CN113025720B - 一种用于检测原发性乳腺弥漫性大b细胞淋巴瘤的标志物及其试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物及其试剂盒和应用,涉及肿瘤检测技术领域,本发明通过对LRRC75A‑AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中的至少一种标志物进行检测,利用这些标志物在PDLBCL癌组织以及PDLBCL癌旁组织中的差异表达,用于PDLBCL的诊断、预后评估或筛药。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤检测技术领域,具体而言,涉及一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物及其试剂盒和应用。
背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一类由中等大至大B淋巴样细胞构成的肿瘤,肿瘤细胞的核相当于或超过正常巨噬细胞的胞核,或大于正常淋巴细胞核的2倍,呈弥漫性生长模式。
DLBCL是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)中最常见的类型。而原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤(PDLBCL)是极罕见结外DLBCL中的一种,占NHL的1%,占乳腺恶性肿瘤的0.04%-0.5%,占结外淋巴瘤的2.2%。目前,尚未有效的治疗方案。
因此,探索PDLBCL患者的临床特征及基因表达谱特性,找出不良预后因素,开发新型靶向药物,对PDLBCL患者的治疗提供有潜力地临床治疗前景。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物及其试剂盒和应用。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了检测样本中肿瘤标志物表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,所述标志物包括碱基序列依次如SEQ ID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中至少一种。
第二方面,本发明实施例提供了检测样本中肿瘤标志物表达水平的试剂在筛选用于治疗原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤药物中的应用,所述肿瘤标志物包括碱基序列依次如SEQ ID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、LNCRNA和RPL17中至少一种,所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第三方面,本发明实施例提供了一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒,其包括用于检测肿瘤标志物的试剂,所述肿瘤标志物选自碱基序列依次如SEQID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、LNCRNA和RPL17中的至少两种。
第四方面,本发明实施例提供了一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物组合,所述标志物组合包括碱基序列依次如SEQ ID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、LNCRNA和RPL17中至少两种的组合。
本发明具有以下有益效果:
通过对LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中的至少一种标志物进行检测,利用这些标志物在PDLBCL癌组织以及PDLBCL癌旁组织中的差异表达,用于PDLBCL的诊断、预后评估或筛药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌组织与癌旁组织中差异表达的基因;
图2为实施例2中KEGG通路分析DLBCL癌组织中的主要富集的通路的结果;
图3为实施例2中DLBCL中显著性差异表达的lncRNA和mRNA;
图4为实施例2中qRT-PCR验证DLBCL中差异表达的lncRNA和mRNA。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了检测样本中肿瘤标志物表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,所述标志物包括碱基序列依次如SEQID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中至少一种。
上述肿瘤标志物包括lncRNA肿瘤标志物和/或RNA肿瘤标志物中的至少一种,LRRC75A-AS1属于lnc肿瘤标志物,lncRNA为长链非编码RNA(Long-non coding RNA,LncRNA),是一类核苷酸大于200nt的非编码RNA。INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16、RPL17以及后续的MYC均属于RNA肿瘤标志物。
发明人发现,上述8种肿瘤标志物在原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的癌组织和癌旁组织中的表达具有差异化,通过对患者癌组织和癌旁组织中的标志物进行检测,能够进行原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤进行诊断和预后评估,为原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的药物开发和延长预后具有重要作用。
在一些实施例中,所述试剂包括引物和/或探针。
优选地,所述试剂包括:分别用于检测LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17的引物对1~8中的至少一种;
其中,引物对1的碱基序列如SEQ ID No.10~11所示;引物对2的碱基序列如SEQID No.12~13所示;引物对3的碱基序列如SEQ ID No.14~15所示;引物对4的碱基序列如SEQ ID No.16~17所示;引物对5的碱基序列如SEQ ID No.18~19所示;引物对6的碱基序列如SEQ ID No.20~21所示;引物对7的碱基序列如SEQ ID No.22~23所示;引物对8的碱基序列如SEQ ID No.24~25所示。
需要说明的是,引物对通常包括上游引物和下游引物,本文中“引物对1的碱基序列如SEQ ID No.10~11所示”是指引物对1中上游引物的碱基序列如SEQ ID No.10所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.11所示。引物对2~9依次类推。
优选地,所述肿瘤标志物还包括MYC。MYC也属于RNA标志物,其在原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的癌组织和癌旁组织中的表达具有明显的差异,能够用于原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的检测。
优选地,所述试剂还包括用于检测MYC的引物对9,所述引物对9的碱基序列如SEQID No.26~27所示。
优选地,所述样本包括生物组织样本。
优选地,所述生物组织样本包括原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌组织和原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌旁组织中的至少一种。
本发明实施例还提供了检测样本中肿瘤标志物表达水平的试剂在筛选用于治疗原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤药物中的应用,所述肿瘤标志物包括碱基序列依次如SEQID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中至少一种,所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
上述标志物能用于PDLBCL的诊断和预后评估,因此,通过对上述标志物的检测,能够加快开发针对PDLBCL患者特异性的靶向药物。
本发明实施例还提供了一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒,其包括用于检测肿瘤标志物的试剂,所述肿瘤标志物包括碱基序列依次如SEQ ID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中的至少两种。
优选地,所述试剂盒包括引物对1~8中的任意一种;
其中,引物对1的碱基序列如SEQ ID No.10~11所示;引物对2的碱基序列如SEQID No.12~13所示;引物对3的碱基序列如SEQ ID No.14~15所示;引物对4的碱基序列如SEQ ID No.16~17所示;引物对5的碱基序列如SEQ ID No.18~19所示;引物对6的碱基序列如SEQ ID No.20~21所示;引物对7的碱基序列如SEQ ID No.22~23所示;引物对8的碱基序列如SEQ ID No.24~25所示。
优选地,所述肿瘤标志物还包括MYC;
优选地,所述试剂盒还包括序列如SEQ ID No.26~27所示的引物对9。
一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物组合,所述肿瘤标志物包括LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17中至少两种的组合。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物组合以及检测标志物的试剂盒,如下。
标志物组合包括:LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、LNCRNA、RPL17和MYC。
LRRC75A-AS1的序列如下:TGTGAGGATTGGGATATTCCGACTCCTTAAGGGCCTGGCGCACATAAGGTGTGACCTTTTCATTCCCGTTGTTATGGAGGGCCACATCTGCCAGAGCCTGGAGTCTGCGAAGGCCGGGACCCGGTTCCCCGGCCCACAGTGGGGGTGTGCAAACCCGAGAGAACTGGGTTGCAAATTCGTGAAGAATCAGCATCATGTTTGGCAGCTGAGTATTGGAGCCAGGAGCCTGCCATGAGGTTATATTCCCAGAGGATGTCAGTCCCAAGGACCAGTAGCTGCCATCAGTTTGGATTCTGAAAACTAACTGGCATCAACACTGGGTGTAGAAACATGCTTGCCTTATGTATCAGAGGACATGCTCAGCAGATCCAAGAGATATATTTGGCAACTTTTTCTAGAAAAGGCACATTGGGTATCATTCATTACATTCTTGAGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGTCTTGCTGTATTGCCCAGGCTGGAGTGTGGTGGCACAATCACAGCTCATTGCATCCTCAATCACCCAGGCCTAAGCAATCCTCCCACCTTGTAGCTGGGACTACAGCTCACAGCACACCTGGCTAAAATTTTTTTTTTGTTGAGACGGATTCTCTATGTTGCCCAGGCTGGTCTCAGGCTCCTGGGCTCAGATGGTCCTCCTGCCTCAGCTTCCAAAGGCACAGGCCAAGTTGTAGCTTTGTCCCTTGCCATCATGCCCAACAAGAGGTTCTATACCTTTTAATGAATTGACTTTCATAAATTGGTTATGTTGGTGGGCAAAGTTCTTTAAGCTGGAAATTGTAAATTCCTCCTGAAATGTTTTTTCATGCAGTTACCATGAACTAATACTACAATAAAGGATGGTCTTGGGTGTCAATTCTTGAAAA。
MYC的序列如下:
CTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCTCCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTATGACCTCGACTACGACTCGGTGCAGCCGTATTTCTACTGCGACGAGGAGGAGAACTTCTACCAGCAGCAGCAGCAGAGCGAGCTGCAGCCCCCGGCGCCCAGCGAGGATATCTGGAAGAAATTCGAGCTGCTGCCCACCCCGCCCCTGTCCCCTAGCCGCCGCTCCGGGCTCTGCTCGCCCTCCTACGTTGCGGTCACACCCTTCTCCCTTCGGGGAGACAACGACGGCGGTGGCGGGAGCTTCTCCACGGCCGACCAGCTGGAGATGGTGACCGAGCTGCTGGGAGGAGACATGGTGAACCAGAGTTTCATCTGCGACCCGGACGACGAGACCTTCATCAAAAACATCATCATCCAGGACTGTATGTGGAGCGGCTTCTCGGCCGCCGCCAAGCTCGTCTCAGAGAAGCTGGCCTCCTACCAGGCTGCGCGCAAAGACAGCGGCAGCCCGAACCCCGCCCGCGGCCACAGCGTCTGCTCCACCTCCAGCTTGTACCTGCAGGATCTGAGCGCCGCCGCCTCAGAGTGCATCGACCCCTCGGTGGTCTTCCCCTACCCTCTCAACGACAGCAGCTCGCCCAAGTCCTGCGCCTCGCAAGACTCCAGCGCCTTCTCTCCGTCCTCGGATTCTCTGCTCTCCTCGACGGAGTCCTCCCCGCAGGGCAGCCCCGAGCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACCGCCCACCACCAGCAGCGACTCTGAGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTTGTTTCTGTGGAAAAGAGGCAGGCTCCTGGCAAAAGGTCAGAGTCTGGATCACCTTCTGCTGGAGGCCACAGCAAACCTCCTCACAGCCCACTGGTCCTCAAGAGGTGCCACGTCTCCACACATCAGCACAACTACGCAGCGCCTCCCTCCACTCGGAAGGACTATCCTGCTGCCAAGAGGGTCAAGTTGGACAGTGTCAGAGTCCTGAGACAGATCAGCAACAACCGAAAATGCACCAGCCCCAGGTCCTCGGACACCGAGGAGAATGTCAAGAGGCGAACACACAACGTCTTGGAGCGCCAGAGGAGGAACGAGCTAAAACGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGACCAGATCCCGGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCCTTAAAAAAGCCACAGCATACATCCTGTCCGTCCAAGCAGAGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGTTGCGGAAACGACGAGAACAGTTGAAACACAAACTTGAACAGCTACGGAACTCTTGTGCGTAA。
INPP5F的序列如下:
ATGGAGCTCTTCCAAGCCAAGGACCACTACATCCTGCAGCAGGGCGAGCGCGCGCTGTGGTGCAGCCGCCGCGACGGCGGCCTCCAGCTCCGACCCGCTACTGATCTACTTCTTGCCTGGAATCCCATTTGTTTGGGGTTGGTAGAAGGTGTTATTGGGAAAATTCAACTTCATTCAGATCTTCCATGGTGGCTTATTCTAATTCGGCAGAAAGCATTGGTGGGCAAACTCCCAGGAGACCATGAGGTCTGTAAAGTTACCAAAATTGCTGTGCTCTCACTTTCTGAAATGGAACCTCAGGATCTTGAGCTAGAGCTCTGTAAGAAGCATCATTTTGGTATTAACAAACCAGAGAAGATCATACCATCTCCTGATGACTCAAAGTTTCTACTGAAGACCTTTACGCATATTAAATCCAATGTGTCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTAAGGAAAGTAAAGAGAAGGAGAAGTTGGAGAGGAGATTACTTGAAGAGTTGCTGAAGATGTTCATGGACTCAGAATCCTTTTATTATAGCTTGACCTATGACCTGACCAATTCCGTGCAGAGGCAGAGCACTGGGGAGAGGGACGGTCGGCCCCTCTGGCAGAAGGTTGATGACCGATTTTTTTGGAATAAATACATGATACAAGATCTTACTGAGATTGGTACTCCAGATGTGGACTTTTGGATTATCCCCATGATCCAAGGTTTTGTGCAGATTGAAGAACTTGTGGTTAATTATACCGAATCATCTGATGATGAGAAAAGCAGCCCAGAGACCCCCCCTCAGGAGTCCACCTGTGTAGATGATATTCACCCACGATTTCTAGTGGCTCTCATTTCACGCCGAAGTAGGCACAGAGCAGGAATGCGCTATAAACGAAGAGGAGTGGATAAAAATGGAAATGTTGCCAATTATGTGGAGACTGAGCAGTTGATTCATGTTCATAATCATACCCTGTCATTTGTTCAAACACGAGGCTCTGTGCCTGTCTTTTGGAGCCAGGTTGGGTATCGATATAACCCAAGACCGCGGCTGGACAGAAGTGAAAAGGAAACTGTTGCCTATTTCTGTGCCCATTTCGAAGAACAACTGAACATTTACAAAAAACAGGTTATTATTAACTTGGTAGACCAGGCAGGAAGAGAGAAGATTATTGGCGATGCTTACCTGAAGCAAGTGTTGCTTTTCAACAACTCACACCTCACTTACGTTTCGTTTGACTTCCATGAGCACTGCCGAGGAATGAAGTTTGAGAATGTTCAGACACTAACAGATGCCATTTATGACATTATTCTTGATATGAAGTGGTGTTGGGTTGATGAAGCTGGGGTAATATGTAAGCAGGAAGGGATTTTTCGTGTTAATTGTATGGACTGCCTGGATCGCACCAACGTGGTCCAAGCTGCCATCGCGAGAGTGGTCATGGAACAGCAG
CTGAAAAAATTAGGTGTGATGCCCCCGGAACAGCCATTACCTGTGAAATGTAATCGCATCTACCAGATAATGTGGGCCAATAATGGTGACTCCATTAGCAGACAGTATGCTGGGACAGCTGCTCTGAAGGGTGACTTTACAAGGACAGGAGAAAGGAAGTTAGCAGGAGTTATGAAAGATGGAGTGAACTCAGCAAACAGATATTACCTCAACCGATTTAAGGATGCTTATAGGCAAGCTGTTATAGATTTGATGCAAGGCATTCCAGTGACAGAAGATCTTTATTCCATATTTACCAAGGAGAAAGAACATGAAGCTTTGCATAAGGAAAATCAGAGAAGCCACCAGGAACTAATTAGCCAGCTCTTACAAAGTTACATGAAGTTACTACTGCCTGATGATGAGAAGTTCCATGGGGGCTGGGCCCTCATTGACTGTGACCCTAGCCTCATTGATGCTACTCACAGAGACGTGGATGTGCTGTTACTGCTTTCTAACTCTGCCTACTACGTGGCCTATTATGATGATGAAGTTGATAAAGTAAACCAGTATCAACGACTAAGTCTAGAAAACCTGGAAAAAATTGAAATAGGCCCTGAACCCACTCTTTTTGGTAAGCCAAAGTTCTCCTGCATGCGACTGCACTACAGATACAAAGAAGCGAGTGGCTATTTCCACACATTGCGAGCTGTAATGCGTAATCCTGAAGAGGATGGAAAAGATACCCTTCAGTGCATTGCAGAGATGCTGCAGATCACCAAGCAAGCCATGGGATCGGATTTACCCATAATTGAGAAGAAACTTGAGAGGAAGAGCAGTAAACCTCACGAAGACATCATTGGTATCAGGTCTCAAAACCAAGGTTCTTTGGCCCAGGGAAAGAATTTTTTAATGAGCAAATTTTCATCTCTAAATCAAAAAGTGAAGCAGACCAAATCCAATGTAAATATTGGCAACCTCCGAAAGCTAGGAAACTTTACCAAACCTGAAATGAAAGTTAACTTTCTAAAACCAAACTTAAAAGTAAATCTTTGGAAATCAGATAGTAGTCTTGAAACTATGGAAAACACAGGAGTGATGGATAAGGTTCAGGCAGAGTCTGATGGGGACATGTCTTCAGATAATGACTCATACCACTCTGATGAATTCCTTACAAATTCTAAGTCTGATGAAGACAGGCAGCTAGCTAACTCATTAGAGAGTGTAGGGCCAATAGATTACGTTCTTCCTAGTTGTGGTATTATTGCCTCAGCGCCTCGATTGGGCAGTCGGTCCCAGTCTCTTAGCAGCACAGATAGTAGCGTTCATGCTCCTTCAGAGATTACTGTTGCTCATGGGAGTGGGCTTGGAAAAGGCCAGGAGTCTCCTTTGAAGAAAAGTCCTTCTGCTGGCGACGTACACATATTGACTGGCTTTGCCAAGCCTATGGATATTTACTGCCACAGATTTGTGCAAGATGCACAGAACAAAGTGACCCACCTATCAGAGACCAGATCTGTGTCTCAGCAGGCTAGTCAGGAAAGAAATCAAATGACCAATCAAGTTTCAAATGAAACCCAATCAGAATCAACAGAACAGACACCTTCTCGGCCATCGCAATTAGATGTCTCTCTTTCTGCAACAGGCCCACAGTTTTTGTCAGTTGAGCCAGCGCATTCAGTTGCATCTCAAAAAACCCCCACCTCCGCTTCCAGCATGCTTGAACTTGAGACAGGGCTTCATGTAACTCCTTCTCCTTCAGAGAGCAGTAGCAGCAGAGCAGTCTCTCCCTTTGCCAAGATTCGAAGTTCCATGGTCCAGGTTGCTAGTATTACCCAAGCTGGATTAACCCATGGGATAAACTTTGCAGTGTCAAAAGTTCAGAAGAGTCCTCCAGAACCTGAAATCATTAATCAAGTCCAGCAAAATGAACTTAAAAAGATGTTTATACAATGCCAGACACGGATAATTCAGATTTAG。
PQBP1的序列如下:
ATGCCGCTGCCCGTTGCGCTGCAGACCCGCTTGGCCAAGAGAGGCATCCTCAAACATCTGGAGCCTGAACCAGAGGAAGAGATCATTGCCGAGGACTATGACGATGATCCTGTGGACTACGAGGCCACCAGGTTGGAGGGCCTACCACCAAGCTGGTACAAGGTGTTCGACCCTTCCTGCGGGCTCCCTTACTACTGGAATGCAGACACAGACCTTGTATCCTGGCTCTCCCCACATGACCCCAACTCCGTGGTTACCAAATCGGCCAAGAAGCTCAGAAGCAGTAATGCAGATGCTGAAGAAAAGTTGGACCGGAGCCATGACAAGTCGGACAGGGGCCATGACAAGTCGGACCGCAGCCATGAGAAACTAGACAGGGGCCACGACAAGTCAGACCGGGGCCACGACAAGTCTGACAGGGATCGAGAGCGTGGCTATGACAAGGTAGACAGAGAGAGAGAGCGAGACAGGGAACGGGATCGGGACCGCGGGTATGACAAGGCAGACCGGGAAGAGGGCAAAGAACGGCGCCACCATCGCCGGGAGGAGCTGGCTCCCTATCCCAAGAGCAAGAAGGCAGTAAGCCGAAAGGATGAAGAGTTAGACCCCATGGACCCTAGCTCATACTCAGACGCCCCCCGGGGCACGTGGTCAACAGGACTCCCCAAGCGGAATGAGGCCAAGACTGGCGCTGACACCACAGCAGCTGGGCCCCTCTTCCAGCAGCGGCCGTATCCATCCCCAGGGGCTGTGCTCCGGGCCAATGCAGAGGCCTCCCGAACCAAGCAGCAGGATTGA。
TOMM7的序列如下:
ATGGTGAAGCTGAGCAAAGAGGCCAAGCAGAGACTACAGCAGCTCTTCAAGGGGAGCCAGTTTGCCATTCGCTGGGGCTTTATCCCTCTTGTGATTTACCTGGGATTTAAGAGGGGTGCAGATCCCGGAATGCCTGAACCAACTGTTTTGAGCCTACTTTGGGGATAA。
RPS15A的序列如下:
ATGGTGCGCATGAATGTCCTGGCAGATGCTCTCAAGAGTATCAACAATGCCGAAAAGAGAGGCAAACGCCAGGTGCTTATTAGGCCGTGCTCCAAAGTCATCGTCCGGTTTCTCACTGTGATGATGAAGCATGGTTACATTGGCGAATTTGAAATCATTGATGACCACAGAGCTGGGAAAATTGTTGTGAACCTCACAGGCAGGCTAAACAAGTGTGGGGTGATCAGCCCCAGATTTGACGTGCAACTCAAAGACCTGGAAAAATGGCAGAATAATCTGCTTCCATCCCGCCAGTTTGGTTTCATTGTACTGACAACCTCAGCTGGCATCATGGACCATGAAGAAGCAAGACGAAAACACACAGGAGGGAAAATCCTGGGATTCTTTTTCTAG。
RPS5的序列如下:
ATGACCGAGTGGGAGACAGCAGCACCAGCGGTGGCAGAGACCCCAGACATCAAGCTCTTTGGGAAGTGGAGCACCGATGATGTGCAGATCAATGACATTTCCCTGCAGGATTACATTGCAGTGAAGGAGAAGTATGCCAAGTACCTGCCTCACAGTGCAGGGCGGTATGCCGCCAAACGCTTCCGCAAAGCTCAGTGTCCCATTGTGGAGCGCCTCACTAACTCCATGATGATGCACGGCCGCAACAACGGCAAGAAGCTCATGACTGTGCGCATCGTCAAGCATGCCTTCGAGATCATACACCTGCTCACAGGCGAGAACCCTCTGCAGGTCCTGGTGAACGCCATCATCAACAGTGGTCCCCGGGAGGACTCCACACGCATTGGGCGCGCCGGGACTGTGAGACGACAGGCTGTGGATGTGTCCCCCCTGCGCCGTGTGAACCAGGCCATCTGGCTGCTGTGCACAGGCGCTCGTGAGGCTGCCTTCCGGAACATTAAGACCATTGCTGAGTGCCTGGCAGATGAGCTCATCAATGCTGCCAAGGGCTCCTCGAACTCCTATGCCATTAAGAAGAAGGACGAGCTGGAGCGTGTGGCCAAGTCCAACCGCTGA。
RPS16的序列如下:
ATGCCGTCCAAGGGCCCGCTGCAGTCTGTGCAGGTCTTCGGACGCAAGAAGACAGCGACAGCTGTGGCGCACTGCAAACGCGGCAATGGTCTCATCAAGGTGAACGGGCGGCCCCTGGAGATGATTGAGCCGCGCACGCTACAGTACAAGCTGCTGGAGCCAGTTCTGCTTCTCGGCAAGGAGCGATTTGCTGGTGTAGACATCCGTGTCCGTGTAAAGGGTGGTGGTCACGTGGCCCAGATTTATGCTATCCGTCAGTCCATCTCCAAAGCCCTGGTGGCCTATTACCAGAAATATGTGGATGAGGCTTCCAAGAAGGAGATCAAAGACATCCTCATCCAGTATGACCGGACCCTGCTGGTAGCTGACCCTCGTCGCTGCGAGTCCAAAAAGTTTGGAGGCCCTGGTGCCCGCGCTCGCTACCAGAAATCCTACCGATAA。
RPL17的序列如下:
ATGGTTCGCTATTCACTTGACCCGGAGAACCCCACGAAATCATGCAAATCAAGAGGTTCCAATCTTCGTGTTCACTTTAAGAACACTCGTGAAACTGCTCAGGCCATCAAGGGTATGCATATACGAAAAGCCACGAAGTATCTGAAAGATGTCACTTTACAGAAACAGTGTGTACCATTCCGACGTTACAATGGTGGAGTTGGCAGGTGTGCGCAGGCCAAGCAATGGGGCTGGACACAAGGTCGGTGGCCCAAAAAGAGTGCTGAATTTTTGCTGCACATGCTTAAAAACGCAGAGAGTAATGCTGAACTTAAGGGTTTAGATGTAGATTCTCTGGTCATTGAGCATATCCAAGTGAACAAAGCACCTAAGATGCGCCGCCGGACCTACAGAGCTCATGGTCGGATTAACCCATACATGAGCTCTCCCTGCCACATTGAGATGATCCTTACGGAAAAGGAACAGATTGTTCCTAAACCAGAAGAGGAGGTTGCCCAGAAGAAAAAGATATCCCAGAAGAAACTGAAGAAACAAAAACTTATGGCACGGGAGTAA。
检测上述标志物组合的引物对包括引物对1~9,具体如表1所示。
表1引物序列
实时荧光定量PCR检测上述标志物的方法包括:
1.RNA反转录实验:
在RNase-Free微管中配制表2所示的混合液,10μL体系,使用DNase降解样本中DNA。
表2混合液
DNase I buffer(10x) | 1μL |
RNA sample | 1μg |
DEPC H<sub>2</sub>O | 7μl |
Dnase I | 1μl |
总体积 | 10μL |
PCR反应条件:37℃,30min。
2.25mM EDTA 1μL至混合液,65℃热激反应10min。向混合液中加入50μM 0.5μL随机引物和4μM 1μL dNTP;
PCR反应条件:72℃,10min,然后置于冰上。
3.RNA反转录合成cDNA(见表3)。
表3合成cDNA
5×First Strand Buffer | 4μL |
0.1M DTT | 1μL |
RNase inhibitior | 0.5μL |
M-MLV | 1μL |
DEPC H2O | 1μL |
总体积 | 7.5μL |
PCR反应条件:37℃,60min;70℃,15min。
得到的20μL cDNA用DEPCH2O稀释20倍后,-20℃冰箱贮存。
4.qRT-PCR
标志物对应的引物见实施例1。
在EP管仲配制如表4所示的PCR反应液,在PCR仪上按照表5所示的反应条件进行反应。
表4 PCR反应液
SYBR reaction buffer | 5μl |
cDNA | 3μl |
引物(R+F) | 0.2μl |
DEPC H<sub>2</sub>O | 1.8μl |
Total | 10μl |
表5反应条件
5.实验结果分析
反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线,基因的表达量=2-ΔΔCt,即ΔΔct=(实验组目的基因的Ct的平均值-实验组管家基因GAPDH的Ct的平均值)-(对照组目的基因的Ct的平均值一对照管家基因的Ct的平均值)。
实施例2
验证实施例1提供的标志物能够用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤。
一、实验对象的选择
PDLBCL病例极为罕见,手术切除PDLBCL组织患者1例,病例来自深圳市人民医院甲乳外科已确诊的乳腺恶性肿瘤的患者。手术切除肿瘤组织,癌旁组织为距肿瘤组织约3-5cm处切除。患者年龄为74岁。
二、组织RNA提取以及反转录建库
1.RNA提取
(1)在将组织在液氮中速冻,使用研磨器将组织磨碎,每管组织内加入1ml TRIzol后用振荡器中涡旋,在水平摇床上慢摇10min,充分裂解组织;
(2)将TRIzol-细胞裂解液加入到1.5mL的无酶管中,每个样品中加入200μL氯仿,剧烈震荡15sec后,室温静置2-3min,10000rcf,4℃离心15min;
(3)将上层水相转移至新的1.5mL的无酶管中,加入500μL异丙醇,混合均匀后室温放置40min,10000rcf,4℃离心15min;
(4)小心移除上清液体,管底可见RNA白色沉淀,使用预冷的无酶水配制的75%乙醇清洗一次,10000rcf,4℃离心1min;
(5)室温干燥RNA白色沉淀,加入30-60μL无酶水水溶解沉淀。-80℃保存备用。
2.反转录建库
(1)首先进行RNA样本质检:琼脂糖凝胶电泳分析样本RNA完整性及是否存在DNA污染;NanoDrop:检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值);Agilent 2100bioanalyzer:精确检测RNA完整性。
(2)通过Oligo(dT磁珠)富集带有poly A尾的RNA(包括mRNA和lncRNA),从总RNA中去除核糖体RNA,在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子打断RNA,片段化的RNA为模板,引物选择随机寡核苷酸,在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链,随后用RNaseH降解RNA链,并在DNA polymerase I体系下,以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头,用AMPure XP beads筛选250-300bp左右的cDNA,进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物,最终获得文库。建库用试剂盒为NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina。
三、质检以及RNA-sesq上机测序
1.文库构建完成后,先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量,稀释文库至1.5ng/μL,随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测,insertsize符合预期后,qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。
2.把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,在每一个测序簇延伸互补链时,每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。
四、RNA-seq数据生物信息学分析
1.数据质控:测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads),去除带接头(adapter)的reads;去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads;去除低质量reads(Qphred<=20的碱基数占整个read长度的50%以上的reads)。
2.数据分析
基因表达水平分析:计算各样本所有基因的表达值(Expected number ofFragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairssequenced,FPKM)后,FPKM是指每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments成对的reads数目,然后通过盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况;
基因差异表达分析:首先对原始的read数(readcount)进行标准化(normalization),主要是对测序深度的校正。然后统计学模型进行假设检验概率(Pvalue)的计算,最后进行多重假设检验校正,得到FDR值(错误发现率)。对不同组别间的基因做差异分析,|log2(FoldChange)|>1&padj<0.05的候选基因进一步分析;此外,采用GO富集分析和KEGG信号通路富集性分析进行细胞功能及差异基因通路分析。
实验结果
分析了病理确诊的1例原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤样本的RNA-seq数据。
原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌组织与癌旁组织差异表达基因如图1所示(DLBCLCa代表癌组织,DLBCLP代表癌旁组织)。结果发现,与癌旁比较,DLBCL癌组织中差异表达上调的lncRNA是26个,下调的是33个;差异表达上调的mRNA是57个,下调的mRNA是525个。
KEGG通路分析DLBCL癌组织中的主要富集的通路的结果如图2所示。由结果可知,与癌旁组织相比,DLBCL中上调表达的lncRNA和mRNA主要富集在核糖体(Ribosome)中,此外,lncRNA也部分富集在B细胞受体信号通路中(B cell receptor signaling pathway),说明核糖体RNA对DLBCL具有重要作用。
在获得的差异表达的lncRNA和mRNA中,设置差异倍数大于2倍且P<0.05为具有显著性差异的条件进行筛选,结果如表6和表7所示。
表6与癌旁组织比较DLBCL癌组织中表达上调的lncRNA
表7与癌旁组织比较DLBCL癌组织肿表达上调的mRNA
由结果可知,共筛选出13个DLBCL中特异性表达的lncRNA,分别是:AC064834.1、AC092484.1、RP11-147G16.1、GAS5、LINC00242、LRRC75A-AS1、C12orf79、RP11-314O13.1、RP11-866E20.3、AC079466.1、NEAT1、CTB-131B5.5和AL035696.4;
同时也筛选出27个DLBCL中特异性表达的mRNA,分别是:SYT13、PDIA2、RPS15、RERG、MYC、MYRF、AFF2、NXPH4、CRYBA4、VNN1、INPP5F、CNR1、PQBP1、STAB2、MMRN1、OR51E1、TOMM7、CFLAR、RPL32、NAP1L1、RPS15A、RPS5、RPS16、RPL17、NOP2、AP3D1和EPG5。
进一步地,通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)对表6和表7中的lncRNA和mRNA进行筛选;GEPIA数据库是基于TCGA癌症大数据分析的统计数据库。
DLBCL中显著性差异表达的lncRNA和mRNA见图3。结果发现,通过GEPIA数据库验证在DLBCL中2个高表达的lncRNA为:GAS5和LRRC75A-AS1;在DLBCL中14个高表达的mRNA为:RPS15、MYC、NXPH4、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPL32、NAP1L1、RPS15A、RPS5、RPS16、RPL17、NOP2和AP3D1。
通过qRT-PCR方法验证在DLBCL癌组织中2个高表达的lncRNA为:GAS5和LRRC75A-AS1,如图4中A所示,与癌旁比较,LRRC75A-AS1在癌组织中高表达(P<0.001),而GAS5无显著性差异;此外,验证DLBCL中14个高表达的mRNA,结果如图4中B所示,MYC、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16、RPL17在癌组织中高表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而RPS15、RPL32、NAP1L1、NOP2和AP3D1无显著性差异;NXPH4无表达。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的标志物及其试剂盒和应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtgaggatt gggatattcc gactccttaa gggcctggcg cacataaggt gtgacctttt 60
cattcccgtt gttatggagg gccacatctg ccagagcctg gagtctgcga aggccgggac 120
ccggttcccc ggcccacagt gggggtgtgc aaacccgaga gaactgggtt gcaaattcgt 180
gaagaatcag catcatgttt ggcagctgag tattggagcc aggagcctgc catgaggtta 240
tattcccaga ggatgtcagt cccaaggacc agtagctgcc atcagtttgg attctgaaaa 300
ctaactggca tcaacactgg gtgtagaaac atgcttgcct tatgtatcag aggacatgct 360
cagcagatcc aagagatata tttggcaact ttttctagaa aaggcacatt gggtatcatt 420
cattacattc ttgagttttt ttgggttttt tttttttttt ttgagacagt cttgctgtat 480
tgcccaggct ggagtgtggt ggcacaatca cagctcattg catcctcaat cacccaggcc 540
taagcaatcc tcccaccttg tagctgggac tacagctcac agcacacctg gctaaaattt 600
tttttttgtt gagacggatt ctctatgttg cccaggctgg tctcaggctc ctgggctcag 660
atggtcctcc tgcctcagct tccaaaggca caggccaagt tgtagctttg tcccttgcca 720
tcatgcccaa caagaggttc tatacctttt aatgaattga ctttcataaa ttggttatgt 780
tggtgggcaa agttctttaa gctggaaatt gtaaattcct cctgaaatgt tttttcatgc 840
agttaccatg aactaatact acaataaagg atggtcttgg gtgtcaattc ttgaaaa 897
<210> 2
<211> 3399
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggagctct tccaagccaa ggaccactac atcctgcagc agggcgagcg cgcgctgtgg 60
tgcagccgcc gcgacggcgg cctccagctc cgacccgcta ctgatctact tcttgcctgg 120
aatcccattt gtttggggtt ggtagaaggt gttattggga aaattcaact tcattcagat 180
cttccatggt ggcttattct aattcggcag aaagcattgg tgggcaaact cccaggagac 240
catgaggtct gtaaagttac caaaattgct gtgctctcac tttctgaaat ggaacctcag 300
gatcttgagc tagagctctg taagaagcat cattttggta ttaacaaacc agagaagatc 360
ataccatctc ctgatgactc aaagtttcta ctgaagacct ttacgcatat taaatccaat 420
gtgtctgctc ctaataaaaa gaaagttaag gaaagtaaag agaaggagaa gttggagagg 480
agattacttg aagagttgct gaagatgttc atggactcag aatcctttta ttatagcttg 540
acctatgacc tgaccaattc cgtgcagagg cagagcactg gggagaggga cggtcggccc 600
ctctggcaga aggttgatga ccgatttttt tggaataaat acatgataca agatcttact 660
gagattggta ctccagatgt ggacttttgg attatcccca tgatccaagg ttttgtgcag 720
attgaagaac ttgtggttaa ttataccgaa tcatctgatg atgagaaaag cagcccagag 780
accccccctc aggagtccac ctgtgtagat gatattcacc cacgatttct agtggctctc 840
atttcacgcc gaagtaggca cagagcagga atgcgctata aacgaagagg agtggataaa 900
aatggaaatg ttgccaatta tgtggagact gagcagttga ttcatgttca taatcatacc 960
ctgtcatttg ttcaaacacg aggctctgtg cctgtctttt ggagccaggt tgggtatcga 1020
tataacccaa gaccgcggct ggacagaagt gaaaaggaaa ctgttgccta tttctgtgcc 1080
catttcgaag aacaactgaa catttacaaa aaacaggtta ttattaactt ggtagaccag 1140
gcaggaagag agaagattat tggcgatgct tacctgaagc aagtgttgct tttcaacaac 1200
tcacacctca cttacgtttc gtttgacttc catgagcact gccgaggaat gaagtttgag 1260
aatgttcaga cactaacaga tgccatttat gacattattc ttgatatgaa gtggtgttgg 1320
gttgatgaag ctggggtaat atgtaagcag gaagggattt ttcgtgttaa ttgtatggac 1380
tgcctggatc gcaccaacgt ggtccaagct gccatcgcga gagtggtcat ggaacagcag 1440
ctgaaaaaat taggtgtgat gcccccggaa cagccattac ctgtgaaatg taatcgcatc 1500
taccagataa tgtgggccaa taatggtgac tccattagca gacagtatgc tgggacagct 1560
gctctgaagg gtgactttac aaggacagga gaaaggaagt tagcaggagt tatgaaagat 1620
ggagtgaact cagcaaacag atattacctc aaccgattta aggatgctta taggcaagct 1680
gttatagatt tgatgcaagg cattccagtg acagaagatc tttattccat atttaccaag 1740
gagaaagaac atgaagcttt gcataaggaa aatcagagaa gccaccagga actaattagc 1800
cagctcttac aaagttacat gaagttacta ctgcctgatg atgagaagtt ccatgggggc 1860
tgggccctca ttgactgtga ccctagcctc attgatgcta ctcacagaga cgtggatgtg 1920
ctgttactgc tttctaactc tgcctactac gtggcctatt atgatgatga agttgataaa 1980
gtaaaccagt atcaacgact aagtctagaa aacctggaaa aaattgaaat aggccctgaa 2040
cccactcttt ttggtaagcc aaagttctcc tgcatgcgac tgcactacag atacaaagaa 2100
gcgagtggct atttccacac attgcgagct gtaatgcgta atcctgaaga ggatggaaaa 2160
gatacccttc agtgcattgc agagatgctg cagatcacca agcaagccat gggatcggat 2220
ttacccataa ttgagaagaa acttgagagg aagagcagta aacctcacga agacatcatt 2280
ggtatcaggt ctcaaaacca aggttctttg gcccagggaa agaatttttt aatgagcaaa 2340
ttttcatctc taaatcaaaa agtgaagcag accaaatcca atgtaaatat tggcaacctc 2400
cgaaagctag gaaactttac caaacctgaa atgaaagtta actttctaaa accaaactta 2460
aaagtaaatc tttggaaatc agatagtagt cttgaaacta tggaaaacac aggagtgatg 2520
gataaggttc aggcagagtc tgatggggac atgtcttcag ataatgactc ataccactct 2580
gatgaattcc ttacaaattc taagtctgat gaagacaggc agctagctaa ctcattagag 2640
agtgtagggc caatagatta cgttcttcct agttgtggta ttattgcctc agcgcctcga 2700
ttgggcagtc ggtcccagtc tcttagcagc acagatagta gcgttcatgc tccttcagag 2760
attactgttg ctcatgggag tgggcttgga aaaggccagg agtctccttt gaagaaaagt 2820
ccttctgctg gcgacgtaca catattgact ggctttgcca agcctatgga tatttactgc 2880
cacagatttg tgcaagatgc acagaacaaa gtgacccacc tatcagagac cagatctgtg 2940
tctcagcagg ctagtcagga aagaaatcaa atgaccaatc aagtttcaaa tgaaacccaa 3000
tcagaatcaa cagaacagac accttctcgg ccatcgcaat tagatgtctc tctttctgca 3060
acaggcccac agtttttgtc agttgagcca gcgcattcag ttgcatctca aaaaaccccc 3120
acctccgctt ccagcatgct tgaacttgag acagggcttc atgtaactcc ttctccttca 3180
gagagcagta gcagcagagc agtctctccc tttgccaaga ttcgaagttc catggtccag 3240
gttgctagta ttacccaagc tggattaacc catgggataa actttgcagt gtcaaaagtt 3300
cagaagagtc ctccagaacc tgaaatcatt aatcaagtcc agcaaaatga acttaaaaag 3360
atgtttatac aatgccagac acggataatt cagatttag 3399
<210> 3
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgccgctgc ccgttgcgct gcagacccgc ttggccaaga gaggcatcct caaacatctg 60
gagcctgaac cagaggaaga gatcattgcc gaggactatg acgatgatcc tgtggactac 120
gaggccacca ggttggaggg cctaccacca agctggtaca aggtgttcga cccttcctgc 180
gggctccctt actactggaa tgcagacaca gaccttgtat cctggctctc cccacatgac 240
cccaactccg tggttaccaa atcggccaag aagctcagaa gcagtaatgc agatgctgaa 300
gaaaagttgg accggagcca tgacaagtcg gacaggggcc atgacaagtc ggaccgcagc 360
catgagaaac tagacagggg ccacgacaag tcagaccggg gccacgacaa gtctgacagg 420
gatcgagagc gtggctatga caaggtagac agagagagag agcgagacag ggaacgggat 480
cgggaccgcg ggtatgacaa ggcagaccgg gaagagggca aagaacggcg ccaccatcgc 540
cgggaggagc tggctcccta tcccaagagc aagaaggcag taagccgaaa ggatgaagag 600
ttagacccca tggaccctag ctcatactca gacgcccccc ggggcacgtg gtcaacagga 660
ctccccaagc ggaatgaggc caagactggc gctgacacca cagcagctgg gcccctcttc 720
cagcagcggc cgtatccatc cccaggggct gtgctccggg ccaatgcaga ggcctcccga 780
accaagcagc aggattga 798
<210> 4
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggtgaagc tgagcaaaga ggccaagcag agactacagc agctcttcaa ggggagccag 60
tttgccattc gctggggctt tatccctctt gtgatttacc tgggatttaa gaggggtgca 120
gatcccggaa tgcctgaacc aactgttttg agcctacttt ggggataa 168
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtgcgca tgaatgtcct ggcagatgct ctcaagagta tcaacaatgc cgaaaagaga 60
ggcaaacgcc aggtgcttat taggccgtgc tccaaagtca tcgtccggtt tctcactgtg 120
atgatgaagc atggttacat tggcgaattt gaaatcattg atgaccacag agctgggaaa 180
attgttgtga acctcacagg caggctaaac aagtgtgggg tgatcagccc cagatttgac 240
gtgcaactca aagacctgga aaaatggcag aataatctgc ttccatcccg ccagtttggt 300
ttcattgtac tgacaacctc agctggcatc atggaccatg aagaagcaag acgaaaacac 360
acaggaggga aaatcctggg attctttttc tag 393
<210> 6
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaccgagt gggagacagc agcaccagcg gtggcagaga ccccagacat caagctcttt 60
gggaagtgga gcaccgatga tgtgcagatc aatgacattt ccctgcagga ttacattgca 120
gtgaaggaga agtatgccaa gtacctgcct cacagtgcag ggcggtatgc cgccaaacgc 180
ttccgcaaag ctcagtgtcc cattgtggag cgcctcacta actccatgat gatgcacggc 240
cgcaacaacg gcaagaagct catgactgtg cgcatcgtca agcatgcctt cgagatcata 300
cacctgctca caggcgagaa ccctctgcag gtcctggtga acgccatcat caacagtggt 360
ccccgggagg actccacacg cattgggcgc gccgggactg tgagacgaca ggctgtggat 420
gtgtcccccc tgcgccgtgt gaaccaggcc atctggctgc tgtgcacagg cgctcgtgag 480
gctgccttcc ggaacattaa gaccattgct gagtgcctgg cagatgagct catcaatgct 540
gccaagggct cctcgaactc ctatgccatt aagaagaagg acgagctgga gcgtgtggcc 600
aagtccaacc gctga 615
<210> 7
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgccgtcca agggcccgct gcagtctgtg caggtcttcg gacgcaagaa gacagcgaca 60
gctgtggcgc actgcaaacg cggcaatggt ctcatcaagg tgaacgggcg gcccctggag 120
atgattgagc cgcgcacgct acagtacaag ctgctggagc cagttctgct tctcggcaag 180
gagcgatttg ctggtgtaga catccgtgtc cgtgtaaagg gtggtggtca cgtggcccag 240
atttatgcta tccgtcagtc catctccaaa gccctggtgg cctattacca gaaatatgtg 300
gatgaggctt ccaagaagga gatcaaagac atcctcatcc agtatgaccg gaccctgctg 360
gtagctgacc ctcgtcgctg cgagtccaaa aagtttggag gccctggtgc ccgcgctcgc 420
taccagaaat cctaccgata a 441
<210> 8
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggttcgct attcacttga cccggagaac cccacgaaat catgcaaatc aagaggttcc 60
aatcttcgtg ttcactttaa gaacactcgt gaaactgctc aggccatcaa gggtatgcat 120
atacgaaaag ccacgaagta tctgaaagat gtcactttac agaaacagtg tgtaccattc 180
cgacgttaca atggtggagt tggcaggtgt gcgcaggcca agcaatgggg ctggacacaa 240
ggtcggtggc ccaaaaagag tgctgaattt ttgctgcaca tgcttaaaaa cgcagagagt 300
aatgctgaac ttaagggttt agatgtagat tctctggtca ttgagcatat ccaagtgaac 360
aaagcaccta agatgcgccg ccggacctac agagctcatg gtcggattaa cccatacatg 420
agctctccct gccacattga gatgatcctt acggaaaagg aacagattgt tcctaaacca 480
gaagaggagg ttgcccagaa gaaaaagata tcccagaaga aactgaagaa acaaaaactt 540
atggcacggg agtaa 555
<210> 9
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60
agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120
gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180
agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240
cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300
aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360
ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420
aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480
tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540
cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600
tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660
aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720
tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780
cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840
tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900
ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960
cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020
aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080
aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140
aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200
aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260
gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320
cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cgtaa 1365
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtcgctgaa acctctacaa c 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggagtaagga caggaattca gg 22
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 22
<212> DNA
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gagatcattg ccgaggacta tg 22
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tgcgtagttg tgctgatgtg 20
Claims (10)
1.检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述标志物组合包括核苷酸序列依次如SEQID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17。
2.根据权利要求1所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂包括引物。
3.根据权利要求2所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂包括:分别用于检测LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17的引物对1~8;
其中,引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.10~11所示;引物对2的核苷酸序列如SEQ IDNo.12~13所示;引物对3的核苷酸序列如SEQ ID No.14~15所示;引物对4的核苷酸序列如SEQ ID No.16~17所示;引物对5的核苷酸序列如SEQ ID No.18~19所示;引物对6的核苷酸序列如SEQ ID No.20~21所示;引物对7的核苷酸序列如SEQ ID No.22~23所示;引物对8的核苷酸序列如SEQ ID No.24~25所示。
4.根据权利要求1~3任一项所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述肿瘤标志物组合还包括核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的MYC。
5.根据权利要求4所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,所述试剂还包括用于检测MYC的引物对9,所述引物对9的核苷酸序列如SEQ ID No.26~27所示。
6.根据权利要求1所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述样本包括生物组织样本。
7.根据权利要求6所述的检测样本中肿瘤标志物组合表达水平的试剂在制备用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用,其特征在于,所述生物组织样本包括原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌组织和原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤癌旁组织。
8.一种用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒,其特征在于,其包括用于检测肿瘤标志物组合的试剂,所述肿瘤标志物组合包括核苷酸序列依次如SEQ ID No.1~8所示的LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17;
所述试剂包括:分别用于检测LRRC75A-AS1、INPP5F、PQBP1、TOMM7、RPS15A、RPS5、RPS16和RPL17的引物对1~8;其中,引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.10~11所示;引物对2的核苷酸序列如SEQ ID No.12~13所示;引物对3的核苷酸序列如SEQ ID No.14~15所示;引物对4的核苷酸序列如SEQ ID No.16~17所示;引物对5的核苷酸序列如SEQ ID No.18~19所示;引物对6的核苷酸序列如SEQ ID No.20~21所示;引物对7的核苷酸序列如SEQ ID No.22~23所示;引物对8的核苷酸序列如SEQ ID No.24~25所示。
9.根据权利要求8所述的用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒,其特征在于,所述肿瘤标志物组合还包括MYC。
10.根据权利要求9所述的用于检测原发性乳腺弥漫性大B细胞淋巴瘤的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括序列如SEQ ID No.26~27所示的引物对9。
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