-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
Verfahren, die zum Reinigen von Materialien durch Adsorptionschromatographie,
vorzugsweise in einer Anordnung mit einem Fließbett oder einem Festbett,
geeignet sind, ohne dass ein beweglicher Adapter für das Festbett
erforderlich wäre,
wodurch die Elutionseigenschaften des Probenmoleküls von Interesse
verbessert werden.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die meisten biotechnologischen Verfahren
zur Herstellung pharmazeutischer oder diagnostischer Produkte umfassen
die Reinigung von Proteinen und Peptiden aus verschiedensten Quellen.
Dazu gehören
Bakterien-, Hefe- und Säugetier-Zellkulturflüssigkeiten
oder Extrakte von natürlich
vorkommendem Gewebe (Expanded Bed Adsorption: Principles and Methods,
Pharmacia Biotech, ISBN 91-630-5519-8).
-
Die anfängliche Reinigung eines Proteins
oder Peptids wird oft mithilfe von Adsorptionschromatographie auf
einem herkömmlichen
Festbett aus einem festen Trägeradsorbens
durchgeführt.
Das erfordert häufig die
Klärung
einer Rohzellenkultur oder eines Gewebegemischs vor dem Auftragen
auf eine Chromatographiesäule
(Pharmacia Biotech, w.o.).
-
Standardverfahren zum Entfernen von
Zellen und/oder Zelltrümmern
umfassen Zentrifugation und Mikrofiltration, die separat oder gemeinsam
eingesetzt werden können.
Festbettchromatographie ist problematisch, da das Bett leicht verklumpt,
wenn Rohmaterial über
das Bett geschickt wird, weshalb vor der Chromatographie Zentrifugation
und/oder Mikrofiltration erforderlich ist, was wiederum die Dauer
und Kosten der Produktgewinnung erhöht. Diskontinuierliche Adsorptionschromatographie
ist ein einstufiger Adsorptionsprozess vom Proteinprodukt an ein
Harz in einem gerührten
Behälter.
Diskontinu ierliche Adsorption benötigt große Mengen an Harz, was die
Rückgewinnungskosten
bedeutend erhöht
(Pharmacia Biotech, w.o.).
-
Fließbett-Adsorptions- („Expanded
Bed Adsorption-",
EBA-) Chromatographie ist zur anfänglichen Gewinnung von Zielproteinen
aus rohem Ausgangsmaterial oder einer Zellkultur geeignet. Die Prozessschritte der
Klärung,
Einengung und anfänglichen
Reinigung können
in eine Einheitsoperation zusammengelegt werden, wodurch aufgrund
der geringeren Anzahl an Prozessschritten, der höheren Ausbeute, der kürzeren Gesamtbearbeitungszeit,
der geringeren Lohnkosten und der geringeren Materialkosten der
Vorgang wirtschaftlicher wird. Bei EBA-Chromatographie wird ein
Adsorbens expandiert und äquilibriert,
indem ein nach oben gerichteter Flüssigkeitsstrom an die Säule angelegt
wird (siehe 1). Ein
stabiles Fließbett
wird gebildet, wenn die Adsorbensteilchen aufgrund des Gleichgewichts
zwischen der Teilchensedimentationsgeschwindigkeit Strömungsgeschwindigkeit
der Flüssigkeit
nach oben im Gleichgewicht suspendiert sind. Während dieser Phase wird ein
Säulenadapter
im oberen Teil der Säule
platziert, und ein Rohzellengemisch wird auf das Fließbett mit
Aufwärtsströmung aufgetragen.
Zielproteine im Gemisch werden an das Adsorbens gebunden, während Zelltrümmer und
andere Verunreinigungen ungehindert durchströmen. Schwach gebundenes Material
wird mithilfe von aufwärts
strömendem
Waschpuffer aus dem Fließbett
herausgewaschen. Zelltrümmer
und suspendierte Feststoffe in der Säule können ausgespült werden,
um eine Verunreinigung des Elutionspools durch Teilchenmaterial
zu verhindern (Draeger, N. M. und Chase, H. A., Bioseparation 2,
67–80
(1991); Chang, Y. K. et al., Biotechnology and Bioengineering 48,
355–366
(1995); Chang, Y. K. und Chase, H. A., Biotechnology and Bioengineering
49, 204–216
(1996); Munehiro, N., EP-A-0699687; und Carlsson, M. et al., WO
92/18237).
-
Nach einem Waschschritt wird die
Strömung
durch die Säule
gestoppt, und das Adsorbens wird in der Säule absetzen gelassen. Der
Säulenadapter
wird dann auf die Oberfläche
des sedimentierten Betts hinabgelassen. Die Strömung wird umgekehrt, und die
eingefangenen Proteine werden mithilfe eines geeigneten Puffers
aus dem sedimentierten Bett eluiert. Das Eluat enthält das Zielprotein
in einem reduzierten Elutionspoolvolumen, das teilweise als Vorbereitung
für Festbettchromatographie
gereinigt wird (Pharmacia Biotech, w.o.). Die Strömungsumkehr
während
der Proteinreinigung wurde dazu verwendet, um die Probenbanddiffusion nach
Einfüllen
einer dichten Probenlösung
(wie beispielsweise eines Ammoniumsulfatproteinniederschlags) in eine
Säule zu
minimieren, erforderte jedoch ungünstigerweise das tatsächliche
Umdrehen der Säule,
um die Strömungsrichtung
durch die Säule
zu ändern
(Scopes, Robert K., Kapitel 8 "Separation
in Solution" in
Protein Purification: Principles and Practice, S 242–249, Springer-Verlag,
NY (1994) und Huber, B. et al., EP-A-055.453).
-
Es besteht Nachfrage nach einem einfachen,
kostengünstigen
Verfahren zur Reduzierung des Elutionspoolvolumens, zur Steigerung
der Reinheit eines Probenmoleküls,
das durch ein chromatographisches Verfahren erhalten wird, und zur
Erhöhung
der Konzentration des Probenmoleküls, wenn es aus einem chromatographischen
Verfahren entnommen wird, ohne beispielsweise darauf warten zu müssen, bis
sich das Adsorbensbett absetzt, ohne den Säulenadapter verschieben zu
müssen
und ohne manuelles Umdrehen der Säule. Solch ein Verfahren würde Ausrüstungskosten
und Zeit für
die Probenreinigung sparen und gleichzeitig den Reinheitsgrad des
Zielproteins oder -peptids erhöhen.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die hierin offenbarte Erfindung stellt
ein Adsorptionschromatographie-Verfahren, vorzugsweise ein Festbett-Adsorptionschromatographieverfahren
mit fixiertem Adapter, bereit, bei dem das Adsorbens sich nicht absetzen
muss, die Säule
nicht umgedreht werden muss oder kein beweglicher Adapter zum Packen
des Adsorbensbettes benötigt
wird. Das Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung ist vorzugsweise eine Verbesserung eines Kontrollverfahrens,
worin die Verbesserung beispielsweise in reduziertem Elutionspoolvolumen,
höherer
Reinheit eines Probenmoleküls
und gesteigerter Konzentration eines durch das chromatographische Verfahren
erhaltenen Probenmoleküls
besteht.
-
In einem Aspekt stellt die vorliegende
Erfindung ein chromatographisches Verfahren bereit, wie es in Anspruch
1 definiert ist. Genauer gesagt umfasst die Erfindung ein Adsorptionschromatographie-Verfahren, wobei
das Verfahren das Kontaktieren einer ersten Flüssigkeit, die ein Probenmolekül enthält und eine
erste Dichte aufweist, mit einem partikulärem festen Träger in einer
vertikalen Säule;
das Kontaktieren einer zweiten Flüssigkeit, die eine zweite Dichte
aufweist, mit der ersten Flüssigkeit;
das Strömenlassen
der Flüssigkeiten durch
den festen Träger;
und das Sammeln des Probenmoleküls
in einem Elutionspoolvolumen; worin die zweite Flüssigkeit
auf die erste Flüssigkeit
folgt und mit der ersten Flüssigkeit
in Kontakt bleibt und die Säule nicht
umgedreht wird, um die Strömungsrichtung
durch die Säule
zu ändern.
Wenn die Dichte der ersten Flüssigkeit
höher ist
als die Dichte der zweiten Flüssigkeit,
strömt
die zweite Flüssigkeit
in der vertikalen Säule
in Abwärtsrichtung
in die erste Flüssigkeit.
Wenn die Dichte der zweiten Flüssigkeit
größer ist
als die Dichte der ersten Flüssigkeit,
strömt
die zweite Flüssigkeit
in der vertikalen Säule
in Aufwärtsrichtung
in die erste Flüssigkeit.
In jeder Ausführungsform
der Erfindung wird eine Grenzfläche
zwischen der ersten und der zweiten Flüssigkeit gebildet, so dass
die Vermischung zwischen den Flüssigkeiten
an der Grenzfläche
minimiert wird. Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist
zur Reduzierung des Elutionspoolvolumens für ein Probenmolekül in einem
chromatographischen Verfahren geeignet. Vorzugsweise beträgt das Probenmolekül-Elutionspoolvolumen
in einer Kontrollanalyse, in der eine Vermischung an der Grenzfläche der
beiden Flüssigkeiten
stattfindet, weniger als etwa 80% des Elutionspoolvolumens, noch
bevorzugter weniger als 70% des Elutionspoolvolumens, des Probenmoleküls, als
wenn bei Abwärtsströmung die
Dichte der ersten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der zweiten Flüssigkeit und bei Aufwärtsströmung die
Dichte der zweiten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der ersten Flüssigkeit.
-
In einer Ausführungsform der Erfindung ist
die erste Flüssigkeit
eine Lösung,
die ein Probenmolekül umfasst,
und die zweite Flüssigkeit
ein Eluens. Vorzugsweise ist die Dichte der Lösung, die das Probenmolekül umfasst,
größer als
die Dichte des Eluenten (zweite Flüssigkeit), und die Probenlösung strömt in Aufwärtsrichtung,
und das Eluens in Abwärtsrichtung.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist die Dichte der ersten Flüssigkeit um zumindest etwa
0,3% größer als
die Dichte der zweiten Flüssigkeit.
Vorzugsweise ist die Dichte der ersten Flüssigkeit um zumindest etwa
1% größer als
die Dichte der zweiten Flüssigkeit.
Vorzugsweise umfasst die erste Flüssigkeit ein dichteerhöhendes Mittel,
wie beispielsweise Glycerin, ein Salz, einen Zucker, Ethanol und
dergleichen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Wenn das dichteerhöhende Mittel
typischerweise ein Feststoff, wie beispielsweise ein Salz oder Zucker,
ist, ist die Obergrenze der Dichte der ersten Flüssigkeit die Dichte einer Lösung bei
der Löslichkeitsgrenze
des Mittels. Wenn das dichteerhöhende
Mittel typischerweise eine Flüssigkeit, wie
beispielsweise Ethanol oder Glycerin, ist, ist die Obergrenze der
Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte des reinen Mittels.
-
In einem weiteren Aspekt stellt die
Erfindung ein chromatographisches Verfahren bereit, wie es in Anspruch
7 definiert ist. Genauer gesagt stellt die Erfindung ein Adsorptionschromatographie-Verfahren
bereit, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer ersten Flüssigkeit,
die ein Probenmolekül
enthält
und eine erste Dichte aufweist, mit einem partikulären festen
Träger,
vorzugsweise in einer vertikalen Säule; das Kontaktieren einer
zweiten Flüssigkeit,
die eine zweite Dichte aufweist, mit der ersten Flüssigkeit;
das Strömenlassen
der Flüssigkeiten
durch den festen Träger,
so dass die zweite Flüssigkeit
auf die erste Flüssigkeit
folgt; das Kontaktieren der zweiten Flüssigkeit mit einer dritten
Flüssigkeit,
die eine dritte Dichte aufweist; das Strömenlassen der dritten Flüssigkeit
durch den festen Träger,
so dass die dritte Flüssigkeit
auf die zweite Flüssigkeit
folgt; und das Sammeln des Probenmoleküls in einem Elutionspoolvolumen;
worin die Säule
nicht umgedreht wird, um die Strömungsrichtung
durch die Säule
zu ändern.
Wenn die Dichte der zweiten Flüssigkeit
höhere
als die Dichte der dritten Flüssigkeit
ist, strömt
die dritte Flüssigkeit
in Abwärtsrichtung
in die zweite Flüssigkeit.
Wenn die Dichte der zweiten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der dritten Flüssigkeit, strömt die dritte Flüssigkeit in
Aufwärtsrichtung
in die zweite Flüssigkeit.
Vorzugsweise ist das chromatographische Verfahren eine Verbesserung
eines Kontrollverfahrens, worin die Verbesserung beispielsweise
in reduziertem Elutionspoolvolumen, höherer Reinheit des Probenmoleküls, das
durch ein chromatographisches Verfahren erhalten wird, und/oder gesteigerter
Konzentration eines durch das chromatographische Verfahren erhaltenen
Probenmoleküls
besteht. Vorzugsweise beträgt
das Probenmolekül-Elutionspoolvolumen
in einem Kontrollverfahren, in der eine Vermischung an der Grenzfläche der
zweiten und dritten Flüssigkeit
stattfindet, weniger als etwa 80% des Elutionspoolvolumens, noch
bevorzugter weniger als 70% des Elutionspoolvolumens, des Probenmoleküls, als wenn
bei Abwärtsströmung die
Dichte der zweiten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der dritten Flüssigkeit und bei Aufwärtsströmung die
Dichte der dritten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der zweiten Flüssigkeit.
-
In einer Ausführungsform der Erfindung ist
die erste Flüssigkeit
eine Lösung,
die ein Probenmolekül umfasst,
die zweite Flüssigkeit
eine Waschlösung
und die dritte Flüssigkeit
ein Eluens. Vorzugsweise ist die Dichte der Waschlösung (zweite
Flüssigkeit)
größer als
die Dichte des Eluens (dritte Flüssigkeit),
und die Waschlösung
strömt
in Aufwärtsrichtung
und die Elution in Abwärtsrichtung.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung mit Strömung der Waschlösung ist
die Dichte der zweiten Flüssigkeit
um zumindest etwa 0,3% größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Vorzugsweise ist die Dichte der zweiten Flüssigkeit um etwa 1% größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Vorzugsweise umfasst die zweite Flüssigkeit ein dichteerhöhendes Mittel,
wie beispielsweise Glycerin, ein Salz, einen Zucker und dergleichen,
ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Wenn das dichteerhöhende Mittel
typischerweise ein Feststoff, wie beispielsweise ein Salz oder Zucker,
ist, ist die Obergrenze der Dichte der ersten Flüssigkeit die Dichte einer Lösung bei
der Löslichkeitsgrenze
des Mittels. Wenn das dichteerhöhende
Mittel typischerweise eine Flüssigkeit,
wie beispielsweise Ethanol oder Glycerin ist, ist die Obergrenze
der Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte des reinen Mittels.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
-
1A bis 1C sind graphische Darstellungen
einer herkömmlichen
Fließbettadsorptions-
(EBA-) Chromatographie (1A);
einer EBA mit fixiertem Adapter unter Verwendung eines Waschpuffers,
worin die Dichte des Waschpuffers geringer ist als die Dichte des
Elutionspuffers (1B)
in 1A; und eine EBA
mit fixiertem Adapter gemäß vorliegender
Erfindung (1C) unter
Verwendung eines Glycerin umfassenden Waschpuffers, worin die Dichte
des Waschpuffers größer ist
als die Dichte des Elutionspuffers, wodurch die Bildung einer scharfen
Grenzfläche
zwischen der Beladung und dem Waschpuffer und zwischen dem Waschpuffer
und dem Elutionspuffer ermöglicht
wird.
-
2A bis 2C sind Profile (UV-Absorption
bei 180 nm) von Aceton in Puffer unter Verwendung von Säule 1 (Innendurchmesser
2,5 cm) nach Modus 1 (herkömmliche
Fließbettadsorptions-
(EBA-) Chromatographie); Modus 2 (EBA mit fixiertem Adapter mit
Pufferwaschung); und Modus 3 (EBA mit fixiertem Adapter mit Glycerinwaschung).
Genauer gesagt zeigt 2A ein
Profil, erhalten unter Verwendung eines Puffers aus 25 mM MES, 200
mM NaCl, 0,5% Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Lineargeschwindigkeit
244,5 cm/Std. in Säule
1 nach Modus 1, Adapterhöhe
18 cm. 2B zeigt ein
Profil, erhalten unter Verwendung eines Puffers aus 25 mM MES, 200
mM NaCl, 0,5% Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Lineargeschwindigkeit
244,5 cm/Std. in Säule
1 nach Modus 2, Adapterhöhe
70 cm. 2C ist ein Profil,
erhalten unter Verwendung eines Puffers aus 25 mM MES, 200 mM NaCl,
0,5% Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Lineargeschwindigkeit
244,5 cm/Std. in Säule
1 nach Modus 3, Adapterhöhe
70 cm.
-
3A bis 3C sind Profile (UV-Absorption
bei 280 nm) von Aceton in Puffer unter Verwendung von Säule 2 (Innendurchmesser
20 cm) nach Modus 1, 2 und 3. Genauer gesagt zeigt 3A ein Profil, erhalten mit 25 mM MES,
200 mM NaCl, 0,5% Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Lineargeschwindigkeit
242,7 cm/Std. in Säule
2 nach Modus 1, Adapterhöhe
19,5 cm. 3B zeigt ein
Profil, erhalten unter Verwendung eines Puffers aus 25 mM MES, 200
mM NaCl, 0,5% Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Linearge schwindigkeit
242,7 cm/Std. in Säule
2 nach Modus 2, Adapterhöhe
70,5 cm. 3C ist ein
Profil, erhalten unter Verwendung eines Puffers aus 25 mM MES, 200
mM NaCl, 0,5 Aceton, pH 5,9, Abwärtsströmung, Lineargeschwindigkeit
242,7 cm/Std. in Säule
2 nach Modus 3, Adapterhöhe
70,5 cm.
-
4A bis 4C sind Profile (UV-Absorption
bei 280 nm) einer gereinigten Proteinbeladung (1.300 ml einer 0,4-mg/ml-Proteinlösung) in
Säule 1
(Innendurchmesser 2,5 cm) nach Modus 1, 2 und 3. Genauer gesagt zeigt 4A ein Profil, erhalten
nach Modus 1, Lineargeschwindigkeit 244,5 cm/Std., Waschung (25
mM MES, pH 5,9), Elution (25 mM MES, 125 mM NaCl, pH 5,9, Adapterhöhe 18 cm). 4B ist ein Profil, erhalten
nach Modus 2, Lineargeschwindigkeit 244,5 cm/Std., Waschung (25
mM MES, pH 5,9), Elution (25 mM MES, 125 mM NaCl, pH 5,9, Adapterhöhe 70 cm). 4C ist ein Profil, erhalten
nach Modus 3, Lineargeschwindigkeit 244,5 cm/Std., Waschung (25
mM MES, 5 Vol.-% Glycerin, pH 5,9), Elution (25 mM MES, 125 mM NaCl,
pH 5,9, Adapterhöhe
70 cm).
-
5A bis 5B sind Profile (UV-Absorption
bei 280 nm) eines rohen Ausgangsmaterials (600 ml einer 0,22-mg/ml-Proteinlösung) unter
Verwendung von Säule
1 (Innendurchmesser 2,5 cm) nach Modus 2 und 3. Genauer gesagt zeigt 5A ein Profil, erhalten
nach Modus 2, Lineargeschwindigkeit 244,5 cm/Std., Waschung (25
mM MES, pH 5,9), Elution (25 mM MES, 125 mM NaCl, pH 5,6, Adapterhöhe 70 cm). 5B ist ein Profil, erhalten
nach Modus 3, Lineargeschwindigkeit 244,5 cm/Std., Waschung (25
mM MES, 5 Vol.-% Glycerin, pH 5,9), Elution (25 mM MES, 125 mM NaCl,
pH 5,6, Adapterhöhe
70 cm).
-
6A bis 6B sind Diagramme, die Veränderungen
der Eluentenleitfähigkeit
(mS/cm) und Dichte (g/ml, Dreiecke) als Funktion von Säulenvolumen
(SV) eines Eluenten, der durch die Säule strömt, zeigen. Die Leitfähigkeit
wurde am Säuleneinlass
(durchgehende Linie) und am Säulenauslass
(gestrichelte Linie) überwacht. 6A zeigt die Ergebnisse
für einen
Salzgradienten (0 bis 0,5 M NaCl), der ohne Dichtekontrolle in Säule 3 laufen
gelassen wurde. 6B zeigt
die Ergebnisse für
einen Salzgradienten (0 bis 0,5 M NaCl), der mit Dichtekontrolle
laufen gelassen wurde (15 Vol.-% Glycerin).
-
7 ist
ein Diagramm, das Eluentenleitfähigkeitsprofile
(mS/cm) einer Abwärtsströmungsschrittelution
mit 0,5 M NaCl als Eluenten zeigt, der mit einer Lineargeschwindigkeit
von 100 cm/Std. in Säule
4 fließt. Die
durchgehende Linie stellt den Betrieb in Modus 1 dar (Adapterhöhe 14 cm);
die gestrichelte Linie stellt den Betrieb in Modus 2 dar (Adapterhöhe 100 cm);
und die Rauten stellen den Betrieb in Modus 3 dar (Adapterhöhe 100 cm).
-
8 ist
ein Diagramm, das die Einlass- und Auslassleitfähigkeitsprofile (normalisiert
in Bezug auf die Leitfähigkeit
von 0,5 M NaCl) als Funktion des Eluentenvolumens für einen
Abwärtsströmungssalzgradienten von
0 bis 0,5 M NaCl bei einer Lineargeschwindigkeit von 100 cm/Std.
in Säule
4 zeigt (Adapterhöhe
betrug 100 cm). Die Rauten zeigen die Veränderung der Einlassleitfähigkeit,
und die durchgehende Linie zeigt die Veränderung der Auslassleitfähigkeit
im Kontrolllauf (ohne Dichtekontrolle). Die Kreise zeigen die Veränderung der
Einlassleitfähigkeit,
und die gestrichelte Linie zeigt die Veränderung der Auslassleitfähigkeit
im Testlauf (mit Dichtekontrolle, 15 Vol.-% Glycerin).
-
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Definitionen
-
Die Begriffe "fester Träger", "Adsorbens", "Harz" und dergleichen
beziehen sich hierin auf chromatographisches Material, das mit der
flüssigen
chromatographischen Phase nicht mischbar ist, und auf welches das
Probenmolekül
durch Affinität,
ionische Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung oder eine chemische
Reaktion, wie beispielsweise eine enzymatische Reaktion, wechselwirkt,
welche die chemische Zusammensetzung des Probenmoleküls verändert.
-
Der Begriff "Probenmolekül" umfasst hierin alle Moleküle, die
mithilfe des chromatographischen Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bearbeitet
werden können.
Vorzugsweise ist das Probenmolekül
eine biologische Einheit natürlichen
biologischen oder biochemischen Ursprungs oder durch biologische
oder biochemische Verfahren oder DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt.
Beispiele für
bevorzugte Probenmoleküle
umfassen Säugetierzellen
und Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, Pilze und Hefe,
sowie Polypeptide, natürliche
oder rekombinant hergestellt Proteine, die glykosyliert sein können oder
auch nicht, Zellbestandteile, Nucleinsäuren, Viren, Kohlenhydrate
und andere biologische Moleküle
von Interesse, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Besonders
bevorzugte Probenmoleküle
umfassen Antikörper,
wie z. B. Anti-IL-8, St. John et al., Chest 103, 932 (1993) und
internationale Veröffentlichung
Nr. WO 95/23865; Anti-CD11a, Filcher et al., Blood 77, 249–256, Steppe
et al., Transplant Intl. 4, 3–7
(1991), und Hourmant et al., Transplantation 58, 377–380 (1994);
Anti-IgE, Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993), und internationale
Veröffentlichung
Nr. WO 95/ 19181; Anti-HER.2, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89, 4285–4289 (1992),
und internationale Veröffentlichung
Nr. WO 92/20798; Anti-VEGF, Jin Kim et al., Growth Factors 7, 53–64 (1992),
und internationale Veröffentlichung
Nr. WO 96/30046; Anti-CD18,
internationale Veröffentlichung
Nr. WO 96/32478; und Anti-CD20, Maloney et al., Blood 84, 2457–2466 (1994),
und Liu et al., J. Immunol. 130, 3521–3526 (1987), sind jedoch nicht
auf diese beschränkt.
-
Der Begriff "Elutionspoolvolumen" bezieht sich hierin auf das Volumen
der Eluatfraktion, die das Probenmolekül enthält, wobei die Fraktion von
dem Zeitpunkt an, an dem die Detektion einer Probenmolekülelution
beginnt, bis zum Ende der Elution abgenommen wird. Andererseits
kann das Elutionspoolvolumen auch von dem Zeitpunkt an, an dem die
Detektion eines Probenmoleküls
etwa 15% des Signalmaximums erreicht (Beginn des positiven Anstiegs
des Eingangssignals) bis zum Zeitpunkt, wo das Detektionssignal
auf etwa 15% des Signalmaximums fällt (negativer Anstieg des
Eingangssignals), bestimmt werden. Außerdem dann das Elutionspoolvolumen
beispielsweise durch Messen der Peak-Breite an beispielsweise der
Basislinie der chromatographischen Kurve be stimmt werden (siehe 4A–4C und 5A–5B).
In einem weiteren alternativen Verfahren kann das Elutionsvolumen
unter Verwendung eines nicht-adsorbierenden Markermoleküls bestimmt werden
(beispielsweise UV-Detektion von Aceton oder Leitfähigkeitsdetektion
eines Salzes in einem Puffer), worin C/C0=
0,1 bis C/C0 = 0,9 ist.
-
Der Begriff "Kontrollverfahren" bezieht sich hierin auf ein chromatographisches
Verfahren mithilfe desselben oder eines ähnlichen Geräts, Adsorbens,
Probenmoleküls
und denselben oder ähnlichen
Flüssigkeiten (wie
beispielsweise Puffern) wie im Verfahren gemäß vorliegender Erfindung verwendet.
Das Kontrollverfahren unterscheidet sich jedoch von einem Verfahren
gemäß vorliegender
Erfindung, vor allem dadurch, dass beim Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung eine erste und eine zweite Flüssigkeit oder eine zweite und
eine dritte Flüssigkeit
sich in einer Eigenschaft (wie beispielsweise Dichte), die das Vermischen
der Flüssigkeiten
während
des Durchströmens
der Säule
beeinflusst, unterscheiden, während
das beim Kontrollverfahren nicht der Fall ist. Folglich findet beim
Kontrollverfahren eine Vermischung an der Grenzfläche zwischen
den beiden Flüssigkeiten
statt, wenn sie durch das feste Trägermaterial strömen, was
zu einem höheren
Elutionspoolvolumen für
das Probenmolekül
führt,
beim Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung wird solch eine Vermischung jedoch minimiert. Wenn das
chromatographische Verfahren einen Beladungspuffer (erste Flüssigkeit),
einen Waschpuffer (zweite Flüssigkeit)
und einen Elutionspuffer (dritte Flüssigkeit) umfasst, weist der
Waschpuffer vorzugsweise eine höhere
Dichte auf als der Beladungspuffer oder der Elutionspuffer, und
die Vermischung an der Grenzfläche
zwischen den Lösungen
wird minimiert. Vorzugsweise ist der Waschpuffer zumindest etwa 0,3%
dichter als der Beladungspuffer oder der Elutionspuffer. Wenn das
dichteerhöhende
Mittel typischerweise ein festes Material ist, wie beispielsweise
ein Salz oder Zucker, ist die Obergrenze der Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte einer Lösung
bei der Löslichkeitsgrenze
des Mittels. Wenn das dichteerhöhende
Mittel typischerweise eine Flüssigkeit
ist, wie beispielsweise Ethanol oder Glycerin, ist die Obergrenze
der Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte des reinen Mittels.
-
Der Begriff "Chromatographie" und ähnliche Begriffe bezeichnen
hierin eine Form von Chromatographie, bei der ein festes Adsorptionsmaterial
mit einem Probenmolekül
in einer Flüssigkeit
kontaktiert wird und das Probenmolekül mit dem festen Material wechselwirkt,
wenn die Flüssigkeit
durch das feste Adsorptionsmaterial strömt (beispielsweise durch Ionenaustausch,
Affinität
und Größenausschlusschromatographie).
Der Begriff "Chromatographie-Assay
oder -Verfahren" und
dergleichen bezieht sich auf solche Beispiele, wie Fließbettchromatographie,
Festbettchromatographie, Festbettreaktoren (worin ein reaktives
Molekül,
wie beispielsweise ein Enzym, kovalent an den festen Träger gebunden
ist) und Membranchromatograpie, die nicht als Einschränkung zu
verstehen sind.
-
Ausführungsformen der Erfindung
-
In einer Ausführungsform der Erfindung, die
zwei Flüssigkeiten
umfasst, enthält
die erste Flüssigkeit Glycerin,
wobei der Glyceringehalt so variiert wird, damit die erste Flüssigkeit
eine größere Dichte
aufweist als die zweite Flüssigkeit.
Vorzugsweise ist die Dichte der ersten Flüssigkeit zumindest etwa 0,3%
größer als
die Dichte der zweiten Flüssigkeit.
Noch bevorzugterweise ist die Dichte der ersten Flüssigkeit
von etwa 1% größer als
die der zweiten Flüssigkeit
bis zu etwa der Dichte einer Lösung
bei der Löslichkeitsgrenze
eines typischen festen dichteerhöhenden
Mittels oder bis zur Dichte der reinen Flüssigkeit eines flüssigen dichteerhöhenden Mittels.
In einer weiteren Ausführungsform
wird ein gelöster
Stoff, wie beispielsweise Salz, Ethanol, Zucker (z. B. Glucose)
oder ein anderes Molekül,
zur ersten Flüssigkeit
zugesetzt, um ihre Dichte so zu ändern,
dass die Dichte der erster. Flüssigkeit
größer ist
als die Dichte der zweiten Flüssigkeit.
Die erste, dichtere Flüssigkeit
ist vorzugsweise ein Waschpuffer und strömt in Aufwärtsrichtung durch den festen
Träger;
die zweite, weniger dichte Flüssigkeit
ist vorzugsweise ein Eluens, das in Abwärtsrichtung durch den festen
Träger
in der Säule strömt.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, die drei Flüssigkeiten
umfasst, enthält
die erste Flüssigkeit
ein Probenmolekül,
die zweite Flüssigkeit
Glycerin, worin der Glyceringehalt so variiert wird, dass die Dichte
der zweiten Flüssigkeit
größer als
die Dich te der dritten Flüssigkeit
und gegebenenfalls auch größer als die
Dichte der ersten Flüssigkeit
ist. Vorzugsweise ist die Dichte der zweiten Flüssigkeit zumindest etwa 0,3 größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Noch bevorzugter ist die Dichte der zweiten Flüssigkeit etwa 1% größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
In einer weiteren Ausführungsform
wird ein gelöster
Stoff, wie beispielsweise Salz, Ethanol, Zucker (z. B. Glucose)
oder ein anderes Molekül
zur zweiten Flüssigkeit
zugesetzt, um seine Dichte zu ändern,
so dass die Dichte der zweiten Flüssigkeit größer ist als die Dichte der
dritten Flüssigkeit,
bis zu einer Dichte, die etwa der Dichte einer Lösungsmittel bei der Löslichkeitsgrenze
eines typischen festen dichteerhöhenden
Mittels entspricht oder bis zu etwa der Dichte des reinen flüssigen dichteerhöhenden Mittels.
Die zweite, dichtere Flüssigkeit
ist vorzugsweise ein Waschpuffer und strömt in Aufwärtsrichtung durch den festen
Träger;
die dritte, weniger dichte Flüssigkeit
ist vorzugsweise ein Eluens, das in Abwärtsrichtung durch den festen
Träger
in der Säule
strömt.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist das chromatographische Verfahren eine Säulenchromatographie
und der feste Träger
teilchenförmig.
Die Teilchen sind vorzugsweise Harz, Glaskügelchen oder ein Material mit
einer Kohlenhydratrückgrat,
das einen festen Träger
für eine
Chromatographie bildet.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist der feste Chromatographieträger eine poröse Membran.
Eine poröse
Membran, die für
die Umsetzung der Erfindung geeignet ist, umfasst mikroporöse und makroporöse Membranen
aus Regeneratcellulose, Polyvinylidenfluorid, Nylon und Polysulfon,
ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung beträgt
das Probenmolekül-Elutionspoolvolumen weniger
als etwa 80% des Elutionspoolvolumens des Probenmoleküls, vorzugsweise
weniger als etwa 70% des Elutionspoolvolumens des Probenmoleküls in der
Kontrollchromatographie. Die Kontrollchromatographie, die keine
Dichtekontrolle zur Minimierung; der Vermischung der Lösungen in
der Säule
umfasst, wird im selben oder in einem ähnlichen Gerät zur Messung
des Elutionspoolvolumens des Probenmole küls durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform
beträgt
das Probenmolekül-Elutionspoolvolumen
vorzugsweise zwischen etwa 50 bis 80% des Elutionspoolvolumens des
Probenmoleküls
im Kontrollverfahren.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, worin die Chromatographie eine erste, zweite und dritte
Flüssigkeit
umfasst, ist die Strömungsrichtung
der dritten Flüssigkeit
der Strömungsrichtung
der ersten und zweiten Flüssigkeit
entgegengesetzt.
-
In einer Ausführungsform der Erfindung, die
eine erste, zweite und dritte Flüssigkeit
umfasst, umfasst die zweite Flüssigkeit
Glycerin, worin das Glycerin die Dichte der zweiten Flüssigkeit
so verändert,
dass seine Dichte größer ist
als die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Vorzugsweise ist die Dichte der zweiten Flüssigkeit zumindest etwa 0,3%
größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Noch bevorzugter ist die Dichte der zweiten Flüssigkeit etwa 1% größer als
die Dichte der dritten Flüssigkeit.
Wenn das dichteerhöhende
Mittel typischerweise ein festes Material, wie beispielsweise ein
Salz oder Zucker ist, ist die Obergrenze der Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte einer Lösung
bei der Löslichkeitsgrenze
des Mittels. Wenn das dichteerhöhende
Mittel typischerweise eine Flüssigkeit,
wie beispielsweise Ethanol oder Glycerin, ist, ist die Obergrenze
der Dichte der ersten Flüssigkeit
die Dichte des reinen Mittels.
-
In einer Ausführungsform der Erfindung, die
eine erste und zweite Flüssigkeit
umfasst, oder in einer Ausführungsform
der Erfindung, die eine erste, zweite und dritte Flüssigkeit
umfasst, kann zumindest eine der Flüssigkeiten einen Gradienten
umfassen, worin die Konzentration einer Art in der Flüssigkeit
im Laufe der Zeit variiert wird, um seine Dichte im Laufe der Zeit
zu ändern.
In solch einer Situation kann ein dichteveränderndes Mittel (wie beispielsweise
Glycerin, Salz, Zucker und dergleichen) zugesetzt werden, so dass
die Dichte der Gradientenflüssigkeit
in Bezug auf die Dichte einer anderen Flüssigkeit, mit der sie in Kontakt
ist, konstant bleibt oder abnimmt (für Abwärtselution) oder zunimmt (für Aufwärtselution).
In einem Beispiel, das nicht als Einschränkung zu verstehen ist, bei
dem eine dritte Flüssigkeit
einen Salzgradienten mit erhöhender
Dich te umfasst, kann Glycerin in einer Anfangskonzentration zugesetzt
und im gesamten Gradienten reduziert werden, wenn die Salzkonzentration
zunimmt, wodurch eine im Wesentlichen konstante (oder abnehmende)
Dichte für
die dritte Flüssigkeit
erhalten wird. Der Gradient kann ein kontinuierlicher Gradient oder
ein schrittweiser Gradient sein.
-
Ausführungsformen der verschiedenen
Aspekte der Erfindung können
in einer Fließbettanordnung verwendet
werden, ohne dass eine Bewegtbett-Adaptervorrichtung erforder1ich
wäre.
-
Eine Ausführungsform jedes Aspekts der
Erfindung umfasst die Änderung
der Dichte einer Flüssigkeit, die
in der Erfindung verwendet wird, durch Zusetzen von Glycerin als
dichteveränderndes
Mittel. In dieser Ausführungsform
umfasst eine Flüssigkeit
gemäß vorliegender
Erfindung Glycerin in einer Konzentration von etwa 2,5% Glycerin
bis zu etwa 25% Glycerin. Vorzugsweise liegt die Glycerinkonzentration
bei etwa 5% Glycerin bis etwa 15% Glycerin. Noch bevorzugter ist
die Glycerinkonzentration so eingestellt, dass sie die Dichte der Flüssigkeit
so verändert,
dass diese zumindest etwa 0,3 größer ist
als die Dichte einer anderen Flüssigkeit
der Erfindung. Wenn die Glucose umfassende Flüssigkeit beispielsweise der
Waschpuffer ist, dann ist ihre Dichte größer als die Dichte des Beladungspuffers
und des Elutionspuffers der Erfindung, und zwar um etwa 0,3% bis etwa
zur Dichte einer Glucoselösung
bei der Löslichkeitsgrenze
von Glucose im Puffer.
-
Eine alternative Ausführungsform
jedes Aspekts der Erfindung umfasst die Änderung einer Kombination von
Merkmalen einer Flüssigkeit
des Verfahrens gemäß vorliegender
Erfindung (z. B. Änderung
der Dichte der Waschlösung).
Vorzugsweise wird die Dichte so geändert, dass die miteinander
in Kontakt stehenden Flüssigkeiten
eine Grenzfläche
bilden, so dass eine Vermischung zwischen den in Kontakt stehenden
Flüssigkeiten minimiert
wird, wenn die Flüssigkeiten
durch das Adsorptionsmaterial strömen.
-
Bevor die Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung zur Reinigung eines Probenmoleküls in einer Fließbett-Adsorptionschromatographie
ohne Verwendung eines Bewegtbett-Adapters
beschrieben werden, sollte angemerkt werden, dass diese Erfindung
nicht auf die hierin beschriebenen Proben oder Verfahren beschränkt ist,
sondern dass diese Proben und Verfahren natürlich variieren können. Außerdem versteht
sich, dass die hierin verwendeten Begriffe nur zur Beschreibung
spezifischer Ausführungsformen
dienen und keineswegs zur Einschränkung dienen, da der Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung nur durch die beiliegenden Ansprüche begrenzt
ist.
-
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung die Erfindung im Detail
zu offenbaren und zu beschreiben, wie die Verbindungen und Zusammensetzungen
der Erfindung hergestellt werden, und nicht, um den Schutzumfang
der Erfindung einzuschränken.
In Hinblick auf Zahlen (z. B. Mengen, Temperaturen usw.) wurde größtmögliche Genauigkeit
angestrebt, doch sollte die Möglichkeit
von Fehlern und Abweichungen in den Beispielen in Betracht gezogen
werden.
-
BEISPIELE
-
Das EBA-Verfahren mit fixiertem Adapter
hebt die Notwendigkeit eines beweglichen, aufsetzbaren Adapters
auf, der für
den Betrieb eines herkömmlichen
EBA-Verfahrens wesentlich ist. Somit kann das EBA-Verfahren mit
fixiertem Adapter gemäß vorliegender
Erfindung kostengünstiger
und bequemer durchgeführt
werden als herkömmliche
EBA.
-
Bei einem typischen EBA-Verfahren
werden Proteine eingefangen, wenn die Proteinlösung in Aufwärtsrichtung
in die Säule
gepumpt wird, wodurch das gepackte Säulenbett expandiert wird. Danach
wird die Säule
mit einer Waschlösung
gewaschen, die ebenfalls in Aufwärtsrichtung
strömt,
während
das Protein von Interesse durch den festen Träger zurückgehalten wird. Eine Proteinelution
findet statt, wenn das Eluens in die Abwärtsrichtung gepumpt wird, wodurch
die Säule
gepackt wird. Bei einer herkömmlichen EBA
wird der Adapter von oben nach unten bewegt und nahe an das Festbett
gebracht, bevor die Elution beginnt. Das wird gemacht, um das Hohlraumvolumen über dem
Festbett zu minimieren, da das Vorhandensein eines Hohlraumvolumens
zu Vermischung und Verdünnung
des Eluenten führen
kann.
-
Bei EBA mit fixiertem Adapter wird
jedoch die Notwendigkeit eines beweglichen Adapters aufgehoben, indem
ein dichteveränderndes
Mittel (z. B. Glycerin) in die Waschlösung eingeführt wird. Dadurch wird die
Vermischung der Lösungen
in der Säule
minimiert, wenn beispielsweise eine dichtere Waschpufferlösung in
Aufwärtsrichtung
strömt
und einen weniger dichten Beladungspuffer verdrängt oder wenn ein weniger dichtes
Eluens in Abwärtsrichtung
strömt
und einen dichteren Waschpuffer verdrängt.
-
Die Fließbettadsorptions- (EBA-) Anordnung
wurde verwendet, um dieses Konzept zu demonstrieren, wobei der Adapter
sich jedoch in fixierter Position befand. Diese Anordnung bestand
aus einer STREAMLINETM-Säule, die mit STREAMLINE-SP-XLTM-Harz (Kationenaustausch) gepackt war,
Masterflex PumpTM, einem UV-Absorptionsdetektor
und einem Schreiber. Die Säule
wurde in 3 Modi betrieben, wie sie in Tabelle 1 beschrieben sind.
Die hierin angegebenen Beispiele vergleichen die Leistung herkömmlicher
EBA (mit beweglichem Adapter) und der EBA mit fixiertem Adapter
gemäß vorliegender
Erfindung mit und ohne Modifikation der Waschpufferdichte.
-
-
-
Beispiel 1:
-
Dieses Beispiel vergleicht das Elutionsprofil
des Eluenten in den 3 in Tabelle 1 beschriebenen Modi. Kein Protein
wurde auf die Säule
aufgegeben. Der Eluentenpuffer (25 mM MES, 200 mM NaCl, 0,5% Aceton, pH
5,9) wurde mit einer Lineargeschwindigkeit von 245 cm/Std. durch
den festen Träger
in der Chromatographiesäule
gepumpt. Das Aceton wurde in den Eluenten eingeführt, um seine Strömung zu überwachen,
indem die UV-Absorption
bei 280 nm aufgezeichnet wurde. Die physikalischen Parameter der
verwendeten Säule (Säule 1) sind
in Tabelle 2 zusammengefasst.
-
Tabelle
2: Physikalische Parameter der Säule
1 (STREAMLINE 25
TM)
-
2A bis 2C zeigen die UV-Kurven des
Eluenten in Modus 1, 2 und 3. Daraus ist erkennbar, dass in Modus
1 (herkömmliche
EBA (beweglicher Adapter), 2A)
die Front des Eluenten scharf war, was auf Massenfluss hinweist.
Das Eluentenprofil in Modus 2 (EBA mit fixiertem Adapter mit 25
mM MES Pufferwaschung, 2B)
wies auf beträchtliche
Vermischung der Lösungen
hin, wie durch die Zeit belegt wurde, die erforderlich war, bis
die UV-Kurve des Eluenten das Maximum erreichte. Das Strömungsprofil
des Eluenten in Modus 3 (EBA mit fixiertem Adapter mit den 25 mM
MES, 5 Vol.-% Glycerinwaschung, 2C)
wies, ähnlich
wie der herkömmliche
EBA-Modus (2A), eine
scharfe Front auf, wobei jedoch kein beweglicher Adapter verwendet
wurde.
-
Beispiel 2
-
Das Zweck dieses Versuchs bestand
darin, auch bei Maßstabsvergrößerung in
Säule 2
(Innendurchmesser 20 cm) konsequentes Verhalten nachzuweisen, wie
es bei Säule
1 (Innendurchmesser 2,5 cm) in 2A bis 2C beobachtet wurde. Die
physikalischen Parameter von Säule
2 sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Wie in Beispiel 1 wurde kein
Protein auf die Säule
aufgegeben. Die Eluentenpufferzusammensetzung war dieselbe wie in
Beispiel 1 und wurde mit einer Lineargeschwindigkeit von 243 cm/Std.
durch das feste Trägerbett
in der Säule
gepumpt.
-
3A bis 3C zeigen die UV-Kurven des
Eluenten in Modus 1, 2 und 3. Diese Profile stimmten mit jenen der
Säule 1
(2A bis 2C) überein,
und somit wies die Wirkung auch bei Maßstabsvergrößerung Konsistenz auf.
-
Tabelle
3: Physikalische Parameter der Säule
2 (STREAMLINE 200
TM)
-
Beispiel 3
-
Die Ergebnisse der Versuche in diesem
Beispiel bestätigen,
dass der Vorgang gemäß vorliegender
Erfindung ein scharfes Elutionsprofil ergibt und das Elutionspoolvolumen
verringert. Zu diesem Zweck wurde ein gereinigtes Protein, in diesem
Beispiel Anti-CD18,
auf Säule
1 (1.300 ml einer 0,4-mg/ml-Proteinlösung mit einer Lineargeschwindigkeit
von 245 cm/Std.) gegeben. Nachdem die Säule mit dem geeigneten Puffer
gewaschen worden war, wie es für
die Modi 1, 2 und 3 erläutert
wurde, wurde das Eluens (25 mM MES, 125 mM NaCl, pH 5,9) mit einer
Lineargeschwindigkeit von 245 cm/Std. in Abwärtsrichtung durch den festen
Träger
in der Säule
gepumpt.
-
Der Ausfluss aus der Säule wurde
bei 280 nm überwacht,
um das Elutionsprofil des Proteins aufzuzeichnen, das in 4A bis 4C dargestellt ist. Daraus ist ersichtlich,
dass bei der herkömmlichen
EBA (Modus 1, 4A) und
der EBA mit fixiertem Adapter mit 25-mM-MES-, 5 Vol.-%-Glycerinwaschung (Modus
3, 4C) die Elutionspoolvolumen
gering (580 ml) und die Proteinkonzentrationen hoch waren. Bei der
EBA mit fixiertem Adapter mit der 25-mM-MES-Waschung (Modus 2, 4B) war das Elutionspoolvolumen
größer (980
ml), und das Protein war nicht so stark konzentriert wie in den
Modi 1 und 3. Das Elutionspoolvolumen wurde bestimmt, indem das
Volumen gemessen wurde, das vom Beginn der Peak-Detektion bis zur
Rückkehr des
Signals zur Basislinie eluiert wurde. Das Beispiel zeigt somit,
dass durch Verwendung des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung das
Elutionsvolumen eines Proteins von Interesse in Bezug auf das Kontrollverfahren,
bei dem keine Minimierung der Vermischung der Waschlösung und
des Eluenten erreicht wurde, abnahm.
-
Beispiel 4
-
Das Ziel dieses Versuchs bestand
darin, die Wirkung zu belegen, die in den vorangegangenen Versuchen
mit einem EBA-Verfahren mit fixiertem Adapter gemäß vorliegender
Erfindung beobachtet wurden, wobei beim Verfahren ein ungereinigter
Zufuhrstrom eines Proteingemischs auf das feste Trägerbett
gegeben wurde. Zu diesem Zweck wurde gefrorene E.-coli-Paste, die
das Protein von Interesse, Anti-CD18, enthielt, aufgetaut und in
einem Extraktionspuffer (25 mM MES, 10 mM MgSO4, pH 5,6) aufgeschlämmt und
durch einen Druckhomogenisator (5.000 psi) geführt, um das Protein zu extrahieren.
Säule 1
wurde dann mit diesem rohen Ausgangsmaterial (600 ml eines etwa
0,22-mg/ml-Proteinausgangsmaterials
mit einer Lineargeschwindigkeit von 245 cm/Std.) befüllt. Die
Säule wurde
dann gewaschen und nach Modus 2 und 3 eluiert. Die Waschung wurde bei
jedem Modus so lange fortgesetzt, bis der Waschausfluss klar war.
Das Eluens (25 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5,6) wurde mit einer Lineargeschwindigkeit
von 245 cm/Std. durch den festen Träger in der Säule nach
unten gepumpt.
-
Die UV-Kurven bei 280 nm für Modus
2 und 2 sind in 5A und 5B dargestellt. Das Elutionsprofil
für die
Proteinreinigung nach Modus 2 und 3 dieses Beispiels (5A und 5B) wiesen dieselben Merkmale auf wie
in Beispiel 3 (4B und 4C). Die Elutionspoolvolumen
waren geringer, und das Protein von Interesse war bei Modus 3 (5B) stärker konzentriert als bei Modus
2 (5A), wie in Tabelle
4 angeführt
ist.
-
Tabelle
4: Waschvolumen und Elutionspoolmerkmale (Beispiel 4)
-
Zusätzlich zur Erzeugung scharfer
Elutionsprofile zur wirksamen Reinigung eines Proteins von Interesse
schärft
das Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung auch das Beladungs- und Waschprofil der ungewünschten
Proteine, die im Überschuss
in der Beladungslösung
vorhanden sind. Ein Vergleich von 5A (Modus
2) und 5B (Modus 3)
zeigt, dass ein Waschpuffer mit größerer Dichte als das Eluens
(5B, Modus 3) das Profil
des großen
Peaks eines unerwünschten
Proteins schärft.
Diese Wirkung verringert den Zeitraum, über den die ungewünschten
Proteine aus der Säule
herausgewaschen werden, und stellt eine verbesserte Basislinientrennung
zwischen unerwünschten
Proteinen und dem Protein von Interesse bereit, wodurch das Protein
von Interesse in stärker
konzentrierter und reinerer Form entnommen werden kann.
-
Dichteunterschiede, und nicht Viskositätsunterschiede,
zwischen den Lösungen,
die durch die Säule geführt werden,
tragen zu der hierin aufgezeigten Verbesserung der Elutionseffizienz
bei. Die Lösungsdichte und
-viskosität
wurden unter Einsatz von Standardverfahren für verschieden Lösungen bestimmt,
die in Analysen nach Modus 2 und Modus 3, die in diesem Beispiel
beschrieben wurden, verwendet wurden. Ein Puffer ohne Dichtekontrolle
("Puffer" in Tabelle 5) und
ein Puffer mit Dichtekontrolle (beispielsweise ein Puffer, der Glycerin
enthält; "Waschung (Puffer
+ 5 Vol.-% Glycerin" in
Tabelle 5) wurden in Modus 2 und Modus 3 verwendet. Die Beladungslösung war
ein in einem Puffer verdünntes
Bakterienpastenhomogenisat. Alle Dichte- und Viskositätsmessungen
wurden bei Umgebungstemperatur (etwa 23°C) vorgenommen.
-
Tabelle
5: Dichte und Viskosität
von EBA-Lösungen
mit fixiertem Adapter
-
In Modus 3 unter Verwendung der oben
genannten Lösungen
wird die Säule
in Aufwärtsrichtung
mit der Beladungslösung
mit einer Dichte von 1,003 g/ml und einer Viskosität von 2,3
cP beladen. Als Nächstes folgt
die Waschlösung,
die eine höhere
Dichte (1,0123 g/ml) und eine geringere Viskosität (1.09 cP) aufweist als die
Beladungslösung,
in Aufwärtsrichtung.
Schließlich
folgt das Eluens, das eine geringere Dichte (1,0067 g/ml) und eine
geringere Viskosität
(0,95 cP) aufweist als die Waschlösung, in Abwärtsrichtung.
Nur die Dichte der einzelnen Lösungen
variiert von Lösung
zu Lösung
von einem geringeren zu einem höheren
zu einem geringeren Wert, was darauf hinweist, dass die Dichteunterschiede
für die
Minimierung der Vermischung zwischen den Lösungen und für die verbesserte
Elutionseffizienz verantwortlich ist.
-
Die hierin angeführten Ergebnisse zeigen, dass
der Zusatz eines dichteändernden
Mittels, wie beispielsweise Glycerin, zur Waschlösung eines EBA-Verfahrens die
Notwendigkeit eines beweglichen, aufsetzbaren Adapters in einer
EBA-Säule
während
der Abwärtsströmung des
Eluenten durch den festen Träger
in der Säule
aufhebt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Beibehaltung der korrekten
Reihenfolge der Dichten (unten – höhere Dichte,
oben – geringere
Dichte) in einem EBA-Verfahren mit fixiertem Adapter gemäß vorliegender
Erfindung zu einem scharfen Eluentenprofil in einem Stufenelutionsverfahren
beiträgt.
-
Beispiel 5
-
Salzgradienten, die in eine EBA-Säule mit
fixiertem Adapter eingeführt
wurden, zeigen bedeutende Vermischung der Gradientenlösungen.
Der steigende Salzgradient entspricht einem steigenden Dichtegradienten,
was zu Vermischung im oberen Bereich über dem gepackten Säulenbett
führt.
-
Dieser Versuch zeigt, dass ein Gradient,
wie beispielsweise ein steigender Salzgradient, in einem EBA-Verfahren
mit fixiertem Adapter gemäß vorliegender
Erfindung verwendet werden kann, indem ein Dichtekontrollmittel
(wie beispielsweise Glycerin, Zucker oder dergleichen) zugesetzt
wird. Wenn beispielsweise ein umgekehrter Dichtegradient erzeugt
wird (von höherer
Dichte zu geringerer Dichte), können
die Gradientenform und Gradientenlänge beibehalten werden, indem
die Vermischung von Lösungen
in der Säule
minimiert wird. Im vorliegenden Beispiel wurde der steigende Salzgradient
durch Waschen der Säule
mit einer Waschlösung
(Lösung
A, Tabelle 7) und dann, während
ei ner Eluentenströmung
in Abwärtsrichtung,
Zusetzen steigender Mengen einer Salzlösung (Lösung B, Tabelle 7) erzielt.
Als Kontrolle wurde kein Dichtekontrollmittel (wie beispielsweise
Glycerin) zu den Lösungen
A oder B zugesetzt. In dieser Testanordnung war ein Dichtekontrollmittel
in Lösung
A vorhanden (in diesem Test beispielsweise 15 Vol.-% Glycerin),
nicht jedoch in Lösung B.
Vorzugsweise ist eine Dichtekontrolle möglich, wenn die Dichte von
Lösung
A (oder seinem Äquivalent
in einem anderen Gradienten) zumindest etwa 0,3% größer ist
als die Dichte der Lösung
B (oder seines Äquivalenten).
Beim vorliegenden Beispiel wurde ein steigender Salzgradient gleichzeitig
mit der Erzeugung eines abnehmenden Dichtegradienten erzeugt. Der
abnehmende Dichtegradient bedeutete, dass eine weniger dichte Lösung auf
eine dichtere Lösung
gegeben wurde, als der Gradient fortschritt. Der abnehmende Dichtegradient
minimierte die Vermischung des Gradienten im Hohlraumvolumen über dem
gepackten Säulenbett.
-
Eine leere Säule (Säule 3, Tabelle 6) wurde verwendet,
um das Hohlraumvolumen über
der gepackten Säule
in einem EBA-Verfahren mit fixiertem Adapter darzustellen. Die Gradientenlänge, die
durch Salzgradienten mit und ohne Zugabe eines dichteändernden
Mittels erzeugt wurde, wurde mithilfe von Standardverfahren als
Volumen eines Eluenten bestimmt, der während des Gradienten durch
die Säule
tritt. Die Gradientenlänge
wurde als Anzahl von Säulenvolumen
(SV) beschrieben, wobei SV das Volumen der in einem Versuch verwendeten
Chromatographiesäule
ist. Eine FPLC-Systemanordnung (Biosys 2000TM,
Beckman Instruments Inc., Fullterton, CA, USA) wurde in den in diesem
Beispiel beschriebenen Versuchen verwendet. Die physikalischen Parameter
von Säule
3 sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die Kontroll- und Testgradienten
sind in Tabelle 7 angeführt.
-
Tabelle
6: Physikalische Parameter von Säule
3
-
Tabelle
7: Salzgradienten mit und ohne Dichtekontrolle
-
SV = 5, worin SV = Säulenvolumen
-
Lineargeschwindigkeit = 100 cm/Std.
-
Das Fortschreiten des Salzgradienten
wurde überwacht,
indem die Leitfähigkeit
des Eluenten am Säuleneinlass
und Säulenauslass
gemessen wurde. 6A zeigt
die Ergebnisse für
die in Tabelle 7 beschriebene Kontrolle mit steigendem Salzgradienten.
Die Leitfähigkeit
am Einlass (durchgehende Linie) misst eine steigende Salzkonzentration,
wenn der Gradient um eine Gesamtgradientenlänge von 5 SV (x-Achse) fortschreitet.
Der Gradient nimmt linear zu einer maximalen Leitfähigkeit
zu, bei der die Linie plötzlich
abflacht. Im Gegensatz dazu weist das Profil der Leitfähigkeit
am Säulenauslass
auf eine Vermischung vor Lösungen
in der Säule
durch die positive Leitfähigkeit
am Auslass vor 1 SV, eine Steigerung der Gradientenlänge auf
7 SV und die allmähliche
Abflachung der Leitfähigkeit
am Ende des Gradienten hin.
-
Eine Dichtekontrolle minimiert die
Vermischung und verbessert das Gradientenprofil, wie es in 6B für den in Tabelle 7 beschriebenen
Testsalzgradienten dargestellt ist. Das Leitfähigkeitsprofil am Auslass überspannt
5 SV von 1 SV (ein Hohlraumvolumen) bis 6 SV entlang der x-Achse,
wodurch die theoretische Gradientenlänge von 5 SV, die am Säuleneinlass
gemessen wurde, beibehalten wird. Der Mangel an detektierbarer Leitfähigkeit
am Aus ass bis 1 SV unterstützt
die Annahme, dass die Vermischung von Lösungen durch Kontrolle der
Dichte stark minimiert wird. Bei diesem Testverfahren nimmt die
Dichte ab (6B, Dreiecke),
wenn die Salzkonzentration zunimmt. Die abnehmende Eluentendichte
spiegelt die bevorzugte Reihenfolge zur Einführung von Lösungen in die Säule wider,
wenn das Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung zum Ein satz kommt. Gemäß dieser
Erfindung wird, wenn die Strömung
durch die Säule
abwärts
gerichtet ist, die weniger dichte Lösung über der dichteren Lösung eingefüllt, so
dass die Gradientenlänge
und das Profil so nah wie möglich
an das theoretische Profil herankommen.
-
Beispiel 6
-
Dieses Beispiel zeigt, wie unvermischte,
umgekehrte Gradienten (worin ein umgekehrter Gradient beispielsweise
ein Salzgradient von einer höheren
zu einer geringeren Salzkonzentration ist) in Aufwärtsströmungsrichtung
durch Glycerinkompensation erzeugt werden können. Da eine Elution in Aufwärtsrichtung
keine Waschlösung
mit hoher Dichte erfordert, begann dieser Versuch damit, Säule 3 komplett
mit Wasser anzufüllen,
das einen Waschpuffer mit geringer Dichte darstellt. Zwei Szenarien
wurden untersucht, und zwar Aufwärtsströmung von
umgekehrten Gradienten mit und ohne Glycerinkompensation, wie in
Tabelle 8 zusammengefasst ist.
-
Tabelle
8: Szenarien für
umgekehrte Gradienten in Aufwärtsströmungsrichtung
-
Der durch dieses Verfahren erzeugte
Gradient wurde überwacht,
indem das Leitfähigkeitsprofil
des Säulenausflusses
wie in Beispiel 5 beschrieben gemessen wurde.
-
Beispiel 7
-
Dieses Beispiel zeigt, dass eine
Dichtekontrolle Vermischung in großen Chromatographiesäulen, die häufig zur
großtechnischen
Proteinreinigung unter Verwendung eines EBA-Systems verwendet werden,
minimiert. Die große
EBA-Säule
(Säule
4, 1,2 m Durchmesser) minimiert die Vermischung von Lösungen auf ähnliche
Weise wie kleinere Säulen,
die hierin für
Stufen- und Gradientenelutionen unter Einsatz von Dichtekontrolle
verwendet werden. Säule
4 ist in Tabelle 9 beschrieben
-
Tabelle
9: Physikalische Parameter von Säule
4
-
Stufenelution: Die Modi der Stufenelution ähneln jenen,
die in Tabelle 1 beschrieben sind, mit der Ausnahme, dass der Waschpuffer
mit geringer Dichte (25 mM MES, pH 5,9) durch Wasser und der Waschpuffer mit
hoher Dichte (25 mM MES, 5 Vol.-% Glycerin, pH 5,9 durch 15 Vol.-%
Glycerin ersetzt wurde. Das Eluens in den Modi 1 bis 3 war 0,5 M
NaCl in Wasser mit einer Eluentenabwärtsströmung mit einer Lineargeschwindigkeit
von 100 cm/Std. In den Modi 2 und 3 war der Adapter bei 100 cm (oberes
Ende der Säule)
fixiert. Die Leitfähigkeit
des Eluenten wurde überwacht,
um die Schärfe
des Eluentenprofils zu bestimmen. 7 zeigt, dass
die Eluentenprofile in den drei Modi mit jenen für kleinere Säulen übereinstimmen
(siehe 2A bis 2C und 3A bis 3C).
-
Gradientenelution mit und ohne Dichtekontrolle:
Ein Kontroll- und Testgradient, denen in Tabelle 8 ähnlich,
wurden verwendet, um die Wirksamkeit einer Gradientenelution in
einer großen
Säule (Säule 4) zu
untersuchen. Die Gradientenlänge
in den vorliegenden Versuchen betrug jedoch 0,7 SV, was einen viel
steileren Gradienten darstellt, wodurch die Wahrscheinlichkeit von
Vermischung der Gradientenlösungen
höher war. Der
Adapter wurde in einer Höhe
von 100 cm fixiert. 8 zeigt,
dass der Salzgradient, die mit Dichtekontrolle erzeugt wurde (Test,
gestrichelte Linie), dem Leitfähigkeitsprofil
am Einlass ähnelt,
was darauf hinweist, dass eine Vermischung in der großen Säule minimiert
wird, wenn die Dichten der Gradientenlösungen kontrolliert werden.
Das Leitfähigkeitsprofil
für den
Kontrollgradienten am Auslass (keine Dichtekontrolle) unterschied
sich deutlich vorn Leitfähigkeitsprofil
am Einlass, weil keine Dichtekontrolle möglich war, um die Vermischung
der Gradientenlösungen
zu minimieren, vor allem unter den vermehrten Schwierigkeiten eines
größeren Säulenvolumens
und eines steileren Gradienten. Das ist für die allmählich abflachende Kurve verantwortlich,
die im Kontrolllauf (keine Dichtekontrolle) beobachtet wurde, weil
der steilere Gradient zu vermehrter Vermischung von Lösungen führte. Verbesserte
Gradienteneffizienz aufgrund von Dichtekontrolle, bei der Lösungen mit
geringerer Dichte über
Lösungen
mit höherer
Dichte gegeben werden, wenn die Strömung abwärts gerichtet ist, wurde sowohl
mit einer größeren Säule (8) als auch mit einer kleinen
Säule (6B) erreicht.
-
Die vorliegende Erfindung wurde hierin
in Form der praktischsten und bevorzugtesten Ausführungsformen
beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass innerhalb des Schutzumfangs
der Erfindung Veränderungen
daran vorgenommen werden können,
wie für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung, die diese Beschreibung lesen,
offensichtlich ist.
