Verfahren zur repetitiven präparativen Chromatographie
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen repetitiven präparativen Chromatographie.
Die präparative Chromatographie ist wegen ihrer Zuverlässigkeit, guten Handhabbarkeit und hohen Produktivität seit vielen Jahren eine wichtige Technik zur Reinigung von chemischen, pharmazeutischen und biologischen Präparaten. Sie wird ein- gesetzt in der Wirkstoffforschung, zur Naturstoffisolierung, zur. Reinigung von
Synthese-Zwischenprodukten und chemisch-pharmazeutischen Produkten, zur Isolierung der Nebenkomponenten in einem Wirkstoff oder zur Trennung von Isomeren. Bei der repetitiven Arbeitsweise wird eine Fraktionierung viele Male wiederholt und das Eluat zu vorher festgelegten Zeitpunkten abgezogen. Eine repetitive Arbeitsweise ermöglicht es gegenüber dem „Ein-Schuss-Verfahren" größere Substanzmengen im semipräparativen Maßstab (mg bis Hektogramm) durch vielfach hintereinander ausgeführte Trennungen kleiner Portionen der Probe unter Laborbedingungen aufzu- reinigen.
Bei der repetitiven präparativen Chromatographie besteht das Problem der Fehltrennung oder Fehlfraktionierung wenn sich der Fraktionierungszyklus in der Säule gegenüber den vorher festgelegten Zeitpunkten verschiebt, wobei sich dieses Problem wegen der großen Zahl der Zyklen über einen längeren Zeitraum hinweg immer weiter verschlimmern kann. Das Problem der Fehltrennung oder Fehlfrak- tionierung konnte bisher nur durch eine personalintensive Überwachung vermieden werden.
Aufgabe ist es deshalb ein Verfahren zur repetitiven Chromatographie bereitzustellen, das über lange Zeiträume automatisch und fehlerfrei funktioniert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur automatischen repetitiven Säulenchromatographie, besteht darin, dass sich zu festen Zeitpunkten in jedem Elutionszyklus wiederholend die Schritte
a) Spülen der Säule, b) Konditionierung der Säule auf einen ballistischen Zustand, c) Probenaufgabe d) Elution
durchgeführt werden und
e) ein Detektorsignal einer chromatographischen Messung des Eluats aufgezeichnet wird und nach dem Signalverlauf des Detektorsignals eine automatische Fraktionierung des Eluats erfolgt.
Bei der repetitiven Chromatographie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird unter nichtstationären Bedingungen gearbeitet, das heißt die Säule wird vor einer Probenaufgabe nicht in den Gleichgewichtszustand, sondern in einen streng reproduzierbaren Ungleichgewichtszustand, den sogenannten ballistischen Zustand, ge- bracht. Dies gilt sowohl für den Einsatz von Normal- als auch für die Reversephase.
Jeder Elutionszyklus beginnt mit einem kurzen Spülen der Säule, vorzugsweise mit einem starken Eluent, um die Säule von stark retardierenden Kontaminanten zu reinigen und die Säule gleichzeitig in einen inaktiven Ausgangszustand zu bringen. Die Menge an Spülflüssigkeit liegt im Bereich von 0,1 bis 3, bevorzugt 0,5 - 1 des
Säulenvolumens und enthält einen hohen Anteil an stark eluierendem Lösungsmittel.
Nach dem Spülschritt erfolgt eine kurze Konditionierung der Säule, vorzugsweise mit einem schwachen Anfangs-Eluent, um sie in einen reproduzierbaren Anfangs- zustand, der ein Ungleichgewichtzustand bzw. ballistischer Zustand ist, zu bringen.
Nach der Konditionierung mit 0,1 bis 3, bevorzugt 0,5 - 1 Säulenvolumen Anfangs- Eluent ist die Säule in einem reproduzierbaren Anfangszustand, und es folgt die Probenaufgabe.
Die Probenaufgabe und die Elution erfolgen im ballistischen Zustand.
Bei der Probenaufgabe wird die Probe portionsweise auf die Säule gegeben. Die Probe kann in den während der Injektion reduzierten Eluentenstrom injiziert werden.
Die Probemenge wird bevorzugt so eingestellt, dass die Säule überladen ist. Das heißt, es werden große Probenmengen injiziert, die sich auf eine breite Zone in der Säule verteilen und in den Chromatogrammen zu breiten und unsymmetrischen Peaks (Substanzzonen) führen, da die Trennung im nicht-linearen Bereich der Adsorptionsisotherme stattfindet. Diese Arbeitsweise ist solange sinnvoll, wie sich die erwünschten Substanzpeaks in den Chromatogrammen noch von anderen Sub- stanzpeaks trennen lassen. Die Peakform in den Chromatogrammen entspricht der für die präparative Arbeitsweise typischen Form mit Plateau, Fronting und Tailing.
Die Chromatographie erfolgt entweder isokratisch, also mit einem Eluent konstanter Zusammensetzung während des gesamten chromatographischen Prozesses oder unter einem Gradienten also mit einem Eluent in zeitlich veränderlicher Zusammensetzung.
Der ballistische Zustand der Säule als Voraussetzung für reproduzierbare Chromato- gramme und Fraktionierung wird nur erreicht, wenn die Schritte a) bis e) (Spülen,
Konditionieren, Probenaufgabe, Elution und Fraktionierung) einen festgelegten, sich konstant wiederholenden Zyklus bilden. Bereits im zweiten Zyklus sind die Bedingungen für eine reproduzierbare Trennung und Fraktionierung gegeben.
Die Schritte a) bis e) werden automatisch wiederholt, bis die gesamte Probemenge chromatografiert ist. Die Fraktionierung erfolgt bei den Wiederholungszyklen immer in die gleichen Gefäße.
Eine erhebliche Eluent- und Zeitersparnis kann erzielt werden, wenn bereits der nächstfolgende Elutionszyklus gestartet wird, während Schritt e) des vorherigen Elutionszyklus noch abgearbeitet wird, also während das analoge Detektorsignal einer chromatographischen Messung des Eluats aus dem vorhergehenden Elutionszyklus aufgezeichnet wird und die automatische Fraktionierung dieses Eluats erfolgt. Diese Optimierung ist limitiert durch die Elution des "Spülpeaks" aus Schritt a), der nicht mit dem letzten interessierenden Peak aus dem vorhergehenden Elutionszyklus zusammenfallen darf, sondern kurz danach eluiert werden muss.
Unter bestimmten Bedingungen, wenn z.B. aus den Proben nur noch Kontaminanten entfernt werden müssen, können in einem Elutionszyklus nach dem Spülschritt a) und der Konditionierung b) mehrere Male die Schritte Probenaufgabe c) und Elution d) hintereinander ausgeführt werden, wobei die Chromatographie isokratisch erfolgt.
Dieses Verfahren führt unter den oben genannten Bedingungen zu befriedigenden Ergebnissen und spart Zeit und Eluent.
Die Fraktionierung kann derart erfolgen, dass das Eluat in einem oder mehreren festgelegten Zeiträumen in jedem Elutionszyklus (Sammelzeitfenstern) und während das Detektorsignal jenseits eines vorbestimmten Werts liegt in einem dem entspre- chenden Sammelzeitfenster zugeordneten Sammelgefäß gesammelt wird. Sammel- zeitfenster und Sammelgefäß stehen also in einer festen Beziehung zueinander.
Die Eluate aus mehreren Sammelzeitfenstern, die zunächst in separaten, den Sammelzeitfenstern zugeordneten, Sammelgefäßen gesammelt worden sind können später zusammengeführt werden.
Der vorbestimmte Wert kann sich auch über den zeitlichen Verlauf des Sammelzeitfensters ändern.
Es kann auch automatisch eine zeitliche Verschiebung der Sammelzeitfenster im nächstfolgenden Elutionszyklus um die Zeitspanne erfolgen, um die sich im vorhergehenden Elutionszyklus der Zeitpunkt verschoben hat, zu dem das Detektorsignal in einem Kontrollzeitfenster (Abstandhalter) einen bestimmten Wert über- oder unterschritten hat.
Die Durchführung des Verfahrens kann automatisch beendet werden, wenn das Detektorsignal zu einem vorgegebenen Zeitpunkt im Zyklus einen von mehreren vorgegebenen Kontrollwerten erreicht. Durch die Auswahl dieser Kontrollwerte wird eine sehr variable, anwendungsspezifische Festlegung der Fehler- und Variabili- tätstoleranz ermöglicht. Es lassen sich mit Hilfe der Kontrollwerte zahlreiche Sicherheitskriterien definieren, die auf den zeitlichen Verlauf und die Höhe des Detektorsignals bezogen sind wie etwa die Anwesenheit von bestimmten Peaks im Chromatogramm, das Erreichen der Basislinie zwischen zwei Substanzzonen, Höhe der Basislinie bei Chromatogrammbeginn etc.
Die chromatographische Messung des Eluats kann mit Standardmethoden wie UV- VIS (sichtbares Licht und UV), RI (Refraktionsindex-Detektion), MS (Massenspektroskopie) oder über Lichtstreudetektion erfolgen, bevorzugt sind UV-VIS und RI.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt mit einer robusten und langlebigen chromatographischen Säule durchgeführt. Bevorzugt wird eine Säule verwendet, die eine Vorrichtung aufweist, die das Packungsmaterial in axialer Richtung komprimiert (siehe z.B. US 5,893,971). Damit wird die Gefahr der Kanalbildung im Säulen- medium eliminiert. Es lassen sich so zum Beispiel mit auf Silica-basierenden
Säulenpackungen hunderte von Elutionszyklen ohne Verschlechterung der Säuleneigenschaften durchführen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein System zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens. Das System umfasst eine chromatographische Säule, ein
System zur Zuführung von Eluenten und Proben in diese chromatographische Säule, einen Fraktionssammler mit einem oder mehreren Sammelgefäßen, einem Detektor und einem digitalen Signalverarbeitungssystem mit Prozessor, Steuereinheit, Eingabeeinheit, Anzeigeeinheit und Speichereinheit. Das digitale Signalverarbei- tungssystem wird mittels eines Programms so gesteuert, dass die mit dem Detektor gemessenen Chromatogramme in der Speichereinheit gespeichert und in der Anzeigeeinheit angezeigt werden. Die über die Eingabeeinheit eingegebenen Werte (Zeit und Detektorsignalhöhe) der Sammelzeitfenster sind zusammen mit den zugehörigen Sammelgefäßnummern in der Speichereinheit gespeichert. Die Werte der Sammelzeitfenster können mit den Chromatogrammen in der Anzeigeeinheit angezeigt werden.
Der Prozessor vergleicht jedes Detektorsignal, das über den Detektor gemessen wird, mit den gespeicherten Werten der Sammelzeitfenster und für den Fall, dass der ge- messen Wert jenseits eines durch das Sammelzeitfenster vorgegebenen Wertes liegt, gibt der Prozessor an die Steuereinheit das Signal den Fraktionssammler so zu steuern, dass das Eluat in das Sammelgefäß gesammelt wird, dessen Sammelgefäßnummer mit diesem Sammelzeitfenster in der Speichereinheit abgespeichert wurde.
Über die Eingabeeinheit können Werte für Kontrollzeitfenster (Zeit und Detektorsignalhöhe) eingegeben werden, die in der Speichereinheit gespeichert werden können mit den gemessenen Chromatogrammen in der Anzeigeeinheit angezeigt werden können. Der Prozessor vergleicht jedes Detektorsignal, das über den Detektor gemessen wird mit den gespeicherten Werten . der Kontrollzeitfenster und für den
Fall, dass sich der Zeitpunkt verschoben hat, zu dem das Detektorsignal in dem Kontrollzeitfenster einen bestimmten Wert über- oder unterschritten hat, werden die gespeicherten Zeitwerte für die Sammelzeitfenster um die entsprechende die Zeitspanne automatisch geändert und die geänderten Zeitwerte der Sammelzeitfenster in der Speichereinheit abgespeichert.
Über die Eingabeeinheit können Kontrollwerte eingegeben werden, die in der Speichereinheit gespeichert werden können und mit den gemessenen Chromatogrammen in der Anzeigeeinheit angezeigt werden können. Der Prozessor vergleicht jedes Detektorsignal, das über den Detektor gemessen wird mit den gespeicherten
Kontrollwerten und für den Fall, dass eine Übereinstimmung zwischen Detektorsignal und Kontrollwert vorliegt kann der Prozessor die Messung abbrechen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen präparativen, chromatographischen Trennaufgaben eingesetzt werden. Es empfiehlt sich besonders in synthesenahen
Einsatzbereichen, bei denen unter hohem Termindruck gearbeitet wird und die Präparate wegen der darin bereits investierten Arbeit außerordentlich wertvoll sind und Fehltrennungen oder Fehlfraktionierungen nicht tolerabel sind.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist auch, dass größere Probenmengen mit vergleichsweise kleinen Säulen gereinigt werden können. So lassen sich auch extrem kostspielige Phasen einsetzen, die aus Kostengründen für große Säulen nicht zur Verfügung stehen. Fehlfunktionen und Fehlfraktionierungen werden vermieden, ohne dass eine personalintensive Überwachung notwendig ist und wertvolle Proben gefährdet sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich Eluent und Zeit sparen.
Figuren und Beispiele
Die Figuren zeigen
Fig. 1 Ablauf einer repetitiven Chromatographie. Fig. 2 Chromatogramme mit Sammelzeitfenstern, Kontrollzeitfenster (Abstandhalter) und Kontroll werten (Kontrolllinien). Fig. 3a Chromatogramm bei der Entfernung einer polaren Verunreinigung mit
Sammelzeitfenster und Kontrollwerten. Fig. 3 b Ablauf der repetitiven Chromatographie bei der Entfernung einer polaren Verunreinigung .
Beispiel 1
Fig. 1 zeigt beispielhaft den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das untere Diagramm gibt die Lösungsmittelzusammensetzung in % aufgetragen über der Zeit an. Die beiden Eluenten A 13 und B 12 wurden über einen Zeitraum von 10 min pro
Zyklus auf die Säule gegeben. Zum Zeitpunkt der Markierungen 11 findet jeweils eine Probeninjektion statt. Das obere Diagramm zeigt das gewonnene Chromatogramm.
Der Ablauf eines Zyklus der repetitiven Chromatographie ist nun folgendermaßen:
Zu Beginn des Zyklus wird die Säule für 1 min gespült mit 100% Eluent A 13 (Spülphase 16). Der zugehörige Spülpeak 14 ist im Chromatogramm zu erkennen. Dann erfolgt für 2 min die Konditionierung bei der das Verhältnis von A 13 zu B 12 80% zu 20% beträgt. Nun folgt die Probenaufgabe. Während der restlichen Zyklusdauer nimmt der Anteil an Eluent A 13 auf 90% zu und der Anteil von Eluent
B 12 entsprechend ab. Etwa 4 bis 5 min nach der Probenaufgabe (bzw. 7 bis 8 min nach dem Beginn des Zyklus) werden die ersten charakteristischen Peaks des Chromatogramms gemessen und das Eluat entsprechend fraktioniert.
Das in Fig. 1 gezeigte Chromatogramm 10 wurde mit einer Eigenbau- Säule aus
Hyperprep HS C18 - 8 μm mit den Säulenmaßen (Länge x Durchmesser) 24 cm x 2 cm erzielt. Die Säule lässt sich bis zur Korngröße 8 μm noch mittels Vakuum problemlos von Hand füllen, bei kleineren Korngrößen wurde eine Slurry-Pumpe eingesetzt. Das Eluentsystem bestand aus drei Gilson-HPLC-Pumpen 30x mit Manometermodul und Mischkammer. Die Probenpumpe war eine Gilson 30x, der
Detektor ein Knauer-UV-Monitor bei 210, der Fraktionssammler ein Gilson 206. Als Eluent A wurde Methanol, als Eluent B wurde H2O eingesetzt. Die Probe bestand aus den Alkylbenzolen CI, C3, C5 zu je 1 g/lOOml in ACN, der noch die Alkylbenzole C5, C6, C7 zu je 0,2 /100ml und 1,5 ml Aceton zugesetzt wurden. Die Injektions- geschwindigkeit der Probe betrug 11,2 ml/min und der Eluentenfluss 20 ml/min.
Beispiel 2
Fig. 2 zeigt beispielhaft wie in den Chromatogrammen (21, 22, 23) die Festlegung der Sammelzeitfenster 1,2,3,4, Kontrollzeitfenster 24 und Kontrollwerte 25 erfolgte. Zunächst wurde unter Einsatz kleiner Probenmengen eine Voroptimierung der Elutionsbedingungen vorgenommen. Zur Voroptimierung wurden nacheinander unterschiedliche Gradienten mit derselben Probe in einer Sequenz gefahren. Damit wurden die Trennbedingungen ermittelt.
Nachdem eine ausreichende Abtrennung und Basislinienstabilität erreicht war, wurden die Sammelzeitfenster 1,2,3,4 für die Fraktionierung festgelegt.
Anhand von mehreren übereinandergelegten Testchromatogrammen 21,22,23 (Zyklus Nr. 13, 50 und 150) wird ersichtlich dass die Chromatogramme nicht stark von einander abweichen.
Die Sammelzeitfenster 1,2,3,4 definieren zeitlich den Beginn und das Ende der Fraktionierung in ein bestimmtes Sammelgefäß. Die Lage der Sammelzeitfenster 1,2,3,4 bezüglich der Detektorsignalwerte definiert die Detektorsignalhöhe, ab der die Fraktionierung innerhalb des entsprechenden Sammelzeitfensters erfolgt. Auf diese Weise wird exakt definiert, welche Eluatanteile gesammelt werden.
Die Sammelzeitfenster können zeitlich überlappen wie es in Fig.2 bei den Sammelzeitfenstern 1 und 2 oder 3 und 4 gezeigt ist. In solch einem Fall wird im
Programm festgelegt, welches Sammelzeitfenster im Überlappungszeitraum Vorrang hat, das heißt in welches Sammelgefäß im Überlappungszeitraum fraktioniert wird. Bevorzugt hat dasjenige Sammelzeitfenster Vorrang, das früher begonnen hat. Es wird also solange in das zu diesem Sammelzeitfenster zugehörige Gefäß fraktioniert, bis dieses Sammelzeitfenster komplett durchlaufen ist und dann nach dem Über-
lappungszeitraum erst mit der Fraktionierung in das zum nächsten Sammelzeitfenster zugeordnete Gefäß begonnen.
Die Festlegung der Sammelzeitfenster 1,2,3,4 erfolgt bevorzugt über ein geeignetes Software-Programm, das es erlaubt, die Sammelzeitfenster 1,2,3,4 repräsentierenden Linien direkt in die Chromatogramme 21,22,23 einzuzeichnen, und das die so gewählten Werte zur Auswertung der in jedem Eluentenzyklus aufgenommenen Chromatogramme und die entsprechende Steuerung des Eluatflusses in die einzelnen Gefäße umsetzt.
Verschieben sich die Retentionszeiten in den unbeaufsichtigten repetitiven Elutionszyklen, so wird die Fraktionierung automatisch adaptiert. Ein Kontrollzeitfenster 24 wird analog zu den Sammelzeitfenstern 1,2,3,4 auch bezüglich der zugehörigen Detektorsignalwerte festgelegt. Das Kontrollzeitfenster 24 sollte den aufsteigenden oder absteigenden Ast eines zuverlässigen Bezugspeaks im Chromatogramm enthalten. Der Schnittpunkt des Detektorsignals mit dem Kontrollzeitfenster 24 wird nach jedem Zyklus ausgewertet, um die Sammelzeitfenster 1,2,3,4 gegebenenfalls einer Verschiebung der Retentionszeit nachzuführen.
Die Gradientendauer kann ebenfalls nachgeführt werden, falls dies aufgrund von
Retentionszeitverschiebungen notwendig sein sollte.
Zur Fehlerkontrolle wurden die Kontroll werte 25 eingeführt. Sollten die Kontrollwerte 25 zu den festgelegten Zeiten durch das Detektorsignal erreicht werden, so wird die Fraktionierung sofort gestoppt. Die Kontrollwerte 25 bewirken, dass das laufende Fraktionierverfahren nicht fortgesetzt wird, wenn die Chromatogramme sich im Laufe der Elutionszyklen zeitlich so sehr verschieben, dass die Sammelzeitfenster nicht mehr in dem gewünschten Bereich der Peaks im Chromatogramm liegen.
Die in Fig. 2 gezeigten Chromatogramme (21,22,23) wurden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsaufbau aufgenommen. Als Eluent A wurde Methanol, als Eluent B wurde H2O eingesetzt. Die Probe bestand in 13,5g/90ml eines unbekannten Wirkstoffs. Das Injektionsvolumen betrug 0,7 ml. Die Injektionsgeschwindigkeit der Probe betrug 11,2 ml/min und der Eluentenfluss 20 ml/min.
Beispiel 3
Fig. 3b zeigt beispielhaft einen alternativen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Proben, die bereits gut vorgereinigt waren, und bei denen nur noch
Kontaminanten entfernt werden sollten. Fig. 3b gibt die Lösungsmittelzusammensetzung in % aufgetragen über der Zeit an. Die beiden Eluenten C 34 und A 36 wurden über hundert Zyklen auf die Säule gegeben. Zum Zeitpunkt der Markierungen 35 fand jeweils eine Probeninjektion statt. Fig. 3a zeigt das gewonnene Chromatogramm.
Im Gegensatz zu Beispiel 1 wurde in diesem alternativen Ablauf das Verhältnis der Eluenten über die gesamte Zeitdauer der Eruierung konstant gehalten. In jedem Zyklus erfolgten nur am Anfang der Spülschritt und die Konditionierung, danach folgten zehnmal Probenaufgaben und Elution kurz hintereinander. So wurden 90% der Zeit und Eluent zum Spülen und Konditionieren eingespart. Das Chromatogramm wurde kontinuierlich aufgezeichnet und das Eluat entsprechend fraktioniert.
Fig. 3 a zeigt beispielhaft wie das Sammelzeitfenster 32 und die Kontroll werte 33 festgelegt wurden. Besonders geeignet ist dieses Verfahren für Trennungen, die isokratisch ausgeführt werden können. Das Sammelzeitfenster 32 definiert zeitlich den Beginn und das Ende der Fraktionierung. Das Sammelzeitfenster 32 wird bezüglich der Detektorsignalwerte so hoch gesetzt, dass die Peaks der Kontaminante sicher darunter liegen. Die Fraktionierung erfolgte immer dann, wenn das Detektor- signal über das Sammelzeitfenster 32 stieg. Alle Peaks der Hauptkomponente wurden
in das gleiche Gefäß gesammelt. Wenn das Detektorsignal unter die Höhe der Fraktionierline fiel, fuhr der Fraktionssammler in eine Abfall-Position.
Durch die Kontrollwerte 33 wird das Vorhandensein einer Probe im Eluat überwacht. Sollte keine Probe mehr im Eluat vorhanden sein, dann weist das Chromatogramm im Bereich der Kontroll werte 33 keinen Peak auf und die Kontrollwerte 33 werden vom Detektorsignal erreicht und das Fraktionierverfahren wird gestoppt.
Durch die Kontrollwerte 34 wird eine Begrenzung der Retentionszeitschwankungen erreicht. Das Fraktionierverfahren stoppt in dem Moment, in dem einer der Peaks einen der Kontrollwerte 34 erreicht.
Das in Fig. 3a gezeigte Chromatogramm wurde mit einer Eigenbau-Säule aus Hyperprep HS C18 - 8 μm mit den Säulenmaßen 18,5x2 cm erzielt. Die Säule ließ sich bis zur Korngröße 8 μm noch mittels Vakuum problemlos von Hand füllen, bei kleineren Korngrößen wird eine Slurry-Pumpe eingesetzt. Das Eluentsystem bestand aus drei Gilson-HPLC-Pumpen 30x mit Manometermodul und Mischkammer. Die Probenpumpe war eine Gilson 30x, der Detektor ein Knauer-UV-Monitor bei 210, der Fraktionssammler ein Gilson 206. Als Eluent A 36 wurde H2O und als Eluent C 34 wurde Methanol eingesetzt. Die Probe bestand aus 89g Wirkstoff in 340ml ACN.
Die Injektionsgeschwindigkeit der Probe betrug 11,2 ml/min und der Eluentenfluss 20 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 0,4 ml, der Druck 65 bar.