WO1998057722A1 - Gradientenelutionsverfahren - Google Patents

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    • G01N2030/524—Physical parameters structural properties
    • G01N2030/528—Monolithic sorbent material

Definitions

  • the invention relates to separation methods for liquid chromatography using a new gradient elution method.
  • the method according to the invention shortens the time required for chromatographic separations under isocratic conditions while maintaining the separation performance achieved.
  • the elution behavior is optimized by means of eluent gradients: on the one hand, analytes that are eluted early are to be sufficiently separated, on the other hand, analytes that elute late are not to be eluted with excessive delay so that the separation can be carried out as quickly as possible overall.
  • an eluent gradient means that the sorbent has to be equilibrated again to the starting eluent after each separation. No equilibration is necessary under isocratic conditions, but compromises must be made between the chromatographic separation performance and the time required for the entire separation.
  • the invention relates to methods for separating at least two substances by means of liquid chromatography under isocratic conditions, the flow rate being changed in the course of the elution of the substances to be separated.
  • Figure 1 shows elution diagrams of separations of various vitamins of the vitamin K group: a) separation according to the invention (isocratic, flow gradient chromatography using a monolithic sorbent); b) isocratic using a monolithic sorbent; c) isocratic using a particulate sorbent.
  • the partial representations b) and c) serve for comparison.
  • Experimental details are described in Example 1.
  • Figure 2 shows elution diagrams of separations of the components of a pharmaceutical preparation: a) separation according to the invention (isocratic, flow gradient chromatography using a monolithic sorbent); b) isocratic, at a flow rate of 1 ml / min; c) isocratic, at a flow rate of 3 ml / min d) isocratic, at a flow rate of 5 ml / min.
  • this process is called flow gradient chromatography.
  • sorbents Prerequisites for the use of this method are sorbents in which the H / u curve is sufficiently flat so that the separation performance is practically unchanged over a wide range of the flow rate.
  • sorbents Another prerequisite for the use of flow gradient chromatography is sorbents, in which the flow rate can be varied to a sufficient extent without the operating pressure having to be increased excessively.
  • suitable sorbents are porous ceramic moldings (monolithic sorbents), as are disclosed in WO 94/19687 and in WO 95/03 256.
  • porous ceramic moldings disclosed in WO 95/03 256, which have interconnected macropores and mesopores in the walls of the macropores, the diameter of the macropores having a median value greater than 0.1 ⁇ m, and the diameter of the Mesopores one Median of 2 and 100 nm.
  • Particulate carriers whose pore structure allows the flow rate to be varied without the operating pressure required for this having to be increased excessively should also be applicable to the process according to the invention.
  • the accelerated separation and good separation performance under isocratic conditions which can be achieved by the method according to the invention, are of particular importance for series analysis and for preparative separations.
  • the elution agents customary for isocratic separation processes or for gradient separation processes can be used for the elution process according to the invention.
  • Sorbents for various separation processes such as, for example, reverse phase chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ion exchange chromatography or chiral separations, are known to the person skilled in the art. Sorbents derivatized in this way can be used according to the invention. Examples of such separation processes and of suitably derivatized sorbents are disclosed in WO 94/19687.
  • a mixture of vitamins from the K group which are vitamins K1. K2. Contains K3 and K4, is dissolved in acetonitrile water (95: 5; v.v). 10 ⁇ l of this solution are applied to a monolithic column (silica gel, modification RP-18; 83 x 7.2 mm). Then a flow gradient is applied:
  • FIG. 1 b) shows an elution diagram at a constant flow rate (1 ml / min) as above.
  • Figure 1 c) shows the elution diagram using a particulate sorbent (LiChroSpher RP 18; 1 ml / min) as a further comparison.
  • Example 2 Separation of components of a drug
  • a pharmaceutical preparation is dissolved in acetonitrile-20 mM phosphoric acid (90:10; v: v). 5 ⁇ l of this solution are applied to a monolithic column (silica gel, modification RP-18; 93 x 4.6 mm). Then a flow gradient is applied:
  • the elution diagram is shown in Figure 2 a) (detection UV at 254 nm).
  • the order of the eluted components is: maleic acid, paracetamol, caffeine and brompheniramine.
  • Figures 2 b) to 2 d) show the elution diagram at different constant flow rates (sorbent as above):

Abstract

Verfahren zur Trennung mindestens zweier Substanzen mittels Flüssigkeitschromatographie unter isokratischen Bedingungen werden offenbart, wobei die Flußrate im Verlauf der Elution verändert wird (Flußgradienten-Chromatographie).

Description

Gradientenelutionsverfahren
Die Erfindung betrifft Trennverfahren für die Flüssigkeitschromatographie unter Anwendung eines neuen Gradientenelutionsverfahrens. Das erfindungsgemäße Verfahren verkürzt unter isokratischen Bedingungen den Zeitaufwand für chromatographische Trennungen unter Erhalt der erreichten Trennleistung.
In der Flüssigkeitschromatographie wird das Elutionsverhalten mittels Elutionsmittelgradienten optimiert: Einerseits sollen früh eluierte Analyten ausreichend getrennt werden, andererseits sollen spät eluierende Analyte nicht übermäßig verzögert eluiert werden, damit die Trennung insgesamt in möglichst kurzer Zeit ausgeführt werden kann. Die Anwendung eines Elutionsmittelgradienten hat jedoch zur Folge, daß das Sorbens nach jeder Trennung wieder auf das Startelutionsmittel äquilibriert werden muß. Unter isokratischen Bedingungen ist keine Äquilibrierung notwendig, jedoch müssen dabei Kompromisse zwischen chromatographischer Trennleistung und Zeitbedarf der gesamten Trennung eingegangen werden.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Trennung mindestens zweier Substanzen mittels Fiüssigkeitschromatographie unter isokratischen Bedingungen, wobei die Flußrate im Verlauf der Elution der zu trennenden Substanzen verändert wird.
in der Abbildung 1 sind Elutionsdiagramme von Trennungen verschiedener Vitamine der Vitamin K Gruppe dargestellt: a) erfindungsgemäße Trennung (isokratisch, Flußgradienten- Chromatographie unter Verwendung eines monolithischen Sorbens); b) isokratisch unter Verwendung eines monolithischen Sorbens; c) isokratisch unter Verwendung eines partikulären Sorbens. Die Teildarstellungen b) und c) dienen dem Vergleich. Experimentelle Einzelheiten sind in Beispiel 1 beschrieben.
In der Abbildung 2 sind Elutionsdiagramme von Trennungen der Bestand- teile einer pharmazeutischen Zubereitung dargestellt: a) erfindungsgemäße Trennung (isokratisch, Flußgradienten- Chromatographie unter Verwendung eines monolithischen Sorbens); b) isokratisch, bei einer Flußrate von 1 ml/min; c) isokratisch, bei einer Flußrate von 3 ml/min d) isokratisch, bei einer Flußrate von 5 ml/min.
Die Teildarstellungen b) bis d) dienen dem Vergleich. Experimentelle Einzelheiten sind in Beispiel 2 beschrieben.
Es wurde gefunden, daß unter isokratischen Elutionsbedingungen Trenn- leistung und Zeitbedarf optimiert werden können, wenn man bei der Trennung die Flußrate dem Elutionsprofil anpaßt. Dieses Verfahren wird erfindungsgemäß Flußgradienten-Chromatographie genannt. Voraussetzung für die Anwendung dieser Methode sind Sorbentien, bei denen die H/u - Kurve hinreichend flach verläuft, so daß die Trennleistung über einen einen breiten Bereich der Flußgeschwindigkeit praktisch unverändert ist. Eine weitere Voraussetzung für die Anwendung der Flußgradienten- Chromatographie sind Sorbentien, bei denen die Flußrate in ausreichendem Umfang variiert werden kann, ohne daß der Betriebsdruck übermäßig erhöht werden muß. Beispiele geeigneter Sorbentien sind poröse keramische Formkörper (monolithische Sorbentien), wie sie in WO 94/19687 und in WO 95/03 256 offenbart sind. Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung der in WO 95/03 256 offenbarten porösen keramischen Formkörper, die untereinander verbundene Makroporen sowie Mesoporen in den Wänden der Makroporen aufweisen, wobei der Durchmesser der Makroporen einen Medianwert größer als 0,1 μm aufweist, und wobei der Durchmesser der Mesoporen einen Medianwert von 2 und 100 nm aufweist. Partikuläre Träger, deren Porenstruktur es erlaubt, die Flußrate zu variieren, ohne daß der dazu notwendige Betriebsdruck übermäßig erhöht werden muß, sollten ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar sein. Die beschleunigte Trennung und gute Trennleistung unter isokratischen Bedingungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreichbar sind, besitzen insbesondere für die Serienanalytik und für präparative Trennungen eine erhebliche Bedeutung.
Im Gegensatz zur Elution mit einem Lösungsmittelgradienten ist bei isokra- tischer Trennung die Rückgewinnung von Elutionsmitteln, z.B. Rückführung von Elutionsmittel, während keine Substanzen eluiert werden, oder Rückgewinnung des Elutionsmittels mittels Destillation, erleichtert. Diese Verfahren sind auch bei der Flußgradienten-Chromatographie anwendbar.
Erfindungsgemäß können die für isokratische Trennverfahren oder für Gradiententrennverfahren gebräuchlichen Elutuionsmittel für das erfindungsgemäße Elutionsverfahren verwendet werden. Sorbentien für verschiedene Trennverfahren, wie beispielsweise Umkehrphasenchromatographie, Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie, lonenaustauschchromatographie oder chirale Trennungen sind dem Fachmann bekannt. Derartig derivatisierte Sorbenzien können erfindungsgemäß verwendet werden. Beispiele für derartige Trennverfahren und für geeignet derivatisierte Sorbentien sind in WO 94/19687 offenbart.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern; sie stellen keine Einschränkung des Erfindungsgedankens dar. Beispiele
Beispiel 1 : Trennung verschiedener Vitamine der Vitamin K Gruppe
Eine Mischung von Vitaminen der K-Gruppe, die die Vitamine K1 . K2 . K3 und K4 enthält, wird in Acetonitril-Wasser (95:5; v.v) gelöst. 10 μl dieser Lösung werden auf eine monolithische Säule (Kieselgel, Modifikation RP- 18; 83 x 7,2 mm) aufgetragen. Anschließend wird ein Flußgradient angewandt:
Figure imgf000006_0001
Das Elutionsdiagramm ist in Abbildung 1 a) dargestellt (Detektion UV bei 280 nm).
Zum Vergleich ist in Abbildung 1 b) ein Elutionsdiagramm bei konstanter Flußrate (1 ml/min) dargestellt (Sorbens wie oben). In Abbildung 1 c) ist als weiterer Vergleich das Elutionsdiagramm unter Verwendung eines partikulären Sorbens (LiChroSpher RP 18; 1 ml/min) dargestellt.
Beispiel 2: Trennung von Bestandteilen eines Arzneimittels
Eine pharmazeutische Zubereitung wird in Acetonitril- 20 mM Phosphorsäure (90:10; v:v) gelöst. 5 μl dieser Lösung werden auf eine monolithische Säule (Kieselgel, Modifikation RP-18; 93 x 4,6 mm) aufgetragen. Anschließend wird ein Flußgradient angewandt:
Figure imgf000007_0001
Das Elutionsdiagramm ist in Abbildung 2 a) dargestellt (Detektion UV bei 254 nm). Die Reihenfolge der eluierten Bestandteile ist: Maleinsäure, Paracetamol, Coffein und Brompheniramine.
Zum Vergleich sind in den Abbildungen 2 b) bis 2 d) Elutionsdiagramm bei verschiedenen konstanten Flußraten dargestellt (Sorbens wie oben):
Figure imgf000007_0002

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Trennung mindestens zweier Substanzen mittels Flüssigkeitschromatographie unter isokratischen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Flußrate im Verlauf der Elution der zu trennenden Substanzen verändert wird.
PCT/EP1998/003430 1997-06-18 1998-06-08 Gradientenelutionsverfahren WO1998057722A1 (de)

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