現が亢進していた遺伝子(横の列における分枝2);転写調節(BTF、WTAP、HTATSF1)、細胞周期調節因子(CDC5L、CCT7)が含まれた。しかしながら、B群における2例の低分化型試料(試料番号10709および10781)は、低分化型よりむしろ高分化型の特徴に類似した発現パターンを示した。いくつかの高分化型試料は、低分化型に特徴的ないくつかの遺伝子の共発現を示した。
乳癌では、腋窩リンパ節への浸潤が最も重要な予後因子である(Shek, L. L. and Godolphin, W. Model for breast cancer survival: relative prognostic roles of axillary nodal status, TNM stage, estrogen receptor concentration, and tumor necrosis. Cancer Res, 48: 5565-5569, 1988)。選択した遺伝子の発現プロファイルを用いて、腋窩リンパ節転移の予測のためのスコア化パラメーターを得るための式を開発するために、20例のリンパ節陽性症例および20例のリンパ節陰性症例の発現プロファイルを比較した。上記の基準に従って、0.0001未満の順列p値を示した93個の識別性のある遺伝子をまず選択した。続いて、候補リストから、リンパ節陽性症例と陰性症例との最も良い分離を示した上位34個の遺伝子を得た(表11)。図10Aに示されているように、これらの34個の遺伝子を用いた階層クラスター分析により、40例の乳癌症例がすべて、リンパ節の状態にしたがって2つの群のいずれかに分類された。
乳癌は、遺伝因子、環境因子およびホルモン因子間の相互作用の結果として発生する多因子疾患である。乳癌の明確なの病理学的病期が記載されているが、これらの病期の間の分子的な差異はほとんど明らかになっていない(McGuire, W. L. Breast cancer prognostic factors: evaluation guidelines. J Natl Cancer Inst, 83: 154-155, 1991.;Eifel, P., et al., National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement:adjuvant therapy for breast cancer. November 1-3, 2000. J Natl Cancer Inst, 93: 979-989, 2001.;Fisher, B., et al., Twenty-year follow-up of a randomized trial comparing total mastectomy, lumpectomy, and lumpectomy plus irradiation for the treatment of invasive breast cancer. N Engl J Med, 347: 1233-1241, 2002)。
レーザービームを用いた切除法(laser-capture dissection)とゲノム全体のcDNAマイクロアレイとの組み合わせによって得られた、本明細書に記載の乳癌の遺伝子発現解析によって、癌の予防および治療の標的となる特異的遺伝子が同定された。これらの発現差のある遺伝子サブセットの発現に基づいて、本発明は、乳癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
Claims (15)
- IDC細胞を検出する方法であって、患者由来の乳癌細胞を含むことが疑われる組織試料におけるBRC番号456の発現のレベルを決定する段階を含み、該試料の発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることによって、前記組織試料がIDC細胞を含むことを示す方法。
- 試料の発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%高い、請求項1記載の方法。
- BRC番号456の発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、請求項1または請求項2のいずれかに記載の方法:
(a)BRC番号456のmRNAを検出する段階、
(b)BRC番号456によってコードされるタンパク質を検出する段階、および
(c)BRC番号456によってコードされるタンパク質の生物活性を検出する段階。 - 検出がDNAアレイ上で行われる、請求項3記載の方法。
- IDCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
(a)被験化合物をBRC番号456からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;ならびに
(c)ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する段階
を含む方法。 - IDCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
(a)候補化合物をBRC番号456を発現する細胞と接触させる段階;ならびに
(b)候補化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、BRC番号456の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階
を含む方法。 - IDCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
(a)被験化合物を、BRC番号456からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;ならびに
(c)BRC番号456からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する被験化合物を選択する段階、
を含む方法。 - IDCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
(a)候補化合物を、BRC番号456の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
(c)候補化合物の非存在下で検出される発現レベルもしくは活性と比較して該レポーター遺伝子の発現もしくは活性を低下させる候補化合物を選択する段階
を含む方法。 - (a)BRC番号456の核酸配列からなる核酸に特異的に結合する核酸、または(b)BRC番号456の核酸配列によってコードされるポリペプチドに結合する抗体を含むIDC検出用キット。
- BRC番号456の核酸配列からなる核酸に特異的に結合する核酸を含むIDC検出用DNAアレイ。
- IDCを治療または予防するためのワクチンであって、ワクチンが、(a)BRC番号456からなる核酸によってコードされるポリペプチド、(b)該ポリペプチドの免疫活性断片、または(c)該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチン。
- IDCに対する抗腫瘍免疫を誘導するための方法であって、対象から採取された抗原提示細胞に、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターを接触させる段階を含み、該ポリペプチドがBRC番号456からなる遺伝子によってコードされるか、またはその断片である方法。
- IDCを治療または予防するための組成物であって、BRC番号456からなるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの薬学的有効量を含む組成物。
- siRNAの標的配列が、SEQ ID NO:25、28、および31のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、請求項13記載の組成物。
- IDCを治療または予防するための組成物であって、BRC番号456からなる遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する、抗体またはその断片の薬学的有効量を含む組成物。
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