CN106053616B - 制备分离色谱仪 - Google Patents

Abstract

提供一种制备分离色谱仪，包括：具有检测器(15)的色谱仪10；馏分收集器(20)；控制器(34)，用于参考当来自检测器(15)的输出信号的变化率超过正参考值时的点，命令馏分收集器发起收集操作，并且参考变化率的绝对值在变化率转向负之后变得比负参考值的绝对值小的点，中止操作；存储部(31)，用于存储采样率信息，采样率信息将输出信号的值与控制器确定变化率的时间间隔关联；以及采样率确定器(33)，用于基于采样率信息和输出信号的实际值，确定用于计算变化率的时间间隔。

Description

制备分离色谱仪

技术领域

本发明涉及制备分离色谱仪，其中，通过色谱仪中的柱所分离的目标成分由馏分收集器分别地收集。

背景技术

作为用于将包含在样品中的成分分离并将这些成分分别地收集的系统，制备分离色谱仪是公知的，其中，成分通过高性能液相色谱仪或者类似设备中的柱在时间上被分离，并且每一成分随后由馏分收集器收集(例如，参见专利文献1和2)。

制备分离色谱仪包括具有送液泵和柱的分离单元、位于分离单元后面的检测器、馏分收集器、以及用于控制那些装置的控制器。已经以时间上分离的形式从柱中洗脱出来的样品成分依序由检测器(例如，紫外可见分光光度计)检测，并且被引入随后阶段的馏分收集器。在馏分收集器中，根据来自控制器的命令，内部通道被切换，以使得目标成分被分别收集进入馏分容器，诸如，小瓶。

许多制备分离色谱仪具有所谓的“自动分馏”的能力，“自动分馏”即从柱中洗脱出的成分的自动收集。在自动分馏中，控制器基于来自检测器的输出信号，定位每一成分的洗脱的开始点和结束点。控制馏分收集器，以便在从一个成分的洗脱的开始起的预定时间量之后，发起收集操作，并且在从该成分的洗脱的结束起的预定时间量之后，中止操作。“预定时间量”与已经经过检测器的成分到达馏分收集器的收集部分所需的时间量对应，由从检测器到馏分收集器的通道的长度、流动相的流速、以及其它因素确定。

自动分馏被大致划分为两个类型：使用阈值的“水平法”，以及使用变化率的“斜率法”。在水平法中，来自检测器的输出信号超过阈值的时间点被定位为色谱峰的开始点(成分的洗脱的开始)，而信号降至低于阈值以下的时间点被定位为峰的结束点(成分的洗脱的结束)。然而，如在流动相的组成随时间改变的梯度洗脱法的情况下，如果色谱的背景水平随时间改变，那么通过水平法来正确地定位成分的洗脱的开始点和结束点是困难的。此外，如果背景水平超过阈值，那么定位那些点将完全是不可能的。

在斜率法中，来自检测器的输出信号在预定时间间隔被获取，并且从以前获取的输出信号的变化率被计算。变化率的大小变得比正的预定斜率值大的时间点被定位为色谱峰的开始点(即，成分的洗脱的开始)，而变化率的绝对值变得比负的预定斜率值的绝对值小的时间点被定位为色谱峰的结束点(即，成分的洗脱的结束)。例如，如果正斜率值是200μV/秒并且负斜率值是–200μV/秒，那么检测器的信号强度上的变化的斜率超过200μV/秒的时间点被定位为峰的开始点。在经过峰顶之后，信号强度上的变化率转向负。随后，变化率的绝对值变得比负斜率值的绝对值(200μV/秒)小的时间点被定位为峰的结束点。以这种方式，根据斜率法，峰的开始点和结束点通过检验输出信号的变化率而被定位，而不是信号的绝对值。即使背景水平随时间变化，这个方法也可以被使用。

引用列表

专利文献

专利文献1：JP 2000—214151A

专利文献2：JP 2007—183173A

发明内容

技术问题

在先前描述的制备分离色谱仪中，控制器在预定时间间隔从检测器获取输出信号。时间间隔被设置成近似等于当平均含量的成分被检测到时出现的峰(标准峰)的半高宽的十分之一，即，一个峰将由近似20个测量点表示。这是因为为一个峰设置太小的测量点数目使得峰的再现性变差，而设置太大的测量点数目要求峰值数据的平滑处理以缓和测量点之间的变化的影响。

然而，实际包含在样品中的各种成分的量是不均匀的。也就是说，由低量成分在质谱图上形成的峰比标准峰更窄且更低，而由高量成分形成的峰比标准峰更宽且更高。如已经描述的，传统的制备分离色谱仪在预定时间间隔从检测器获取输出信号而不管成分的量，并且进行用于定位该成分的洗脱的开始点和结束点的处理。因此，由低量成分形成的低峰可能被遗漏，允许该成分避免收集处理，或者相反地，由高量成分形成的峰上的检测信号的波动可能被误认为是峰的结束，导致该成分的收集被错误地中止。

本发明要解决的问题是提供一种制备分离色谱仪，该制备分离色谱仪能够精确地定位包含在样品中的成分的洗脱的开始点和结束点，并且收集相同的成分，而不管化合物的量。问题的解决方案

根据本发明的制备分离色谱仪已经被开发用于解决先前描述的问题，包括：

a)色谱仪，所述色谱仪具有柱和检测器，所述柱用于时间分离包含在样品中的一个或者多个目标成分，所述检测器用于检测从所述柱中被洗脱出的每一个目标成分；

b)馏分收集器，所述馏分收集器用于收集从所述检测器离开的目标成分；

c)控制器，所述控制器用于基于所述输出信号来确定来自所述检测器的输出信号上的变化率，参考所述变化率变得比正的预定参考值大的时间点，命令所述馏分收集器对于所述目标成分发起收集操作，以及参考所述变化率的绝对值在所述变化率转向负之后变得比负的预定参考值的绝对值小的时间点，中止对于所述目标成分的所述收集操作；

d)存储部，所述存储部用于存储采样率信息，在所述采样率信息中，来自所述检测器的所述输出信号的值与所述控制器确定所述输出信号的所述变化率的时间间隔相关；以及

e)采样率确定器，所述采样率确定器用于基于所述采样率信息和通过所述控制器从所述检测器获取到的所述输出信号的所述值，确定所述控制器确定所述输出信号的所述变化率的所述时间间隔。

采样率信息的一个实例是其中检测器的动态范围被划分为段(segment)的表格，每一段与时间间隔的一个值相关。另一个实例是用于从来自检测器的输出信号的值计算时间间隔的数学公式。

“参考所述变化率变得比正的预定参考值大的时间点，命令所述馏分收集器对于所述目标成分发起收集操作”的操作指的是在从变化率已经变得比正的预定参考值大的时间点(目标成分的洗脱的开始点)延迟预定时间量的时间点，命令馏分收集器对于目标成分发起收集操作。“预定时间量”对应于已经经过检测器的成分到达馏分收集器的收集部分所需的时间量(延迟时间)，其通过从检测器到馏分收集器的通道的长度、目标成分的移动速度(流动相的流速)、以及其它因素而被确定。对于目标成分的收集操作的中止同样类似地被进行：馏分收集器在从变化率转向负之后变化率的绝对值已经变得比负的预定参考值的绝对值小的时间点(即，目标成分的洗脱的结束点)延迟预定时间量的时间点，被命令中止对于目标成分的收集操作。

控制器从检测器获取输出信号的时间间隔只需要等于或者短于控制器确定输出信号的变化率的时间间隔；该两个间隔不需要总是彼此相等。例如，控制器可以被配置成在等于或者小于用于确定变化率的最短的可能的时间间隔的预定时间间隔从检测器获取输出信号，并且仅使用获取的输出信号的一部分来确定输出信号上的变化率。

由低量成分形成的峰比标准峰更窄且更低，而由高量成分形成的峰比标准峰更宽且更高。为了处理这种取决于成分的量的在峰的宽度和高度上的变化，采样率信息被准备，以使得对于来自检测器的较低的输出信号的水平，用于确定变化率的较短的时间间隔将被设置，而对于较高的输出信号的水平，用于确定变化率的较长的时间间隔将被设置。这个设置防止由低量成分形成的低峰被遗漏，从而允许该成分避免采集处理的情况，以及在由高量成分形成的峰上的检测信号的波动被误认为峰的结束的情况。因此，不管样品中的成分的量，目标成分的洗脱的开始点和结束点可以被精确地定位，并且该成分可以由馏分收集器收集。

被开发用于解决先前描述的问题的本发明的另一个方面是用于使用制备分离色谱仪收集目标成分的方法，所述制备分离色谱仪被配置成参考通过色谱仪中的柱来被时间分离的一个或者多个目标成分的检测信号的变化率变得比正的预定参考值大的时间点，对于目标成分发起收集操作，并且参考所述变化率的绝对值在所述变化率转向负之后变得比负的预定参考值的绝对值小的时间点，中止对于所述目标成分的所述收集操作，其中：

所述检测信号的所述变化率在取决于所述检测信号的值的大小的时间间隔被确定。

本发明的有利效果

通过使用根据本发明的用于收集目标成分的制备分离色谱仪或者方法，目标成分的洗脱的开始点和结束点可以被精确地定位，并且成分可以由馏分收集器收集，而不管样品中的成分的量。

附图说明

图1是显示根据本发明的制备分离色谱仪的一个实施例的主要部件的配置图。

图2是在本实施例的制备分离色谱仪中使用的采样率信息的一个实例。

图3是显示在本实施中生成的色谱以及输出信号的变化率被计算的时间间隔的图。

具体实施方式

以下参考附图描述作为根据本发明的制备分离色谱仪的一个实施例的制备分离液相色谱仪以及用于使用相同的制备分离液相色谱仪收集目标成分的方法。

图1显示本实施例的制备分离液相色谱仪的主要部件的配置。本实施例的制备分离液相色谱仪包括用于分离包含在样品中的目标成分的液相色谱单元10、用于收集由液相色谱单元10分离的目标成分的馏分收集器20、以及用于控制这些单元的操作的控制器30。

在液体色谱单元10中，保持在流动相容器11中的流动相由送液泵12吸入，且以预定流速被提供给柱14。包含目标成分的样品通过样品注入器13被注入，并且通过流动相的流动而被运送至柱14。样品中的目标成分在柱14内被时间分离，且被洗脱。从柱14中被洗脱出的目标成分由紫外可见分光光度计15检测，并且被引入到馏分收集器20中。紫外可见分光光度计15以100Hz的检测周期检测目标成分。检察信号被存储在存储部31(稍后将描述)中。

馏分收集器20包括多个馏分容器21以及用作通道切换单元的电磁阀22。电磁阀22根据来自分馏操作控制器32(稍后将描述)的控制信号来操作，以便将来自液相色谱单元10的通道连接至分馏容器21之一或者排水管。

除了存储部31外，控制器30包括分馏操作控制器32、采样率确定器33，以及洗脱定位器34作为功能块。控制器30实际上是个人计算机，必要的软件程序被安装在其上。输入单元40以及显示单元50被连接至个人计算机。存储部31保存在定位目标部件的洗脱的开始点和结束点中由洗脱定位器34使用的斜率值(±200μV/秒)，以及采样率信息。

采样率信息是将来自紫外可见分光光度计15的输出信号的值(阈值)与洗脱定位器34计算输出信号的变化率的时间间隔关联的信息。在本实施例中，图2中所示的表格格式的信息被使用。以下关系被定义：用于1000μV以下的输出信号的100Hz的采样率，用于1000μV以上且小于50000μV的输出信号的50Hz的采样率，用于50000μV以上且小于100000μV的输出信号的20Hz的采样率、以及用于100000μV以上的输出信号的5Hz的采样率。除表格格式外，用于从输出信号的数值计算采样率的数学公式也可以被用作为采样率信息。

以下描述在本实施例的制备分离色谱仪中的目标成分的收集操作。

一旦接收到来自用户的发起制备分离的命令，分馏操作控制器32读取存储在存储部31中的正和负斜率值(±200μV/秒)以及采样率信息，并且将它们显示在显示单元50上。在使用输入单元40适当地编辑斜率值和采样率信息之后，进行固定操作，借此被编辑的数据被固定为要在收集实际样品中的目标成分的处理中使用的斜率值以及采样率信息。

分馏操作控制器32命令液相色谱仪10的部件以及馏分收集器20的部件来发起它们的操作(“分馏操作”)。还基于在分馏操作中的流动相的流速、从紫外可见分光光度计15至馏分收集器20中的电磁阀22的通道的长度、以及其它因素来计算延迟时间td。延迟时间td是已经经过紫外可见分光光度计15的目标成分到达电磁阀22所需要的时间量，电磁阀22是馏分收集器20的收集部。

在用于目标成分的分馏操作被发起之后，分馏操作控制器32确定修正值，以使得由紫外可见分光光度计15最初产生的检测信号的值变为紫外可见分光光度计15的输出信号的零点(0μV)。这个修正值被应用至所有的随后的输出信号。另外，分馏操作控制器32基于来自紫外可见分光光度计15的(修正的)输出信号生成色谱，并将其显示在显示单元50上。图3显示在本实施例中生成的色谱的一个实例。

因为分馏操作的开始的输出信号是0μV，采样率确定器33根据采样率信息将采样率设置为100Hz。洗脱定位器34以这个采样率(100Hz)确定输出信号的变化率。对于在100Hz的每一个输出信号的获取，洗脱定位器34计算输出信号的变化率并且判定该变化率是否超出正斜率值(200μV/秒)。变化率超出斜率值的时间点(ta)被定位为目标成分的洗脱的开始点。在目标成分的洗脱的开始点通过洗脱定位器34被定位之后，分馏操作控制器32在从时间ta延迟了延迟时间td的时间点(ta+td)操作馏分收集器20的电磁阀22，以便将目标成分收集在馏分容器21之一中。

采样率确定器33进一步连续监控来自紫外可见分光光度计15的输出信号。在输出信号的值已经到达或者超出采样率信息中指定的最低阈值(1000μV)的时间点(t1)，采样率确定器33将采样率改变为50Hz。同时，洗脱定位器34将用于确定输出信号的变化率的时间间隔改变为50Hz。在那之后，采样率确定器33在输出信号的值达到50000μV以上的时间点(t2)，将采样率改变为20Hz，并且在输出信号的值达到100000μV以上的时间点(t3)，将采样率进一步改变为5Hz。

在目标成分的洗脱的开始之后，当质量色谱的峰顶被经过时，目标成分的洗脱的量开始逐渐减小，并且来自紫外可见分光光度计15的输出信号的值上的变化率转向负。在那之后，采样率确定器33在输出信号的值已经降至低于采样率信息中所指定的阈值(100000μV)以下的时间点(t4)，将采样率改变为20Hz，在输出信号的数值已经降至低于50000μV以下的时间点(t5)，将采样率改变为50Hz，以及在输出信号的值已经降至低于1000μV以下时的时间点(t6)，将采样率改变为100Hz。

同时，洗脱定位器34将输出信号的值的变化率的绝对值降至低于负斜率值的绝对值(200μV/秒)的时间点定位为目标成分的洗脱的结束点。在目标成分的洗脱的结束点通过洗脱定位器34被定位之后，分馏操作控制器32在从时间tb延迟了延迟时间td的时间点(tb+td)，操作馏分收集器的电磁阀22，以中止目标成分的收集。

在本实施例中，如图3中所示，输出信号的变化率被确定的时间间隔在输出信号具有小数值的时间周期内被缩短。因此，对应于低量成分的微小尺寸的峰P1将不会被遗漏，并且该成分将无疑被收集。相反地，输出信号的变化率被确定的时间间隔在输出信号具有大的数值的时间周期内被延长。因此，形成与高量成分对应的大尺寸峰P2的输出信号的小波动(例如，图3中峰P2上的点A或者B上的输出信号的波动)将不会被误认为该成分的洗脱的结束，并且该成分将会被精确地收集。

先前的实施例仅仅是实例，并且可以在本发明的精神内被适当地改变。例如，在先前的实施例中，背景的影响通过修正被减小，其中，最初从检测器获取到的输出信号被设置为零值。如在梯度洗脱法的情况下，如果背景随时间改变，背景的影响可以如下被减小：

最初，在样品中的目标成分的制备分离之前，流动相在与目标成分的制备分离中的梯度条件相同的梯度条件下被单独提供(没有样品注入)和检测。由此从检测器获取到的输出信号(“空白数据”)被存储在存储部分31中。其次，当实际样品中的目标成分的制备分离被进行时，在输出信号的变化率被计算之前，从输出信号减去空白数据，以定位目标成分的洗脱的开始点和结束点。通过这个操作，在使用梯度洗脱法的情况下出现的背景的影响被消除，因此，目标成分可以被精确地收集。

另外，也可以在用于在检测器中检测目标成分和流动相两者的条件下获取两者检测信号，并且在用于只检测流动相的条件下获取检测信号，以及从前者检测信号中减去后者检测信号。根据这个方法，因为用于减法的空白数据实时被获取，所以由制备分离色谱仪周围的环境的变化(例如，温度变化)所导致的背景的变化的影响也可以被去除。如果检测器是紫外可见分光光度计，那么可以通过进行吸光度测量获得空白数据，吸光度测量使用波长，在该波长处，出现通过流动相的光的吸收，而没有出现通过目标成分的吸收的波长。如果检测器是质谱仪，那么可以通过以质荷比进行选择性离子监控测量来获得空白数据，在该质荷比处，离子从流动相产生，而没有出现来自目标成分的离子的产生。

参考标记列表

10…液相色谱仪

11…流动相容器

12…送液泵

13…样品注入器

14…柱

15…紫外可见分光光度计

20…馏分收集器

21…馏分容器

22 电磁阀

30…控制器

31…存储部

32…分馏操作控制器

33…采样率确定器

34…洗脱定位器

40…输入单元

50…显示单元。

Claims (2)

1.一种制备分离色谱仪，其特征在于，包括：

a)色谱仪，所述色谱仪具有柱和检测器，所述柱用于时间地分离包含在样品中的一个或者多个目标成分，所述检测器用于检测从所述柱中被洗脱出的每一个目标成分；

b)馏分收集器，所述馏分收集器用于收集从所述检测器离开的目标成分；

c)控制器，所述控制器用于基于来自所述检测器的输出信号来确定所述输出信号的变化率，参考所述变化率变得比正的预定参考值大的时间点，来命令所述馏分收集器对于所述目标成分发起收集操作，以及参考所述变化率的绝对值在所述变化率转向负的之后变得比负的预定参考值的绝对值小的时间点，来中止对于所述目标成分的所述收集操作；

d)存储部，所述存储部用于存储采样率信息，在所述采样率信息中，来自所述检测器的所述输出信号的值与所述控制器确定所述输出信号的所述变化率的时间间隔相关；以及

e)采样率确定器，所述采样率确定器用于基于所述采样率信息和通过所述控制器从所述检测器获取到的所述输出信号的所述值，来确定所述控制器确定所述输出信号的所述变化率的所述时间间隔。

2.一种用于使用制备分离色谱仪来收集目标成分的方法，其特征在于，所述制备分离色谱仪被配置成参考通过色谱仪中的柱来被时间地分离的一个或者多个目标成分的检测信号的变化率变得比正的预定参考值大的时间点，来对于目标成分发起收集操作，并且参考所述变化率的绝对值在所述变化率转向负之后变得比负的预定参考值的绝对值小的时间点，来中止对于所述目标成分的所述收集操作，其中

所述检测信号的所述变化率在取决于所述检测信号的值的大小的时间间隔被确定。