JP4614952B2 - 腎細胞癌(rcc)の潜在的な新規治療標的としての低酸素誘導タンパク質2(hig2) - Google Patents
腎細胞癌(rcc)の潜在的な新規治療標的としての低酸素誘導タンパク質2(hig2) Download PDFInfo
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Description
腎細胞癌(RCC)は、泌尿器生殖器系の悪性腫瘍の中では3番目に多く、ヒトの全悪性腫瘍の2〜3%に相当する。外科的切除が、限局性RCC腫瘍の患者にとっては最も有効な治療法であるが、このような治療は、進行期のRCCの患者には十分ではない。一部の生物医学的な治療法は、〜20%の奏功率を示すことが報告されているが、これは重度の副作用を引き起こす場合があり、一般に患者の生存率を向上させない。外科的治療を受けた患者のうち、約25〜30%が手術後に再発する(Ljungberg B., Alamdari F. I., Rasmuson T. & Roos G. Follow-up guidelines for nonmetastatic renal cell carcinoma based on the occurrence of metastases after radical nephrectomy. BJU Int. 84, 405-411 (1999); Levy DA., Slaton JW., Swanson DA. & Dinney CP. Stage specific guidelines for surveillance after radical nephrectomy for local renal cell carcinoma. J Urol. 159, 1163-1167 (1998))。腫瘍の病期および外科的な切除度は、RCCの最も重要な予後因子である。しかし現時点において、このような予後の多様性に影響を及ぼす、基礎となる分子機構は、ほとんどわかっていない。
したがって本発明は、腎細胞癌と相関する遺伝子発現のパターンの発見に関する。腎細胞癌で差次的に発現される遺伝子は本明細書で、「RCCX核酸」または「RCCXポリヌクレオチド」と集合的に呼ばれ、また対応する、コードされたポリペプチドは「RCCXポリペプチド」または「RCCXタンパク質」と呼ばれる。
本明細書に記載されたデータは、腎細胞癌(RCC)におけるゲノムワイドな遺伝子発現解析を意味する。特に本データは、臨床試料中の23,000個を上回る遺伝子の発現の測定で得られた、腎細胞癌の包括的なゲノムワイドな発現プロファイルを提供する。同定された、差次的に発現される遺伝子は、診断目的で、また腎細胞癌を阻害するための遺伝子標的治療アプローチの開発に使用される。
本発明の文脈では、細胞の成長は、HIG2 siRNAを含む組成物を細胞に接触させることで阻害される。細胞にはさらに、トランスフェクション剤を接触させることができる。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野で周知である。あるいは細胞の成長は、HIG2抗体または抗体断片を含む組成物を細胞に接触させることで阻害される。
本発明の文脈では、HIG2-siRNAは、1つの標的HIG2遺伝子配列に向けられることができる。あるいはsiRNAは、複数の標的HIG2遺伝子配列に向けられる場合がある。例えば、組成物は、2個、3個、4個、もしくは5個、またはこれ以上のHIG2標的配列に向けられるHIG2-siRNAを含む場合がある。本発明の文脈では、HIG2標的配列は、HIG2遺伝子の一部と同一か、または天然に生じるHIG2遺伝子の一部に相補的なヌクレオチド配列である。標的配列は、ヒトHIG2遺伝子の5'非翻訳(UT)領域、オープンリーディングフレーム(ORF)、または3'非翻訳領域を含む場合がある。あるいはsiRNAは、HIG2遺伝子発現の上流または下流の調節因子に相補的な核酸配列である場合がある。上流および下流の調節因子の例には、HIG2遺伝子プロモーターに結合する転写因子、HIG2ポリペプチド、HIG2プロモーター、およびHIG2エンハンサーと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼなどがあるがこれらに限定されない。
cactgacctagacatgtcc-[b]-ggacatgtctaggtcagtg (配列番号:78の標的配列);
gaacctgtctaactggatg-[b]-catccagttagacaggttc (配列番号:79の標的配列); および
cctgtctaactggatgctc-[b]-gagcatccagttagacagg (配列番号:80の標的配列).
本発明の文脈では、HIG2抗体はポリクローナル抗体である場合がある。あるいは、HIG2抗体はモノクローナル抗体である場合がある。アミノ酸配列「EPTKGLPDHPSRSM」は、本発明のHIG2抗体によって認識される好ましいエピトープである。本発明の文脈では、HIG2抗体は、HIG2に結合する限りにおいて抗体断片または修飾抗体である場合がある。例えば抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、または1本鎖Fv(scFv)である場合がある(H鎖およびL鎖に由来するFv断片が適切なリンカーによって連結されているもの)。より具体的には、適切な抗体断片は、抗体をパパインやペプシンなどの酵素で処理することで作製できる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築してもよく、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞で発現させることができる(例えば、Co M.S. et al. J. Immunol. 152: 2968-2976 (1994); Better M. and Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178: 476-496 (1989); Pluckthun A. and Skerra A. Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121: 652-663 (1986); Rousseaux J. et al. Methods Enzymol. 121: 663-669 (1986); Bird R.E. and Walker B.W. Trends Biotechnol. 9: 132-137 (1991)を参照されたい)。
本発明の文脈では、HIG2の過剰発現を特徴とする腫瘍の患者は、HIG2-siRNA抗体またはHIG2抗体を投与することで治療される。siRNA療法または抗体療法を用いることによって、例えば腎細胞癌に罹患した患者、または腎細胞癌を発症するリスクのある患者におけるHIG2の発現または活性が阻害される。このような患者は、特定の腫瘍型に標準的な方法によって同定される。例えば腎細胞癌は、コンピューター断層撮影(CT)スキャニングや超音波検査法によって診断可能である。
本発明の文脈では、腎細胞癌は、細胞の試験集団(すなわち患者由来の組織試料)に由来する1つもしくは複数のRCCX核酸の発現を調べることで診断される。好ましくは、試験細胞集団は腎細胞、例えば腎臓系から得られた細胞を含む。遺伝子発現は、骨髄、血液、便、尿、または他の体液(痰など)から測定することもできる。
腎細胞癌関連遺伝子の発現または活性を阻害する薬剤は、腎細胞癌関連遺伝子を発現する試験細胞集団に試験薬剤を接触させ、腎細胞癌関連遺伝子の発現レベルを決定することで同定される。対照レベルと比較時の腎細胞癌関連遺伝子の発現の低下は、薬剤が腎細胞癌関連遺伝子の阻害剤であり、したがって腎細胞癌の阻害に有用なことを示す。
本明細書において同定された差次的に発現されるRCC関連遺伝子は、腎細胞癌の治療経過のモニタリングも可能とする。この方法では、試験細胞集団は、腎細胞癌の治療を受けている被験対象から提供される。望ましいならば、試験細胞集団は、治療前、治療中、および/または治療後の、さまざまな時点で被験対象から得られる。細胞集団における1つもしくは複数のRCC関連遺伝子の発現を次に判定し、腎細胞癌状態が既知である細胞を含む標準細胞集団と比較する。標準細胞は、処置を受けていないものとすべきである。
個体の遺伝的構成の差は、さまざまな薬物の相対代謝能力に差を生じる場合がある。被験対象で代謝されて抗腎細胞癌剤として作用する薬剤は、被験対象細胞における遺伝子発現パターン、癌状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと変化を誘導することによって明らかになる場合がある。したがって、本明細書に開示された差次的に発現されるRCC関連遺伝子群は、薬剤が被験対象のための抗腎細胞癌剤として適しているか否かを判定することを目的として、選択された被験対象に由来する試験細胞集団における、推定される治療用または予防用の抗腎細胞癌剤の検証を可能とする。
本明細書に開示された差次的に発現される配列を使用して、腎細胞癌を治療するための候補治療用薬剤を同定することもできる。この方法は、候補治療用薬剤が、腎細胞癌状態に特徴的なRCCX 1〜32遺伝子の発現プロファイルを、腎細胞癌と関連しない臨床状態におけるパターンを示すか、もしくは、より類似したパターンに変換するか否かを判定する候補治療用薬剤のスクリーニングに基づく。
本明細書では、一連の病期にわたり、被験細胞集団における1つもしくは複数のRCC関連遺伝子の発現を、患者由来の参照細胞集団における同一遺伝子の発現と比較することにより、腎細胞癌を有する被験対象の予後を評価する方法もまた提供する。被験細胞集団と参照細胞集団における1つもしくは複数のRCC関連遺伝子の発現を比較することにより、または被験対象から由来する被験細胞集団において長期にわたり遺伝子発現のパターンを比較することにより、被験対象の予後を評価することができる。例えば、正常対照と比較した場合の1つもしくは複数のRCCX1〜32遺伝子の発現の増加は、予後が良好でないことを示す。
本発明はまた、RCCX検出試薬、例えば、RCCX核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、1つもしくは複数のRCCX核酸に特異的に結合するかもしくはこれを同定する核酸、またはRCCX核酸によってコードされるタンパク質に結合する抗体を含む。試薬はキットの形態で共に包装されることができる。試薬は、例えば核酸もしくは抗体(固体マトリックスに結合されているか、またはそれらをマトリックスに結合させるための試薬と共に個別に包装されている)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識といった個別の容器内に包装されることができる。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROM等)がキットに含まれる。キットのアッセイ形式は、当技術分野において公知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAである。
本発明は、1つもしくは複数の核酸配列を含む核酸基質アレイも含む。アレイ上の核酸は具体的には、RCCX 1〜32遺伝子によって代表される1つもしくは複数の核酸配列に対応する。RCCX 1〜32遺伝子によって代表される2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、15、20、25、またはこれ以上の配列の発現のレベルを、アレイに対する核酸の結合を検出することで同定することができる。
(1)マーカー遺伝子を含むaRNAまたはcDNAを合成する段階;
(2)aRNAまたはcDNAと、マーカー遺伝子に対するプローブをハイブリダイズさせる段階;ならびに
(3)プローブとハイブリダイズしたaRNAまたはcDNAを検出し、それのmRNA量を定量する段階。
本発明は、1つもしくは複数のRCCX1〜32遺伝子の発現または活性を減少させることにより、被験対象におけるRCCの1つもしくは複数の症状を治療または軽減する方法をさらに提供する。RCCを発症している(または発症しやすい)被験対象に、治療化合物を予防的または治療的に投与することができる。投与は全身投与または局所投与であることができる。そのような被験対象は、標準的な臨床的方法を用いて、またはRCCX1〜32遺伝子の発現もしくは活性の異常なレベルを検出することによって同定されることができる。治療薬剤には細胞増殖の阻害剤が含まれる。
1. 目的の転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流方向にスキャンする。潜在的siRNA標的部位として、各AAおよび3'隣接19ヌクレオチドの存在を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍の領域(75塩基内)には制御タンパク質結合部位がより豊富である可能性があるため、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2. 有力な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有するいかなる標的配列も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/のNCBIサーバー上で見ることができる。
3. 合成のための適格な標的配列を選択する。Ambionでは、評価するために、好ましくは遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
− 腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
− 腫瘍を認識する抗体の誘導、および
− 抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
薬学的製剤には、経口、直腸、経鼻、局所(口腔および舌下を含む)、膣、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは通気による投与に適した製剤が含まれる。投与は静脈内投与であることが好ましい。製剤は任意で個別の投与単位で包装される。
臨床試料
cDNAマイクロアレイおよび免疫組織化学的解析に使用するRCC腫瘍および周囲の正常腎組織を、外科的切除を受けた10人の患者から十分な説明に基づく同意を得た上で得た。各症例の臨床病理学的データを表1にまとめた。すべてがI期またはII期であると診断された。対をなす試料を、外科的切除直後に液体窒素中で瞬間凍結し、-80℃で保存した。各検体で、生きている細胞の少なくとも90%が腫瘍細胞であると同定された。したがって、非癌性細胞の混入は極めて少ないと考えられた。これらの組織から、十分な量および質のRNAを伴う細胞集団をマイクロアレイ解析用に選択した。ELISA解析用のRCCおよび慢性糸球体腎炎(CGN)の患者に由来する血漿試料も十分な説明に基づく同意の上で得た。また、正常で健康なボランティアに由来する20の血漿試料も十分な説明に基づく同意の上で得た。
4種類のRCC(A498、786-O、caki-1、caki-2)、1種類の頚部腺癌(HeLa)、9種類の結腸癌(SW480、SW948、LoVo、DLD1、HT29、HCT15、HCT116、SNU-C4、およびSNU-C5)、1種類の乳癌(MCF7)、4種類の肝細胞癌(Huh7、SNU475、HepG2、およびAlexander)のそれぞれに由来する細胞系列、1系列のヒト胚性腎細胞(HEK293)およびCOS7細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%抗生物質/抗真菌剤溶液を添加した適切な培地中で単層で成長させ、5% CO2を含む雰囲気中で37℃で維持した。
TRIzol(Invitrogen)を用いて、製造業者の指示書に従い全RNAの抽出を行った。DNase I(Nippon Gene, Osaka, Japan)による処理後に、各腫瘍および対応する正常組織に由来する10 μgの全RNAを、T7転写キット(Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて増幅し、増幅されたRNAを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下(各5 μg)で逆転写した。標識プローブを混合し、23,040個のcDNAを含むマイクロアレイスライドに対して、Automatic Slide Processor(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, U.K.)を用いてハイブリダイズさせた。各スポットに対するCy5およびCy3の蛍光強度を、52個のハウスキーピング遺伝子の平均Cy5/Cy3比が1となるように調節した。低シグナル強度に由来するデータは信頼性が低いので、各スライドについてカットオフ値を設定し、Cy3とCy5の両方がカットオフ値より低いシグナル強度を供した場合には、遺伝子をその後の解析から外した。
各遺伝子の相対発現(Cy5/Cy3の強度比)を以下のように定義した:(i)上方制御された場合(発現比>2.0)、(ii)下方制御された場合(発現比<0.5)、(iii)変化がなかった場合(発現比が0.5〜2.0)、または(iv)発現がなかった場合(または、わずかな発現はあるが、検出用カットオフレベル未満の場合)。これらのカテゴリーを、試料群のなかで発現比の変化が共通の一連の遺伝子、ならびに特定の下位群に特異的な一連の遺伝子を、Schenaらのプロトコルに従って検出するために用いた。RCCで一般に上方制御される遺伝子を検出するために、マイクロアレイ上における23,040個の遺伝子の全体的な発現パターンのスクリーニングを最初に行い、(i)、(ii)、または(iii)に分類されたRCC症例の50%を上回る割合で存在した、発現比が2.0を上回る遺伝子を選択した。最後にRCCに高度に特異的な診断用マーカーを得て、潜在的な分子標的を同定するために、正常腎臓で発現しなかった遺伝子を、正常ヒト組織の発現データベースを参考にして選択した。
抽出されたRNAを、オリゴ(dT)21プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写した。cDNAマイクロアレイの構築用に調製したものと同じ遺伝子特異的プライマー、または内部対照としてチューブリンαIII(TUBA3)特異的プライマーを用いて半定量RT-PCR実験を実施した。プライマーの配列を表2に列挙した。PCR反応は、産物の強度を増幅の対数期内で保証するために、サイクル数を最適化した。
ヒトHIG2(hHIG2)のcDNAプローブを[α-32P]dCTPで標識し、サプライヤーのマニュアルに従ってHuman MTN Blot(Clontech)とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、製造業者の推奨通りに行った。このブロットを増感スクリーンを用いて-80℃で14日間かけてオートラジオグラフ化した。
HIG2の全コード配列をKOD-plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用いてRT-PCRで増幅し、neo耐性遺伝子を含むpcDNA3.1(+)-Myc/Hisベクター(Invitrogen)のBamHIおよびXhoIの制限酵素切断部位に挿入した(pcDNA3.1(+)-hHIG2-Myc/His)。構築物を配列決定で確認した。フォワードプライマーとして5’- TTTCTCTGCAGAGGAGTAGGG-3’ (配列番号; 69)を、またリバースプライマーとして5’-CATGCTTCTGGATGGATGG-3’ (配列番号; 70)を使用した。hHIG2の安定形質転換体を得るために、FuGene 6(Roche diagnostics)を用いて、指示マニュアルに従いCOS7細胞にpcDNA-hHIG2をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10% FCSおよびGENETICIN(0.5 mg/ml)を含むDMEM中で培養した。約3週間後に20個の個別のコロニーを選択し、安定トランスフェクタントのスクリーニングを限界希釈法(LDA)で行った。個々のクローンで、HIG2の発現をRT-PCRおよび免疫組織化学染色法で調べた。
疎水性ドメイン(27〜63アミノ酸残基)をコードするHIG2断片をpET28a大腸菌ベクター(Novagen)にサブクローンニングした。pET28a-hHIG2で、BL21 codon plus(Invitrogen)コンピテント細胞を形質転換し、0.5 mM IPTGで37℃で3時間かけて誘導した。清澄な細胞溶解物から、TALON Metal Affinity Resins(Clontech)により、サプライヤーの指示マニュアルに従ってrhHIG2を精製した。rhHIG2の最終精製をMonoQ陰イオン交換カラム上でAKTAexplorer 10S(Amersham Biosciences)を用いて行い、大腸菌タンパク質の混入のない1本のピークを得た。
抗原溶液をアジュバントによって乳化することで、注射用のrhHIG2タンパク質を調製した。精製済みのrhHIG2タンパク質に対するポリクローナルの抗HIG2抗体(抗HIG2 pAb)をウサギで作製した(Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)。抗血清のアフィニティ精製は、以下の手順で実施した。rhHIG2タンパク質を20 mM HEPES緩衝液(pH 8.5)で透析後に、平衡化したAffi-Gel 15ゲル(Bio-Rad)で2時間インキュベートした。ゲル樹脂の活性エステルをブロックするために、1 Mのエタノールアミン-HCl(pH 8.0)を添加して1時間回転した。アフィニティ樹脂結合リガンドをカラムに移しTBS-Tで平衡化した。濾過された抗血清を上記カラムに添加し、4℃でインキュベートして2時間回転した。TBS-Tおよび50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 M NaCl、1% Triton X-100で洗浄後に、10%エチレングリコールを添加した0.1 Mグリシン-HCl(pH 2.5)によって精製後の抗体を溶出し、PBSで透析を行った。
FuGene6トランスフェクション試薬(Roche, Basel, Switzerland)と混合した1 μgのpcDNA3.1(+)-HIG2-Myc/HisプラスミドをCOS7細胞にトランスフェクトした。COS7に由来する安定トランスフェクタントをPBS(-)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温で10分間かけて固定し、0.1% Triton X-100を含むPBS(-)で2.5分間処理することで透過性を付与した。一次抗体と反応させる前に、細胞をPBS(-)中の3% BSAで60分間覆うことにより、非特異的な抗体結合部位をブロックした。抗HIG2 pAb(一次抗体)、およびウサギIgG(FITC結合)(ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH)に対するヤギIgG画分(二次抗体)によって、Myc標識HIG2タンパク質を検出した。正常ヒト組織(心臓、肝臓、肺、成体腎、胎児腎、前立腺、膵臓、脊髄;BIOCHAIN)のパラフィン包埋標本をキシレンおよびエタノールで処理してパラフィンを除去した。ENVISION+Kit/HRP(DAKO)がHIG2を検出するために用いられ、内因性のペルオキシダーゼおよびタンパク質ブロッキング反応後に、アフィニティ精製したウサギ抗hHIG2ポリクローナル抗体を一次抗体として添加し、混合物をHRP標識抗ウサギIgG(二次抗体)で処理した。最後に基質-色素原を添加し、組織標本をヘマトキシリンで対比染色した。免疫染色を阻害する実験も過去に記載されたように行った(Mintz PJ., Kim J., Do KA., Wang X., Zinner RG., Cristofanilli M., Arap MA., Hong WK., Troncoso P., Logothetis CJ., Pasqualini R., Arap W. Fingerprinting the circulating repertoire of antibodies from cancer patients. Nat Biotechnol. 21, 57-63 (2003))。
トランスフェクトされたCOS7細胞を無血清培地で維持し、トランスフェクションの24時間後と48時間後に回収した。溶解物および濃縮後の培地を15% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移行させ抗HIG2 pAbとともにインキュベートした。マウス抗ヒトc-Mycモノクローナル抗体9E10(Roche)およびヒツジ抗マウスIgG-HRP抗体(Amersham Biosciences)とのインキュベーション後に、ECLキット(Amersham Bioscience)でシグナルを可視化した。RCC細胞系列であるA498、786-O、caki-1、およびcaki-2を5% O2下で24時間培養した。アフィニティ精製したHIG2-pAb(一次抗体)、およびヒツジ抗ウサギIgG-HRP(二次抗体)(Amersham Biosciences)によって、内因性のHIG2タンパク質が検出された。β-アクチンを2000倍に希釈して、タンパク質のローディング用の対照として使用した(クローンAC-15、Sigma)。
COS7細胞のHIG2安定トランスフェクタントを6ウェルのマイクロタイタープレート上(1 X 104細胞/ウェル)に播種し、0.5 mg/mlのGENETICINを添加した10% FCSを含む培地で24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、および144時間維持した。各時点において、細胞増殖を細胞計数キット(WAKO)で評価した。トランスフェクタント(5 X 103細胞/ウェル)を、0.1% FCSおよび100 nMまたは1 mMのBSAを含むDMEM中で、組換え型hHIG2タンパク質の添加後5日間培養し、その時点で再度細胞数を決定した。RCC細胞系列であるcaki-1およびcaki-2を12ウェルのマイクロプレート(1 X 103細胞/ウェル)に播種し、1 mMのアフィニティ精製抗HIG2 pAbを添加した0.5% FCSを含むMcCoys'5A培地で5日間培養した。
HIG2をトランスフェクトしたCOS7細胞を、FBSを含まないDMEMで2日間維持し、細胞成長中におけるHIG2の自己産生を確認した。COS7細胞を、HIG2を発現するCOS7細胞および非発現細胞の調整培地中で培養した。自己分泌作用は、抗HIG2 pAb(濃度 1 mM)に曝露することで中和した。成長の変化を血球計数器で監視した。
100 mmのディッシュで培養した細胞を氷冷PBS(-)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを用いて4℃で30分間かけて固定し、再びPBS(-)で2回洗浄し、4%ギムザ溶液で染色した。
caki-1細胞を0.5 μMおよび1.0 μMの抗HIG2 pAbで、また0.5 μMおよび1.0 μMの免疫前ウサギIgGでそれぞれ5日間処理した。FACS解析では、吸着性および遊離性の細胞を混合し、70%エタノールで4℃で固定した。PBSで2回洗浄した後に、細胞を、1 μgの煮沸済みRNase Iを含む1 mlのPBSと37℃で30分間インキュベートした。次に細胞を、50 μgのヨウ化プロピジウム(PI)を含む1 mlのPBSで染色した。サブG1画分のパーセンテージを、少なくとも2000個の細胞からフローサイトメーター(FACScalibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)で決定した。
RCC患者の血漿中のHIG2タンパク質を検出して定量するために、ポリスチレン製プレート(Nalge Nunc)を被覆するために50 mM炭酸ナトリウム中10 μg/mlの濃度で、アフィニティ精製した抗HIG2 pAbを用いて酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)を実施した。過剰な結合部位は、2%ウシ血清アルブミン/PBSで37℃で2時間処理してブロックした。RCC患者、慢性糸球体腎炎(CGN)患者、および健康で正常なボランティアの血漿を37℃で2時間インキュベートした。ビオチン化された抗HIG2 pAbおよびペルオキシダーゼ(HRP)標識アビジン(DAKO)をo-フェニレンジアミン(DAKO)溶液とともにインキュベートすることで、血漿中のヒトHIG2タンパク質を検出した。
腎細胞癌の発癌の基礎となる機構を明らかにするために、この型の腫瘍で共通して上方制御される遺伝子を探索した。10の腫瘍における20,000個を上回る遺伝子のcDNAマイクロアレイ解析の結果、検査症例の50%以上で上方制御された32個の遺伝子が同定された(表3)。これら32個の遺伝子の上方制御は、半定量RT-PCR解析で再確認された(図1)。
HIG2は、検査されたRCCの10症例中9症例において上方制御された(図1、2a)。これとは対照的にHIG2の発現は、調べた他のどの29の臓器においても、胎児の腎臓を例外として、ほとんど検出されなかった(Saito-Hisaminato A., Katagiri T., Kakiuchi S., Nakamura T., Tsunoda T., Nakamura Y. Genome-wide profiling of gene expression in 29 normal human tissues with a cDNA microarray. DNA Res. 9, 35-45 (2002))。多組織ノーザン(MTN)ブロット解析でも、HIG2の発現が一様に低レベルであり、気管、脊髄、および甲状腺(図2b)に限定されることが示された。
HIG2がRCC細胞成長の因子であるか否かを判定するために、MTTアッセイ法およびコロニー形成アッセイ法を行った。HIG2を発現するように設計されたプラスミド発現ベクターを、内因性のHIG2発現が低かったCOS7細胞にトランスフェクトし(擬似試料;図4a)、HIG2を安定に過剰発現する細胞集団を確立した(安定A、B;図4a〜4b)。COS7-HIG2-安定は、対照ベクタープラスミドをトランスフェクトしたCOS7細胞と比較して、細胞成長の有意な促進を示した(図4c)。この結果は、3回の独立した実験で確認された。
RNAポリメラーゼIIIによるH1 RNA遺伝子の転写によって、3'端にウリジンを伴う短い転写物が得られた。H1 RNAのプロモーター領域を含むゲノム断片を、5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’ (配列番号; 71)、および 5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA -3’ (配列番号; 72)のプライマー対を用いて、またヒト胎盤DNAをテンプレートとしたPCRで増幅した。産物を精製し、pCR2.1プラスミドベクターにTAクローニングキットを用いて、製造業者のプロトコル(Invitrogen)に従ってクローニングした。H1 RNAを含むBamHI、XhoI断片を精製し、ヌクレオチド1257と56の間のpcDNA3.1(+)にクローニングし、断片を5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’ (配列番号; 73) 、および5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ (配列番号; 74)のプライマーを用いてPCRで増幅した。連結されたDNAは、プライマー 5’- TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’ (配列番号; 75)、および 5’- TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA -3’ (配列番号; 76)によるPCR増幅用のテンプレートとなった。産物をHindIIIで切断して、引き続き自己連結させることで、psiH1BXベクタープラスミドを得た。HIG2に対するsiRNA発現ベクター(psiH1BX-HIG2)を、表4に従って、2本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BXベクターのBbsI切断部位にクローニングすることで調製した。
siRNA #1
5'- GCATGTGATAAGACCTCCT-3' (配列番号; 77)、
siRNA #2
5'-CACTGACCTAGACATGTCC-3' (配列番号; 78)、
siRNA #3
5'-GAACCTGTCTAACTGGATG-3'(配列番号; 79) 、
siRNA #4 および
5'-CCTGTCTAACTGGATGCTC-3' (配列番号; 80)
HIG2 siRNAが細胞の成長に及ぼす作用を決定するために、上記の各siRNA発現ベクターをLipofectamine(商標)2000(Invitrogen)を用いてRCC細胞系列(caki-1およびcaki-2)、およびHIG2を内因的に発現するヒト胚性腎細胞HEK293にトランスフェクトした。GENETICIN(Invitrogen)による選択後に、細胞増殖様式を上述のギムザ染色(2週間で選択)、およびMTTアッセイ法(1週間で選択)で評価し、HIG2 mRNAのノックダウン作用を半定量RT-PCRおよびウェスタンブロット解析で同定した。
RCCに特異的な診断用腫瘍マーカーとしてのHIG2の有用性を評価するために、32人のRCC患者、ならびに負の対照として20人の健康で正常なボランティアおよび10人の慢性糸球体腎炎(CGN)患者の血漿試料を用いてサンドイッチ型ELISA解析を実施した。全20人の健康で正常なボランティアおよび10人のCGN患者の場合と比較して、かなり高いレベルのHIG2タンパク質が32人のRCC患者全員に由来する血漿中に観察された(図7a)。予想した通り、限局性腫瘍を有するRCC患者の血漿中のHIG2タンパク質レベルは、腫瘍の外科手術後に劇的に低下した(図7b)。しかしながら、転移性腫瘍を有する患者の血漿中のHIG2タンパク質レベルには、原発巣が外科的手術によって切除された後でもほとんど変化しなかった。これらの結果は、HIG2の発現がRCCに特異的であり、また特異的な腫瘍マーカーが現時点で入手不可能な癌であるRCCの高感度診断用マーカーとしての、高い可能性を有することを意味する。
ゲノムワイドなcDNAマイクロアレイにより得られた、本明細書に記載されたRCCの遺伝子発現解析では、癌の予防および治療の標的として特異的な遺伝子が同定された。これらの差次的に発現される遺伝子群の発現を基に本発明は、RCCを同定または検出するための分子診断マーカーを提供する。
本発明を詳細な説明とともに記述したが、上記の記述は説明することが意図されており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限する意図はないことを理解すべきである。他の局面、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内にある。
Claims (21)
- 被験対象から採取した腎組織試料における、低酸素誘導タンパク質-2(HIG2)遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、腎細胞癌細胞の検出方法であって、該遺伝子の正常腎組織試料における対照レベルと比較した時の上記発現レベルの上昇は、腎組織試料における腎細胞癌細胞の存在を示す、方法。
- 決定された試料の発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%大きい、請求項1記載の方法。
- 試料の発現レベルを、HIG2遺伝子のmRNAに対するプローブと、被験対象由来の生物学的試料の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを検出することで決定する、請求項1記載の方法。
- ハイブリダイゼーション段階をDNAアレイ上で実施する、請求項3記載の方法。
- 腎組織試料が明細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、血液中の腎細胞癌の診断用マーカーを検出する方法であって、前記腎細胞癌の診断用マーカーがHIG2遺伝子にコードされたタンパク質である方法:
i.被験対象から採取した血液試料に、HIG2遺伝子にコードされたタンパク質を認識する抗体を接触させる段階;
ii.抗体と腎細胞癌の診断用マーカーの結合を検出する段階;
iii.被験対象に由来する血液試料の結合レベルを、正常被験対象に由来する血液試料の結合レベルと比較する段階;および
iv.比較の結果、被験対象に由来する試料における結合レベルが、正常試料の場合と比較して高いことが示された場合に、腎細胞癌の診断用マーカーが、被験対象が腎細胞癌(RCC)に罹患している可能性を示す段階。 - 抗体とタンパク質の結合を酵素結合免疫吸着アッセイ法で検出する、請求項6記載の方法。
- 以下の段階を含む、RCCの治療用または予防用の候補薬剤のスクリーニング法:
(a)HIG2遺伝子にコードされたポリペプチドに試験化合物を接触させる段階;
(b)ポリペプチドと試験化合物間の結合活性を検出する段階;および
(c)ポリペプチドに結合する試験化合物を候補薬剤として選択する段階。 - 以下の段階を含む、RCCの治療用または予防用の候補薬剤のスクリーニング法:
(a)HIG2遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階;および
(b)HIG2遺伝子の発現レベルを低下させる候補化合物を候補薬剤として選択する段階。 - 細胞がRCC細胞を含む、請求項9記載の方法。
- 以下の段階を含む、RCCの治療用または予防用の候補薬剤のスクリーニング法:
(a)HIG2遺伝子にコードされたポリペプチドに試験化合物を接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、HIG2遺伝子にコードされたポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験化合物を候補薬剤として選択する段階。 - ポリペプチドの生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項11記載の方法。
- 以下の段階を含む、RCCの治療用または予防用の候補薬剤のスクリーニング法:
(a)HIG2遺伝子の転写調節領域、および転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞に候補化合物を接触させる段階;
(b)レポーター遺伝子の活性または発現のレベルを測定する段階;および
(c)試験化合物の非存在下と比較時に、レポーター遺伝子の活性または発現のレベルを低下させる候補化合物を候補薬剤として選択する段階。 - HIG2遺伝子に結合する核酸を含む、RCCの診断用キット。
- HIG2遺伝子にコードされるタンパク質に結合する抗体を含む、RCCの診断用キット。
- HIG2遺伝子に結合する核酸を含むRCCの診断剤。
- HIG2遺伝子に対する、薬学的有効量のアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子量干渉RNAを含む、RCCの治療用または予防用の組成物。
- siRNAの標的配列が、配列番号:77、配列番号:78、配列番号:79、および配列番号:80からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項17記載の組成物。
- HIG2遺伝子にコードされたタンパク質に結合する、薬学的有効量の抗体または抗体断片を含む、RCCの治療用または予防用の組成物。
- 抗体または抗体断片が、HIG2遺伝子にコードされたタンパク質の少なくともC末端領域を含むタンパク質に結合する、請求項19記載の組成物。
- C末端領域が、アミノ酸配列EPTKGLPDHPSRSMを含む、請求項20記載の組成物。
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