JP6862813B2

JP6862813B2 - 多項式検量線による定量および補正方法

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Publication number: JP6862813B2
Application number: JP2016241712A
Authority: JP
Inventors: 原一植松
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2021-04-21
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: JP2018096850A

Description

本発明は、クロマトグラフィの多項式検量線の補正方法であり、日常の定量操作の簡素化、正確さを向上させる方法に関するものである。

クロマトグラフィとは複数の目的成分の定性分析および定量分析する技術である。定性分析は、予め標準試料を測定し、その溶出時間と合致するか否かにより行うのが一般的である。定量分析では、濃度の異なる標準試料を調整し、クロマトグラフィを行い、濃度に対する検出器の出力（ピーク高さ、面積等）を基に検量線を作成し、それを基に未知試料の濃度を決定するものである。検量線は、濃度に対する出力（ピーク高さ、面積等）を、最小二乗法等を用いて近似式を作成し、数式化される。

定量目的成分の濃度範囲が広い場合など、高濃度側で検量線の傾きが若干小さくなる現象がしばしば観測される。また、低濃度側では目的成分の回収率が下がり、同様に検量線の傾きが若干小さくなる現象もしばしば観測される。このような場合、１次式での近似では誤差が大きくなることから、２次式、３次式等の多項式により近似した検量線を使用することになる。多項式を用いる場合は、検量線が曲線となることから、当然のことながら１濃度の標準試料では作成できない。濃度の異なる標準試料を複数用いて検量線を作成することが必須となり、作業工数が多くかかる難点がある。

また、１次式の場合、濃度と出力（ピーク高さ、面積等）は完全に比例関係にあることから、未知試料の出力（ピーク高さ、面積等）に対する検量値は常に１つとなるが、多項式を使用した場合は、必ずしも、未知試料の出力（ピーク高さ、面積等）に対する検量値は１つとは限らない。未知試料の出力（ピーク高さ、面積等）に対する検量値が２つ以上あると、どれが真の定量値か判断することが難しい。また、極値付近では濃度に対する出力（ピーク高さ、面積等）の変化量が極端に小さくなり（１次微分値が０に近づく）、定量精度、信頼性の担保が難しくなる。

本発明は、クロマトグラフィにおける多項式検量線による定量操作を簡素化するとともに、定量精度、信頼性を担保しつつ、定量範囲を広げることを目的とする。

本発明は、クロマトグラフィにおける多項式検量線の作成方法であって、
濃度をｘ、出力値をｙとしてプロットした検量点を２次式又は３次式にて近似を行い、その近似式が単純増加関数となるまで前記検量点のプロットを行う工程と、
前記単純増加関数の極大値に１未満の定数を乗じて又は前記検量点の最大出力値に１以上の定数を乗じて、出力値の上限を決定する工程と、
を含んでなることを特徴とする。

また、本発明は、特定の濃度ｘ_０の標準試料をクロマトグラフィで測定し、得られた出力値ｙ_０と、前記近似式で計算される濃度ｘ_０に対する出力値との比率を算出し、前記検量点の出力値に前記比率を各々乗じて得られる補正出力値を２次式又は３次式にて近似を行う工程を更に含んでいてもよい。

そして、補正出力値を近似した近似式に対して、単純増加関数の極大値に１未満の定数を乗じて又は前記補正出力値の最大出力値に１以上の定数を乗じて、出力値の上限を再決定する工程を更に含んでいてもよい。

本発明の詳細について、手順ごとに説明する。なお、検量線を用いた定量の手順を表したフローチャートを図７、８に示す。

（ステップ１）
まず、複数濃度の標準試料を測定し、濃度に対する出力値（ピーク高さ、面積等）を得る。最小二乗法により多項式近似を行い、基準検量線（以下、単に検量線と言う場合がある）を作成する。

（ステップ２）
次に、多項式の係数ａ、および極値（ｐ、ｑ）の座標、判別式Ｄの値から近似式の形状を特定し、それぞれにあった定量上限を決定する。多項式が２次式の場合、係数ａ＜０であれば極大値が存在する形状をとる（図１参照）。極大値の座標が（ｐ、ｑ）ともに正でない場合、作成された検量線は単純増加関数ではないため、異常と判断し、再測定等を促す指示を出し、検量点のプロットを増やす又は異常値と思われる検量点のプロットを修正する等を行う（以下、異常と判断した場合の対応は同様である）。極大値の座標が（ｐ、ｑ）とも正の場合、作成された検量線は正常と判断し、定量上限値を決定する。定量上限値は、極大値のｑ座標に係数ｆ１を乗じて算出する。係数ｆ１は１未満であればよく、特に指定するものではないが、１に近いほど定量精度が悪くなり、値を小さくすると定量範囲が狭くなるため、０．６〜０．９５程度の値が望ましい（図３ａ参照）。

係数ａ＞０であれば極小値が存在する形状をとる（図２参照）。極小値の座標ｐが負でない場合、作成された検量線は異常と判断する。極小値の座標ｐが負の場合、作成された検量線は正常と判断し、定量上限値を決定する。定量上限値は、最大濃度の検量点のｙ値に係数ｆ２を乗じて算出する。係数ｆ２は１以上であればよく、特に指定するものではないが、値が大きくなるほど定量の信頼性が低くなり、値が小さくなるほど定量範囲が狭くなるため、１．００〜１．５０程度の値が望ましい（図３ｂ参照）。

表１は２次式の形状および前記手段で得られる定量上限の一覧を示した表である。

多項式が３次式の場合、係数ａ＞０であれば極値はあるものの単純増加関数の形状をとる（図４参照）。係数ａ＜０であれば減少関数の形態をとることから、作成された検量線は異常と判断する。判別式Ｄ＞０の場合、定量上限値は、極大値のｑ座標に係数ｆ３を乗じて算出する。係数ｆ３は１未満であればよく、特に指定するものではないが、１に近いほど定量精度が悪くなり、値を小さくすると定量範囲が狭くなるため、０．６〜０．９５程度の値が望ましい。判別式Ｄ≦０の場合、極大、極小値は存在しないことから、定量上限値は、最大濃度の検量点のｙ値に係数ｆ４を乗じて算出する。係数ｆ４は１未満であればよく、特に指定するものではないが、１に近いほど定量精度が悪くなり、値を小さくすると定量範囲が狭くなるため、０．６〜０．９５程度の値が望ましい（図５参照）。

表２は３次式の形状および前記手段で得られる定量上限の一覧を示した表である。

（ステップ３）
未知試料を測定し、出力値（ピーク高さ、面積等）を得る。

（ステップ４）
未知試料の出力値（ピーク高さ、面積等）が、ステップ２で得られた定量上限に収まっているかを判断し、定量上限以下であれば近似式に従い定量計算を実施する。ただし、出力値（ピーク高さ、面積等）が定量上限値と極値の間の場合は、近似式に従い定量計算を実施してもよいが、定量精度に誤差が生じている可能性があることを示す警告フラグを付加しておくことが好ましい。

（ステップ５）
未知試料の分だけ、ステップ３から繰り返し行い、その未知試料群の測定を終了する。

（ステップ６）
異なる未知試料群の測定を更に行う場合は、検量線の補正を行う。図６に補正の流れを示す。

基準検量線を作成する際に使用した複数の標準試料のうち１試料を、基準検量線を補正するために使用する。前記補正用の標準試料を測定し、出力値（ピーク高さ、面積等）を取得する（図６ｂ）。得られた補正用標準試料の出力値（ＡＦ）と、それに対応する基準試料作成時に得られた出力値（ＡＲ）の比率Ｆ（ＡＦ／ＡＲ）を算出する。

検量線作成時に得られたすべての出力値（ＡＲ１〜ＡＲｎ）に比率Ｆを乗じて、補正出力点を算出する（図６ｃ）。

濃度に対する補正出力値（ピーク高さ、面積等）から最小二乗法により多項式近似を再度行い、補正検量線を作成する（図６ｄ）。なお、比率Ｆが一定値以上または以下の場合、検量線の形態が大きく変化していることを意味することから、検量線の補正ではなく、新しい検量線を再作成する指示を出す、または、測定を中止するなどのアクションを行うことが好ましい。一般的に比率Ｆは０．９から１．１の範囲が好ましいが、定量結果への影響を個々に判断し指定することが望ましく、この値に限定するものではない。ここでは、基準検量線を補正するために１濃度の試料を用いることを前提に説明したが、複数濃度の標準試料を用いて補正を実施しても良い。この場合、面積比率Ｆが複数得られるが、平均値で補正を実施すれば、より補正の精度が高まることになる。また、基準検量線作成時に使用していない濃度の標準試料で補正を行っても問題ない。基準検量線の対応する濃度の出力値（ピーク高さ、面積等）を近似関数（基準検量線の近似式）により求め、比率Ｆを算出し、前述の通り補正計算に用いれば良い。

（ステップ７）
ステップ２と同様に新たに得られた多項式の係数等により近似式の形状を特定し、それぞれにあった定量上限を再度決定する。

以降、ステップ３に戻り、未知試料を測定し、定量計算を行う。

以上説明したように、本発明の方法では、２次式、３次式といった多項式を検量線に用いた場合であっても、日常の分析操作においては１濃度の標準試料を用い、基準検量線を補正したうえで、未知試料の定量を行うことができ、工数を大幅に短縮することができる。また、定量上限を近似式の係数等から算出し、判断基準として用いることで、定量値の信頼性も向上させることが可能となった。

２次式の形態を分類した図である（係数ａ＜０の場合）。２次式の形態を分類した図である（係数ａ＞０の場合）。本発明における、２次式を検量線に使用した場合の定量上限値を示した図である。３次式の形態を分類した図である。本発明における、３次式を検量線に使用した場合の定量上限値を示した図である。本発明における、検量線の補正の手順の一例を示した図である。本発明における、検量線を用いた定量の手順を示したフローチャートで示した図である（２次式の場合）。本発明における、検量線を用いた定量の手順を示したフローチャートで示した図である（３次式の場合）。実施例で使用したシステム構成を示した図である。実施例１で得られた基準検量線を示した図である。図１０の基準検量線のピーク３を拡大した図である。実施例２で得られた基準検量線を示した図である。実施例２での定量上限値を模式的に示した図である。図ａは極大値を有する形状、図ｂは極小値を有する形状の場合である。実施例２での、流速を変化させた場合の標準試料１のクロマトグラムである。実施例２での、ピーク５の定量結果の一部を示した図である。横軸に基準検量線作成時に定量を行った結果である。

（実施例１）
本発明の効果を、実際のクロマトグラフィを実施し検証を行った。図９は検証に使用したシステムである。溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０）７、およびデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１００Ｚ（５μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）を使用し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸類の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：８０ｕＬ、カラム温度：４０℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（６０／４０）、検出：２８０ｎｍ
標準試料：Ｍｅｔｈｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．１ｍｇ／１ｍＬ）、Ｐｒｏｐｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．２ｍｇ／１ｍＬ）、Ｂｕｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．３ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｘｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．４ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｐｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．５ｍｇ／１ｍＬ）
上記混合物を標準試料１とし、１／２希釈した試料を標準試料２、１／４希釈した試料を標準試料３、１／８希釈した試料を標準試料４、１／１６希釈した試料を標準試料５、１／３２希釈した試料を標準試料６、１／６４希釈した試料を標準試料７とした。
未知試料：
混合物Ａ；Ｍｅｔｈｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．０５６ｍｇ／１ｍＬ）、Ｐｒｏｐｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．０６７ｍｇ／１ｍＬ）、Ｂｕｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．２００ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｘｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．１３３ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｐｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．１００ｍｇ／１ｍＬ）混合物
混合物Ｂ；Ｍｅｔｈｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．０３１ｍｇ／１ｍＬ）、Ｐｒｏｐｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．０６７ｍｇ／１ｍＬ）、Ｂｕｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．２５０ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｘｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．１３３ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈｅｐｔｙｌｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．２７８ｍｇ／１ｍＬ）混合物
上記２種の未知試料を標準試料と同様に、１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４希釈し、未知試料Ａ１〜７、未知試料Ｂ１〜７とし、合計１４種類調整し、検証に使用した。

図１０は前記手順で調整した濃度の異なる標準試料７種を用いて作成した標準検量線である。横軸に濃度（希釈率）、縦軸に各成分の面積をとり、最小二乗法により原点を通る２次式で近似したものである（ｙ＝ａｘ＾２＋ｂｘ＋ｃ、ｃ＝０）。各成分の近似式の係数および極大濃度、極大面積および定量上限面積を表４に示す。

いずれのピークに対しても、係数ａは負の値を示すことから、標準検量線は極大値を持つ形状であることが分かる。定量上限面積は、係数ｆ１＝０．８５として計算を行った。つまり、極大面積の８５％までを正確に定量できる範囲としたものである。

この基準となる検量線を作成した直後に、未知試料Ａ１〜Ａ７、Ｂ１〜Ｂ７、計１４種を測定し、前記基準検量線により定量した結果を表５、表６に示す。

得られた面積値は、ぼぼ全ての試料、全ての成分で、定量最大面積を下回っているが、未知試料Ａ１のピーク３のみ、定量最大面積をわずかに上回っている。図１１はピーク３に対する検量線を拡大して、極大と定量上限面積の範囲を示した図である。これからも分かるように、未知試料Ａ１のピーク３は検量線の極大と定量上限面積の範囲に入っていることが分かる。すなわち、この成分は検量線の極大値にかなり近寄っており、定量の信頼性が低いと判定される。

（実施例２）
検証に使用したシステム及び測定条件は、下記を除いて実施例１と同じである。
検出波長：２５４ｎｍ
標準試料：実施例１の標準試料７を１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４希釈し、標準試料８〜１４とした。
未知試料：実施例１の未知試料Ａ７、未知試料Ｂ７をそれぞれ１／４、１／１６、１／６４希釈し、未知試料Ａ８〜１０、未知試料Ｂ８〜１０とした。

図１２は前記手順で調整した濃度の異なる標準試料７〜１４を用いて作成した検量線である。横軸に濃度（希釈率）、縦軸に各成分の面積をとり、最小二乗法により原点を通る２次式で近似したものである（ｙ＝ａｘ＾２＋ｂｘ＋ｃ、ｃ＝０）。図１２ａは濃度（ｘ軸）、面積（ｙ軸）とも正で、検量域付近、図１２ｂは極値の存在が明確になるように広域で示した図である。

各成分の近似式の係数、関数の形状、極大濃度、極大面積および定量上限面積を表７に示す。

ピーク５に対しては、係数ａは負の値を示すことから、標準検量線は極大値を持つ形状であることが分かる。また、ピーク１から４に対しては、係数ａは正の値を示すことから、標準検量線は極小値を持つ形状であることが分かる。

ピーク５に対しての定量上限面積に係数ｆ１＝０．８５、ピーク１〜４に対して最も大きな測定点（検量点）のｙ座標ＡＲｎに係数ｆ２＝１．２０として計算を行った（図１３参照）。

この基準となる検量線を作成した直後に、未知試料Ａ７〜Ａ１０、Ｂ７〜Ｂ１０、計８種を測定し、前記基準検量線により定量した結果を表８に示す。得られた面積値は、全ての試料、全ての成分で、定量最大面積を下回っており、数学的には定量性が信頼できる範囲に入っていることが分かる。

次に、流速を０．９５、０．９９、１．０１、１．０５ｍＬ／ｍｉｎと僅かに変化させ、上記検量線を１濃度の標準試料にて補正し、その補正検量線を基に未知試料Ａ７〜Ａ１０、Ｂ７〜Ｂ１０、計８種を測定し、同様に定量を実施した。検量線を補正するための基準点として、最も高い濃度である標準試料１で定量計算を試みた。

図１４は、元の検量線（基準検量線）を測定した流速１．００ｍＬ／ｍｉｎでの標準試料１および標準試料４のクロマトグラムと、補正計算を実施した流速０．９５、０．９９、１．０１、１．０５ｍＬ／ｍｉｎでの標準試料１のクロマトグラムである。ここから分かるように、各ピークの溶出時間は大きく変化しており、通常の分析では、検量線を再測定しないと正確な定量ができない状態であることが容易に推測できる。このような状態でも本発明が有効に機能するか検証を行った。

図１５はピーク１から５の定量結果の一部を示した図である。横軸に基準検量線作成時に定量を行った結果、縦軸に流速を変えて検量線を補正・未知試料を定量した結果をプロットした図である。定量値が正確であれば、両者は同じ値を示すことになる。つまり、ｙ＝ａｘ（ａ＝１）の直線上にデータ点がくるようになる。

いずれの条件、ピークでも全ての未知試料の面積は定量上限以下に収まっていることから定量結果は担保されている。また、基準検量線作成時に行った定量結果との差異も全領域で微小であり、ｙ＝ｘの直線上に載っており、定量値の絶対値も担保されていることが分かる。

１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．紫外可視検出器
８．廃液
９．システム制御およびデータ処理装置

Claims

クロマトグラフィにおける多項式検量線の作成方法であって、
濃度をｘ、出力値をｙとしてプロットした検量点を２次式又は３次式にて近似を行う工程と、
前記２次式においては係数ａ及び極値の座標から、前記３次式においては係数ａ、極大値の座標、極小値の座標及び変曲点の座標の全部又は一部から、検量線の形状を判定する工程と、
前記２次式においては前記係数ａ及び前記極値の座標から、前記３次式においては前記係数ａから、前記検量線が正常であるか異常であるかを判定する工程と、
正常と判定された前記検量線において、前記２次式においては極大値のｙ座標に１未満の定数を乗じて又は最大濃度の検量点のｙ座標に１以上の定数を乗じて、前記３次式においては極大値が存在する場合には極大値のｙ座標に、極大値が存在しない場合には変曲点のｙ座標に１未満の定数を乗じて出力値の上限を決定する工程と、
を含んでなる作成方法。
特定の濃度ｘ０の標準試料をクロマトグラフィで測定し、得られた出力値ｙ０と、前記検量線で計算される濃度ｘ０に対する出力値との比率を算出し、前記検量点の出力値に前記比率を各々乗じて得られる補正出力値を２次式又は３次式にて近似を行う工程を更に含む請求項１に記載の作成方法。
補正出力値を近似した近似式に対して、２次式においては極大値のｙ座標に１未満の定数を乗じて又は最大濃度の検量点のｙ座標に１以上の定数を乗じて、３次式においては極大値が存在する場合には極大値のｙ座標に、極大値が存在しない場合には変曲点のｙ座標に１未満の定数を乗じて、出力値の上限を再決定する工程を更に含む請求項２に記載の作成方法。
請求項２又は３の方法によって作成された検量線について、前記比率が一定の値以上の場合は、前記検量線の信頼性がないと判断する方法。