JP6953989B2

JP6953989B2 - ピーク幅包含法を用いたピーク同定手法

Info

Publication number: JP6953989B2
Application number: JP2017201242A
Authority: JP
Inventors: 原一植松; 雅史堀賀
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2037-10-17
Also published as: JP2019074427A

Description

本発明は、クロマトグラフィでの成分同定を、ピークの特定の時間範囲を示す指標（時間）を基に行い、同定精度を向上させる方法に関するものである。

クロマトグラフィでは、溶離液をカラムに送液する送液ポンプが不安定になる等の装置上の問題、室温の変動などによる測定環境上の問題、成分の濃度が変化することによりピーク形状が変化するという試料濃度の問題等により、同じ成分であっても必ずしも同じ溶出時間にならないことがある。このような溶出時間の変動があっても、確実に同定を行うために、基準となる溶出時間の許容幅を広げることも考えられるが、一定程度正確に同定できる確率が高くなる一方、不純物由来のピークを目的の成分として誤同定してしまうリスクも同時に高まることになる。

そこで、一般的な溶出時間による同定法にピーク幅による同定を併用する方法が考案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法では溶出条件の変動などによる誤同定は防止できるが、試料濃度が変化することによりピーク形状が変化し、それにより溶出時間が変動することで、本来同定するべきピークが同定できなくなる現象への対応はできなかった。

特開昭６０−０７３４５８号公報

本発明の課題は、試料を分析した際の溶出ピークに、リーディングやテーリングなどが発生し非対称になるなどの、ピーク形状変化が発生した際にも対応できるピーク同定方法を提供することである。

本発明者は、ピーク同定の基準を従来の溶出時間ではなく、クロマトグラム中の任意の点を基準点とし、ピークがその基準点から任意の高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、当該ピーク幅をピーク同定に用いることで、同定精度を向上させることができることを見出した。なお、本発明で言う「高さ」とは出力値＝０の直線からの距離を指すものであり、マイナスの出力値に対しても適用される概念である。

すなわち本発明は、
クロマトグラフィによる試料の分析方法であって、
クロマトグラム中の任意の点を基準点、
前記基準点から任意の高さを指定高さ、
ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、
濃度が既知である特定成分の前記ピーク幅を基準ピーク幅として、
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、前記基準ピーク幅に包含される又は前記基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする分析方法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

まず、本発明のピーク同定法の特徴である「ピーク幅」について説明する。「ピーク幅」とは、クロマトグラム中の任意の点を基準点、前記基準点から任意の高さを指定高さとするときに、ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲を指すものである。具体的な算出方法としては、クロマトグラムに含まれるピークを時間微分などの手法を用いて検出し、同定すべきピーク曲線の立ち上がりが、基準点からの高さで指定された出力値を超えた点をピーク幅開始Ａ点、同ピークの立下りが同基準点からの高さで指定された出力値を下回った点をピーク幅終了Ｂ点とした場合のＡ点とＢ点間の絶対時間の範囲を示す（図１）。一般的にはピークを発生させる成分の濃度が変化すると、ピークの形状が変化することにより、ピーク幅も変動する。

本発明における基準点は、クロマトグラム中のピーク開始点又はピーク終了点、クロマトグラムの開始点又は終了点、クロマトグラム中でピークが存在しない安定点から選択することが好ましいが、固定点、クロマトグラム中でユーザーが任意に指定した点などでも問題はない。ベースラインがドリフトしている場合の基準点は、ピーク開始点又はピーク終了点を選択し、ピーク幅を取得することが望ましい（図２）。試料の濃度が高いなどの理由により２つ以上のピークが不分離となった場合、前半のピークのピーク幅終了Ｂ点と後半のピークのピーク幅開始Ａ点が２ピーク間の谷となる時間で同一としてもよく（図３）、各ピークの指定高さを２ピーク間の谷となっている出力値よりも大きい値を設定してもよい（図４）。一方で不分離ピークとなっている場合でも、波形分離等のデータ処理にて各ピークが取得できている場合は、不分離点の高さに依らずピーク毎に単一のピークとしてピーク幅を取得することができる（図５）。

本発明における指定高さは、クロマトグラムに含まれる測定対象とする各ピーク幅が取得できる値となるように任意に設定すればよい。つまり、指定高さの設定は、ピーク幅を取得するピークの出力値が、クロマトグラムのノイズレベルよりは高い値であり、測定対象とする成分の下限濃度の出力値よりは低い値となるように設定することが望ましい。指定高さは、すべての成分で同じ値を用いても良いが、検量範囲等の違いなどにより、成分毎に異なる値を設定してもよい。例えば、巨大ピークの後方に出現する微小な目的ピークがショルダーピークとなった場合でも、異なる指定高さを用いることにより、巨大ピークと微小ピークのピーク幅を取得することができる（図６）。

次に、「ピーク幅」を用いたピーク同定の方法について説明する。最初に、含有成分が既知である標準試料のクロマトグラムを取得し、各ピークのピーク幅と、指定高さと、該当する成分の関連を同定条件として作成し、特定成分の基準ピーク幅と定める。次に、未知試料から得られたクロマトグラムのピークについて、標準試料と同じ条件の基準点及び指定高さを選択して得られるピーク幅が、基準ピーク幅に包含されるか、基準ピーク幅を包含する場合はピーク成分を特定成分と同定し、その他の場合は成分不明のピークとして取り扱う（図７）。指定高さをピーク毎に変える場合は、同定条件の指定高さを成分毎に異なる値に設定すればよい。

図８には表１に記載した４条件での同定基準を示した。条件Ａのピーク幅は基準ピーク幅に包含されるために同定される。条件Ｂ、Ｃのピーク幅は基準ピーク幅に包含されることも、基準ピーク幅を包含することもないために同定されない。条件Ｄのピーク幅は基準ピーク幅を包含するために同定される。

しかしながら、同一の分析条件で同一の試料を測定したにもかかわらず、溶離液の性状変化や外部環境変化などによってピーク溶出時間に変動が生じた場合は、同一成分であってもピーク幅が変わる可能性がある。そのため、ピーク幅の誤差を考慮して、任意の比率で基準ピーク幅を伸長及び短縮し、伸長された基準ピーク幅に包含される又は短縮された基準ピーク幅を包含するかどうかでピークの同定を行うことが好ましい。図９ａ、ｂには基準ピーク幅を任意の比率で伸長及び短縮した場合の同定条件を示した。条件Ｅは通常の基準ピーク幅の場合は基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないが、短縮された基準ピーク幅を包含するために同定される。条件Ｆは通常の基準ピーク幅の場合は基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないが、伸長された基準ピーク幅に包含されるために同定される。

前述した比率は同定条件に含めることができ、絶対時間による指定や、ピークの開始時間や終了時間の割合、ピーク幅開始Ａ点や終了Ｂ点の割合などで指定しても良く、ピーク幅開始Ａ点と終了Ｂ点で別の指定方法を用いても良い。また、ピーク毎に別々の設定基準を用いて指定しても良い。

また、ピーク幅を用いて同定を行う本発明は、従来の溶出時間を用いた同定方法と併用することが可能である。つまり、巨大ピークの後方に出現する微小な目的ピークがショルダーピークとなり、かつ微小ピークが正規分布様のピークである場合などで、指定高さの設定が困難である場合などで併用を行うことが望ましい。

上述した方法で、ピーク形状の変化に伴う「ピーク幅」の変動を、擬似クロマトグラムを基に説明する。なお、擬似クロマトグラムは、非対称の分布関数である、下記のジョンソンＳＵ関数を用いて作成したものである。

図１０は正規分布様の基準ピーク、基準ピークよりもピーク面積値が小さい正規分布様のＰｅａｋＡ、基準ピークよりも面積値の大きい正規分布様のＰｅａｋＢ、ＰｅａｋＡの立ち上がりがなだらかで立下りが急なリーディング状態のＰｅａｋＣ及びＰｅａｋＢの立ち上がりが急で立下りがなだらかなテーリング状態のＰｅａｋＤを示す。

表２に図１０に示した６つのピークの溶出時間と、ピーク幅を示す。なお、基準点は出力値が０．０の点、指定高さは出力値が１５．０となった点とした。

表３に、溶出時間を用いて同定を行う従来法にて、±１．０％の同定許容幅を設定してピーク同定を行った結果を示す。正規分布様のＰｅａｋＡ及びＰｅａｋＢは、基準ピークと溶出時間に差が生じないために同定されるが、リーディング及びテーリングが発生しているＰｅａｋＣ及びＰｅａｋＤの溶出時間は同定許容幅を超えているため、同定されない。また、不純物ピークは正規分布様のピークであるが、溶出時間が同定許容幅を超えているため同定されない。このように溶出時間を用いた同定手法の場合、試料濃度の違いによりリーディング及びテーリングが生じた場合、同定許容幅の設定によっては同定されない場合がある。

表４に、溶出時間を用いて同定を行う従来法にて、試料濃度の違いによりリーディング及びテーリングが生じた場合でも同定できるように、同定許容幅を±５．０％に設定した場合のピーク同定を行った結果を示す。ＰｅａｋＡ〜Ｄのいずれも同定されているが、本来は同定されるべきではない不純物由来ピークも基準ピークと誤同定されていることがわかる。

表５に、本発明におけるピーク幅を用いた方法にて、ピーク同定を行った結果を示す。ＰｅａｋＡ、Ｃはピーク幅が基準ピーク幅に包含されるため同定され、ＰｅａｋＢ、Ｄはピーク幅が基準ピーク幅を包含するため同定される。一方で同定されるべきではない不純物由来ピークは、基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないため同定されない。

表６に、基準ピーク幅を＋１．０％の比率で伸長及び短縮した場合のピーク同定を行った結果を示す。許容ピーク幅を用いていない表５の結果と同じとなったことから、溶離液の性状変化や外部環境変化などによってピーク溶出時間に変動への対応として許容ピーク幅を設定した場合であっても、正しくピーク同定されることがわかる。

以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。
図１１に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置２、送液ポンプ３、試料注入部４、カラムオーブン６、サプレッサー７、電気伝導度検出器８、廃液ボトル９、及びデータ処理プログラム（ＩＣ−２０１０Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）１０で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＩＣ−ＡｎｉｏｎＨＳ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｃｍ）を使用し、標準物質の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０ μＬ、カラム温度：４０ ℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：９．０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ_３＋１．０ｍｍｏｌ／ＬＮａ_２ＣＯ_３
サンプル：陰イオン混合標準液（和光純薬工業（株）製）
臭化物イオン１００ｍｇ／Ｌ
塩化物イオン２０ｍｇ／Ｌ
フッ化物イオン２０ｍｇ／Ｌ
亜硝酸イオン１００ｍｇ／Ｌ
硝酸イオン１００ｍｇ／Ｌ
リン酸イオン２００ｍｇ／Ｌ
硫酸イオン１００ｍｇ／Ｌ
希釈試料各種：
試料１混合液１／２希釈希釈率：０．５
試料２混合液１／２０希釈希釈率：０．０５
試料３混合液１／３２０希釈希釈率：０．００３１２５

図１２は上記、試料１から３のクロマトグラムを重ねて表示した図である。
図１３は上記クロマトグラムを重ねて表示した図のうち、８．５分〜１０．０分前後に出現するリン酸イオンのピークをベースライン付近で拡大表示した図である。基準点を０．０μＳとし、指定高さを０．１μＳとした場合における試料３のリン酸イオンピーク幅を表す。

次に、本発明の同定法の効果について検証を行った。
試料１を基準ピークとした場合の、溶出時間による同定条件を表７に、本発明を用いた同定条件を表８に示す。基準ピークの基準点を０．０μＳ、指定高さを０．１μＳとした。

これらの同定条件を試料２および試料３に適用し検証した結果を表９に示す。

これらの結果から、従来法である溶出時間を用いたピーク同定法では、濃度が異なる他の試料に対して同定できないピークが発生するが、本発明であれば１００倍以上濃度が異なる試料に対しても正しくピーク同定できていることがわかる。

本発明に用いるピーク幅、及びピーク幅決定に用いる開始Ａ点、終了Ｂ点、指定高さを示した図である。ベースラインがドリフトしている場合の、ピーク幅包含法に用いるピーク幅を示した図である。２つのピークが不分離ピークである場合の、不分離点において前後のピークのピーク幅を分けることを示した図である。２つのピークが不分離ピークである場合の、不分離点において前後のピークのピーク幅を分けないように指定高さを設定し、それぞれのピーク幅を示した図である。２つのピークが不分離である場合に、波形分離を用いてピークを分離したのち、それぞれのピーク幅を示した図である。２つのピークのうち、巨大ピークの後方に出現する微小な目的ピークがショルダーピークとなった場合の、各ピークのピーク幅を示した図である。本発明の検証へ用いた、基準ピークに対して信号強度が高いＰｅａｋＡと、基準ピークに対して溶出時間が異なるＰｅａｋＢを示した図である。本発明において、ピークを同定する場合と同定しない場合の条件を示した図である。本発明において、ピーク幅を任意の比率で伸長及び短縮した場合における、ピークを同定する場合の条件を示した図である。従来法と本発明の比較として、基準ピークと基準ピークよりも面積が小さいＰｅａｋＡ、基準ピークよりも面積が大きいＰｅａｋＢ、基準ピークよりも面積が小さくリーディングしたＰｅａｋＣ、基準ピークよりも面積が大きくテーリングしたＰｅａｋＤ、及び基準ピークと同定されるべきではない不純物由来ピークを示した図である。実施例で用いたイオンクロマトグラフ装置である。実施例１で用いた標準試料を希釈した３濃度の試料のクロマトグラフである。実施例１で用いた標準試料を希釈した３濃度の試料のクロマトグラフのうち、８．５〜１０．０分付近に出現するリン酸イオンのピークをベースライン付近で拡大表示し、もっとも濃度の低いピークのピーク幅を示した図である。

１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．サプレッサー
８．電気伝導度検出器
９．廃液ボトル
１０．システム制御及びデータ処理装置

Claims

クロマトグラフィによる試料の分析方法であって、
クロマトグラム中の任意の点を基準点、
前記基準点から任意の高さを指定高さ、
ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、
濃度が既知である特定成分の前記ピーク幅を基準ピーク幅として、
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、前記基準ピーク幅に包含される又は前記基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする分析方法。
前記基準ピーク幅について任意の比率で伸長及び短縮を行い、
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、伸長された基準ピーク幅に包含される又は短縮された基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
前記基準点として前記クロマトグラム中のピーク開始点又はピーク終了点、前記クロマトグラムの開始点又は終了点、クロマトグラム中でピークが存在しない安定点のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析方法。